专利名称：用于检测psa的可活化游离形式的方法及其用于诊断前列腺的良性病理学和前列腺的腺 ...的制作方法
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本发明涉及前列腺腺癌的诊断。具体来说，本发明涉及用于在怀疑患有这些病理学的患者中诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，该方法使用能识别特别是处于其可活化游离形式的前列腺特异性抗原(或PSA)的结合配偶体。
PSA由人前列腺的腺上皮产生，可能处于非活性酶原形式(Lundwall等，FEBS Lett.1987)，并以其活性形式分泌进精液中(Lilja，J.Clin Invest 1985)。精液中的PSA的生物活性牵涉其限制性蛋白水解断裂由精囊分泌的主要蛋白(Lilja，J.Clin Invest1985；Lilja等，J.Clin Invest 1987；Mc Gee等，Biol.reprod.1988)。
PSA是前列腺癌的主要标记，在西方，六个男性中有一个将在一生中受到PSA的影响。这种主要由前列腺上皮分泌的激肽释放酶家族的蛋白酶在患者精液中的浓度为0.5-5mg/ml，而血清中其浓度要低一百万倍。因而，一般发现PSA在血清中浓度为低于2.5ng/ml。然而，当有前列腺癌和当有良性改变如良性前列腺增生(BPH)或急性前列腺炎时，该浓度原则上显著增加。
PSA的蛋白序列已经测定。其为含有237个氨基酸的糖蛋白(“Molecular cloning of human prostate specific antigen cDNA”.Lundwall A.，Lilja H.，1987.FEBS Lett 214317-322)。
已经提出了一种诊断方法，包括测量血清PSA浓度并将其于阈值比较，阈值是4ng/ml。然而，已经注意到，这种诊断方法导致四分之三的患者受到错误的怀疑，这是不利的。而且，这种方法使得不可能诊断30-40％的局限于腺体的癌症病例，而局限于腺体的癌症属于潜在可治愈的疾病早期阶段，因而特别期望能诊断该阶段。此外，由文章“Prostate Cancer Detection in Men With Serum PSAConcentrations of 2.6 to 4.0ng/ml and Benign ProstateExamination″，Catalona等，JAMA，14 May 1997-Vol.277，No.18报告的研究证实了这种方法相对令人不满意的特征，该研究显示，对于早期发现前列腺癌，阈值必须低于4ng/ml。
此外，已经表明，在血清中，PSA与蛋白酶抑制剂，例如α-1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)和α-2-巨球蛋白(A2M)结合。这种结合导致PSA的胰凝乳蛋白酶活性的失活，如文章″Enzymatic activity ofprostate specific antigen and its reactions with ultracellularserine proteinase inhibitors″A.Christensson，C.B.Laurell，H.Lilja，1990 Eur.J.Biochem 194755-763中所证明的。这也使得能够证明血清中存在的PSA为游离形式即非结合形式，或为复合形式即结合形式。也因此提出了使用游离PSA与总PSA的比率来提高诊断的特异性。
因此，专利申请WO 97/12245描述了用于诊断前列腺的腺癌而不需活组织检查的方法。该方法包括在患者的血清或血液中测量PSA的总量。如果该值在2.5和2.5ng/ml之间，也测量游离PSA的浓度。然后计算游离PSA与总的PSA的比率。如果该比率小于7％，诊断结果就倾向于前列腺的腺癌。
然而，将阈值7％用于诊断前列腺癌受到许多作者的质疑，如出版物，Lein等“Relation of free PSA/total PSA in serum fordifferentiating between patients with prostatic cancer andbenign prostate hyperplasiawhich cutoff should be used？”所显示的。在这篇在期刊Cancer Investigation，16(1)，45-49，1998中出版的文献中，据证实，通过该比率难以系统地区分前列腺癌和BPH。
因为这些原因，在专利申请WO 00/02052中，申请人的兴趣在于血清中游离形式PSA中的裂解(cleaved)形式PSA的存在。患有癌症或BPH的患者中血清PSA的分子形式已经通过二维电泳，并结合化学发光检测进行了作图，以便观测全部PSA形式，即游离形式，其中包括裂解形式，和复合形式。
