一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白的制作方法

专利名称：一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程抗体领域，更具体地，涉及一种趋化因子SLC(Secondary lymphoid tissue chemokine，次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白；这种融合蛋白的构建、表达和纯化方法；含有该融合蛋白的载体和大肠杆菌宿主菌。
背景技术：
随着抗体工程的发展，免疫治疗是继手术、放疗、化疗后，又一治疗肿瘤的重要方法。理想的治疗方案应是针对肿瘤细胞的特异性高效杀伤的，即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞的双特异抗体，是这个方案的较理想的候选。它一方面针对肿瘤，实现与靶肿瘤细胞的特异性结合，另一方面将效应细胞富集在肿瘤细胞周围，模拟天然配体的作用，在肿瘤部位与效应细胞引发分子结合，激活效应细胞，实现对肿瘤的特异性杀伤和裂解(参考文献1-10)。但富集在肿瘤部位的效应细胞的数量毕竟有限，使这一作用难以得到最大的发挥。
趋化因子的发现使这一问题的解决出现新的曙光。趋化因子(趋化性细胞因子的简称)是一由小分子(8-10KD)的碱性分泌蛋白组成的复杂超家族，对各种白细胞有趋化效应(参考文献11-15)。根据N末端半胱氨酸的数量和位置，趋化因子分为四个亚家族CC，CXC，CX3C和C。其中SLC是CC家族的成员(参考文献16)，主要在次级淋巴组织(如脾脏、淋巴结、派氏集结、淋巴内皮中)表达，对T淋巴细胞、B淋巴细胞、成熟的树突状细胞有趋化作用。
最近，一些趋化因子的三维结构已经得到解析(参考文献17-22)，从已有的资料看趋化因子的三维结构是高度保守的，他们大都有一柔性无序的N末端，而后是呈螺旋转角的N末端环形区，接着是三个反平行的β折叠，最后是C末端α螺旋，N末端和N末端区通过两个二硫键连接到β折叠上。人们通过截短N末端区或对N末端区和N末端环形区进行丙氨酸扫描，证明了这两个区域在配体结合和激活受体是必须的(参考文献23-26)。Pius Loetscher等人证实SDF-1的N末端区和N末端环形区对其受体CXCR4有足够的结合活性，对表达该受体的淋巴细胞有一定的趋化活性(参考文献27)。本实验室也证实CCL21的N末端区和N末端环形区对受体CCR7的结合活性很高，对树突状细胞和T淋巴细胞有相当的趋化活性。
结合双特异抗体与趋化因子的特点，本发明人已成功构建了趋化因子SLC的N末端十八肽和抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白，并已证明该融合蛋白即有对表达CCR7受体的细胞结合和趋化活性，又具有双特异抗体对相应的肿瘤细胞的结合和杀伤活性。这样该融合蛋白在双特异抗体的导向作用下到达肿瘤部位，而后发挥趋化作用将足够量的树突状细胞和T淋巴细胞吸引到肿瘤部位，杀伤肿瘤，这样可以高效地治疗肿瘤。

发明内容
本发明将趋化因子CC家族SLC的N末端十八肽，抗卵巢癌单链抗体×抗CD3单链抗体依次相连构建趋化因子SLC(Secondary lymphoid tissuechemokine，次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白；这一构建物能将二者的优点充分发挥。一方面，利用SLC的N末端十八肽的趋化作用，吸引T淋巴细胞和树突状细胞到相应部位；另一方面，利用抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的桥连作用，特异性激活T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞。该融合蛋白在卵巢癌的免疫治疗领域，具有较大的应用前景。
因此，本发明的一个目的是提供一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述趋化小肽是CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽(SDGGAQDCCLKYSQRKIP)。
在本发明的另一个实施方案中，所述双特异抗体是抗肿瘤×抗CD3双特异抗体。在本发明中优选所述抗肿瘤×抗CD3双特异抗体是抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体。
在本发明的一个具体实施方式
中，所述融合蛋白是由CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)2连接肽、抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体依次连接而成。优选所述融合蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所编码，其C末端可以任选地带有C-myc(氨基酸序列为EQKLISEEDLN)和His6标签。
本发明另外一个目的是提供一种表达载体，其特征在于包含权利要求1-6中任何一项所述融合蛋白的编码基因。优选所述载体是p18TBHL。
本发明还提供含有上述载体的宿主细胞，优选大肠杆菌。
本发明另一方面还提供一种纯化上述任一种融合蛋白的方法，其特征在于联合采用DEAE阴离子交换树脂和Ni亲和柱进行纯化。
更具体地，按照本发明的一方面，提供了一种治疗卵巢癌的趋化因子SLC的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供了一种构建趋化因子SLC的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白的方法。
优选本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列如以下SEQ ID NO2所示。
SDGGAQDCCLKYSQRKIPGGGGSGGGGSLELEDVQLLESGPEAKKPGETVRISCKASGYTFTTAGMQWVQKMPGKGLKWLGWINTNSEVPKYAEDFRGRFAFSLETSASTAYLQISNLKNEDTATFFCARSFTWGTMDYWGQGTPVTVSSTSGGGGSGGGGSGGGGSSRDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLELKEFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSELDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLELKRATSGGGGSGGGGSGGGGSSREVKLVESGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGAGTSVTVSS(粗体部分是趋化因子SLC的N末端十八肽，下划线部分是(GGGGS)2连接肽，以下部分是抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体)
