一种紫杉醇纯品的生产方法

文档序号:3575567阅读:949来源:国知局
专利名称:一种紫杉醇纯品的生产方法
技术领域
紫杉醇,英文名为Paclitaxel,系统命名为5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13-[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3’苯基异丝氨酸酯]。其分子式为C47H51NO14,分子量为853.9,是制造紫杉醇类抗癌药物的重要原料。本发明以天然或人工红豆杉枝叶及树皮为原料,经过浸提、粗分离、精制等工艺过程获得纯度大于99%的精品,属于生物化工领域。
背景技术
紫杉醇能够与微管蛋白结合,促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体,从而抑制细胞中微管的生理解聚,使细胞有丝分裂停止在G2期及M期,阻止了癌细胞的快速繁殖,这一机理与其它纺锤体毒性的抗癌药物的作用机制恰好相反,至今仍是独一无二的。临床研究表明,紫杉醇治疗晚期卵巢癌总响应率为56%,治疗转移性乳腺癌,总响应率为30%,治疗非小细胞肺癌总响应率为24%,而且对前列腺癌、上胃肠道癌、头颈癌、白血病等亦有较好疗效。早在1856年Lucas就从浆果红豆杉(Taxus baccataL.)中分离得到了碱性物质Taxine,但直到本世纪60年代,在现代光谱技术发展的基础上,有关这方面的研究才得以全面展开。1967年,美国化学家M.E.Wall和M.C.Wani首先从短叶红豆杉中分离得到紫杉醇,1971年由M.C.Wani及其同事鉴定了结构并说明其有抗癌活性。1979年,美国爱因斯坦医学院的Susan B.Horwitz等发现紫杉醇独特的抗癌机理。1980年进行给药规程研究,1982年美国开始I期临床试验,1986年开始II期临床试验。1992年12月29日,美国食品及药品管理局(FDA)首先批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌的新抗癌药上市,一年后又批准用于治疗乳腺癌。90年代以来,紫杉醇的研究空前发展,主要集中在原料浸出率的提高、分离方法的改进、细胞组织培养法的工业化、半合成及全合成法的工业化、低毒及水溶新剂型的研究等等。
现有的紫杉醇浸提方法一般均是将原料干燥、粉碎后,先用甲醇、乙醇浸出,加水稀释,用己烷或石油醚萃取脱脂,二氯甲烷或氯仿萃取,浓缩后得到浸膏。其缺点是萃取有机溶剂用量大,乳化严重,浸出收率难以超过85%,浸膏纯度低。
国内外目前分离紫杉醇的方法一般是用将浸膏经多级硅胶柱层析、硅胶键合C-18柱层析或吸附树脂柱层析,再经结晶、重结晶后得到产品。上述方法分离紫杉醇与邻近衍生物Cephalomannine是比较困难的,且产量很小,因而有时需要经过溴化或氧化后再用硅胶柱层析将二者分开。上述方法所得产品纯度>98%,但存在如下缺陷(1)收率低。硅胶对紫杉醇存在不可逆吸附,造成产品损失,生产纯度大于98%的紫杉醇,总收率小于60%。(2)操作繁琐、产量小。(3)溶剂消耗量大,成本高。(4)吸附树脂抗压能力弱,柱效低。(5)难以利用可再生的红豆杉枝叶为原料进行工业化生产。

发明内容
本发明的目的是提供一种稳定、工业化、低成本地提纯获得高纯度紫杉醇的方法。本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料,经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解,加入吸附剂混合浓缩吸附,采用工业固-液相柱色谱分离技术,用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱,分段除去与紫杉醇极性不同的杂质,将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到高纯度的紫杉醇精品,纯度大于99%。按紫杉醇量计算,产品直接收率大于70%,总收率大于85%。其工艺步骤详述如下A.提取 将红豆杉枝叶或树皮阴干,粉碎过5mm直径筛,分三次加入浸提液进行三级间歇浸提,粉碎原料∶浸提液=1∶7(W/V),浸提液为甲醇\乙醇,优选甲醇。其中第三级浸提液用作下批投料时的一级浸提液。第一、二级浸提液合并浓缩,得到浓缩液,有机溶剂回收利用。