患有前列腺腺癌的受试者的血清的电泳图谱是相对同质的，基本显示出非裂解的游离形式的PSA，而患有BPH的受试者的血清含有相对高比例的裂解的游离形式和无裂解形式的稍微更碱性(basic)的点。因而可认为在患有BPH的患者中观察到的血清游离PSA/血清总PSA的比率的增加基本上与裂解的游离PSA的存在相关，所述裂解的游离PSA可以是无酶促活性的并因而不能结合至ACT，并且也可认为与比活性游离PSA形式稍微更碱性的游离PSA形式的存在相关，所述的稍微更碱性的游离PSA形式可能对应无活性的、酶原形式的PSA。
依照这些观测，申请人已经描述了用于诊断前列腺腺癌的方法，包括在用二维电泳分离后定量裂解和/或非裂解的游离PSA并用这些值来进行诊断。
然而，即使这些方法已经使得有可能改进诊断，但是它们需要用到二维电泳。因而，它们是相当昂贵的并需要大量操作时间。
为了避免这些操作，专利申请WO 01/77180已经描述了新的特异性针对无活性游离PSA的抗体，及其在用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法中的用途。
申请人现在已经发现，在患者的生物样品中，在游离形式的PSA中，存在一种新形式的PSA，该PSA不是酶原形式(ProPSA)但也是可活化的，即其潜在地具有与蛋白酶抑制剂反应的能力，并且公开了利用检测这样的可活化PSA的游离形式使得能在患有前列腺良性病理学的受试者和患有前列腺腺癌的受试者之间做出区别性诊断，其具有良好的特异性和灵敏性。
因此，本发明的一个目标是用于体外诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，该方法的特征在于其包括在来自怀疑患有前列腺良性病理学或患有前列腺腺癌的患者的生物样品中检测PSA的可活化游离形式的步骤。
存在于患者的生物流体如精液或血清中的多种不同形式的PSA通常具有多个不同的名字，这取决于创始者。他们都同意认为，总PSA处于两种形式，即游离形式(游离PSA)和与蛋白酶抑制剂如ACT复合的形式(复合PSA)。游离PSA也可根据其大小命名当其以ProPSA的形式产生时，其具有额外的氨基酸(7或5或4或2个)。那么可称为酶原PSA或ProPSA-7、ProPSA-5等等。这种proPSA，在成熟并因而失去额外的氨基酸后，可以处于完整形式或处于部分形式。在后面的情况下，称为截短的或裂解的PSA。完整形式的游离PSA也可以变性(糖基化或去糖基化)；则称为变性形式。因此，游离形式的PSA包括酶原PSA、完整的PSA和裂解的PSA，完整的PSA可以是或不是变性的。
对于这些PSA的不同的游离或复合形式，也可称为活性和无活性形式。术语“活性形式”用于表示能结合至蛋白酶抑制剂如ACT的形式。术语“无活性形式”用于表示不具有这种结合能力的形式。已知复合的PSA是无活性的，因为其已经结合至抑制剂上。类似地，裂解的游离PSA和变性的游离PSA是无活性的，因为它们不再具有结合至抑制剂的能力。最后，酶原形式的PSA是无活性的。其它游离形式的PSA因此是有活性的。虽然这些活性形式存在于精液中或存在于LnCaP细胞系的上清液中，但是通常认为这些活性形式不存在于血清中，因为它们与蛋白酶抑制剂复合。
申请人现在已经证明，出乎所有意料，在这些游离形式中，在患者的生物样品中存在可活化游离形式，即仍具有与血清中的蛋白酶抑制剂结合的能力的形式，所述的可活化游离形式激活后有可能进行这种结合。也已证明了利用测定这种可活化游离PSA形式的量使得有可能诊断患有前列腺腺癌或患有BPH的患者。
虽然不希望受任何理论的约束，但申请者认为这种PSA的可活化游离形式在激活后将等价于与ACT复合的PSA形式。这种可活化游离形式可能是“闭合”形式的PSA，束缚着ACT-结合位点，这种形式的PSA的激活使得有可能将“闭合”形式转化为“开放”形式并因而释放结合位点。
本发明的诊断方法可以使用能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体，或使用能以非特异性方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体。
因此，根据第一个实施方案，本发明涉及用于体外诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，该方法的特征在于其包括以下步骤i)让能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体与来自怀疑患有前列腺良性病理学或前列腺腺癌的患者的生物样品接触；ii)证明所述的结合配偶体捕获了PSA的可活化游离形式；iii)计算在步骤ii)中检测的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率；和iv)通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选择的并代表了每种病理学的检测界限。