更优选编码本发明所述融合蛋白的核苷酸序列如以下SEQ ID NO1所示。
agcgatggtggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccgggtggtggtggttctggtggtggtggttctctcgagctcgaggatgtgcagctgctggagtctggacctgaggcgaagaagcctggagagacagtcaggatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaactgctggaatgcagtgggtgcaaaagatgccaggaaagggtttgaagtggcttggctggataaacaccaactctgaagttccaaaatatgcagaagacttcaggggacggtttgccttctctttggagacctctgccagcactgcatatttacagataagcaacctcaaaaatgaggacacggctacgtttttctgtgcgagatcttttacttgggggactatggactattggggccaagggaccccggtcaccgtctcctcaactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcttctagagatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagacccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagccaggccagtctccaaaactcctgatctacaaggtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctcaaagaattccagaatgcgctgttagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcagagctcgacatccagatgacccagaccacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagaaattatttaaactggtatcaacagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaagttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaggatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtggacgttcgctggaggcaccaaactggaactgaagcgcgctactagtggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttcttctagagaggtgaagctggtggagtctggacctgagctggtgaagcctggagcttcaatgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattcactggctacaccatgaactgggtgaagcagagtcatggaaagaaccttgagtggatgggacttattaatccttacaaaggtgttagtacctacaaccagaagttcaaggacaaggccacattaactgtagacaagtcatccagcacagcctacatggaactcctcagtctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatcggggtactacggtgatagtgactggtacttcgatgtctggggcgcaggaacctcagtcactgtctcctca发明详述在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
本发明所构建的趋化因子SLC的N末端十八肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体的融合蛋白是通过基因工程重组的方法构建的，即具有吸引T淋巴细胞和树突状细胞的能力，又具有激活T淋巴细胞杀伤肿瘤的功能。具体地，本发明所述的趋化因子SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白是将具有趋化能力的CC家族趋化因子SLC的N末端十八肽经(GGGGS)2连接肽与抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体串联而成的分子。本发明选用具有趋化能力的CC家族趋化因子SLC的N末端十八肽，而未用SLC全分子，这就避免因分子过大造成后续的纯化和用药的困难。在十八肽和双特异抗体之间加入连接肽，可以保证两部分都能正确折叠，行使正常的功能。在双特异抗体的C端加上C-myc标签和组氨酸标签(参考文献28，29)，便于活性的检测和纯化。该融合蛋白具有以下优点1.利用CC家族趋化因子SLC的N末端十八肽的趋化能力可吸引大量的T淋巴细胞和树突状细胞到相应的部位；2.发挥卵巢癌双特异抗体的功能，激活T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞。
本发明所述的纯化，是采用DEAE阴离子交换树脂和Ni亲和柱耦连，首先将胞内可溶表达产物，经过DEAE阴离子交换层析，使大部分杂蛋白被吸附在DEAE柱上，而趋化因子SLC的N末端十八肽与双特异抗体的融合蛋白随流穿液流出，而后流穿液过Ni亲和柱进一步除去残留的杂蛋白，纯度可达90％。