B.脱酯 将步骤A产生的浓缩液分两次加入脱脂液进行二级间歇脱脂,浓缩液∶脱脂液=1∶1(V/V),脱脂液为石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等,优选石油醚。搅拌20分钟,静置60分钟,弃去下层胶状或絮状沉淀物,收集下层液,上层液合并回收溶剂。
C.脱胶 将步骤B的下层液加入二氯甲烷,下层液∶二氯甲烷=1∶1(V/V),搅拌15分钟,静置30分钟,弃去下层胶状或絮状沉淀物,得混合液。
D.反萃取 将步骤C的混合液加入含1%NaCl的水,搅拌20分钟,静置60分钟,弃去上层液,混合液∶盐水=1∶1(V/V);下层液中分两次再加入甲醇及盐水,每次搅拌20分钟,静置60分钟,弃去上层液,下层液∶甲醇∶盐水=1∶1∶1(V/V/V),得下层有机相。
E.浓缩 将步骤C的下层有机相于60℃减压浓缩回收有机溶剂,得到含紫杉醇1.5%以上的浸膏。
F.制料 将步骤E所得浸膏加丙酮溶解,加入吸附剂,紫杉醇净含量∶吸附剂=1∶200(W/W),在60℃减压浓缩至干。吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等,优选硅胶。
G.一次固-液色谱分离 将步骤F制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,用极性溶剂及弱极性溶剂的混合液进行梯度洗脱,洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶弱极性溶剂=10∶90~100∶0的阶梯梯度。上述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮\乙酸乙酯,优选乙酸乙酯。上述弱极性溶剂为氯仿\四氯化碳\二氯甲烷\1,2-二氯乙烷\石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等,优选正己烷。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱;上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱,柱内为硅胶或氧化铝,优选硅胶。
H.再制料 将步骤G所得富含紫杉醇段的收集液,加入吸附剂,紫杉醇净含量∶吸附剂=1∶200(W/V),在60℃减压浓缩。吸附剂为活性炭\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等,优选吸附树脂。
I.二次固-液色谱分离 将步骤H制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,用极性溶剂及水的混合液进行梯度洗脱,洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶水=40∶60~100∶0的阶梯梯度。上述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮,优选丙酮。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱;上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱,柱内为键合十八烷基填料或以硅胶\氧化锆为基质包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚环氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料,优选硅胶\氧化锆为基质包覆聚丙烯酸酯。
J.结晶 将步骤I所得富含紫杉醇段的收集液于60℃减压浓缩,静置12小时,过滤,得一次结晶。
K.重结晶 将步骤J所得一次结晶加丙酮溶解,溶解液浓度为8g/L,搅拌加入二氯甲烷,搅拌陈化4小时,过滤,滤液中搅拌加入正己烷,搅拌陈化8小时,过滤,得重结晶滤饼。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷=1∶1∶7(V/V/V)。