申请人已经发现，出乎意料，在适用于本发明目的的结合配偶体中，识别由序列SEQ ID No.1(DTPYPWGWLLDEGYD)模拟的表位的那些结合配偶体在血清中能有效地特异性结合至这种PSA的可活化游离形式上，而不结合变性的或裂解的游离PSA，也不结合ProPSA，而且利用这种特殊性质使得可能获得一种用于诊断前列腺相关的病理学的方法，该方法十分灵敏而且非常有特异性。
在其中进行本发明方法的生物样品是任何可能含有PSA的生物样品。例如，这种样品的实例可提及精液、血液、血清、血浆和尿，特别优选血清和血浆。
适用于本发明目的的、能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体包括，例如，抗体、抗体片段和模拟位(mimotope)，以及还有本领域技术人员已知具有这种能力的任何其他配偶体。
在本申请中，术语“抗体片段”一般用于表示任何保留了原始抗体的特异性(在这种情况下，即具有特异性结合可活化游离PSA的能力)的抗体片段，特别是Fab和F(ab′)2类型的片段。在本申请中，当意思允许时，单词“抗体”在下文中也表示抗体片段。
可用于本发明范围的抗体特别包括纯化的多克隆抗体和单克隆抗体。
多克隆抗体和单克隆抗体的制备为本领域技术人员所周知并且下文将提到这种制备的原理。
多克隆抗体可以通过以下方法获得用至少一种目标靶抗原免疫动物，随后通过抽取所述动物的血清而回收纯化形式的所期望的抗体，并将所述的抗体与其它血清成分分离，特别是通过在其上连接有被该抗体特异性识别的抗原，尤其是目标靶抗原的柱上的亲和层析。
单克隆抗体可通过杂交瘤技术获得，其一般性原理在下面叙述。
首先，用目标靶抗原免疫动物，一般是小鼠(或在体外免疫的情况下是培养中的细胞)，其B淋巴细胞然后能产生针对所述抗原的抗体。随后将这些产生抗体的淋巴细胞与“无限增殖的”骨髓瘤细胞(在实例中是鼠细胞)融合以产生杂交瘤。然后从如此获得的非均质混合物中选择能产生特殊抗体并无限增殖的细胞。每种杂交瘤以克隆的形式增殖，每个克隆导致产生一种单克隆抗体，所述产生的单克隆抗体对于目标肿瘤抗原的识别性质可以例如通过ELISA，通过一维或二维免疫转移法，以免疫荧光或使用生物感受器进行测试。将如此选择出的单克隆抗体随后进行纯化，特别是根据上面描述的亲和层析技术来进行。
术语“模拟位(mimotope)”用于表示能模拟与所述表位特异性相互作用的构象的任何合成的或重组的肽。
根据优选的实施方案，能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体满足至少一种以下条件-能识别由序列SEQ ID NO.1模拟的表位；-其为抗体或抗体片段。
被适于本发明目的的结合配偶体所识别的序列SEQ ID No.1模拟PSA的构象表位。
适于本发明目的的能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的抗体的实例是抗体5D3D11，如Michel S.等，1999，ClinicalChemistry，45(5)638-650中描述的。这种特别的抗体在本发明方法中的使用在这种意义上是意想不到的，即该文章指出这种抗体能抑制PSA的酶促活性并因而抑制ACT的结合；换而言之，其仅能结合至“开放的”活性游离形式的PSA。在本发明中，申请人还已经指出其能结合至可活化游离形式，即“闭合的”形式。
由能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体和PSA的可活化游离形式组成的缀合物是新的并也构成本发明的一个目标。
根据一个实施方案，本发明缀合物的能特异性结合至可活化游离PSA的所述结合配偶体是能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的结合配偶体。
本发明的诊断方法的第二个步骤在于证明所述的能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体对所述的PSA的可活化游离形式的捕获。
该步骤可以通过检测所述的结合配偶体和所述的PSA的可活化游离形式之间的结合直接进行，或在洗脱由所述结合配偶体免疫捕获的所述PSA的可活化游离形式后进行。由所述结合配偶体免疫捕获并随后洗脱的PSA的可活化游离形式在下文中称为免疫纯化的可活化游离PSA。
由能特异性结合至可活化游离PSA的所述结合配偶体免疫捕获的PSA的可活化游离形式的洗脱可以通过本领域技术人员已知的任何洗脱方法如pH休克法(pH shock)进行。优选使用酸性休克法，例如使用0.1M的甘氨酸缓冲液，pH 2.8。
所述的PSA的可活化游离形式的捕获的检测，不管其是否是免疫纯化的，可以通过免疫测定含量领域已知的任何检测方法，如直接检测法和间接检测法进行。
