专利名称：重组人成骨蛋白－1的“一步纯化”法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人成骨蛋白-1的纯化方法，尤其涉及一种基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽的“一步纯化”方法，属生物技术制药领域。
背景技术：
成骨蛋白-1(Osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形成蛋白-7(Bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)，是TGF-β超家族中的一员。OP-1是一种多用途的蛋白可用于治疗骨及软骨的缺损及在矫形和整形外科有广泛的应用。其在骨折方面的治疗作用已被大量的临床试验所证明是非常有效的，它能治愈现有的所有技术无法治愈的骨不连和骨缺损。在治疗牙周病方面OP-1还具有能促进牙周重建、牙槽骨密度增高等功效，这对于牙的种植具有重大的应用前景(Giannobile WV et al.，J Periodontol.，1998，69129)。
利用基因工程原核表达体系可以获得大量的目的蛋白，但是，OP-1的纯化、复性却一直是一个具有挑战性的难题，通常的纯化需要多步层析才能够完成，耗时长，丢失多。目前虽然有表达成功的报道，但是尚没有一套高效率重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)的纯化、复性方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽的“一步纯化”方法，利用本发明提供的方法，将rhOP-1的粗品提取液通过离子交换柱层析一步纯化，即可获得高纯度的rhOP-1蛋白，实现纯化生产rhOP-1的目的，并且本发明所述的方法还具有高效快速的优点，适合企业生产放大。
本发明所述的基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)成熟肽利用常规技术设计引物，从人胚胎组织中获得了目的基因；利用基因工程技术构建表达质粒，通过宿主菌转化实验筛选、建立了重组人成骨蛋白-1(rhOP-1)高效表达体系，构建了含有目的蛋白OP-1成熟肽基因(即人OP-1成熟肽基因序列，其核苷酸序列为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，公开的SEQ ID NO.1http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝4502426公开序列mat_peptide999---1415/gene＝″BMP7″；所述核苷酸序列SEQ ID NO.1表达的蛋白质序列为SEQ ID NO.2(139氨基酸，其序列为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝4502427&itemID＝7&view＝gpwithparts公开序列)表达系统；宿主菌为常规技术使用的BL21系列、DH5α大肠杆菌(①李邦印；庄玉辉人成骨蛋白-1成熟肽基因在大肠杆菌中的克隆与表达生物技术通讯1999.03.30；10(1)17-19；②陈文；史俊南；付士红；孙叶芳；梁国栋；侯云德人成骨蛋白-1成熟肽基因5’端的修饰及其在大肠杆菌中的表达牙体牙髓牙周病学杂志1998.03.30；8(1)3-6，)。利用常规热诱导表达，即可获得目的蛋白质的高表达，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％左右，本发明所述的rhOP-1在大肠杆菌中以包涵体的形式存在。
本发明所述的基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1的“一步纯化”法，其特征在于将工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性，一步层析纯化，SDS-PAGE电泳分析，即可获得95％以上纯度的重组人成骨蛋白-1。
其中，所述工程菌破碎可以是采用冰浴超声裂菌或者其他常规裂菌方法，将工程菌破碎至镜检细菌破碎率大于98％，即得包涵体混合液。
其中，所述包涵体洗涤是将包涵体混合液于4℃，6000g，离心15～20min，收集其沉淀物；用包涵体洗涤液1和包涵体洗涤液2依次分别以4℃，8000g条件，洗涤离心20～30min，得包涵体沉淀物；上述包涵体洗涤液1成分是20mmol/L磷酸盐缓冲液，体积百分比为1％ Triton 100，pH 6.0；上述包涵体洗涤液2成分是20mmol/L磷酸盐缓冲液，2mol/L Urea，pH 6.0。
其中，所述重组蛋白变性，一步层析纯化是指将洗涤后得到的包涵体沉淀物用包涵体溶解液即平衡缓冲液A溶解，12000g离心20～30min，收集上清，即得rhOP-1提取液；将所述提取液用0.45μm微孔滤膜过滤或12000g离心15～30min后，取滤液或上清液上经过平衡缓冲液平衡的强阳离子交换柱进行层析纯化；洗脱时，先以体积百分比为10％的洗脱缓冲液B洗脱部分杂蛋白，再用体积百分比为20％洗脱缓冲液B洗脱目的蛋白质，分部收集体积百分比为20％洗脱缓冲液B的洗脱峰。
上述包涵体沉淀物与包涵体溶解液即平衡缓冲液A的混合比，以克比毫升计，优选是1∶10-50。
上述包涵体溶解液即平衡缓冲液A的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0或8mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCI，pH6.0；上述洗脱缓冲液B的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，1mol/L NaCl，pH6.0。