本发明的技术方案如下首先将载体pTMF酶切处理，与片段c-myc-his6相连而成pTMFMH。而后将载体pTMFMH双酶切与扩增的BHL-1相连构建pTCMBO，接着将pTCMBO酶切、补平，再酶切；十八肽两条互补链在适当温度退火形成双链片段，随后与处理好的载体连接构建p18TBHL。质粒p18TBHL转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自美国Invitrogen公司)，用IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(购自宝生物工程(大连)有限公司)进行低温诱导表达，表达产物超声上清用DEAE阴离子交换柱(法码西亚公司)和Ni亲和柱(法码西亚公司)纯化。SDS-PAGE和免疫印记检测表达纯化情况。用趋化实验检测纯化产物对刺激过的外周血淋巴细胞的趋化作用。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测纯化产物的抗原结合活性，单色流式细胞术(FACS)检测其对肿瘤细胞和淋巴细胞的结合活性。MTT法(四甲基偶氮唑蓝法)检测纯化产物介导T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞的效果。双色FACS法检测纯化产物介导T淋巴细胞对卵巢癌细胞的杀伤。
应当指出，在本说明书的上下文，尤其是“实施例”部分的公开内容的基础上，本发明的其它方面和优点对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。


图1.构建SLC的N末端18肽和卵巢癌双特异抗体融合蛋白的质粒图。SLC的N末端18肽以NcoI和XhoI构建到卵巢癌双特异抗体BHL的N末端，在融合蛋白的C末端有检测标签C-myc和纯化标签6His。
图2.融合蛋白表达纯化图。第一泳道，表达产物超声上清；第二泳道，DEAE流穿；第三泳道，DEAE洗脱；第四泳道，Ni柱上样样品；第五泳道，Ni柱流穿；第六泳道，Ni柱洗涤；第七泳道，Ni柱洗脱；第八泳道，低分子量蛋白标准(上海生物化学研究所)。
图3.检测纯化的融合蛋白。第一泳道，纯化的融合蛋白；第二泳道，预染蛋白分子量标准。
图4.趋化试验结果图。SLC，18T-BHL，18T，BHL，BSA在0.1，1，10，100，1000，10000nM时对外周血单个核细胞PBMC的趋化作用。
图5.BHL和18T-BHL对SKOV3膜抗原结合的ELISA检测。两种样品的浓度分别为20，10，5，2.5，1.25，0.625和0.3125μg/ml，图中曲线Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被SKOV3膜抗原，分别加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。图中曲线Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被SKOV3膜抗原时，加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。
图6.BHL和18T-BHL对PBL膜抗原结合的ELISA检测。两种样品的浓度分别为20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125μg/ml，图中曲线Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被PBL膜抗原，分别加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。图中曲线Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被PBL膜抗原时，加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。
图7.BHL和18T-BHL对Jurkat膜抗原结合的检测。两种样品的浓度分别为20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.3125μg/ml，图中曲线Ag-18T-BHL和Ag-BHL表示不包被Jurkat膜抗原，分别加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。图中曲线Ag+18T-BHL和Ag+BHL表示包被Jurkat膜抗原时，加入一定量的18T-BHL和BHL的结果。
图8.18T-BHL和BHL对SKOV3细胞结合的FACS鉴定，图中带阴影的峰是不加样品18T-BHL和BHL的对照样品测定结果，不带阴影的峰是添加18T-BHL和BHL的样品测定结果。其中左边的图是BHL的测定结果，右边的图是18T-BHL的测定结果。
图9.18T-BHL和BHL对Jurkat细胞结合的鉴定，图中带阴影的峰是不加样品18T-BHL和BHL的对照样品测定结果，不带阴影的峰是添加18T-BHL和BHL的样品测定结果。其中左边的图是BHL的测定结果，右边的图是18T-BHL的测定结果。
图10.18T-BHL和BHL对PBL细胞结合的鉴定，图中带阴影的峰是不加样品18T-BHL和BHL的对照样品测定结果，不带阴影的峰是添加18T-BHL和BHL的样品测定结果。其中左边的图是BHL的测定结果，右边的图是18T-BHL的测定结果。
图11.MTT检测不同浓度的18T-BHL和BHL介导的T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的结果。效应细胞和靶细胞的比率为10∶1时，浓度分别为80，40，20，10，5，2.5，1.25，0.625μg/ml的18T-BHL和BHL介导的T淋巴细胞对靶细胞SKOV3的杀伤结果。
图12.PKH26和AnnexinV-FITC双标记被杀伤的肿瘤细胞(SKOV3)的FACS检测结果。效应细胞和靶细胞的比率为10∶1时，18T-BHL和BHL的浓度分别为20，10，1，0μg/ml时介导T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。左上区为PKH26染色的未凋亡的SKOV3细胞，右上区为PKH26和双染色的凋亡细胞。
图13.PKH26和AnnexinV-FITC双标记被杀伤的肿瘤细胞(SKOV3)的FACS检测结果的统计图。BHL浓度为20，10，1，0μg/ml时，凋亡的细胞分别为45.58％，43.54％，28.37％，26.02％。18T-BHL浓度为20，10，1，0μg/ml时，凋亡细胞分别为52.33％57.33％47.04％24.68％。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本说明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1载体pTCMBO的构建。
(1)载体pTMF的处理。