在间接检测，即依靠检测配偶体的情况下，使用能结合至可活化游离形式的PSA的检测配偶体。当可活化游离PSA没有经免疫纯化时，该检测配偶体结合至不同于在步骤i)中使用的所述结合配偶体所使用的表位上。对于适于该目的的检测配偶体，可提及抗体，如抗-总PSA抗体，其构成本发明的一个实施方案。
这种能识别与在步骤i)中使用的所述结合配偶体所使用的表位不同的表位的抗-PSA抗体的实例在Michel S.等的文章(1999，同上)中描述。
这种检测配偶体可以预先标记。
术语“标记”用于指能直接或间接产生可检测信号的标记物的固定。这些标记物的非限制性列表包括·能产生例如通过比色法、荧光或发光而可检测的信号的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，·发色团例如发光化合物或染料化合物，·放射性分子例如32P、35S或125I，·荧光分子例如荧光素、rhodomine、alexa或藻蓝蛋白，和·颗粒例如金颗粒、磁性胶乳颗粒，脂质体。
也可以使用间接标记体系，例如，通过另外的配体/抗-配体(anti-ligand)对。配体/抗-配体对是本领域技术人员所熟知的，并可提及，例如以下的对生物素/链霉抗生物素蛋白、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/与该多核苷酸互补的多核苷酸。在本情况下，是配体与结合配偶体结合。该抗-配体依靠前面段落描述的标记物是可直接检测的，或依靠配体/抗-配体是可自身检测的。
在某些情况下，这些间接体系可以导致信号放大。这些信号放大技术为本领域技术人员所熟知，并且可参考申请人先前的专利申请FR98/10084 or WO 95/08000或参考文章J.Histochem.Cytochem.45481-491，1997。
所述的结合配偶体捕获可活化游离形式的直接检测，即不通过检测配偶体的检测，可以例如通过等离子体(Plasmon)共振或通过在带有导电聚合物的电极上的循环伏安法(cyclic voltametry)进行。
直接检测也可以利用活性形式的PSA的酶促活性的特殊性质进行。在本情况下，如有必要，在其免疫纯化后进行PSA的可活化游离形式的活化是适当的。事实上，这种可活化游离形式的活化使得可能释放用于结合酶底物的位点，然后该位点可以与酶底物反应。因而，通过测定经免疫纯化的并经活化的游离形式的PSA的酶促活性来进行该检测，其构成了本发明的一个特殊实施方案。
适于本发明目的的酶底物的实例包括显示胰凝乳蛋白酶类型的蛋白酶活性并为本领域技术人员所周知的所有底物。这样的底物例如可从Enzyme System Products获得。它们由被PSA识别并裂解的肽序列构成，该序列与发色团或荧光团基团相偶联。
PSA的可活化游离形式的活化可以通过至少一种以下方法进行-让所述的可活化形式与具有至少0.15M、优选至少1M、更优选最多2M的高盐浓度的介质接触，-让经免疫纯化的可活化游离PSA结合至能增加PSA的酶促活性的抗体上，将这两种方法分开进行、同时进行或以任何顺序依次进行都是可以的。
对于具有高盐浓度的介质，可提及含有1.5M NaCl的介质，以及对于能增加PSA的酶促活性的抗体，可提及抗体8G8F5(bioMérieux，法国)。
由于这些能增加PSA的酶促活性的抗体的特殊性质，它们在本发明方法中的使用使得能够提高所述方法的灵敏性。
因此，根据一个实施方案，本发明方法的特征在于，除了能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体之外，还使用能增加PSA的酶促活性的抗体，特别是抗体8G8F5。
当能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体用于免疫纯化可活化游离PSA时，这种能增加PSA的酶促活性的抗体可在ELISA型测定含量法中用作捕获配偶体。其也可以用作检测配偶体，特别是当能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体用作捕获配偶体时。
由能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体，如能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的结合配偶体，和经活化的可活游离形式的PSA组成的缀合物也是新的，并构成本发明的一个特殊实施方案。
在本发明方法中，能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体，其特异性结合至可活化游离PSA，可以就这样或者特别是以固定在固体支持物上和/或与标记物连接的形式使用。
这些结合配偶体在固体支持物上的固定是熟知的。支持物可采用任何生物或合成固体材料，其具有吸附性质或能固定偶联剂。这些材料是已知的并在文献中有描述。能通过吸附而固定这些结合配偶体的固体材料中，可提及，例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳，等等。借助于偶联剂使得能够通过共价键固定这些结合配偶体的材料中，可特别提及右旋糖酐、纤维素，等等。支持物可以，例如，以圆盘的形式、管的形式、珠的形式、锥体( )的形式、板的形式，特别是以微量滴定板的形式存在。