L.干燥 将步骤K所得重结晶滤饼在60℃温度减压干燥得到高纯度的紫杉醇精品,纯度大于99%,直接收率大于70%。
M.将步骤I所得低含紫杉醇段的收集液及步骤J、K所得回收母液减压浓缩,重复步骤F~L,继续得到高纯度的紫杉醇精品,纯度大于99%,总收率大于85%。


附图1为本发明提取过程工艺流程图;附图2为本发明精制过程工艺流程图;附图3为本发明的预柱与分离柱的连接示意图。
具体实施例方式
实施例11.前处理 取云南红豆杉树皮400kg,含紫杉醇为0.016%用甲醇2800L,三级浸提,提取液浓缩至480L,用480L的正己烷进行二级脱脂;用480L二氯甲烷,按甲醇∶二氯甲烷∶1%盐水=1∶1∶1(V/V/V)的比例,连续三次反萃取,将下层有机相浓缩得膏状物2.6kg,经HPLC检测紫杉醇含量为2.2%。
2.制料 将步骤1所得紫杉醇浸膏2.6Kg,加丙酮溶解,加入硅胶11Kg,在60℃减压浓缩至干。
3.洗脱 将步骤2制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,洗脱梯度为乙酸乙酯∶正己烷=10∶90~100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢柱;上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢柱,柱内为硅胶。
4.再制料 将步骤3所得富含紫杉醇段的收集液,加入硅藻土11Kg,在60℃减压浓缩至干。
5.二次固-液色谱分离 将步骤4制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,洗脱梯度为丙酮∶水=40∶60~100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢柱;上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢柱,柱内为硅胶基质包覆\聚丙烯酸酯填料。
6.结晶 将步骤5所得富含紫杉醇段的收集液于60℃减压浓缩,静置12小时,过滤,得一次结晶。将一次结晶加丙酮溶解,溶解液浓度为8g/L,搅拌加入二氯甲烷,搅拌陈化4小时,过滤,滤液中搅拌加入正己烷,搅拌陈化8小时,过滤,得重结晶滤饼。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷=1∶1∶7(V/V/V)。
7.干燥 将步骤6所得重结晶滤饼在60℃温度减压干燥得到高纯度的紫杉醇精品49.9g,纯度99.6%,直接收率77.9%。
实施例2 以人工种植Media红豆杉枝叶400kg,含紫杉醇为0.025%,其工艺过程完全与实施例1相同,所得紫杉醇精品99.70%,直接收率75%。
权利要求
1.本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料,经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解,加入吸附剂混合浓缩吸附,采用工业固-液相柱色谱分离技术,用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱,分段除去与紫杉醇极性不同的杂质,将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到高纯度的紫杉醇精品。其工艺步骤详述如下A.提取 将红豆杉枝叶或树皮阴干,粉碎过5mm直径筛,分三次加入浸提液进行三级间歇浸提,粉碎原料∶浸提液=1∶7(W/V)。其中第三级浸提液用作下批投料时的一级浸提液。第一、二级浸提液合并浓缩,得到浓缩液,有机溶剂回收利用。B.脱酯 将步骤A产生的浓缩液分两次加入脱脂液进行二级间歇脱脂,浓缩液∶脱脂液=1∶1(V/V)。搅拌20分钟,静置60分钟,弃去下层胶状或絮状沉淀物,收集下层液,上层液合并回收溶剂。C.脱胶 将步骤B的下层液加入二氯甲烷,下层液∶二氯甲烷=1∶1(V/V),搅拌15分钟,静置30分钟,弃去下层胶状或絮状沉淀物,得混合液。D.