在上述的基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1的“一步纯化”法中，所述包涵体溶解液即平衡缓冲液A中还可以添加1-10mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)；1-20mmol/L的DDT(二硫苏糖醇)或者1-20mmol/L的二巯基乙醇。
在上述的基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1的“一步纯化”法中，所述强阳离子交换柱是SP-Sepharose系列(Amersham公司)、SP Resin HP系列(北京卓冠)、UNOsphereTMS系列(Bio-Rad公司)之一。
其中，所述强阳离子交换柱优选是SP-Sepharose Fast Flow(SP-FF)或UNOsphereTMS Exchange Media强阳离子交换柱。
在上述的基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1的“一步纯化”法中，所述“一步纯化”法是指将体积百分比为20％洗脱缓冲液B的洗脱峰收集的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，利用灰度扫描及软件分析收集的目的蛋白的纯度，即可获得95％以上纯度的重组人成骨蛋白-1。
本发明所提供的“一步层析纯化法”纯化生产rhOP-1方法的要点是先以体积百分比为10％的洗脱缓冲液B洗脱部分杂蛋白，再用体积百分比为20％洗脱缓冲液B洗脱目的蛋白质(见图1)，其中20％的B液洗脱峰2基本是目的蛋白rhOP-1，SDS-PAGE电泳分析各收集部分，即可获得95％以上纯度的目的蛋白质(见图2)。
从事本领域的技术人员可以很容易地看出，本发明所述之平衡缓冲液A中可以添加1-10mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)；1-20mmol/L的DDT(二硫苏糖醇)或者1-20mmol/L的二巯基乙醇；B液中的1mol/L NaCl，也可以是0.5-1mol/L浓度的NaCl，计算相对浓度，也可以获得相应B液梯度浓度的洗脱浓度，但是1mol/L NaCl在获得目的蛋白后，可以直接再生层析柱，有提高纯化效率的优点。
用100％ B液洗脱其余结合蛋白并同时再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重复上样纯化样品。本发明的梯度浓度洗脱法大大提高了效率，降低了成本，具有高效快速的优点，尤其适合企业生产放大。
图1本发明典型的rhOP-1纯化图谱其中峰1为穿透峰；峰2为10％B液的洗脱峰；峰3为20％B液的第1个洗脱峰；峰4即为20％B液的第二个洗脱峰。
图2本发明方法收集的蛋白进行的SDS-PAGE电泳图其中泳道1为包涵体第一次溶解后的样品；泳道1为包涵体第二次溶解后的样品；液泳道3即为20％洗脱缓冲液B液的第二个洗脱峰收集的目的蛋白；泳道4为标准蛋白质分子量marker。
具体实施例方式
实施例1按1g菌体10ml的比例加入裂解液悬浮工程菌，冰浴超声裂菌。超声功率400～1200w，超声10s，间隔15s，重复45次(共19分钟)。用相差显微镜检测裂解率，离心裂解后的悬浊液(4℃，6000g，离心15min)弃去上清，保留沉淀。显微镜检测若没有达到98％以上细菌破裂，将沉淀重新用裂解液悬起重复裂解至98％以上细菌破裂，以上述条件离心收集沉淀物，即为包涵体混合物。
用包涵体洗涤液1(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0，1％ Triton 100)和包涵体洗涤液2(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0，2mol/L Urea)分别依次洗涤离心(8000g，25min)收集包涵体沉淀物。
将上述收集的包涵体用平衡缓冲液A(8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.0)以(克比毫升计)1g湿菌体2ml或者是包涵体沉淀物与包涵体溶解液即平衡缓冲液A的混合比以1∶10-20的比例混合，于4℃条件溶解包涵体30min以上或者过夜，12000g离心30min收集上清液，沉淀再以上述步骤溶解、离心，重复1-2次，进行SDS-PAGE电泳分析，视目的蛋白质含量确定收集上清液。合并收集的上清液，即为rhOP-1提取液。
将rhOP-1提取液以0.45μm的微孔滤膜过滤或12000g离心20min后，取滤液或上清液上离子交换柱SP-Sepharose Fast Flow(SP-FF)强阳离子交换柱层析纯化。具体步骤是1、用平衡缓冲液A(8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0)平衡2-3个柱体积，流速为20cm-100cm/小时线性流速。
2、当柱流出液基线平稳后，将通过0.45μm的微孔滤膜过滤或12000g离心30min后的rhOP-1提取液样品等速上SP-FF柱。
3、上样后用平衡缓冲液A洗柱1-2个柱床体积。
4、用90％的平衡液A和10％洗脱缓冲液B(A液+1mol/LNaCl)洗脱1-2个柱床体积，去除部分杂蛋白。
5、用80％的平衡液A液和20％缓冲液B洗脱3-5个柱床体积，分部收集20％缓冲液B的洗脱峰。
6、用100％缓冲液B洗脱其余结合蛋白并同时再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重复以上步骤，继续上样纯化样品。