结合配偶体与标记物的结合也使得可能获得直接的检测，如上面描述的。这种标记物是如上面描述的。
当结合配偶体没有与支持物连接或当可活化游离PSA经免疫纯化，本发明方法也可以使用捕获配偶体。在第一种情况中，这种捕获配偶体能结合至与能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体所识别的表位不同的表位上。
捕获配偶体的实例包括如上面描述的抗-PSA抗体。
当在本发明方法中既使用捕获配偶体又使用检测配偶体来测定可活化游离PSA的量的情况下，这些配偶体结合至不同的表位，当可活化游离PSA没有经免疫纯化时，这些表位不同于由能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体所识别的表位。
使用可活化形式的PSA的多种不同配偶体来证明所述结合配偶体捕获可活化游离形式PSA的方法是本领域技术人员所周知的。例如，可提及三明治(sandwich)型方法如ELISA方法，以及竞争测定法(competition assay method)。
本发明方法的步骤iii)包括计算在步骤ii)中检测到的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了本发明的可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率。
表述“取自相同受试者的相同本质的样品”意在表示同一次抽取的两个级分，或源于两次不同抽取的两个样品，但样品必须是相同本质的，例如血清样品。
除了PSA的可活化游离形式之外的形式特别是复合的PSA、总的PSA、总的游离PSA、酶原游离PSA、变性的游离PSA、裂解的游离PSA及其组合，即全部的活性或无活性的、游离或复合的PSA。
这些不同形式的每种的测定，特别是使用特异性抗体，是已知的。
例如，使用专利申请WO 98/22509中描述的抗体测定复合PSA的量。
总的PSA例如使用H.Nagasaki等，(1999)，Clin.Chem.454486-496描述的抗体进行测定。
能结合至不同形式的游离PSA(包括总的游离PSA)的其它抗体由Chugai(日本)，BiosPacific(Emeryville，CA)和Euromedex USBiological(Swampscott，MA)出售。
定量是以已知的方式进行，其基于如上描述的检测免疫反应的证明方法(三明治法等)，例如当使用标记时通过测定标记物的量来进行。
当然，当测量的量用于进行比较时，这些值应该是可以相比较的。换而言之，这些测量值应该涉及样品的相同的可选稀释度或浓度以及涉及相同体积。
可在本发明方法的步骤iii)中计算的各种不同的比率可以选自以下-可活化游离PSA的量/总PSA的量，-可活化游离PSA的量/总的游离PSA的量，-可活化游离PSA的量/复合PSA的量，-可活化游离PSA的量/裂解的游离PSA的量，-可活化游离PSA的量/酶原游离PSA的量，-可活化游离PSA的量/变性的游离PSA的量，-可活化游离PSA的量/(变性的游离PSA+酶原游离PSA)的量，
-可活化游离PSA的量/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的量，-可活化游离PSA的量/无活性游离PSA(酶原、变性和裂解的PSA)的量，-这些比率的倒数，或-这些比率的组合，优选的比率涉及可活化游离PSA的量与(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的量的比率或可活化游离PSA的量与无活性游离PSA的量的比率。
根据本发明的一个特殊实施方案，用于计算本发明方法的步骤(iii)中的比率的、除了可活化游离形式之外的PSA形式是变性的游离PSA形式+裂解的游离PSA形式或无活性游离PSA形式。
显然，该计算的实施是按如下进行-用能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体评测在取自受试者的生物样品中的可活化游离PSA的量，如上描述，-对于取自相同受试者的相同本质的样品评测选自如下的量中之一总PSA的量、总的游离PSA的量、复合的PSA的量、酶原游离PSA的量、裂解的游离PSA的量、变性的游离PSA的量、变性的游离PSA+裂解的游离PSA的量、变性的游离PSA+酶原游离PSA的量和无活性游离PSA的量或其组合，并-测定所述比率或所述比率倒数或所述的比率组合。
本发明方法的步骤iv)包括通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选定的并代表了每种病理学的检测界限。