PTMFMH的构建流程。首先将载体pTMF(载体pTMF来源于载体pET28a(+)(Novagen公司)，由本公司将合成的一段多克隆位点取代载体pET28a(+)的多克隆位点构建而成，见参考文献30)用限制性内切酶BamHI(宝生物工程(大连)有限公司，下同)酶切，具体如下取载体pTMF18μl，BamHI 1.5μl，K缓冲液3μl，用ddH2O补足体积至30μl，37℃水浴酶解反应4小时。按照小量胶回收试剂盒(华舜生物技术有限公司产品，下同)说明纯化回收酶切后的DNA。回收产物用Bpul 102I酶切，具体如下pTMF 16μl，Bpul 102I 1.5μl(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)，基本缓冲液3μl，用ddH2O补足体积至30μl，37℃水浴酶解反应4小时。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照小量胶回收试剂盒说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。
(2)片段c-myc-his的制备根据c-myc和his的序列，设计合成两条互补链上游5’aacggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggccgcacatcat3’下游5’gacgcttagcttattgctcgtgatggtgatgatgatgtgcggccccattcagatcctctt 3’两条互补链PCR扩增得到含有酶切位点BamHI和Bpul 102I的互补双链。具体操作如下上游引物2μl，下游引物2μl，PCR缓冲液2μl(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)，dNTP 2μl(上海博亚生物技术有限公司，下同)，pfu酶1μl(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)，H2O 11μl，反应程序95℃变性5min；94℃1min 53℃1min 72℃1min反应25个循环，72℃5min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用小量胶回收试剂盒纯化回收所需的片段。回收的片段分别进行BamHI和Bpul 102I酶切，具体操作参照(1)，小量胶回收试剂盒纯化回收酶切的片段。
(3)载体片段pTMF和片段c-myc-his的连接取回收的双酶切pTMF约40ng，c-myc-his片段约20ng，加入2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液(购自宝生物工程(大连)有限公司，组分如下660mM Tris-HCl(pH7.6)，66mM MgCl2，100mM DTT，1mM ATP，下同)，1μl T4DNA连接酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)，加ddH2O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜(约16小时)。
(4)大肠杆菌感受态细胞的制备用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下从野生大肠杆菌菌株Top10(Invitrogen公司)平板上挑取单菌落，接种于3ml LB(10g/l 胰蛋白胨(GIBCO公司)，5g/l酵母膏(GIBCO公司)，5g/l NaCl，pH7.5)液体培养基中，37℃震荡培养过夜。以1％的接种量转接于40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中10分钟，于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L CaCl2(Sigma公司)中，冰浴放置30分钟，4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2(含20％甘油)重悬细胞，以每管200μl分装备用。不及时使用的各管于-70℃保存。
(5)重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定10μl连接产物加入到200μl的感受态细胞Top10中，轻轻混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中2-5分钟，然后加入800μl不加抗生素的液体LB培养基，轻轻混匀，37℃轻摇培养复苏45-60分钟。取200μl培养液涂布于LB(含50μg/ml Km)平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，用BamHI和Bpul 102I双酶切，能切下大约87bp的片段，即初步确定为阳性克隆；同时，进行PCR鉴定。引物序列如下上游引物5’atagcgatggtggtgcacaggattgctg3’，下游引物5’gacggatccttattgctcgtgatggtgatgatgatgtgcggccccattcagatcctctt，PCR反应参照分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔，冷泉港实验室出版)，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到与预期大小相同的片段，进一步鉴定了插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送上海博亚生物技术有限公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为pTMFMH。
(6)设计一对扩增BHL-I(编码卵巢癌双特异抗体的序列)的引物，分别含有酶切位点XhoI和BamHI。引物序列如下引物1 5’ttctcgaggatgtgcagcctgctggagtc 3’引物2 5’atggatcctgaggagacagtgactgagg 3’以pBHL-I为模板(参考文献10)，PCR反应参照分子克隆，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到1590bp大小的片段。并将片段进行XhoI(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)和BamHI双酶切，小量胶回收试剂盒回收。
(7)pTCMBO的构建将质粒pTMFMH进行XhoI和BamHI双酶切，小量胶回收试剂盒回收，与酶切的片段BHL-I连接，转化大肠杆菌感受态细胞Top10，而后筛选阳性克隆。先进行PCR鉴定，扩增出约1600bp大小的片段，再用XhoI和BamHI对重组质粒进行酶切鉴定，切下1600bp大小的片段。将鉴定阳性的质粒送上海博亚生物技术有限公司测序鉴定，测序正确的阳性质粒命名为pTCMBO。
