专利名称：聚合物结合的抗体癌症治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗剂，其包括结合有多个抗肿瘤抗体的聚合物，以及所述治疗剂在癌症治疗中的应用。
背景技术：
下面对本发明背景的讨论仅仅是被提供用来帮助读者理解本发明，不意图于描述或构成本发明的现有技术。
单克隆抗体(MABs)已经成为人类恶性淋巴瘤和其它癌症的重要治疗模式。针对CD20标志物的抗体产品RITUXAN、ZEVALIN和BEXXAR，已经得到美国FDA的批准，用于淋巴瘤治疗。这些试剂的应用正在帮助肿瘤学家设计更加有效的方案。
CD20是一种非糖基化的33-37KD的磷蛋白，表达于＞95％的正常和赘生性B细胞上(1)。从发育的前B期到最终分化为浆细胞，CD20表达于细胞表面。单核细胞、静息和活化的T细胞、裸细胞以及非淋巴细胞始终是CD20阴性的(2)。CD20的氨基酸序列提示，它由四个跨膜区组成，氨基和羧基末端均位于质膜的胞质侧(3)。目前认为CD20起钙离子通道的作用，用以引发细胞内信号，并且调节细胞生长和分化(4)。
CD20以高表面密度在恶性淋巴瘤细胞上的表达为针对这种细胞表面靶标开发MAbs提供了理论基础。此外，在抗体结合之后，CD20没有显示出内化或调制的趋向(5)。
RITUXAN(通用名利妥昔单抗)是针对CD20的嵌合单克隆抗体。在临床上，给予利妥昔单抗在25-50％的患者中诱导客观治疗反应(6)。为了了解对利妥昔单抗的差异反应，已努力研究了其抗肿瘤活性的潜在机制和每一机制的相对贡献。已经显示，CD20和抗-CD20抗体如利妥昔单抗的连接激活与CD20非共价缔合的酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，从而诱导磷脂酶C-γ(PLCγ)的酪氨酸磷酸化(7、8)。而且，已经显示，交联CD20和抗-CD20二抗(例如，羊抗鼠抗体(GAM))，从细胞内储备中动员出钙离子(9)。有趣的是，不同的抗-CD20抗体对CD20的功能有不同的影响。例如，抗体IF5刺激B细胞周期从G0转变为G1(10)，而抗体B1抑制B细胞在促有丝分裂剂刺激后从细胞周期的G1期进展到S/G2+M期(4)。已显示，这些差异与抗CD20抗体将CD20抗原移位到去污剂不溶性脂微域的能力相关，所述脂微域通常被称作“筏(rafts)”，在触发细胞内信号或激活细胞溶解型补体中，这是必须的(11-14)。
Harjunpaa等人(15)和Manches等人(16)已经报道，直接补体杀伤作用是利妥昔单抗给予的快速和有效的效应物机制，但在近来，Weng和Levy(16)提出了不同的结果，表明利妥昔单抗的治疗活性和补体防御分子CD55或CD59的表达水平不相关。因为这些结果，CDC在利妥昔单抗治疗中的作用受到质疑，并且在利妥昔单抗治疗期间观察到的补体消耗可能事实上反映了毒性而不是疗效。
近来研究了用利妥昔单抗抗体或带有FcR的巨噬细胞或浸润肿瘤的其它辅助细胞对CD20的交联而引发的、导致凋亡和细胞死亡的细胞内事件的作用(9、18、19)。临床研究表明，表达FcγRIIIa的高亲和力变体(158V同种异型)的患者对利妥昔单抗的反应好于携带低亲和力158F同种异型的那些患者(20)。作为一般机制，也已报道了B-细胞表面抗原和其它抗原，包括表面IgM(21、22)、独特型(23)、CD19(24)、CD21(28)、CD22(9)和HER-2(28)以及主要组织相容性复合体(MHC)II类抗原(25)引起小鼠和人B细胞的细胞周期停滞和/或凋亡。与抗-IgM或抗-MHC II类分子抗体结合可以直接诱导B淋巴细胞凋亡，而抗-CD19、CD20和CD22抗体仅在包含与第二抗体(例如，羊抗鼠抗体或GAM)交联的附加步骤时诱导凋亡(26)。在表达CD20的淋巴瘤细胞中，通过用EGTA或细胞内钙螯合剂Bapta AM进行Ca2+螯合处理，用GAM抗体交联对凋亡产生的诱导显示出显著的降低(9)。
发明概述 在一方面，本发明提供了由聚合物制成的癌症治疗剂，多个抗肿瘤细胞抗体与所述聚合物连接，所述抗体可以和肿瘤细胞抗原结合。癌症治疗剂诱导肿瘤细胞的凋亡或细胞死亡，癌症治疗剂的抗肿瘤细胞抗体与所述肿瘤细胞结合。该癌症治疗剂不是脂质体或脂质体的一部分。
如此处所用，“肿瘤细胞抗原(tumor cell antigen)”或“肿瘤抗原(tumorantigen)”是指在肿瘤细胞上存在的蛋白质，以及在胎儿期的正常细胞上(癌胚抗原)、出生后在选择的器官中存在，或在许多正常细胞上存在，但是较在肿瘤细胞上的浓度低得多的蛋白质。肿瘤抗原也被称为“肿瘤相关抗原”(TAA)。肿瘤抗原也包含本领域中所称的肿瘤特异性抗原(TSA)(也称作“肿瘤特异性移植抗原或TSTA)。TSA是指肿瘤细胞上存在而在非肿瘤细胞上不存在的蛋白质。TSA通常在感染病毒使得细胞变得永生并且表达病毒抗原时出现。不由病毒诱导的TSAs可以是B细胞淋巴瘤上的免疫球蛋白的独特型或T细胞淋巴瘤上的T细胞受体(TCR)。肿瘤相关抗原(TAA)比TSA更为普遍。
选择用于本发明治疗剂的抗体的一个特征是它们能够诱导肿瘤细胞的凋亡或细胞死亡。在一种实施方案中，抗体的特征是，当其被直接施用于肿瘤细胞时，并不实质地诱导凋亡或细胞死亡，但是当肿瘤细胞结合的抗体通过第二抗体被交联时(例如，羊抗鼠抗体或GAM；参考文献26)或通过加入带有FcR的巨噬细胞被交联时，诱导凋亡或细胞死亡(术语“交联”用在涉及二抗的内容中时，在本领域中也被称作“超交联(hyper-cross-linking)”)。CD19、CD20、CD21、CD22和HER-2的抗体是这种类型抗体的示例。这样的抗体可以被称作交联依赖性肿瘤细胞凋亡诱导抗体。如此处所述，连接有这种抗体的聚合物与不与聚合物连接时的抗体相比，表现出增强的诱导凋亡或细胞死亡的能力。
因此，本发明提供了将抗肿瘤抗体转变为癌症治疗剂的方法，所述抗肿瘤抗体需要第二交联(secondary cross-linking)来诱导该抗体引起的实质性凋亡或细胞杀死，所述癌症治疗剂直接诱导凋亡和肿瘤细胞杀死。根据本方法，抗体如本文所公开地被偶联在聚合物上。
在另一种实施方案中，连接于聚合物的抗体的一个特征是，在直接与肿瘤细胞结合之后诱导凋亡或细胞死亡。这样的抗体包含与表面IgM(21、22)，独特型(23)和主要组织相容性复合体(MHC)II类抗原(25)结合的那些抗体。MHC II类和独特型可以被认为是一种肿瘤相关抗原。
在一种优选实施方案中，聚合物包括3个或更多个这样的抗体。在一种实施方案中，聚合物包括至少5个抗体。在另一实施方案中，聚合物包括至少10个抗体。在又一实施方案中，聚合物包括至少25个抗体。在又一实施方案中，聚合物包括至少50个抗体。在又一实施方案中，聚合物包括至少100个抗体。在再一实施方案中，聚合物包括至少300个抗体，或者包括至少1000个抗体。
在一种优选的实施方案中，聚合物包括3个或更多个抗体结合位点。在一种实施方案中，聚合物包括至少5个抗体结合位点。在另一实施方案中，聚合物包括至少10个抗体结合位点。在又一实施方案中，聚合物包括至少25个抗体结合位点。在又一实施方案中，聚合物包括至少50个抗体结合位点。在又一实施方案中，聚合物包括至少100个抗体结合位点。在再一实施方案中，聚合物包括至少300个抗体结合位点，或者包括至少1000个抗体结合位点。
如此处所用，“聚合物”意味着天然发生的化合物或合成的化合物，其为由连接的一系列重复的简单单体组成的大分子。一个聚合物通常包含至少约50个单体。天然聚合物包含蛋白质、糖类或核酸，以及非天然的水溶性生物相容聚合物。非天然聚合物包含水溶性聚合物如聚乙二醇、聚丙二醇等。聚合物可以用功能基团如羟基、氨基、硫醇和羧基取代。
在一种实施方案中，聚合物的大小是至少1,000道尔顿。在另一种实施方案中，聚合物的大小是至少2,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物的大小是至少3,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物的大小是至少4,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物的大小是至少5,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物的大小是至少6,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物的大小是6,000至8,000道尔顿。在又一种实施方案中，聚合物在1Kd至30Kd之间。
在一种实施方案中，聚合物是同聚物。在另一种实施方案中，聚合物是杂聚物。在又一种实施方案中，聚合物选自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺类树枝状聚合物(PAPAM)，N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)的合成共聚物，和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
在另一种实施方案中，聚合物是可溶性聚合物。在另一种实施方案中，聚合物是线性聚合物。在又一种实施方案中，聚合物是支化聚合物。在另一种实施方案中，聚合物是不可溶性的。
在一种实施方案中，结合于相同肿瘤抗原的抗体被偶联在聚合物上。如果抗体是相同的，则聚合物对于偶联物的抗体部分而言是同聚物。如果抗体是不同的，则聚合物对于偶联物的抗体部分而言是杂聚物。
在另一种实施方案中，结合于相同肿瘤的不同表位的抗体被偶联到聚合物上。在又一种实施方案中，结合于不同肿瘤抗原的抗体被偶联到聚合物上。后两种实施方案对于偶联物的抗体部分而言是杂聚物。因此，聚合物偶联物可以包括与其连接的两种或更多种不同抗体。在这些实施方案的任意方案中，偶联于聚合物的抗体的形式可以不同。因此，聚合物可以与完整抗体和/或抗体片段偶联。而且，聚合物可以与多于一种类型的抗体片段偶联。
在一种实施方案中，抗肿瘤抗体选自抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22。在一种实施方案中，抗CD20抗体是利妥昔单抗。如此处所用，利妥昔单抗是来自转染瘤的嵌合抗CD20抗体，所述转染瘤包括抗CD20，在TCAE 8中，如在ATCC编号69119下保藏的(参见美国专利5,776,456)。在另一种实施方案中，肿瘤抗体选自抗肺、抗乳腺、抗结肠、抗卵巢、抗前列腺和抗肉瘤抗体。
在另一种实施方案中，本发明的癌症治疗剂被用于癌症治疗。本发明的癌症治疗剂可以被用来降低个体的肿瘤体积或减慢个体的肿瘤生长，包括给予有效量的试剂，其中所述试剂靶向于体内肿瘤。
本发明的又一方面是降低或抑制遭受癌症个体中的转移(metastasis)发展的方法，包括给予有效量的癌症治疗剂，其中所述试剂在体内靶向于转移性细胞(metastatic cell)。
在上述治疗方法中，对于治疗特别适合的癌症患者是与年龄匹配的正常个体相比，表现出降低水平的抗体依赖性细胞介导细胞毒性的患者。ADCC的程度可以如已述地进行测定(24、25)。