步骤5中，80％的A液和20％的B液的洗脱峰有2个(见图1)，其中洗脱峰2基本是目的蛋白rhOP-1，SDS-PAGE电泳分析各收集部分，即可获得95％以上纯度的目的蛋白质(见图2)。
实施例2准备包涵体溶解液(8mol/L尿素，pH 6.0，20mmol/L磷酸盐缓冲液，含1mmol/L的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)；10mmol/L的DDT(二硫苏糖醇)。
以实施例1方式裂菌、洗涤、离心获得包涵体，收集的包涵体用上述包涵体溶解液溶解，以1g湿菌体∶8ml的比例混合，4℃溶解包涵体30min以上或者过夜。12000g离心25min收集上液，沉淀再以上述步骤溶解，离心，重复2次，进行SDS-PAGE电泳分析，视目的蛋白质含量确定收集上清液。合并收集的上清液，即为rhOP-1提取液。
将上述收集的rhOP-1提取液以0.45μm的微孔滤膜过滤后上离子交换柱UNOsphereTM S Exchange Media(Bio-Rad公司)强阳离子交换柱层析梯度纯化。具体步骤是1.用平衡缓冲液A(20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0，8mol/L Urea)平衡2-3个柱体积，流速为40cm-120cm/小时线性流速。
2.当柱流出液基线平稳后.将通过0.45μm的微孔滤膜过滤后的rhOP-1提取液样品等速上UNOsphereTM S Exchange Media柱。
3.上样后用平衡缓冲液洗柱1-2个柱床体积(再平衡)。
4.用90％的平衡液A和10％缓冲液B(A液+1mol/LNaCl)洗脱1-2个柱床体积，去除部分杂蛋白。
5.用80％的平衡液A液和20％缓冲液B洗脱3-5个柱床体积，分部收集20％缓冲液B的洗脱峰。SDS-PAGE电泳分析各收集部分，即可获得95％以上纯度的目的蛋白质。
6.用100％缓冲液B洗脱其余结合蛋白并同时再生柱子；平衡液A液平衡后，可以重复以上步骤，继续上样纯化样品。
权利要求
1.一种基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白-1的“一步纯化”法，其特征在于将工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性，一步层析纯化，SDS-PAGE电泳分析即可获得95％以上纯度的重组人成骨蛋白-1。
2.按权利要求1所述方法，其特征在于所述工程菌破碎是将工程菌破碎至镜检细菌破碎率大于98％，即得包涵体混合液。
3.按权利要求1所述方法，其特征在于所述包涵体洗涤是将包涵体混合液于4℃，6000g离心15～20min，收集其沉淀物；用包涵体洗涤液1和包涵体洗涤液2依次分别以4℃，8000g条件，洗涤、离心20～30min，得包涵体沉淀物。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组蛋白变性，一步层析纯化是指将洗涤后得到的包涵体沉淀物用包涵体溶解液即平衡缓冲液A溶解，12000g离心20～30min，收集上清，即得rhOP-1提取液；将所述提取液用0.45μm微孔滤膜过滤或12000g离心15～30min后，取滤液或上清液上经过平衡缓冲液平衡的强阳离子交换柱进行层析纯化；洗脱时，先以体积百分比为10％的洗脱缓冲液B洗脱部分杂蛋白，再用体积百分比为20％洗脱缓冲液B洗脱目的蛋白质，分部收集体积百分比为20％洗脱缓冲液B的洗脱峰。
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于所述包涵体沉淀物与包涵体溶解液即平衡缓冲液A的混合比，以克比毫升计是1∶10-50。
6.按权利要求4所述的方法，其特征在于所述包涵体溶解液即平衡缓冲液A的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.0或8mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCI，pH6.0；所述洗脱缓冲液B的成分是8mol/L Urea，20mmol/L磷酸盐缓冲液，1mol/L NaCl，pH 6.0。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于所述包涵体溶解液即平衡缓冲液A中可以添加1-10mmol/L的乙二胺四乙酸二钠；1-20mmol/L的二硫苏糖醇或者1-20mmol/L的二巯基乙醇。
8.按权利要求4所述的方法，其特征在于所述强阳离子交换柱是SP-Sepharose系列、SP Resin HP系列、UNOsphereTMS系列之一。
9.按权利要求8所述的方法，其特征在于所述强阳离子交换柱是SP-Sepharose FastFlow或UNOsphereTMS Exchange Media强阳离子交换柱。
10.按权利要求4所述方法，其特征在于20％的B液洗脱峰第2峰为目的蛋白重组人成骨蛋白-1峰，将收集的体积百分比为20％洗脱缓冲液B的洗脱峰进行SDS-PAGE电泳分析，即可获得95％以上纯度的重组人成骨蛋白-1。
全文摘要
本发明公开了一种基因工程菌所表达的重组人成骨蛋白－1的“一步纯化”法，其方法是，利用获得的人成骨蛋白－1的成熟肽基因片段，通过DNA重组技术构建表达质粒，转化工程菌，发酵收集，将工程菌破碎，包涵体洗涤，重组蛋白变性，一步层析纯化即可获得95％以上纯度的重组人成骨蛋白－1。本发明所提供的“一步层析纯化法”具有高效快速的优点，适合企业生产放大。
文档编号C07K14/51GK1789276SQ200510045370
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者王世立, 韩金祥, 车睛, 张更林, 赵甜娜, 王国栋, 孙杰, 李俊玲 申请人:山东省医药生物技术研究中心