实施例2载体p18TBHL的构建趋化因子18肽的制备根据SLC的序列，设计合成两条产生N末端18肽的互补链etup5’agcgatggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccg3’etdown 5’ctcgagagaaccaccaccaccagaaccaccaccacccggaattttacgctggctata3’两条互补链PCR扩增得到3’端含有酶切位点XhoI的互补双链。具体操作参照分子克隆指南。用小量胶回收试剂盒回收PCR产物。回收的PCR产物进行XhoI单酶切，酶切反应参照产品说明书，用小量胶回收试剂盒纯化回收酶切的片段。
载体pTCMBO的处理载体pTCMBO先用NcoI酶切(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)，补平，再用XhoI酶切。具体操作如下载体pTCMBO的NcoI酶切，酶切反应参照产品说明书，用小量胶回收试剂盒纯化回收酶切的片段。酶切载体的补平DNA 15μl PCR缓冲液3μl pfu酶1μl dNTP 3μlH2O 8μl，94℃10min 72℃20min，用小量胶回收试剂盒纯化回收补平的片段。补平片段用XhoI酶切酶切反应参照产品说明书，用小量胶回收试剂盒纯化回收酶切的片段。
载体pTCMBO与十八肽的连接取回收的酶切补平载体pTCMBO约40ng，十八肽片段约20ng，加入2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，1μl T4DNA连接酶，加ddH2O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜(约16小时)。
(4)重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定质粒转化参照实施例1的(5)。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒DNA，进行PCR鉴定。引物序列如下上游引物5’agcgatggtgcacaggattgctgcctgaaatatagccagcgtaaaattccg 3’下游引物5’tgaggagacagtgactgaggttc 3’PCR反应参照分子克隆，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到与预期大小相同的片段，将鉴定后的质粒送上海博亚生物技术有限公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒命名为p18TBHL。
实施例3p18TBHL的低温诱导胞内可溶表达(1)将p18TBHL转化大肠杆菌BL21(DE3)按照实施例1的(4)中所述制备感受态细胞的方法，制备大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)感受态细胞。按照质粒提取试剂盒(上海华舜公司)的说明书提取质粒p18TBHL，按照实施例1的(5)进行转化实验。
(2)低温诱导表达将含有p18TBHL的BL21(DE3)涂LB-K平板，37℃过夜培养，然后挑取单克隆，接种于5ml LB-K液体培养基中，在大试管内，37℃摇床培养过夜(200转/分钟)。次日取过夜培养物按1/100的比例转接到250mlLB-K液体培养基中，继续37℃摇床培养(200转/分钟)至A600＝0.6，补加IPTG(购自宝生物工程(大连)有限公司)至终浓度为0.4mmol/ml，继续在30℃培养4小时，进行低温诱导表达。室温12,000rpm离心10分钟，收集菌体，悬于1/5培养体积的缓冲液中，进行菌体超声破碎。经过进一步室温12,000m离心10分钟后，离心上清组分含有胞内可溶表达的趋化因子SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白。因为超声上清可以直接用于纯化和后续的体外活性实验，省去了变性和复性的步骤，大大节约生产成本和时间。
实施例4采用DEAE阴离子交换柱和Ni亲和柱纯化趋化因子SLC的N末端十八肽与双特异抗体的融合蛋白将上述250ml的低温诱导胞内可溶表达产物室温12,000rpm离心10分钟，收集菌体并悬于1/5体积(50ml)的DEAE阴离子交换树脂(法码西亚公司)的平衡缓冲液(10mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH9.0)中，进行超声破碎。然后室温12,000rpm离心10分钟，离心上清直接用于纯化。
将20mlDEAE阴离子交换树脂悬浮在100ml平衡缓冲液中，进行装柱(上海华美公司)，柱的规格为16mm×20cm；然后使用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡，流速为1ml/分钟；将上述超声产物的离心上清直接上柱，上样流速为0.25ml/分钟，收集流穿组分；收集结束后，使用2个柱体积(约40ml)的洗脱缓冲液(500mmol/ml NaCl，50mmol/ml Tris-HCl，pH9.0)进行洗脱，流速为0.25ml/分钟；使用2个柱体积(约40ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，2个柱体积(40m1)1mol/L NaCl进行柱的再生，流速为0.5ml/分钟；最后再使用2个柱体积(40ml)平衡缓冲液平衡柱料，流速为1ml/分钟用于下一次纯化。如果较长时间不使用，必须使用4个柱体积以上的20％乙醇水溶液过柱后，保存在4℃，以免柱料滋生细菌。
将10ml Ni亲和柱料(法码西亚公司)悬浮在50ml平衡缓冲液(50mMNaH2PO4150mM NaCl PH8.0)中，进行装柱(上海华美公司)，柱的规格为10mm×8cm；然后用5个柱体积的平衡缓冲液进行平衡，流速为0.5ml/分钟；将上述DEAE流穿液上柱，上样流速为0.25ml/分钟，收集流穿组分，用平衡液洗至基线；使用2个柱体积的洗涤液(50mM NaH2PO4150mMNaCl PH8.0 20mM咪唑)洗涤柱，收集洗涤组分；用2个柱体积的洗脱液(50mM NaH2PO4150mM NaCl PH8.0250mM咪唑)洗脱，收集洗脱组分，使用2个柱体积(约20ml)0.5mol/L NaOH清洗柱料，最后用水冲洗。如果较长时间不使用，必须使用4个柱体积以上的20％乙醇水溶液过柱后，保存在4℃，以免柱料滋生细菌。