在又一方面，提供了鉴定抗体的方法，与不和聚合物连接的抗体相比，在至少两个这样的抗体被连接于聚合物时，所述抗体表现出增强的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。该方法包括，将被期望进行这样的试验的候选抗体连接到不溶性颗粒，以及使连接有抗体的颗粒与肿瘤细胞接触，所述肿瘤细胞表达该候选抗体能够与之结合的抗原。合适的时间后，测定在肿瘤细胞中诱导的凋亡程度。将该凋亡程度与另外一批相同肿瘤细胞中被诱导的凋亡程度相比较，所述另外一批肿瘤细胞是与未连接于任何颗粒的候选抗体接触。在一种实施方案中，与未连接于任何颗粒的抗体相比，应用连接有抗体的颗粒时，诱导肿瘤细胞凋亡的增强的能力被测定为至少2倍的增加，更优选地至少3倍。在另一实施方案中，颗粒是珠子。在又一实施方案中，珠子的直径是约2至约5微米长度之间。更优选地，直径是约3微米长度。
如此处所用，“约”意味着加10％或减10％。如此处所用，“实质地(substantially)”意味着10％或更多、更优选地是20％或更多、更优选地是30％或更多、更优选地是40％或更多，以及更优选地是50％或更多。
图1A-1K显示了在不同的已确立的B细胞淋巴瘤和霍奇金病细胞系中，通过FACS分析得到的CD20表达情况。
图2显示了，在存在Lym-1抗体和对照IgG的情况下，悬浮培养物中的Raji细胞增殖。
图3A-3G显示了，与第二抗体超交联和不与第二抗体超交联的利妥昔单抗和Lym-1抗体(对于利妥昔单抗，第二抗体是羊抗人IgG“GAH”，对LYM-1，是羊抗鼠IgG“GAM”)对悬浮液中的Raji细胞的凋亡诱导。凋亡是通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)复染以及FACS分析评价的。使用对照IgG的Raji细胞染色被显示，用于比较。
图4A-4C显示抗淋巴瘤抗体，LYM-1和利妥昔单抗，以及对照抗体(chTV-1)诱导的悬浮液中的Raji细胞中的DNA片段化。利用检测BrdU的TUNEL分析产生了用FITC-标记抗-BrdU抗体染色的DNA链断裂，随后进行FACS分析。
图5A-5B显示了，用考马斯蓝染色的SDS-PAGE(非还原条件)对聚合物抗体的分析。泳道分子量(MW)(分子量标准是123Kd和204Kd)；泳道a利妥昔单抗；泳道b葡聚糖-利妥昔单抗；泳道c葡聚糖-Lym-1；和泳道dLym-1。
图6显示了，对照IgG、利妥昔单抗、葡聚糖-利妥昔单抗、LYM-1和葡聚糖-LYM-1对Raji细胞悬浮液的凋亡诱导。凋亡是经膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色以及FACS分析证实的。
图7A-7B显示了，静脉给予三日后，利妥昔单抗和葡聚糖-利妥昔单抗在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。结果表示为百分注射剂量/克数(图7A)和肿瘤/正常器官的比值(图7B)。
图8A-8B显示了，静脉给予三日后，LYM-1和葡聚糖-LYM-1在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。结果表示为百分注射剂量/克数(图8A)和肿瘤/正常器官的比值(图8B)。
图9显示了，在Raji异种移植物模型中，利妥昔单抗和葡聚糖-利妥昔单抗免疫疗法。带有0.5cm直径皮下肿瘤的裸鼠被隔日处理3次(箭头，1、3和5天)，通过静脉给予对照IgG、利妥昔单抗或葡聚糖-利妥昔单抗偶联物来实施。肿瘤体积在纵轴上表示，时间在横轴上表示。天数1表示开始处理的时间，这通常是肿瘤移植后14天。
图10显示了，在Raji异种移植物模型中，LYM-1和葡聚糖-LYM-1免疫疗法。细节如图9所述。
图11A显示了，对照IgG、利妥昔单抗、羊抗人IgG(″GAH″)和利妥昔单抗+GAH处理在Raji细胞中诱导的凋亡。凋亡是通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析测定的。
图11B1-B4显示了，对与图11A所述相同地处理的Raji细胞的TUNEL分析得到的凋亡情况。
图12A显示了，用Dynabeads、连接于Dynabeads的对照IgG和连接于Dynabeads的利妥昔单抗处理，在Raji细胞中诱导的凋亡。凋亡是通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色及FACS分析测定的。
图12B1-B3显示了，对与图12A所述相同地处理的Raji细胞的TUNEL分析得到的凋亡情况。
图13A-13C显示了，用多种抗体处理后5小时(左手图)和24小时(右手图)，Raji细胞中的胱天蛋白酶3活性。细胞用产荧光蛋白酶底物Phiphilux，(FL1-H)染色并用FACS评价。
图14A-14B显示了，静脉给予三日后，利妥昔单抗、利妥昔单抗二聚体(二聚体)和葡聚糖-利妥昔单抗聚合物(聚合物)在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布。结果表示为百分注射剂量/克数(图14A)和肿瘤/正常器官比值(图14B)。
图15显示了，利妥昔单抗、利妥昔单抗二聚体(二聚体)和葡聚糖-利妥昔单抗聚合物(聚合物)以及磷酸盐缓冲液(PBS)在Raji异种移植物模型中的免疫疗法。箭头表示通过静脉给予进行的处理。
发明详述 根据本发明的一方面，提供了癌症治疗剂，其包括连接有抗肿瘤细胞抗体的聚合物。癌症治疗剂诱导肿瘤细胞的凋亡和细胞死亡，其中癌症治疗剂的抗肿瘤细胞抗体结合到所述肿瘤细胞上。
如此处所用，“凋亡”是指细胞的生理性死亡或程序性死亡，由特定的形态学特征来表征，所述特征包括细胞和细胞核固缩、细胞质空泡化，以及由于核小体内DNA片段化而造成的浓缩染色质在核膜周围边缘化并产生通过琼脂糖凝胶电泳可见的DNA梯(DNA ladders)。参见，例如，参考文献27。对于宽范种类的癌症，凋亡性细胞杀伤在用特定的抗癌剂处理之后发生。凋亡是免疫B细胞的重要调节机制，并且在恶性转化后仍然有充分的功能。凋亡可以如本文所述和如以前所报道地(参见，例如，美国专利6,368,596)进行测定。
利妥昔单抗抗体与CD20+淋巴瘤细胞的结合没能诱导凋亡至显著的程度(16)。为了增强凋亡，利妥昔单抗可以被超交联，这是通过包含羊抗人/鼠IgG、加入带有FcγR的细胞、或在体外将抗体固定在塑料上来实施的(16-19)。利妥昔单抗的超交联使CD20重新分布到Triton X-不溶性细胞膜信号转导-加工中心(20、21)，随后发生脂膜筏群集(lipid raft clustering)并反式激活Src-家族酪氨酸激酶如Lyn、Fyn和Lyc，这进一步导致淋巴瘤细胞的凋亡(19、22-24)。
Ghetie等人(29)报道，与从药房得到的单体制备物相比，利妥昔单抗的四价同型二聚体在人类恶性淋巴瘤细胞系中能够诱导出更高的凋亡率。在这些研究中，观察到的凋亡率与通过羊抗鼠超交联获得的凋亡率相当，并且当与化疗剂如阿霉素联合测试时，同型二聚体制备物产生明显更好的肿瘤细胞杀伤作用。
认为抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)，特别是Fc:FcR相互作用，是利妥昔单抗疗法的主要效应机制(25、26)。效应细胞上的Fcγ受体似乎对抗CD20抗体在小鼠中的体内活性负责，这通过应用基因敲除小鼠模型被证实，在基因敲除模型中显示，Fc:FcR相互作用对于循环和渗出B淋巴细胞的耗尽是必需的(25)。目前的临床研究集中于FCGR3A基因的二态性，所述基因编码在残基158处具有苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)的FcγRIIIa，它以不同的亲和性(V＞F)与IgG1的低铰链区特异地反应(27-29)。观察到纯合FCGR3A-158V患者具有经历临床反应的更高概率，这支持了Fc:FcR相互作用的关键作用(27、29)。为了使ADCC有效，假定带有Fc受体的细胞必须进入肿瘤微环境，以直接与其靶标接触。如果情况是这样，则带有Fc受体的细胞可以作为ADCC和超交联诱导凋亡的媒介物起作用，以破坏肿瘤。因此，肿瘤相关效应细胞的缺乏可以解释特定患者中的利妥昔单抗失效。应用本发明的抗体聚合物对于ADCC能力降低的个体的治疗性癌症干预是有用的。
本发明的包括抗体如利妥昔单抗的癌症治疗剂代表了高价试剂，在体外和体内试验中，它都是比单体或二聚体制备物更有效的凋亡诱导物。由于其可溶性质，聚合物连接的利妥昔单抗是已经在CD20+Raji异种移植物中显示出好的肿瘤靶向和治疗潜能的临床相关试剂。含有多个抗肿瘤抗体的可溶性聚合物提供了显著改进的基于抗体的免疫疗法，特别是在具有低亲和力FcγR同种异型的患者中。
抗肿瘤抗体可以用美国专利6,368,596中描述的氚标记胸苷掺入试验来鉴定，所述抗体被表征为，当不与第二抗体交联(或与带有Fc受体的巨噬细胞接触)时，不能诱导实质性的凋亡或细胞死亡。被表征为在二级诱导的交联之后凋亡或细胞杀伤增强的抗肿瘤抗体包含抗CD19、抗CD20、抗CD21、抗CD22和HER-2。在一种实施方案中，抗CD20抗体是利妥昔单抗。其它抗体包含针对多种癌中的任意癌的抗体，所述癌包含肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢、前列腺癌以及肉瘤。其它此类抗体在美国专利6,368,596中有所描述，或者可以通过本文公开的方法容易地被鉴定。
CD19(也称为B4抗原)是95Kd的B细胞标志物，其通过抗-CD19抗体(例如，抗体FMC63)来检测，包括这些抗体的嵌合形式。Zola等人，Immunol Cell Biol.69(Pt6)411-22(1991)；Pieterxz等人，Cancer Immunol Immunother.41(1)53-60(1995)。CD19是B谱系特异性的并且表达于早期B细胞前体、前-前-B细胞、前-B细胞、B细胞、中间B细胞、成熟B细胞和一些浆细胞样细胞。浆细胞和骨髓瘤细胞是CD19阴性的。
CD21是补体片段C3d、C3dg或ic3D并且也是EBV的受体(约145Kd)。CD21也是CD23的配体并且参与IgE合成。抗CD21抗体已经被描述。已报道，结合于B细胞的抗CD21抗体保护细胞免遭凋亡。Bonnefoy等人Eur.J.Immunol.23,969-972(1993)。
CD22是人类B淋巴细胞上表达的130Kd蛋白质。CD22的人源化抗体(例如，Epratuzumab，Amgen，CA)已经被描述。Carnahan等人，Clin Cancer Res.9(10Pt2)3982S-90S(2003)。正常T细胞、多形核白细胞、单核细胞和血小板是CD22阴性的。细胞系SB、Raji和NALM-1如CALLA-ALL一样是阳性的。CLL和NHL的表达型是可从弱阳性到阴性变化的。PLL是明显阳性的，毛细胞白血病是非常强阳性的。
原癌基因Her-2/neu(C-erbB2)已被定位在染色体17q并且编码跨膜酪氨酸激酶生长因子受体。Her-2/neu基因的蛋白产物在25-30％的乳腺癌中被过表达，并且在约90-95％的这些情形中，增量调节是基因扩增的直接结果。HER2的抗体可以阻断肿瘤的增殖信号通路，这导致肿瘤生长的抑制和肿瘤细胞凋亡的诱导。参见，例如，Clin.Cancer Res.81720-30(2002)；Brodowicz等人Br.J Cancer851764-70(2001)；Crombet-Ramos等人，Int.J.Cancer101567-75(2002)；Herbst等人，Expert Opin.Biol.Ther.1719-32(2001)。HER-2抗体在以前已被描述过(参见，美国专利6,054,561；5,169,774；4,938,948；4,753,894；6,387,371；6,399,063；6,627,196；6,821,515；6,719,971和美国专利6,800,738。