反萃取 将步骤C的混合液加入含1%NaCl的水,搅拌20分钟,静置60分钟,弃去上层液,混合液∶盐水=1∶1(V/V);下层液中分两次再加入甲醇及盐水,下层液∶甲醇∶盐水=1∶1∶1(V/V/V),每次搅拌20分钟,静置60分钟,弃去上层液,得下层有机相。E.浓缩 将步骤C的下层有机相于60℃减压浓缩回收有机溶剂,得到含紫杉醇1.5%以上的浸膏。F.制料 将步骤E所得浸膏加丙酮溶解,加入吸附剂,紫杉醇净含量∶吸附剂=1∶200(W/W),在60℃减压浓缩至干。G.一次固-液色谱分离 将步骤F制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,用极性溶剂及弱极性溶剂的混合液进行梯度洗脱,洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。H.再制料 将步骤G所得富含紫杉醇段的收集液,加入吸附剂,紫杉醇净含量∶吸附剂=1∶200(W/V),在60℃减压浓缩。I.二次固-液色谱分离 将步骤H制好的物料装入预柱,自由沉降压实。将预柱与分离柱串联,用极性溶剂及水的混合液进行梯度洗脱,洗脱收集液通过TLC及HPLC检测进行分段处理。洗脱梯度为极性溶剂∶水=40∶60~100∶0的阶梯梯度。上述预柱为300mm直径×1000mm长度的不锈钢或玻璃柱;上述分离柱为200mm直径×2000mm长度的不锈钢或玻璃柱。J.结晶 将步骤I所得富含紫杉醇段的收集液于60℃减压浓缩,静置12小时,过滤,得一次结晶。K.重结晶 将步骤J所得一次结晶加丙酮溶解,溶解液浓度为8g/L,搅拌加入二氯甲烷,搅拌陈化4小时,过滤,滤液中搅拌加入正己烷,搅拌陈化8小时,过滤,得重结晶滤饼。丙酮∶二氯甲烷∶正己烷=1∶1∶7(V/V/V)。L.干燥 将步骤K所得重结晶滤饼在60℃温度减压干燥得到高纯度的紫杉醇精品,纯度大于99%,直接收率大于70%。M.将步骤I所得低含紫杉醇段的收集液及步骤J、K所得回收母液减压浓缩,重复步骤F~L,继续得到高纯度的紫杉醇精品,纯度大于99%,总收率大于85%。
2.权利要求1所指红豆杉是指各种天然红豆杉及人工种植的红豆杉。
3.权利要求1之步骤A所述浸提液为甲醇\乙醇,优选甲醇。
4.权利要求1之步骤B采用甲醇与脱脂液两相分配脱脂,不加水。所述脱脂液为石油醚\正己烷\环己烷\6号溶剂油等,优选石油醚。
5.权利要求1之步骤C采用甲醇与二氯甲烷混合脱胶,不加水。
6.权利要求1之步骤D采用1%浓度的盐水反萃取。
7.权利要求1之步骤F所述吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等,优选硅胶。
8.权利要求1之步骤H所述吸附剂为活性炭\硅藻土\活性白土\硅胶\氧化铝\离子交换树脂\吸附树脂等,优选吸附树脂。
9.权利要求1之步骤I所述极性溶剂为甲醇\乙醇\异丙醇\乙腈\叔丁醇\丙酮,优选丙酮。
10.权利要求1之步骤I所述分离柱内填料为键合十八烷基填料或以硅胶\氧化锆为基质包覆聚苯乙烯\聚苯乙烯-二乙烯基苯\聚丁二烯\聚丙烯酸酯\聚丙烯腈\聚环氧乙烷\聚醚\聚丙烯酰胺等的填料,优选硅胶\氧化锆为基质包覆聚丙烯酸酯。
11.权利要求1之步骤J所述重结晶步骤为将一次结晶加丙酮溶解,搅拌加入二氯甲烷,搅拌陈化4小时,过滤,滤液中搅拌加入正己烷,搅拌陈化8小时,过滤,得重结晶滤饼。
12.权利要求1之步骤J所述重结晶溶剂比例为丙酮∶二氯甲烷∶正己烷=1∶1∶7(V/V/V)。
全文摘要
本发明采用紫杉醇含量大于万分之一的红豆杉枝叶或树皮为原料,经过浸提、脱脂、脱胶后得到含量大于百分之一点五的浸膏。将浸膏用溶剂溶解,加入吸附剂混合浓缩吸附,采用工业固-液相柱色谱分离技术,用极性、弱极性溶剂或混合溶剂洗脱,分段除去与紫杉醇极性不同的杂质,将富含紫杉醇段经过浓缩、结晶、真空干燥后得到纯度大于99%的紫杉醇精品。按紫杉醇量计算,产品直接收率大于70%,总收率大于85%。
文档编号C07D305/14GK1687044SQ20051006305
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月5日 优先权日2005年4月5日
发明者杨雪峰, 谢曼 申请人:杨雪峰, 谢曼
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