Ni柱的再生，首先用0.2M醋酸(sigma公司)洗涤5个柱体积，用水冲洗；再用0.5M NaOH洗涤5个柱体积，用水冲洗；进而用100mM EDTA(乙二胺四乙酸)鏊合下Ni离子，用足够的水冲洗；然后用200mM NiSO4再生柱3个柱体积，最后用水冲洗掉未结合的Ni离子。
上述收集的各组分，直接进行还原SDS-PAGE，鉴定纯化效果。SDS-PAGE的结果显示经过DEAE阴离子交换和Ni亲和柱纯化，可以去除超声上清中的大部分杂蛋白，使用数字图象分析仪(美国AlphaInnotech公司，AlphaImage 2200 Documentation & analysis system)确定18TBHL的纯度达到90％左右，结果见图2。用免疫印迹的方法检测纯化产物，操作方法参照分子克隆，同样表明产物的纯度很高，结果见图3。
上述纯化样品需要对PBS(磷酸盐缓冲液)(8克NaCl，0.2克KCl，1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调pH至7.4，定容至1升)透析过夜(4℃)。透析体积为500ml，每隔6个小时换一次透析液。采用Bradford法对透析后的样品进行蛋白定量，具体操作按照《精编分子生物学实验指南》(颜子颖，王海林译，金冬雁校，1999，科学出版社，)进行。定量后的样品补加NaN3(Sigma公司)至终浓度0.05％(W/V)，作为防腐剂；补加海藻糖(购自中国科学院微生物研究所)至终浓度0.15mol/L，作为稳定剂。然后分装为1ml/份冻存于-80℃，待用。
实施例5趋化试验(1)外周血单个核细胞(PBMC)的分离将北京红十字中心血站购得的浓白血液用2倍体积的RPMI1640(GIBCO公司，下同)稀释。加3ml淋巴细胞分离液到10ml离心管，而后缓慢加入6ml血液到同一离心管，保持分层不被破坏。2500rpm离心25分钟，出现分层，上层为稀释的血浆，中层为淋巴细胞分离液，下层为红细胞。在上层与中层间的灰白色层为外周血单个核细胞。吸取外周血单个核细胞到50ml离心管，加适量的RPMI1640稀释，而后2000rpm离心5分钟。弃取上清，加适量的RPMI1640重悬细胞，1800rpm离心5分钟。弃取上清，细胞沉淀用适量的RPMI1640重悬，1500rpm离心5分钟。弃去上清，细胞用RPMI1640(含10％的FBS(胎牛血清)(黑龙江江海生物工程技术公司))重悬，调整细胞浓度到1×106，37℃，5％CO2培养箱培养备用。
(2)趋化试验细胞迁移试验在48孔细胞趋化小室中进行(Neuroprobe，USA)。外周血单个核细胞(PBMC)悬浮培养于RPMI1640(含有10％的)，分别经PHA(20mg/L)刺激3天，IL-2(1000kU/L)刺激2天，充分活化后使用。下层孔加入30μl含有不同浓度的各种实验样品，上层孔加入50μl的4×106细胞/ml的细胞悬液。上层孔和下层孔为5μm孔径的无聚乙烯吡咯酮的聚碳酸酯膜(Neuroprobe，USA)所分隔。朝向下层孔的膜面事先用5μg/ml四型胶原蛋白在室温预包被2小时，然后用灭菌水充分洗涤。试验在37℃湿润的环境中(含5％的CO2)进行4小时。而后试验后的聚碳酸酯膜被洗涤，固定，用Liu solution试剂盒染色(Baso Diagnostic Inc.Taiwan)。在高倍镜下(160×)随机选取5个视野记录趋化的细胞数量。计算趋化指数(CI)，趋化指数＝趋化因子作用下趋化的细胞数/迁移到对照孔的细胞数。结果见图4。由图可见SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白对外周血淋巴细胞有较强的趋化能力。
实施例6ELISA方法检测趋化因子SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白的抗原结合活性Jurkat细胞膜抗原的制备收集Jurkat细胞(人急性白血病淋巴瘤细胞)(购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，序号TIB-152)约5×106，1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在0.5ml PBS中，进行超声破碎。将超声破碎液12,000rpm室温离心10分钟后，保留超声上清，使用Bradford法进行蛋白浓度定量。然后补加NaN3至终浓度0.05％(W/V)，作为防腐剂；补加海藻糖(购自中国科学院微生物研究所)至终浓度0.15mol/L，作为稳定剂。后分装为100μl/份冻存于-80℃，待用。SKOV3(购自美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，序号)和PBL(外周血淋巴细胞)参照Jurkat细胞膜抗原的制备ELISA操作步骤(1)包被抗原浓度分别为10μg/ml SKOV3细胞膜抗原；10μg/ml Jurkat细胞膜抗原；10ug/ml PBL细胞膜抗原。包被体积为100μl/孔包被。包被缓冲液配方1.36g Na2CO3，7.35g NaHCO3，950ml水，使用1mol/L HCl或1mol/L的NaOH调pH9.2，补水至1L。PBS 37℃包被2小时或4℃包被过夜。
封闭PBS洗板1-2次后，加入封闭液PBSA(PBS-1％BSA(W/V))，200μl/孔，37℃封闭1-2小时。
(3)加样PBS洗板三次后，加入纯化样品，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。样品使用方法以20μg/ml的纯化趋化因子SLC的N末端十八肽与双特异抗体的融合蛋白作为起始浓度，进行倍比稀释7个梯度，每个梯度三复孔。
(4)加入第一抗体PBST(PBS-0.05％Twen-20(V/V))洗板三次后，以封闭液1/1000稀释自制兔抗抗体，37℃孵育1-2小时。
(5)加入第二抗体PBST洗板三次后，以封闭液1/1000稀释标记的羊抗兔IgG(购自华美公司)，100μl/孔，37℃孵育1-2小时。
(6)显色PBST洗板5次后，添加显色液(48.6ml 0.1M柠檬酸，51.4ml0.2M Na2HPO4加水至1L，pH5.0，配成底物缓冲液；10ml底物缓冲液中加入4mg OPD即邻苯二胺((Sigma公司)，15μl 30％H2O2配成显色液)，100μl/孔，室温避光显色15-30分钟。
(7)终止反应添加终止液(1mol/L HCl)，50μl/孔。
(8)测定结果在490nm读取吸光值。
ELISA结果见图5-7。由图可见对于SKOV3膜抗原，SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白有着与卵巢癌双特异抗体相似的结合能力，对于Jurkat和PBL膜蛋白，SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白的结合能力强于卵巢癌双特异抗体。