如此处所用，术语“蛋白质”是指可以从天然来源分离的、或应用重组DNA技术从分离的cDNA产生的一条或多条多肽。如果一个蛋白质包含多于一条多肽，则这些多肽通过共价和/或非共价力作为单个分子结合在一起(即，多聚体)。由多条多肽组成的蛋白质的一个例子是含有重链和轻链的抗体。术语蛋白质包含具有其它化学实体的蛋白质如糖蛋白、蛋白聚糖、脂蛋白和类似物。
如此处所用，术语“核酸”一般指多脱氧核糖核苷酸(含2′-脱氧-D-核糖或其修饰形式)、多核糖核苷酸(含有D-核糖或其修饰形式)，也指作为嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其它类型的多核苷酸。
如此处所用，术语“纯化的”在谈及多肽(或蛋白质)时，并不要求绝对纯净。相反，它代表了这样的提示，感兴趣的多肽(例如抗体)处于分立的环境中，在该环境中，所述多肽相对于其它蛋白质的丰度(以质量为基础)大于在生物学样品中的丰度。“分立的环境”是指单一介质，如单一溶液、单一凝胶、单一沉淀物等。纯化的多肽可以通过许多方法获得，包括，例如实验室合成、色谱法、制备电泳、离心、沉淀、亲和纯化等。一种或多种感兴趣的“纯化的”多肽优选地为分立的环境中蛋白质含量的至少10％。一种或多种“基本上纯化的”多肽为分立的环境中蛋白质含量的至少50％，更优选地为分立的环境中蛋白质含量的至少75％，更优选地为分立的环境中蛋白质含量的至少95％。可以用牛血清白蛋白作为蛋白标准，用Hartree，Anal Biochem 48422-427(1972)描述的、对Lowry等人J.Biol.Chem.193265，1951中的方法的修改来测定蛋白质含量。
可以用本发明方法治疗的癌症包含癌、肉瘤以及白血病和淋巴瘤以及其它类型的癌症。癌包含肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌和类似癌症。对于治疗为优选的癌症是淋巴瘤。
偶联有抗体的聚合物优选地是可溶性聚合物。它优选地是约1,000道尔顿或更大。聚合物可以是同聚物或杂聚物。聚合物可以选自葡聚糖、聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺类树枝状聚合物(PAPAM)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)，和类似物。参见Ulbrich等人(2002)Materials Structure 10(1)3。水溶性非抗原性聚合物可以如美国专利6,113,906中所述被应用。水溶性聚合物载体可以是可生物降解的。聚合物可以是多肽。
聚合物的分子量可以从1,000至30,000。聚合物的大小优选地是约6,000-8,000道尔顿或更小。
可以用本文描述的化学方法以及本领域中已知的其它化学方法将抗体偶联于聚合物。连接化学术可以复制用于制备半抗原载体偶联物或药物载体偶联物的化学策略，其中，抗体与半抗原或药物类似，聚合物与载体类似。
多个肽或蛋白质分子可以被连结到单个改性聚乙二醇(PEG)聚合物上，如Jones等人，Bioconjugate Chem.(2003)14，1067-76所述。具体地，聚乙二醇聚合物的一个末端或两个末端被修饰，以使各自包含两个、四个或八个氨基氧基团。也公开了连接四个改性PEG聚合物分子以便提供对四个肽或蛋白质分子的连结的连接结构。偶联物是通过在PEG的氨基氧基团和多肽的N-末端乙醛酸化区域之间形成肟键而制备的。Jones等人描述了β2GPI的B细胞表位的偶联物，目的是诱导B细胞对β2GPI的耐受。相关的美国专利6,458,953描述了类似的化合物(带有或不带有PEG)，它们用作用于连结包括抗体在内的生物分子的多价平台。肽或蛋白质可以通过多种键如硫醚键被连结到该平台上。然而，偶联于抗肿瘤细胞抗体的PEG聚合物的制备还没有被描述过，所述抗体用于诱导肿瘤细胞的凋亡。也可以用5,670,132、5,234,903和5,234,903中描述的方法实施对抗体的PEG偶联。
在用于进行偶联的抗体的属性以及抗体与偶联物的比例方面，本发明的聚合物偶联物不同于以前已知的那些偶联物。在以前的研究中，聚合物被偶联于抗体，但比例是每个抗体带有多于一个聚合物。与之不同，本发明的聚合物抗体偶联物是每个聚合物带有多于一个抗体。单个聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多个抗体。在另一实施方案中，单个聚合物包括至少3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000或更多个抗体结合位点。
如此处所用，术语“抗体”包含免疫球蛋白，免疫球蛋白是B细胞的产物及其变体，以及T细胞受体(TcR)，T细胞受体是T细胞产物及其变体。免疫球蛋白是包括一条或多条多肽的蛋白质，所述多肽基本上由免疫球蛋白κ和λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因编码。轻链被分类为κ链或λ链。重链被分类为γ链、μ链、α链、δ链或ε链，它们分别依次定义出免疫球蛋白的种类，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。重链的亚类也是已知的。例如，人类的IgG重链可以是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类中的任意一类。
已知典型的免疫球蛋白结构单位包括四聚体。每一四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对多肽链具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端限定出主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体以全长的完整抗体(二价体)存在，或者以经各种肽酶或化学品消化产生的许多被很好地表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区的二硫键下游消化抗体，产生F(ab′)2，F(ab′)2是Fab的二聚体，Fab本身是通过二硫键连接于VH-CH1的轻链。F(ab′)2可以在温和条件下被还原，铰链区的二硫键断裂，从而将F(ab′)2二聚体转变为Fab′单体(单价)。Fab′单体实质上是带有部分铰链区的Fab片段(对于其它抗体片段的更详细描述，参见Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。虽然多种抗体片段是根据完整抗体的消化来限定的，但技术人员将理解，多种抗体片段中的任意抗体片段可以通过化学方法从头合成或通过重组DNA方法合成。因此，如此处所用，术语抗体也包含通过完整抗体的修饰或从头合成产生的抗体片段或者应用重组DNA方法得到的抗体和片段。
重组抗体可以是常规的全长抗体、来自蛋白水解消化的已知抗体片段、独特的抗体片段如Fv或单链Fv(scFv)、结构域被删除的抗体，和类似抗体。片段可以包括少至一个或几个氨基酸被删除或突变的结构域或多肽，而更广泛的缺失也是可能的，如一个或多个结构域的缺失。
Fv抗体的大小是约50Kd，包括轻链可变区和重链可变区。单链Fv(″scFv″)多肽是共价连接的VH::VL杂二聚体，它可以由包含VH和VL编码序列的核酸表达，VH和VL编码序列或是直接连接或是经肽编码接头连接。参见Huston等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，855879-5883。许多结构用于将抗体V区的天然聚集、但化学上被隔离的轻链和重链多肽链转化为scFv分子，所述分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上相似的三维结构。参见，例如，美国专利5,091,513，5,132,405和4,956,778。
抗体可以是非人抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，后者包括人抗体序列和非人抗体序列。如本领域已知，嵌合抗体是通过交换非人抗体恒定区(重链、轻链或两者)和人抗体恒定区制备的。参见，例如，授予Cabilly等人的美国专利4,816,567。从非人抗体如鼠抗体制备人源化抗体的方法也是公知的(参见，例如，授予Winter的美国专利5,565,332)。
抗体可以共价或非共价地连接于聚合物。如此处所用，“连接”意味着，在生理条件的pH、离子强度和渗透压下，所述实体的大多数平衡地彼此相连。共价连接可以通过多种化学交联剂中的任意交联剂形成，包括例如，同型双功能交联剂或异型双功能交联剂，其中的许多是可以经商业途径得到的(参见，例如，PierceChemical Co.或Sigma Chemical Co.)。交联可以通过本领域中熟知的许多化学术实现，包括例如，活化的聚乙二醇、醛、异氰酸盐、马来酰亚胺和类似物。从抗体制备二聚体和多聚体的进一步描述提供在实施例中。
可以用重组表达方法，如本领域熟知的例如在原核或真核细胞中的重组表达方法制备抗体(参见，例如，美国专利5,116,943和6,331,415)。一般而言，可以将编码抗体的核酸克隆入表达载体，用于高产量地表达编码产物。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包含表达序列盒，编码抗体的核酸被克隆入所述序列盒，与启动子和任选地增强子可操作地相连。表达序列盒也可以包含其它特征，如复制起点和/或染色体整合元件如反转录病毒LTRs或腺相关病毒(AAV)ITRs。如果需要抗体分泌，则可以将编码信号序列的DNA放在编码成熟抗体氨基酸的核酸上游。可以将编码用于协助随后的纯化(例如，组氨酸标签)或协助标记抗体的、短的蛋白质序列的DNA包含在抗体编码核酸中或抗体编码核酸的末端。
适于复制和支持抗体重组表达的细胞是本领域中熟知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导这种细胞，并且可以使大量的含载体细胞生长，用于接种大规模发酵罐，得到临床应用的足够量的蛋白质。这样的细胞可以包含原核微生物如大肠杆菌，或多种其它真核细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞，或类似细胞。在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。
可以将本发明的癌症治疗剂用于在遭受癌症的个体中的癌症治疗。因此，本发明的另一方面是降低个体中的肿瘤大小或减缓个体中肿瘤生长的方法，包括给予有效量的本发明组合物，其中所述癌症治疗剂定位于个体中的癌细胞。本发明的又一方面是降低或抑制遭受癌症的个体中的转移进展的方法，包括给予有效量的本发明组合物，其中所述癌症治疗剂定位于个体中的转移性癌细胞。
可以通过耗尽或失活个体中的免疫调节T细胞，增加应用本发明癌症治疗剂的治疗有效性。如此处所用，术语“免疫调节T细胞”是指，直接或间接起作用，以抑制宿主对肿瘤的免疫应答的T细胞群。免疫调节T细胞可以是CD4+，CD25+，或这两种标志物均是阳性。