已知，一般而言，免疫测试的结果很大程度上取决于所使用的抗体的特异性和亲和力的特征，并且这些特征影响用这些抗体测量的值。因此可以想象，给出精确的阈值是不可能的，并且每种情况中适于每种所使用的抗体的阈值可以通过简单的常规试验确定。
应该相当理解，在此术语“阈值”指不连续的值，或指相应于不确定区域的值的区间。显然，当测量的值包括在该不确定区间中时，或在不连续值的情况下十分接近阈值时，是不可能做出确定结论的，而需进行额外的研究。
当然，当已经对于给定的比率类型给出阈值时，可以从该值推知对应于其它比率类型的阈值。
当考虑可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率或可活化游离PSA/无活性游离PSA的比率时，对于具有高于使用所述比率而获得的阈值的比率的患者将会诊断为前列腺腺癌，而对于具有低于该阈值的比率的患者将诊断为BPH或其它非癌性前列腺病理学(“正常患者”)。
通常，当可活化游离PSA的量是所计算的比率的分子时，对于具有高于使用所述比率而获得的阈值的比率的患者将诊断为前列腺腺癌，而对于具有低于该阈值的比率的患者将诊断为BPH或其它非癌性前列腺病理学(“正常患者”)。相反，当可活化游离PSA的量是所计算的比率的分母时，对于具有低于使用所述比率而获得的阈值的比率的患者将诊断为前列腺腺癌，而对于具有高于该阈值的比率的患者将诊断为BPH或其它非癌性前列腺病理学(“正常患者”)。
为了实施本发明方法，本发明的另一个目标是用于诊断前列腺腺癌或前列腺良性病理学的诊断试剂盒，所述的试剂盒包括-能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体，优选能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的结合配偶体，更优选抗体或抗体片段，和-用于测定除了可活化游离形式之外的PSA形式的量的手段，优选抗体或抗体片段。
这种可以用于所述试剂盒的手段是如上对于测定希望定量的PSA形式的量而进行描述的。
本发明的方法也可以使用能以非特异性方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体来实施。
这种配偶体可以是能与总PSA结合的配偶体，所述总PSA中特别包括可活化游离PSA。对于这种配偶体的实例，可提及抗体、抗体片段和模拟位，也还有任何其它本领域技术人员已知具有这种能力的配偶体，如上面描述的，特别是抗体11E5C6(Michel等，1999，同上)，其构象表位涉及PSA的C-末端区域(Michel S等，2001，J.Mol.Recognit.，14406-413)。
能以非特异性的方式结合至可活化游离PSA的这种结合配偶体可用于使用能特异性结合至可活化游离PSA的如上描述的本发明方法，即作为捕获配偶体或者用于免疫纯化游离的PSA。
然而，在该特定的实施方案中，PSA的可活化游离形式的检测必须利用活性形式的PSA的酶促活性的特殊性质来进行。在该情况下，进行PSA的可活化游离形式的活化是适当的。这是因为，这种可活化游离形式的活化使得可能释放用于结合酶底物的位点，然后该位点可以与如上描述的酶底物反应。因此，检测通过测定已经活化了的游离形式的PSA的酶促活性来进行。
因此，根据该实施方案，本发明涉及根据权利要求1的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，该方法的特征在于其包括以下步骤i)让能以非特异性方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体与来自怀疑患有前列腺良性病理学或前列腺腺癌的患者的生物样品接触；ii)通过在活化PSA的可活化游离形式后测定经活化的PSA游离形式的酶促活性来证明所述结合配偶体捕获了PSA的可活化游离形式；iii)计算在步骤ii)中检测的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率；并iv)通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选择的并代表了每种病理学的检测界限。
PSA的可活化游离形式的活化可以通过至少一种以下方法进行-让所述可活化形式与具有至少0.15M、优选至少1M、更优选至多2M的高盐浓度的介质接触，如上面描述的。
-让可活化游离PSA结合至能增加PSA的酶促活性的抗体，特别是抗体8G8F5，将这两种方法分开进行、同时进行或以任何顺序依次进行都是可以的。
由于这些能增加PSA的酶促活性的抗体的特殊性质，它们在本发明方法中的使用使得可能提高所述方法的灵敏性，其构成了一个优选的实施方案。
因而，根据该实施方案，本发明方法的特征在于，除了能以非特异性的方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体之外，其还使用能增加PSA的酶促活性的抗体，特别是抗体8G8F5。