实施例7FACS(流式细胞术)方法检测融合蛋白与肿瘤细胞的结合活性首先采用间接FACS方法检测融合蛋白对肿瘤细胞SKOV3的结合。
具体操作如下(1)培养、收集肿瘤细胞SKOV3细胞的培养条件均为液体培养基RPMI1640(GIBCO公司)，10％FBS(黑龙江江海生物工程技术公司)，5％CO2，37℃孵箱培养。在细胞生长至对数期后，收集细胞5×105个。
(2)将上述细胞1,000g离心10分钟后，使用PBS悬浮细胞，再次1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有10μg/ml融合蛋白和双特异抗体BHL的PBS中，4℃放置30分钟。每种细胞均设立不加抗体的同型对照，该对照以下各步均与待测样品同样操作。
(3)1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有1/10000稀释兔抗抗体PBS中，继续4℃放置30分钟。
(4)1,000g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在100μl含有1/1000稀释FITC偶联羊抗鼠IgG(BD公司)的PBS中，继续4℃放置30分钟。
(5)流式细胞仪(BD公司，FACS Calibur)检测，激发光为488nm，每次收10,000个细胞。
上述实验结果见图8。由图可见SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白与卵巢癌双特异抗体对SKOV3细胞有相似的结合能力实施例8FACS(流式细胞术)方法检测融合蛋白与外周血淋巴细胞(PBL)和Jurkat细胞的结合活性我们还采用直接FACS的方法检测融合蛋白对外周血淋巴细胞(PBL)和Jurkat细胞的结合活性。具体实验操作参照实施例7。
上述实验结果如图9和10所示。由图可见对Jurkat和PBL细胞，SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白的结合能力比卵巢癌双特异抗体强。
实施例9MTT融合蛋白介导T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞SKOV3的活性我们以与双特异抗体BHL发生特异结合的卵巢癌细胞SKOV3为靶细胞(Target cells)，以PBL为效应细胞(Effect cells)，在体外按照一定的效靶比(靶细胞/效应细胞，E/T)混合，同时添加一定浓度的融合蛋白和卵巢癌双特异抗体BHL，然后在37℃培养48小时，再采用MTT方法测定肿瘤细胞的存活情况。以此检测二者介导T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞SKOV3的活性。具体操作如下(1)提取收集PBMC，具体操作与实施例5的(1)相同。
(2)培养收集SKOV3细胞，具体操作与实施例6相同。
(3)使用RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)调整效应细胞(PBMC)和靶细胞(SKOV3)的浓度固定SKOV3细胞的密度为1×105个/ml，100μl/孔加入到96孔细胞培养板(Nunc公司)中。同时添加PBL，100μl/孔加入到上述细胞培养板中，使效靶比为10。同时使用RPMI1640培养基调整18TBHL和BHL的浓度。以50μl/孔加入已经加有效应细胞和靶细胞的96孔细胞培养板中，然后在37℃的CO2(5％)培养箱中，培养48小时。每种样品均为4复孔。同时每种效靶比均设立不加抗体的阴性对照，单独效应细胞或靶细胞的阴性对照以及不加任何细胞的培养基阴性对照。
(4)将细胞培养基弃掉后，使用PBS(300μl/孔)洗板一次，再加入MTT(Sigma公司)溶液(浓度200μl/孔)，37℃孵育4小时后，使用PBS(300μl/孔)洗板一次，加入DMSO(二甲基亚砜，200μl/孔)(Sigma公司)37℃孵育30分钟后，测定A600。
(5)特异杀伤率(specific cytolysis)的计算公式为特异杀伤率(％)＝[A600(E/T)-A600(E/T/A)]/[A600(E/T)-A600(M)]×100％A600(E/T)每种效靶比不加抗体的阴性对照孔的A600测定值；A600(E/T/A)每种样品的A600测定值；A600(M)不加任何细胞的培养基阴性对照的A600测定值。
MTT杀伤结果见图11。由图可见SLC的N末端十八肽与卵巢癌双特异抗体的融合蛋白介导外周血淋巴细胞杀伤SKOV3细胞的功能稍强于卵巢癌双特异抗体。
实施例9流式检测融合蛋白介导T淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞SKOV3的活性1.靶细胞标记PKH26(1)使用新鲜无血清培养基(RPMI1640)洗涤靶细胞，室温400g离心5分钟。将靶细胞沉淀悬浮在250μl的重悬缓冲液中，并吹打均匀，尽量成为单细胞悬液。
(2)将PKH26250×稀释在250μl的重悬缓冲液(10-6M)(3)将两者混合后，立即吹打均匀，室温反复倒转，混合2-5分钟。
(4)加入500ul的1％BSA或FBS，充分混匀，并放置1分钟。
(5)加入1ml完全培养基，含有10％FBS。
(6)室温400g离心10分钟，使用1ml完全培养基洗三次。最后将细胞悬浮在1ml完全培养基中。
2.杀伤试验及凋亡检测(1)使用新鲜完全培养基(RPMI1640)将样品稀释到一定浓度，以一定体积加入到U形底96孔细胞培养板。
(2)使用新鲜完全培养基(RPMI1640)将PKH26标记和未标记的靶细胞均稀释至106ml，并且10μl/孔加入到U形96孔细胞培养板中。
(3)使用新鲜完全培养基(RPMI1640)将效应细胞稀释至2×106/ml，并以50μl/孔加入到96孔细胞培养板中，使效靶比为10∶1。
(4)室温250g离心5分钟，在37℃孵育3-4小时。
(5)将平行孔细胞合并在一个1.5ml的离心管中，400g离心10分钟。细胞沉淀使用PBS洗一次，将细胞沉淀悬浮在100μl结合缓冲液中。
(6)每管加入3-5ul AnnexinV-FITC(异硫氰酸荧光素，Fluoresceinisothiocynate)，室温细胞沉淀悬浮在400μl结合缓冲液中。
(7)FACS检测。FITCFL1，PKH26FL2。
结果如图12-13所示。由图可见融合蛋白介导外周血淋巴细胞杀伤卵巢癌细胞SKOV3的能力稍强于卵巢癌双特异抗体。