如此处所用，术语“耗尽或失活(depleting or inactivating)”是指有效降低免疫调节T细胞介导的免疫系统抑制的方法。这样的方法可以从个体去除(耗尽)细胞，或可以使细胞功能失活，所述的细胞功能导致抗肿瘤免疫应答的抑制。耗尽或失活免疫调节T细胞的方法无需仅限于此类细胞，而是可以作用于其它类型的免疫细胞。
免疫调节T细胞通过本领域熟知的多种方法中的任意方法被耗尽或失活。例如，可以通过流式细胞术或通过采用例如装填有抗体的柱子或过滤器的免疫吸附细胞去除，将这样的细胞从个体的循环中去除。这样的柱子或过滤器含有特异于CD4抗原的抗体和/或特异于IL-2受体(例如CD25)的抗体。耗尽或失活免疫调节T细胞也可以通过给予个体抗CD4和/或抗CD25特异性抗体来实施。可以用一种或多种抗体，优选地是人抗体或人源化抗体。例如，可以应用与IL-2受体(CD25)的α亚基结合的人源化单克隆抗体Daclizumab或巴利昔单抗(basiliximab)(嵌合抗体)(均来自Novartis Pharma AG)。完全的人抗体HuMax-CD4，由GenMab制备。抗CD40配体也可以被用来耗尽或失活免疫调节T细胞。
耗尽或失活免疫调节T细胞的处理可以被重复。而且，不同的方法可以一起使用(免疫吸附细胞去除和体内抗体给予)。为了耗尽或失活而被给予的抗T细胞抗体的量可以和移植领域中应用的量类似。参见，例如，Meiser等人，Transplantation.(1994)27；58(4)419-23。
免疫调节T细胞可以在给予本发明的癌症治疗剂之前、期间和/或之后被耗尽或失活。免疫调节T细胞优选地在给予本发明的癌症治疗剂之前被耗尽。
在又一实施方案中，本发明用于癌症治疗的方法可以包括免疫细胞的过继性转移，用以增强抗肿瘤免疫。这些方法优选T细胞，其可以被离体活化，用以增强它们支持抗肿瘤免疫应答作用的能力。被过继性转移的免疫细胞可以用多种熟知试剂中的任意试剂被离体活化，包括，例如，暴露于IL-2和/或抗CD3抗体。离体活化也可以包含暴露于癌细胞疫苗。这样的癌细胞疫苗可以是活的(但不复制)或被杀死的癌细胞，它们来自待治疗的个体或完全来自其它癌症。疫苗也可以是癌细胞提取物或来自癌细胞的纯化的疫苗制备物。癌细胞疫苗是本领域熟知的，并且可以根据熟知的方法制备。
被过继性转移的T细胞可以在给予本发明的癌症靶向剂组合物之前、期间和/或之后被给予。被过继性转移的T细胞优选地在给予本发明的癌症靶向剂组合物之后被给予。在这种治疗形式中，患者接受多次T细胞输注，所述T细胞是经IL-2(62)或其它试剂如抗CD3+和抗CD28+抗体(63)离体刺激之后得到的。
在一些实施方案中，通过结合耗尽或失活免疫调节T细胞的方法和过继性转移免疫细胞的方法，可以使应用本发明癌症治疗剂的疗法的有效性得以增加。在这样的实施方案中，有利的是，在耗尽或失活免疫调节T细胞的步骤之后进行过继性转移。
本发明的癌症治疗剂可以以用药学上可接受的载体配制的药物或药剂给予。因此，化合物可以用于药剂或药物组合物的配制。本发明的药物组合物可以被配制为溶液或冻干粉末，用于肠道外给予。可以通过在使用之前加入合适的稀释剂或其它药学上可接受的载体，对粉末进行重构。液体制剂可以是缓冲的、等张的水溶液。粉末也可以以干燥形式被喷雾。合适稀释剂的例子是普通等张盐溶液，标准的5％葡萄糖水溶液，或缓冲醋酸钠或醋酸铵溶液。这样的制剂特别适于肠道外给予，但也可以用于经口给予或包含在计量吸入器或喷雾器中用于吸入。可能需要加入赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯树胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、柠檬酸钠和类似物。
可选地，化合物可以被包囊、压片或制备于乳剂或糖浆中，用于经口给予。可以加入药学上可接受的固体或液体载体，以增强或稳定组合物，或协助组合物的制备。固体载体包含淀粉、乳糖、二水合硫酸钙、白土、硬脂酸镁或硬脂酸、云母、果胶、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。液体载体包含糖浆、花生油、橄榄油、盐水和水。载体也可以包含缓释物质如单独应用或带有蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量是变化的，但是优选地，将为每剂量单位约20mg至约1g。药物制备物按照制药学常规技术制备，对于片剂形式，在需要时，涉及研磨、混合、颗粒化和压缩；或对于硬明胶胶囊形式，涉及研磨、混合和装填。应用液体载体时，制备物可以是糖浆、酏剂、乳剂或含水或非含水悬浮液。对于直肠给予，本发明的化合物可以和赋形剂如可可脂、甘油、明胶或聚乙二醇结合并模塑为栓剂。
可以将本发明的化合物配制为，包含其它医学上有用的药物或生物试剂。化合物也可以和用于本发明化合物所涉及的疾病或状态的其它药物或生物试剂的给予联合应用。例如，本发明的癌症治疗剂可以和其它凋亡诱导剂如放射线或化疗剂(例如，阿霉素；参见美国专利6,090,365)联合。
如此处所用，短语“有效量”是指提供足以对其接受者施加有益效果的足够高浓度的剂量。对于任何特定对象而言，具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包含被治疗的疾病、疾病的严重程度、具体化合物的活性、给予路径、化合物的清除率、治疗的持续时间、与化合物联合应用或同时应用的药物、对象的年龄、体重、性别、饮食，和对象的一般健康状态，和医学领域及医学科学中熟知的类似因素。在确定“治疗有效量”中被考虑的各种一般事项是本领域技术人员已知的，在例如Gilman等，eds.，Goodman And Gilman′sThe PharmacologicalBases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；和Remington′s PharmaceuticalSciences，17th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1990中有描述。剂量水平典型地落入约0.001至100mg/kg/日的范围；通常应用的水平是约0.05至10mg/kg日范围。化合物可以被肠道外给予，如血管内、静脉内、动脉内、肌内、皮下或类似地给予。给予也可以是经口、经鼻、经直肠、经皮或通过气雾剂吸入。化合物也可以作为丸剂给予，或缓慢输注。
可以通过确定IC50从细胞培养物试验初步估计治疗有效剂量。随后，可以在动物模型中配制剂量，用以达到一定的循环血浆浓度范围，所述范围包含如在细胞培养物中测定的IC50。可以用此类信息更加精确地确定人类中的有用剂量。血浆中的水平可以，例如，通过HPLC测定。确切制剂、给予路径和剂量可以由各医生根据患者的状态进行选择。
下列实施例用来解释本发明。这些实施例不意图于限制本发明的范围。
实施例 实施例1材料和方法 1.试剂 分子生物学试剂购自New England BioLabs(Beverly，MA)或BoehringerMannheim(Indianapolis，IN)。免疫学试剂和交联剂购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)或Pierce Biotechnology(Rockford，IL)。已表征和透析(diaylyzed)的胎牛血清购自Hyclone Laboratories(Logan，Utah)。碘-125和碘-131获自DuPont/New England Nuclear(North Billerica，MA)。BALB/c鼠和无胸腺裸鼠购自Harlan Sprague Dawley(San Diego，CA)。
2.抗体和细胞系 嵌合抗-HLA-Dr MAb(chLym-1)如上所述根据已公开的结果制备(41)。IDEC Pharmaceuticals(San Diego，CA)开发的嵌合抗-CD20 MAb(利妥昔单抗)获自药店。用于超交联试验的羊抗人IgG(Fc特异性)购自Caltag laboratories(Burlingame，CA)；用于免疫荧光显微术研究的异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的羊抗鼠F(ab′)2购自ICN-Cappel(Aurora，OH)，用于测定CD20表达的藻红蛋白(PE)标记的抗-CD20抗体购自BD Pharmingen(San Diego，CA)。
Raji细胞系(42)和其它北美和非洲伯基特淋巴瘤细胞系(B35M，DG-75，RAMOS，Chevallier)获自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，MD)。Farage、Granda 519和L540淋巴瘤以及霍奇金病细胞系获自DSMZ德国保藏中心(Braunschweig，Germany)。SU-DHL-4、SU-DHL-6、SU-DHL-10、SU-DHL-16和NU-DHL-1人B淋巴瘤细胞系如以前所述被开发(43、44)。所有细胞系在RPMI 1640(Life Technologies，San Diego，CA)中生长，RPMI1640中补充有10％特征胎牛血清(FCS)(Hyclone，Logan，Utah)、1％谷氨酰胺和青霉素(100单位/mL)以及链霉素(100μg/mL)(Gemini Bio-Products，Woodland，CA，USA)抗生素，并且在潮湿的5％CO2培养箱中，37℃，作为静止悬浮培养物被培养。
3.抗体超交联 将Raji细胞(2.5×104)在V-底96孔板中，在5％CO2培养箱中，37℃温育，96孔板中含有系列稀释的Lym-1、chLym-1、利妥昔单抗或其它抗体。随后用RPMI1640洗涤细胞2次，并将细胞分为试验组和对照组。随后将试验组细胞与25ug/ml羊抗人(GAH)IgG(对于嵌合Lym-1和利妥昔单抗MAbs)或羊抗鼠(GAM)IgG(对于鼠Lym-1)温育，体积是100μl/孔。18小时之后，用膜联蛋白V-FITC/PI染色，如下所述地测定凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露情况。
4.利用免疫荧光显微术进行的交联分析 通过免疫荧光显微术观察用不同抗体制备物处理的细胞表面上的抗原交联程度和型式。对于这些研究，用每一抗体制备物20μg在37℃处理5×105Raji细胞，用稀释于PBS中的2％多聚甲醛(Polysciencs，Inc.Warrington，PA；Cat.No.4018)室温固定，随后用PBS(1％BSA)洗涤2次。随后用25μg GAM F(ab′)2(ICN-Cappel)温育被固定的细胞，4℃ 30分钟，随后用PBS(1％BSA)洗涤2次。对于二抗羊抗鼠IgG F(ab′)2的超交联研究，用20μg利妥昔单抗在37℃处理5×105Raji细胞1小时。用PBS洗涤细胞2次，并与25μg GAM F(ab′)2温育，4℃ 30分钟。随后用PBS(1％BSA)洗涤细胞2次，随后用2％多聚甲醛在室温固定细胞。然后用PBS洗涤细胞2次。最后，1,250×g 10分钟，制备细胞旋转沉降物(cytospin preparation)，将玻片在Vectorshield中用4′，6′-二氨基-2-吲哚苯(DAPI，Vector Laboratories，Burlingame，CA)固定，用于在相差荧光显微镜(Leitz Orthoplan，Wetzlar，Germany)下，用50×水浸透镜进行观察。
5.胱天蛋白酶(caspase)3活性分析
使偶联有2μg的利妥昔单抗单体、二聚体、聚合物以及利妥昔单抗和同种型对照抗体的Dynabeads与5×104Raji细胞温育。5小时和24小时之后，用PBS洗涤细胞，在40μl的产荧光蛋白酶底物Phiphilux(OncoImmunin Inc.，MD)中重悬浮，并在30℃的水浴中温育40分钟。最后，将细胞重悬浮于制造商提供的培养基中，并立即用流式细胞术分析。
6.通过使用多功能交联剂制备多聚体
多功能交联剂是能够形成多聚聚集体的水溶性试剂(表1)。交联剂诸如戊二醛(45、46)、葡聚糖(47-49)和/或聚酰胺型胺类(PAPAM)树枝状聚合物(50-54)可以被用来制造Mabs的聚合物。
A.戊二醛是五碳二醛，作为交联剂用于多种蛋白质用途中。抗体的亲核基团如巯基和氨基在一步反应中被共价地加在醛基上，形成希夫碱(Schiff base)。简言之，使抗体(利妥昔单抗，1ml)在暗处以5mg/ml的浓度用200ml 8％戊二醛进行透析，其中戊二醛溶于PBS(0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.2)，4℃透析16小时。随后使活化的抗体用PBS(1L PBS，2次，持续几小时)进行透析，以去除过量的戊二醛。剩下的活性戊二醛基团在2小时温育期间被0.2M赖氨酸-HCl(0.1ml)封闭。过量的赖氨酸通过用PBS透析而被去除。随后，将交联的偶联物无菌过滤并进一步进行SDS-PAGE分析。
B.葡聚糖是平均分子量1至500k的葡萄糖聚合物。葡聚糖的邻位羟基可以被氧化为醛基，随后与氨基反应形成希夫碱。
方法1多醛活化的葡聚糖(1∶1利妥昔单抗∶氧化葡聚糖)。葡聚糖与抗体的结合如以前所述通过应用多醛活化的葡聚糖实施(47)。这可以成功地作为多功能交联剂并与MAbs的伯胺反应，形成希夫碱，希夫碱可以通过用硼氢化钠还原进一步得以稳定。简言之，使葡聚糖(100mg，平均分子量6,000，Fluka)和高碘酸钠(120mg，Sigma-Aldrich)溶解在5ml的0.9％NaCl溶液中。暗处温育过夜之后，使化合物通过预平衡的PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％NaCl洗脱。纯化的氧化葡聚糖于4℃保存，该混合物在暗处4℃可稳定2周。同时，使1ml的纯化利妥昔单抗(10mg/ml)通过预平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.1)洗脱。用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.1)将洗脱的利妥昔单抗稀释为4.2mg/ml，随后与氧化葡聚糖混合，二者的摩尔比是1∶1。在暗处连续振荡4小时后，用5mg硼氢化钠(Sigma)还原反应物1小时。最后，使1ml的葡聚糖-利妥昔单抗偶联物通过预平衡的PD-10柱。根据抗体浓度，用UV-分光光度计测定此偶联物的OD值。随后，经非还原SDS PAGE测定交联效率。
方法2多醛活化的抗体。共价结合的一种不同方法利用了抗体的糖部分。这是在两步反应中，通过将葡聚糖-肼复合体偶联于多醛活化的MAbs而实施的。简言之，将纯化的多醛活化的葡萄糖(如上)与0.09g肼单盐酸盐混合并于室温在暗处温育30分钟。将葡聚糖-肼衍生物和三甲胺硼烷复合物(TMAB，5mg)混合并在室温下再温育2小时。最后，使葡聚糖-肼衍生物通过预平衡的PD-10柱，该柱是用0.1M NaAc pH 5.5平衡。多醛活化的利妥昔单抗通过混合300μl的纯化利妥昔单抗(10mg/ml)和1ml pH 7.5PBS中的高碘酸钠(126mg)生成。室温下连续振荡90分钟后，在PD-10柱上纯化氧化的RITUXAMAB(7.14mg/ml，在PBS中)并与葡聚糖-肼复合体(82μl)在暗处室温下混合18小时。用0.1M甘氨酸pH7.5(300μl)在2小时温育期间封闭剩余的活化基团。通过用PBS透析去除过量的甘氨酸，并将交联的偶联物无菌过滤，进一步用SDS-PAGE进行分析。
C.PAPAM是一类新的高度分支的球形聚合物，它是高度水溶性的并且具有大量的表面伯胺基团(50-54)。PAPAM树枝状聚合物与抗体的偶联是通过应用不同代的树枝状聚合物实施的，可以在两步反应过程中成功制备。简言之，在表面拥有8至64个活性氨基的多代树枝状聚合物(G1至G4)(平均分子量是1.7至14.5k)被溶解在PBS中并与杂型双功能交联剂混合。将得到的聚合物偶联物透析过夜，在Sephadex G-25上色谱纯化，经SDS/PAGE和HPLC分析，并进一步表征以确定每一树枝状聚合物分子上的抗体分子数目。
表1.选择的多功能交联剂
7.单体和交联制备物的体外评价
A.凋亡分析
i.膜联蛋白V，PI染色。通过膜联蛋白V，PI染色试验测定抗体偶联物诱导的凋亡百分数，该试验允许直接测定凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露情况和膜完整性的丧失。将系列稀释(约2μg)的Lym-1、chLym-1和利妥昔单抗或包被了利妥昔单抗的Dynabeads(下文论述)加入到2.5×104Raji细胞，随后37℃温育18小时。为了超交联，使200μl培养基中的5×104Raji细胞与2μg利妥昔单抗在37℃温育1小时，随后用PBS(1％BSA)洗涤细胞2次并与5μg GAH(Caltag)在37℃在5％CO2培养箱中温育18小时。用制造商(Oncogene Research Product，Boston，MA，USA)提供的RAPID方案进行膜联蛋白V-FITC和PI染色。简言之，将培养基结合试剂加入细胞，随后与FITC-标记的膜联蛋白V温育15分钟。随后将细胞悬浮在1x结合缓冲液中，在用流式细胞术(FACS-diva，Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)进行样品分析之前即刻，加入碘化丙啶(PI)，以区分早期(膜联蛋白V+/PI-)和晚期(膜联蛋白V+/PI+)凋亡细胞。
ii.TUNEL试验。此试验是用APO-DIRECT试剂盒(Phoenix Flow Systems，San Diego，CA，USA)进行，以测定不同抗体制备物诱导的凋亡性DNA链断裂。简言之，使5×105至1×106个Raji细胞与667ng/ml至66.7μg/ml的每种MAb于37℃在5％CO2培养箱中温育18小时。为了超交联研究，使5×105个Raji细胞与20μg利妥昔单抗在1.5mL中37℃温育1小时。用PBS洗涤细胞2次并进一步用50μgGAH(Caltag)在1.5mL中37℃在5％CO2培养箱中温育18小时。将细胞在PBS中洗涤，在1％多聚甲醛中固定，在70％乙醇中进行渗透性处理。将细胞在70％乙醇中于-20℃保存过夜。用末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)将溴脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(BrdU)偶联于DNA链断裂处，随后用荧光素标记的抗-BrdU抗体对凋亡细胞染色，以便用于FACS分析。细胞中的总DNA通过用PI/RNase复染测定。对于每一样品，用流式细胞术对10,000个细胞进行分析。
8.CD20和HLA-Dr抗原表达的评价
应用标准方法，CD20和HLA-DR10抗原阳性的几种不同的人恶性淋巴瘤(Raji、RAMOS、DG-75、Farage、Granda 519、Chevallier、SU-DHL-4、SU-DHL-10、SU-DHL-16)和霍奇金病细胞系(L540)通过FACs分析被评价，以说明这些抗原在淋巴瘤细胞表面的表达水平。
A.增殖分析。通过细胞增殖试验对所有抗原制备物进行评价。对于此试验，Raji细胞(7.5×104/孔)用67μg/ml的抗体培养，所述Raji细胞悬浮于RPMI-1640培养基(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)中，培养基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。应用血细胞计数器，用台盼兰染料排斥法，在不同时间点评价细胞增殖。对血细胞计数器的四个不同区域进行计数并将其平均，得到数据点。
B.亲和常数(Avidity Constants)的测定。采用以前描述的修定过的氯胺-T方法，用125I对纯化的MAb制备物进行放射性标记(56)。通过传统的固定Raji细胞放射免疫分析对放射性标记蛋白质的体外免疫反应活性进行评价(55)。简言之，使每毫升含有106个细胞的Raji淋巴瘤细胞悬浮液与200μl PBS中的10至110ng的125I标记抗体在室温下温育，同时持续混合。随后用含1％牛血清白蛋白的PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的抗体，并用γ计数器计数。随后通过每管中剩余的细胞结合的放射活性(cpm)和放射性标记抗体的比活性(cpm/ng)确定结合的抗体的量。用斯卡查德作图分析(Scatchard plot analysis)得到斜率。用公式K＝-(斜率/n)计算平衡常数或亲和常数Ka，其中n是抗体的价数(对于单体，n＝2；对于二聚体，n＝4；对于聚合物，n＝10)。
C.体外稳定性。也如以前所述评价体外血清稳定性(56)。简言之，使放射标记的制备物在鼠和/或人血清中于37℃温育48小时。三氯乙酸沉淀和离心之后，用γ计数器测定蛋白结合的放射活性，目的是计算完整融和蛋白的百分数。此外，如上所述对血清温育之前和之后的放射性标记MAbs的体外免疫反应活性进行测定。
9.交联制备物的体内评价
研究了能够在体外诱导有效凋亡的那些制备物的体内生物学活性，以确定它们的药物动力学清除率和生物分布。此外，研究了每一试剂在带有Raji人淋巴瘤的裸鼠中的抗肿瘤活性，通过评价它们对肿瘤生长(肿瘤大小，存活时间)和形态学的影响来实施。
A.药物动力学研究。用以前描述的修改过的氯胺-T方法制备125/131I-标记的蛋白质(41、56)。用6周龄BALB/c鼠来测定所有制备物的全身药物动力学清除(whole-body pharmacokinetic clearance)。将125I-标记的蛋白质(30-40μCi/小鼠)静脉注射给予几组小鼠(n＝5)，所述小鼠事先在饮水中给予碘化钾1周，以封闭甲状腺对放射性碘的摄取。用CRC-7 microdosimeter(Capintec，Inc.，Pittsburgh，PA)测定注射后即刻以及其后选择的时间的全身活性。数据被分析，半衰期值如以前所述地被确定(41、57、58)。
B.生物分布研究。在带有Raji肿瘤的裸鼠中进行组织生物分布研究，以检测选择的每一制备的靶向能力。为了这些研究，用来自铯源的350拉德照射6周龄雌性无胸腺裸鼠，三日后，在左侧腹皮下注射含有1×107Raji淋巴瘤细胞和1×106人胚胎成纤维饲细胞的0.2ml接种物。先前的照射对于减少裸鼠中存在的天然杀伤细胞是有必要的。人胚胎成纤维饲细胞提供VEGF和其它生长因子，这些生长因子促进高肿瘤发生率(90％)。使肿瘤生长10-15日，直至它们的直径达到0.5cm。在每一组中(n＝5)，将含有30-40μCi的125I-标记的蛋白质的0.1ml接种物静脉注射给每只小鼠。在注射后3个不同时间点(24、48和72小时)，用过量戊巴比妥钠处死动物，移去组织，称重，用γ计数器测量。对每只小鼠，将数据表示为注射剂量/克数百分比(％ID/g)和肿瘤/器官比值(每克肿瘤的cpm/每克器官的cpm)。用魏克森秩和检验(Wilcoxon′s rank-sum test)测定显著性水平。