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Ala Arg Ser Phe Thr Trp Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr130 135 140Pro Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly145 150 155 160Gly Ser GIy Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Val Val Met Thr Gln Thr165 170 175Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys180 185 190Arg Ser Ser Gln Thr Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His195 200 205Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys210 215 220Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly225 230 235 240Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp245 250 255Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe260 265 270Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Glu Phe Gln Asn Ala Leu Leu275 280 285Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val290 295 300Glu Val Ser Glu Leu Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu305 310 315 320Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln325 330 335Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr340 345 350Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro355 360 365
Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile370 375 380Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly385 390 395 400Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys405 410 415Arg Ala Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly420 425 430Gly Gly Ser Ser Arg Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu435 440 445Val Lys Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr450 455 460Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys465 470 475 480Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr485 490 495Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser500 505 510Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser515 520 525Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp530 535 540Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser545 550 55权利要求
1.一种趋化小肽与双特异抗体的融合蛋白。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于趋化小肽是CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽。
3.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于双特异抗体是抗肿瘤×抗CD3双特异抗体。
4.权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于所述抗肿瘤×抗CD3双特异抗体是抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体。
5.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于该融合蛋白是由CC家族趋化因子SLC(次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)2连接肽、抗卵巢癌×抗CD3双特异抗体依次连接而成。
6.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所编码，其C末端可以任选地带有C-myc和His6标签。
7.一种表达载体，其特征在于包含权利要求1-6中任何一项所述融合蛋白的编码基因。
8.权利要求7所述的载体，其是p18TBHL。
9.含有权利要求7或8所述载体的宿主细胞，优选大肠杆菌。
10.一种纯化权利要求1-6中任何一项所述融合蛋白的方法，其特征在于联合采用DEAE阴离子交换树脂和Ni亲和柱进行纯化。
全文摘要
本发明涉及一种趋化小肽与抗肿瘤×抗CD3双特异抗体的融合蛋白，其特征在于由CC家族趋化因子SLC(Secondary lymphoid tissuechemokine，次级淋巴组织趋化因子)的N末端十八肽、(GGGGS)
文档编号C07K1/00GK1958614SQ200510117179
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月1日 优先权日2005年11月1日
发明者黄华樑, 宋景震, 王祥斌, 春雷, 朴锦华, 张众, 林晴 申请人:北京安波特基因工程技术有限公司