C.疗效研究对于这些研究，将选择的制备物的抗肿瘤活性与未偶联的Lym-1和RITUXAN的抗肿瘤活性相比较，以帮助评价哪种偶联制备物在Raji淋巴瘤/裸鼠模型中最为有效。对于每一制备物，隔日给予几组小鼠(n＝5)0.1ml的两种剂量接种物(25和100μg)，给予3次，通过测径器在三个尺度上的测量进行肿瘤体积监测，每周3次。测定相对于未处理的对照的肿瘤生长的消退或抑制情况，用以说明治疗的效率。所有剂量都是同一技术人员给予的，以保持一致性。记录动物存活时间，并根据已建立的University Vivarium方案，将具有大于2cm直径的肿瘤的那些鼠处死。用魏克森秩和检验进行统计学分析，得到P值。
实施例2结果
1.通过FACs得到的人恶性淋巴瘤细胞系上的CD20表达水平
用FACs分析霍奇金或非霍奇金淋巴瘤细胞系的CD20表达。这些研究的结果显示在图1A-1K中。具有均一高表达的细胞系包括Raji、Farage、SU-DHL-4、SU-DHL-16、Chevallier和Granda 519。发现RAMOS、DG75和SU-DHL-10具有两种形式的表达水平，L540霍奇金氏病细胞系的CD20表达是阴性的。
2.抗-HLA-DR Lym-1对Raji淋巴瘤细胞增殖的影响
将Raji细胞(7.5×104/孔)在存在67μg/ml的Lym-1或阴性对照IgG(chTV-1)的情况下进行培养，Raji细胞悬浮于RPMI-1640培养基中(Life Technologies，Inc.，San Diego，CA)，培养基中含有10％特征胎牛血清(Hyclone Laboratories，Logan，UT)。用血细胞计数器在多个时间点评价细胞增殖，通过台盼兰染料排斥确定细胞存活。在第3天时更新培养基和抗体。如图2所示，与对照抗体相比较，发现Lym-1抑制Raji细胞增殖。
3.有和没有超交联时Lym-1和利妥昔单抗对Raji细胞的凋亡影响
A.膜联蛋白V/PI染色。用膜联蛋白V-FITC和PI复染分析每一MAb诱导凋亡的能力，所述分析分别检测磷脂酰丝氨酸(PS)在凋亡细胞上的暴露情况和细胞膜完整性的丧失。如图3A-3G所示，Lym-1能够以剂量依赖方式诱导Raji细胞凋亡(使用单剂量时呈现出的数据)。在这些试验中，利妥昔单抗对凋亡的诱导几乎没有影响。然而，利妥昔单抗的超交联显著改进了其诱导Rai细胞凋亡的能力，如图3所示。用对照IgG染色的Raji细胞被显示以进行比较。
B.TUNEL试验。如图4A-4C所示，TUNEL试验的FACs分析显示出由Lym-1诱导的广泛凋亡，但利妥昔单抗和chTv-1没有诱导广泛调亡。
4.聚合物结合的抗体对凋亡的诱导
RITUXAN和Lym-1被结合于葡聚糖，葡聚糖是一种可溶的、多分支的、刚性聚合物。对于这些研究，将葡聚糖(200mg，平均分子量是10,000 Sigma-Aldrich)和高碘酸钠(240mg，Sigma，Aldrich)溶解在10ml的0.9％NaCl溶液中。暗处温育过夜后，使混合物通过预平衡PD-10柱(Pharmacia)并用0.9％ NaCl洗脱。将纯化的氧化葡聚糖于暗处4℃保存。同时，用碳酸氢钠缓冲液(0.1M，pH 8.1)透析100μlLym-1(23.6mg/ml)、利妥昔单抗(10mg/ml)和无关的IgG(chTV-1，11.8mg/ml)过夜。将透析的Lym-1、利妥昔单抗和chTV-1与氧化葡聚糖以不同摩尔比混合(1∶1和1∶2)。暗处连续振荡6小时后，用含有5mg硼氢化钠(Sigma)的PBS还原反应物。最后，用PBS透析每一葡聚糖-抗体偶联物过夜。根据抗体的浓度测定每一偶联物的OD值。随后通过非还原SDS凝胶测定交联效率(图5A-5B)，其显示，连接于葡聚糖聚合物之后，葡聚糖-Lym-1、葡聚糖-利妥昔单抗和葡聚糖-chTV-1(阴性对照)的分子量比非偶联抗体显著增加。
使Raji细胞与增加浓度的试剂在37℃于5％ CO2培养箱中温育18小时。随后用膜联蛋白V/PI对每一样品进行染色，并使每一样品经历FACs分析，如上所述。对于单一剂量，这些研究的结果显示在下面的图6中。用1∶1的偶联比例，用667ng/ml浓度的葡聚糖-Lym-1，得到73％的凋亡。这些结果和图3D-3F中所看到的用非偶联的鼠Lym-1获得的凋亡水平大致相同。特别地，当浓度增加至6.7μg/ml时，得到100％凋亡(数据未显示)。与之不同，葡聚糖-利妥昔单抗制备物显示出对凋亡诱导的显著改进，从非偶联利妥昔单抗(667ng/ml)的约13％至相同浓度的葡聚糖-利妥昔单抗的约30％(偶联的比例是1∶2)。当应用更高浓度的葡聚糖-利妥昔单抗时(6.7μg/ml)，凋亡的诱导增加至52％。在这些试验中，葡聚糖-chTV-1阴性对照不诱导任何显著水平的凋亡，这说明这种现象是抗体相关的。这些结果说明，结合于多分支刚性聚合物如葡聚糖的抗-CD20可以直接诱导凋亡。因此，聚合物/抗体偶联物可以模仿通过加入对于抗-CD20诱导调亡为必需的第二GAM所产生的交联事件。
5.葡聚糖-利妥昔单抗在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中进行生物分布研究，以测定葡聚糖-利妥昔单抗聚合物靶向肿瘤和跳过非靶向的正常组织及器官的能力。如图7A所示，相比相同剂量的单独的利妥昔单抗，葡聚糖-利妥昔单抗在肿瘤中显示出增强的摄取。显著地，在脾和肺中仅观察到摄取的轻度增加，这两个部位具有活性网状内皮系统。这些数据说明，葡聚糖-利妥昔单抗聚合物在体内是药学上可行的，并且与非偶联利妥昔单抗相比，肿瘤靶向性质得到改进。尽管不希望受限于任何理论，对葡聚糖-利妥昔单抗的增强的摄取可能归因于更长的血清半衰期，因为对两种试剂而言，观察到的肿瘤/正常器官比值大约相同(图7B)。
6.Lym-1和葡聚糖-Lym-1在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的生物分布
也用Lym-1和葡聚糖-Lym-1进行了比较性生物分布研究。图8A-8B中显示的3日生物分布分析说明，两种试剂的摄取或分布几乎没有差异。
7.葡聚糖-RITUXAMAB在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治疗效应的增强
进行体内研究，以确定葡聚糖-利妥昔单抗对凋亡诱导的增强是否也对裸鼠中已确立的异种移植Raji肿瘤产生改进的治疗效果。如图9所示，应用已述的3次剂量隔日给予的治疗方案，在此肿瘤模型中，应用葡聚糖-利妥昔单抗，清楚地看到临床效应的剂量依赖性增强。葡聚糖-利妥昔单抗引起的肿瘤减轻比相同蛋白质剂量的单体利妥昔单抗更显著。
8.Lym-1和葡聚糖-Lym-1免疫疗法在带有Raji淋巴瘤的裸鼠中的治疗效应
图10中显示的用Lym-1和葡聚糖-Lym-1进行的比较性研究证明，基于聚合物的制剂没有改进此抗体的临床效应，按照例如图6中看到的体外研究，此抗体已经显示出对凋亡的明显诱导。与对照处理鼠相比，天然Lym-1和聚合物-Lym-1均产生非常有效的肿瘤抑制。
结合于聚合物的抗-CD20(利妥昔单抗)显示出对CD20阳性人淋巴瘤细胞系的早期和晚期凋亡诱导的显著增强，这类似于用超交联方法所看到的结果。当在体内测试时，这种制剂变化使得抗-CD20能够在模型中成为有效的试剂，在所述模型中，由于裸鼠的免疫缺陷状态，ADCC是忽略的。这些结果说明，如果抗体经聚合物配制以多聚体的形式被提供，则凋亡的诱导可以成为经CD20的肿瘤杀伤的重要机制。
实施例3.用同型双功能交联剂和异型双功能交联剂制备的抗体二聚体
1.同型双功能交联剂。这些交联剂有两个相同的活性基团(表2)并且在一步反应过程中被使用，以结合2个MAb分子(Park等，J.Biol.Chem.261205-210，1986；Browning等，J.Immunol.1431859-1867，1989)。同型双功能交联剂包括硫代-EGS和/或硫代-DST，它们用于结合两个MAb分子，而不破坏抗体的S-S键并且不应用苛刻的还原剂。硫代-DST是水溶性类似物，可用于在一步反应中制备同型二聚体。这种交联剂通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与MAbs的伯胺基团反应，形成共价酰胺键。硫代-EGS是水溶性类似物，能够在一步反应中通过形成共价酰胺键，经伯胺基团交联MAbs。与DST相比，EGS具有降低空间位阻效应的延伸的间隔臂。根据制造商(Pierce)的指导和根据以前描述的优化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)，将所有的MAbs交联起来。偶联之后，将反应混合物透析过夜并在Sephadex G-25上色谱纯化。将不同级分浓缩、过滤，并进一步通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高压蛋白色谱(HPLC)进行分析，以确定纯度和每一接头的抗体分子数目。
2.异型双功能交联剂。这些交联剂有两个不同的活性基团，其允许与蛋白质的特定基团相继偶联(表3)，这使得不需要的聚合和自偶联最小化(Samoszuk等人，Antibody，Immunoconj.& Radiopharm.237-45，1989；Duncan等人，Anal.Biochem.13268-73，1983)。两种异型双功能交联剂如硫代-SMCC和SATP被用于通过稳定的硫醚键相继结合于两个MAbs。二聚体是在两步反应过程中形成的。a.SATP是可用于将受保护的SH基团引入MAbs的试剂，并且为SH基团提供了更大空间自由度。稳定的共价酰胺键是根据制造商(Pierce)的指导由NHS酯和MAbs的伯胺的反应形成的。脱保护以形成SH键是通过使用羟胺的脱乙酰化作用完成的(不应用还原剂)。b.硫代-SMCC是水溶性交联剂类似物，由NHS酯和用限制空间位阻的间隔臂连接的马来酰亚胺基组成。NHS酯与伯胺反应，马来酰亚胺与SH基团反应。NHS反应首先根据制造商(Pierce)的指导和根据以前描述的优化方法(Khawli等人，Cancer Biother & Radiopharm.11203-215，1996；Sharifi等人，Q.J.Nucl.Med.42242-249，1998)被实施，随后除去过量的交联剂，随后加入带有SH基团的组分(MAb-SATP)，通过形成稳定的硫醚键完成交联。
将衍生的MAbs(MAb-SMCC和MAb-SATP)混合在一起并在室温下温育2-3小时。将最终的混合物透析并在Sephadex G-25柱上色谱纯化。将不同级分浓缩、过滤，并进一步通过SDS/PAGE和HPLC进行分析，以确定纯度和每一接头的抗体分子数目。
实施例4.通过使用三功能交联剂制备三聚体
三功能交联剂是相对新的形式的偶联剂，每一分子具有三个不同的活性基团或配位基团(表4)。交联剂如硫代-TSAT和TMEA被用来结合三个MAb分子。
1.硫代-TSAT是新的三功能交联剂，用于在一步反应过程中制备三聚体。此交联剂是水溶性类似物，经N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯与MAbs的伯胺基团反应，形成共价酰胺键。2.TMEA是三功能交联剂，可用于在两步反应中制备含SH蛋白的三聚复合体。异型双功能接头如SATP首先被用于将SH基团引入MAb(如上所述)，随后加入TMEA。交联是通过马来酰亚胺(在TMEA上)与SH基团反应形成稳定的硫醚键而完成。
所有的三聚抗体都是根据制造商的指导(Pierce)制备的。偶联之后，将反应混合物透析过夜并在Sephadex G-25上色谱纯化。如上所述将不同级分浓缩、过滤，并进一步通过SDS/PAGE和HPLC进行分析。
表2同型双功能交联剂(从商业来源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)
表3.异型双功能交联剂(从商业来源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)
表4.三功能交联剂(从商业来源得到，包括Pierce、Sigma和Fluka)
实施例5.包被有利妥昔单抗的DynabeadsM-280的制备
按照制造商的方案，将利妥昔单抗包被在甲苯磺酰基活化的DynabeadsM-280(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)上。简言之，用PBS洗涤7×108Dynabeads两次，与500μl的200μg利妥昔单抗或同种型对照抗体温育，同时持续旋转，30℃，18-20小时。随后用磁珠吸引器(Dynal Biotech Inc.，Brown Deer，WI)使Dynabeads沉积，通过用UV分光光度计(Ultraspec 2000，Pharmacia，Piscataway，NJ)测定280nm处的OD值，对上清液中的未偶联的抗体进行定量。偶联于Dynabeads的抗体总量通过公式计算(总抗体-未偶联的抗体＝珠子上的偶联抗体)。用PBS和1％(w/v)BSA洗涤包被有抗体的Dynabeads 2次，随后用端对端旋转(end-to-end rotation)，用封闭溶液(0.2M Tris-HCl pH 8.5；0.1％BSA)处理自由甲苯磺酰基基团，37℃，3-4小时，用PBS(0.1％BSA，1％ Tween-20)洗涤两次，随后再用PBS(0.1％ BSA)洗涤两次。最后，将偶联有抗体的Dynabeads重悬浮于PBS(0.05％叠氮钠)中并于4℃保存。使用前通过洗涤去除叠氮钠。
实施例6.葡聚糖-利妥昔单抗聚合物的产生(1∶2.4利妥昔单抗∶氧化葡聚糖) 将100mg葡聚糖(平均分子量是6,000Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)和120mg高碘酸钠(Sigma，St Louis，MO)溶解在5mL的0.9％NaCl溶液中并于暗处室温下温育18h。使混合物通过预平衡的PD-10柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，用0.9％NaCl洗脱，于暗处4℃保存。使2mL利妥昔单抗(10mg/mL)通过预平衡的PD-10柱并用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.1)(Sigma)洗脱。用0.1M碳酸氢钠缓冲液(pH 8.1)将洗脱的利妥昔单抗稀释为5mg/1ml，与480μg氧化葡聚糖以摩尔比1∶2.4(利妥昔单抗∶氧化葡聚糖)混合。暗处持续振荡6小时后，用5mg硼氢化钠(Sigma)还原反应物1小时，随后在PBS中透析。随后使透析物通过0.22μm的非热源性注射滤器(Costar，Coming，NY)，并应用Pharmacia AKTA System(FPLC；(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)使葡聚糖利妥昔单抗混合物通过在PBS中预平衡的Superose 6柱，流速为0.5mL/分钟，从而进行分级分离。一般地，聚合物的驻留时间是约16分钟。用Centricon YM-100(Millipore)进一步浓缩聚合物级分，0.22μm过滤除菌，并通过SDS/PAGE进行分析。蛋白质在非还原条件下通过SDS/PAGE进行分析，浓缩胶是4％，分离胶是5％。通过考马斯蓝染色可见蛋白质条带。
实施例7.利妥昔单抗同源二聚体的产生
用两种异型双功能交联剂SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代-乙酸酯，(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)和SMCC[琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯](Pierce)产生利妥昔单抗的同源二聚体(28、29)。
1.用SMCC衍生化处理。使浓度为5mg/mL的5mg利妥昔单抗与2.5μlSMCC(9.3mg/mL，溶于二甲基亚砜)室温下温育1小时，同时持续旋转，SMCC/利妥昔单抗的摩尔比是4.5，其中利妥昔单抗溶于0.05M磷酸盐缓冲液中，缓冲液中含有3mM Na2EDTA(PBE；pH 7.5)。在相同PBE缓冲液中在PD-10柱上通过层析纯化偶联的蛋白质。
2.用SATA衍生化处理。使PBE缓冲液中浓度为5mg/mL的5mg利妥昔单抗与2.5μL SATA(5.8mg/mL，溶于二甲基亚砜)混合，于室温下温育1小时，SATA/利妥昔单抗的摩尔比是4.0。随后通过在PD-10柱上的层析移去过量的SATA，用5mg的羟胺-HCl(Sigma)对纯化的蛋白质脱乙酰基，室温下进行5分钟。通过在PD-10柱上的层析去除过量的羟胺-HCl。
3.利妥昔单抗同源二聚体形成和生理特征
将SMCC-和SATA-衍生蛋白质混合在一起并温育，室温下持续旋转1-2小时。将制备物在PBS中4℃透析过夜，通过0.22μm非热源性过滤器(Costar，Coming，NY)过滤除菌，用上述Pharmacia AKTA在Superose 6柱(FPLC)上进一步分级分离，流速是0.5mL/分钟。
一般地，通过FPLC，聚合物显示的驻留时间大约是16分钟，而二聚体显示的驻留时间大约是29分钟。应用Centricon YM-100(Millipore，Billerica，MA)使来自FPLC的蛋白质级分进一步浓缩，过滤灭菌，并用SDS/PAGE分析。通过非还原SDS-PAGE，对该二聚体制备物观察到了预期的利妥昔单抗二聚体分子量。以鼠IgM作为标准(970kDa)，应用2％琼脂糖凝胶测定聚合物的大小。通过本方法，确认一条带是利妥昔单抗聚合物，其略高于IgM，所述IgM的分子量对应于约5个免疫球蛋白分子。
实施例8.利妥昔单抗二聚体和利妥昔单抗聚合物(1∶2.4利妥昔单抗∶氧化葡聚糖)的比较结果
1.利妥昔单抗制备物的亲和研究
进行亲和结合研究，其中使125I-标记的利妥昔单抗制备物与Raji淋巴瘤细胞温育，通过斯卡查德分析法(Scatchard analysis)用结合的放射活性计算亲和常数(Ka)。应用此方法，发现利妥昔单抗聚合物的亲和常数是3.16×108M-1，而单体和二聚体的亲和常数分别是3.6×108M-1和2.09×108M-1。这些研究表明，利妥昔单抗聚合物和二聚体对抗原的结合亲和性与利妥昔单抗本身相似，这有利于随后在体外和体内进行直接比较。
2.利妥昔单抗制备物对凋亡的诱导
在37℃单独应用利妥昔单抗或应用超交联利妥昔单抗处理Raji淋巴瘤细胞18-20小时。凋亡的量通过膜联蛋白V/PI染色(图11A)和TUNEL试验(图11B1-B4)测定。在本试验中，利妥昔单抗单体在Raji细胞中仅诱导最小水平的凋亡，膜联蛋白分析中是约26％，TUNEL试验中是约2.99％。图11B1-4中膜联蛋白分析中的利妥昔单抗单体的背景凋亡高于图6所示，差异可能是由于一段时间内的分析误差产生的。与之相比，GAH超交联利妥昔单抗引起更高水平的凋亡(膜联蛋白分析中是约50％，TUNEL分析中是约30.41％；图11A和图11B-14)。偶联于甲苯磺酰基活化的Dynabeads(直径是2.8μm)的利妥昔单抗诱导出最佳的凋亡水平，所述水平通过膜联蛋白V/PI染色和TUNEL试验检测(分别是约96％和83.28％；图12A和12B1-B3)。
用凋亡试验来分析利妥昔单抗聚合物和二聚体诱导凋亡的能力。TUNEL试验显示，利妥昔单抗聚合物诱导57.8％的凋亡，而二聚体仅产生2.99％(结果未显示)。
多种利妥昔单抗制备物的凋亡诱导量在10种不同细胞系中得以测试，所述细胞系包括10种CD20+细胞系和2种CD20-细胞系。结果显示在表5中。
表5.利妥昔单抗单体、二聚体和聚合物制备物对CD20阳性和阴性细胞系的凋亡诱导，通过膜联蛋白V测定。
1平均荧光强度2非存活细胞百分数
在CD20+细胞系中(Raji，B35M，Ramos，Farage，Granda 519和Chevallier)，与二聚体或单体处理的那些细胞相比，利妥昔单抗聚合物处理的细胞中的凋亡显著增加。然而，不是所有利妥昔单抗聚合物处理的CD20+细胞都表现出显著的凋亡。认为这些淋巴瘤细胞系中的一些细胞可能具有不同的关联于CD20连接的细胞内途径。在用不同利妥昔单抗制备物处理的任意CD20-细胞系中均没有检测到明显凋亡，这很可能是由于抗体结合的缺乏。
3.免疫荧光显微术研究
在用第二抗体FITC-偶联的羊抗鼠F(ab′)2染色之前，使利妥昔单抗单体、二聚体和聚合物与Raji细胞温育，随后用2％多聚甲醛固定。此外，通过在用2％多聚甲醛固定之前，用利妥昔单抗和FITC-偶联的羊抗鼠F(ab′)2先后处理细胞，研究超交联的影响。结果表明，利妥昔单抗单体和二聚体处理产生环状形式的免疫荧光，表明CD20平均分布在淋巴瘤细胞的表面。与之不同，发现用利妥昔单抗聚合物或利妥昔单抗+二抗处理的细胞有更加分离的极性染色型，这与CD20移动和固定入脂膜筏一致。这些结果表明，CD20在脂膜筏中的群集和固定与凋亡诱导一致。
4.胱天蛋白酶3活化研究
如图13A-13E所示，发现用利妥昔单抗单体或二聚体处理的Raji淋巴瘤细胞具基础水平的胱天蛋白酶3活性，与对照相似。与之不同，用利妥昔单抗聚合物或包被了利妥昔单抗的Dynabeads处理的Raji淋巴瘤细胞显示出明显的胱天蛋白酶3活化。对于聚合物处理的细胞，胱天蛋白酶3活性在处理5小时后开始升高，在24小时达到峰值。对于用包被了利妥昔单抗的Dynabeads处理的那些细胞，胱天蛋白酶3活性在处理5小时后达到峰值，在24小时下降。从这些试验中，似乎凋亡的早期诱导与胱天蛋白酶3的更强效活化相关，如在包被了利妥昔单抗的Dynabeads处理的样品中所见。
5.药物动力学和生物分布研究
在BALB/c小鼠中进行全身放射活性研究，以确立125I-标记的利妥昔单抗单体、二聚体和聚合物之间的药物动力学特性差异。从这些研究中确定，125I-利妥昔单抗的T1/2是96小时(p＜0.01)，而二聚体和聚合物表现出更慢的总全身清除，分别是120小时和144小时(p＜0.01)。延长的清除与分子量增加有关。
对生物分布研究，对几组带有Raji的裸鼠静脉注射125I-标记的利妥昔单抗单体、二聚体或聚合物。三日后，处死小鼠，测定每一器官的放射性，计算百分注射剂量/克(％ID/g)和肿瘤/器官比值(每克肿瘤的cpm/每克器官的cpm)。如图14A所示，所有三种利妥昔单抗制备物都有效地定位于Raji人淋巴瘤异种移植物，这产生了大致相似的肿瘤对正常器官比值(图14B)。数据进一步说明了所有三种利妥昔单抗制备物的肿瘤靶向特异性，如观察到的高肿瘤摄取所提示的。
6.免疫治疗研究
如图15所示，对已建立的Raji异种移植物的处理直至第10天肿瘤的大小可以触知时才开始。在接受利妥昔单抗单体或二聚体的这些组的小鼠中，肿瘤生长或是不受影响或是比未处理的对照组中所见的略微缓慢。与之不同，接受利妥昔单抗聚合物的小鼠表现出明显的肿瘤消退。肿瘤移植后28天，聚合物处理组的平均肿瘤体积是PBS处理对照组的肿瘤体积的＜30％(p＜0.01)。考虑到所有这些制备物在此相同肿瘤模型中具有相当的亲和常数和生物分布特性的事实，这些发现特别值得注意。
7.结论
利妥昔单抗对调亡的直接诱导是非常低效率的，除非抗体通过第二抗体被超交联或被固定在塑料上(5-7和19)。与利妥昔单抗单体或二聚体相比，由每一葡聚糖分子至少5个免疫球蛋白组成的利妥昔单抗聚合物显示了体外和体内的效力。与单体或二聚体制备物相比，聚合物在结合后直接诱导CD20+人淋巴瘤细胞系的凋亡。此外，应用单体和二聚体制备物几乎没有效果的剂量的聚合物时，利妥昔单抗聚合物在体内对移植的Raji淋巴瘤要有效得多。值得注意的是，在带有肿瘤的裸鼠中，所有三种抗体制备物对CD20具有基本相同的亲和力，并且表现出相似的药物动力学特性和生物分布特性。
包被了利妥昔单抗的Dynabeads在Raji细胞中诱导最大水平的凋亡，其中＞90％的细胞显示出凋亡。在体内，Dynabead递呈可能类似于带有FcR的细胞。包被了抗体的Dynabeads提供了鉴定抗体的简单方法，其中通过带有FcR的细胞递呈而发生的凋亡诱导是重要的作用机制。
免疫荧光显微术显示，CD20抗原群集与利妥昔单抗抗体制剂的卓越的细胞凋亡诱导相关。因此，免疫荧光显微术检测的CD20抗原群集可以被用来预测能够诱导凋亡的抗体制剂。
提出了几种机制解释动物模型和人体中利妥昔单抗处理的有效性。ADCC在体内起主要作用的观念是目前流行的假说，几种出版物都陈述了经FcRs的抗体递呈的重要性(20、59、60)。在小鼠模型中，FcγRII对利妥昔单抗的治疗效果有抑制作用(59)，但是一些研究产生了对立的结果(61)。具体而言，用FcγRII转染的小鼠成纤维Ltk-细胞仍然促进信号诱导的凋亡(6)。在本文的结果中，利妥昔单抗聚合物制备物在抑制Raji淋巴瘤体内生长中的有效性说明，凋亡是治疗淋巴瘤的有力机制。应用包被了利妥昔单抗的Dynabeads和聚合物时，看到了胱天蛋白酶3的诱导，而应用利妥昔单抗单体和二聚体时，仅观察到基础水平的胱天蛋白酶活性。更高和更有效的凋亡诱导与胱天蛋白酶3更早和更多的活性增加有关。
总之，除了二聚体抗体制备物外，用多聚形式的抗-CD20抗体，实现了通过凋亡诱导对淋巴瘤的有效治疗。合适的凋亡诱导抗-CD20制备物的体外筛选可以用第二抗体、带有FcR的细胞或包被了利妥昔单抗的Dynabeads来检验。在体内，超交联似乎需要带有FcR的细胞的递呈(59)。然而，如本文所述制备的抗-CD20聚合物制备物似乎避免了对效应细胞的需求。因此，抗-CD20聚合物可以特别用于具有低FcR表型和对利妥昔单抗单一疗法无反应的淋巴瘤患者(62)。
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本领域技术人员容易认识到，本发明完全可以进行调整以实现目标并获得所提及的以及固有的结果和优势。本文中描述的实施例，代表了优选的实施方案，是示范性的，而不意图成为对本发明范围的限制。其中的修改和其它用途对本领域技术人员将是明显的。这些修改包含在本发明的精神之内并且被本发明的范围限定。
对本领域技术人员明显的是，可以对公开的实施方案作各种置换和修改，而不脱离本发明的精神和范围。
本说明书中提及的所有专利和出版物指出了本发明所属技术领域的普通技术人员的水平。所有专利和出版物通过参考并入本文至这样的程度，如同每个单独的出版物都表示为明确地分别并入本文，作为参考。
本文中例证性地描述的发明可以在缺少本文中未具体公开的任一元素或许多元素、限定或许多限定的情况下适宜地实施。因此，例如，在此处的任何情况下，术语“包括”、“基本上由…组成”和“由…组成”可以替换为其它两个术语中的任一个。已被使用的术语和表述，是被用作描述性术语，而不是限定性的，并且本发明的意图不是在使用这些术语和表述时排除显示和描述的特征或其部分的等同物，应认识到在要求保护的发明范围内各种修改是可能的。因此，应该理解，尽管本发明通过优选的实施方案和可选的特征被具体地公开，但本领域技术人员可以对本文公开的概念进行修改和变化，而这些修改和变化被认为包含在本发明的范围之内，如所附权利要求所限定的。
其它实施方案在权利要求中列出。
权利要求
1.癌症治疗剂，其包括连接有多个抗肿瘤细胞抗体的聚合物，其中所述抗体可以结合于肿瘤细胞的肿瘤细胞抗原并且诱导所述肿瘤细胞的凋亡或细胞死亡。
2.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体在不与聚合物连接时的特征是，不会实质性地诱导所述肿瘤细胞的凋亡或细胞死亡。
3.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体在不与聚合物连接时的特征是，诱导所述肿瘤细胞的凋亡或细胞死亡。
4.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体结合于相同的肿瘤抗原。
5.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体结合于相同肿瘤抗原的多于一个表位。
6.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体结合于多于一种肿瘤抗原。
7.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中至少一个抗体是二价抗体。
8.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中至少一个抗体是单价抗体。
9.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中至少一个抗体是抗体片段。
10.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述抗体选自抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD21抗体和抗CD22抗体。
11.权利要求10所述的癌症治疗剂，其中所述癌症治疗剂包括抗体中的任意两种或更多种，所述抗体选自抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗CD21抗体和抗CD22抗体。
12.权利要求11所述的癌症治疗剂，其中所述抗体是抗HER-2。
13.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述癌症治疗剂包括至少5个抗体。
14.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述癌症治疗剂包括至少10个抗体结合位点。
15.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述肿瘤是淋巴瘤或白血病。
16.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物的大小是至少1,000道尔顿。
17.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物的大小是在6000-8000道尔顿之间。
18.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物是同聚物。
19.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物是杂聚物。
20.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物选自葡聚糖、聚(乙二醇)(PEG)的嵌段共聚物、聚酰胺型胺类树枝状聚合物(PAPAM)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的合成共聚物(HPMA)，和N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的不可降解共聚物(PHPMA)。
21.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物是可溶性聚合物。
22.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物是线性聚合物。
23.权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述聚合物是支化聚合物。
24.降低个体中的肿瘤体积或抑制个体中癌细胞生长的方法，包括给予有效量的权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述癌症治疗剂结合于个体中的所述肿瘤或癌细胞。
25.权利要求24所述的方法，其中所述肿瘤或所述癌细胞是淋巴瘤或白血病。
26.权利要求25所述的方法，其中所述个体表现出降低水平的抗体依赖细胞介导性细胞毒性。
27.减轻或抑制患癌症个体中转移性癌发展的方法，包括给予有效量的权利要求1所述的癌症治疗剂，其中所述个体具有表达肿瘤细胞抗原的癌细胞，所述癌症治疗剂中的抗体可以结合于所述肿瘤细胞抗原。
28.权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤或所述癌细胞是淋巴瘤或白血病。
29.权利要求27所述的方法，其中所述个体表现出降低水平的抗体依赖细胞介导性细胞毒性。
30.鉴定抗体的方法，相比未连接于聚合物的抗体，所述抗体在至少两个这种抗体被连接于聚合物时，诱导肿瘤细胞凋亡的能力增强，所述方法包括a)将期望进行这种试验的候选抗体连接于不溶性颗粒并使所述连接有抗体的颗粒与肿瘤细胞接触，所述肿瘤细胞表达所述候选抗体能够结合的抗原；和b)步骤a)之后，确定所述肿瘤细胞中诱导的凋亡的程度，并将其与在另外一批相同肿瘤细胞中诱导的凋亡程度相比较，所述另外一批相同肿瘤细胞与未连接于颗粒的所述候选抗体接触。
31.权利要求30所述的方法，其中所述诱导肿瘤细胞凋亡的能力增强是，使用连接有抗体的颗粒比未连接于颗粒的抗体相比，有至少2倍的增加。
32.权利要求30所述的方法，其中所述不溶性颗粒是直径为约2至约5微米长度的珠子。
全文摘要
描述了包括聚合物的癌症治疗剂，三个或更多个抗肿瘤细胞抗体与所述聚合物相连接。优选大小为6－8Kd之间的可溶性聚合物。聚合物上的抗体可以和肿瘤细胞的肿瘤细胞抗原结合并诱导肿瘤细胞凋亡或细胞死亡。聚合物可以被连接于针对相同肿瘤抗原的不同抗体或针对不同肿瘤抗原的不同抗体。也描述了用该癌症治疗剂治疗患有癌症的个体的方法。
文档编号C07K16/28GK1925871SQ200580006321
公开日2007年3月7日 申请日期2005年1月27日 优先权日2004年1月27日
发明者A·L·爱泼斯坦, L·A·赫里 申请人:南加州大学