在这方面，这种能增加PSA的酶促活性的抗体可用于含量测定中，作为预先以特异性或非特异性的方式从生物样品中免疫纯化出来的可活化游离PSA的捕获配偶体。如此在被抗体捕获后活化了的游离PSA将可以依靠其酶促活性得以检测，该酶促活性将通过荧光底物的水解动力学来测量。动力学的斜率将以荧光单位表示。相应的PSA的量将通过用活性PSA的量建立的标准曲线而获得。
除了上述的内容，该特定实施方案的步骤i)至iv)是如先前所描述的。
借助于仅以非限制性说明的方式给出的以下实施例以及借助于附
图1-6，本发明将得到更完全的理解，其中-图1显示3块二维电泳的凝胶的照片，其使用源于LNCaP细胞的培养物上清液的，并用抗体5D3D11(照片A)、6C8D8(照片B)和11E5C6(照片C)免疫纯化的0.5μg的PSA而获得。
-图2表现了将荧光作为PSA浓度的函数的标准化曲线图，所述的PSA浓度是使用预先用抗体5D3D11免疫纯化并基于总PSA而测定含量的精液PSA而获得的。
-图3是给出了可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率值的图示，所述的比率值是对下列患者的血清施用本发明方法而获得的患有前列腺癌并用放射疗法(RT)、激素疗法(HT)或前列腺切除术(PR)治疗的患者、患有癌症但用于他的治疗是未知的(其它的)患者、患有良性增生(BPH)的患者和正常患者(PN)(图的A部分)，以及用这些相同的血清根据现有技术的方法获得的游离PSA/总PSA的比率值(图的B部分)。
-图4是给出了可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率值的图示，所述的比率值是在具有0.15和0.25之间的游离PSA/总PSA的比率的血清中用本发明方法获得的，所述的血清来自患有前列腺癌并用放射疗法(RT)、激素疗法(HT)或前列腺切除术(PR)治疗的患者、患有癌症但用于他的治疗是未知的(其它的)患者、患有良性增生(BPH)的患者和正常患者(PN)。
-图5是给出血清的可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率值的图示，所述的血清来自患有前列腺癌的患者和来自患有良性增生(BPH)的患者，这些患者的总PSA水平低于2.5ng/ml，以及-图6是给出血清的可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率值的图示，所述的血清来自患有前列腺癌的患者和来自患有良性增生(BPH)的患者，所述的比率值是用抗体5D5A5或抗体11E5C6作为用于检测可活化PSA的抗体而获得的。
实施例1使用LNCaP上清液检测PSA的可活化游离形式1.1LNCaP上清液的制备根据文章“LNCaP Produces both putative zymogen andinactive，free form of prostate specific antigen”E.Corey等，1998，Prostate 35135-143；“Androgen-Sensitive human prostatecancer cell，LNCaP，Produce both N-terminally mature andtuncated prostate specific antigen isoform”A.Herrala等，1997，Eur.J.Biochem.255329-335；“Production of miligramconcentration of free prostates pecific antigen(fPSA)fromLNCaP cell cultureDifference between fPSA from LNCaP cell andseminal plasma.”J.T.Wu等，1998，J.Clin.Lab.Anal.126-13中描述的技术由LNCaP细胞系来合成PSA。
如此由LNCaP细胞系产生的PSA由游离PSA组成。而且，因为该细胞系的培养是在存在含有ACT的胎牛血清时进行的，因而一定比例的PSA-ACT复合物也是可能存在的。
1.2上清液中的游离形式的PSA与结合抗体的结合使用抗体5D3D11，其为识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的结合配偶体，或使用抗体6D8C8，其为不识别该表位的结合配偶体(MichelS.等，1999，同上)。
按如下进行结合根据由厂商提供的本领域技术人员熟知的常规技术方案将抗体5D3D11或6C8D8连接至CNBr活化的Sepharose树脂支持物(Pharmacia)上。使用的偶联比率是5mg抗体/1ml膨胀的树脂。将1ml连接有5mg抗体的树脂与200ml的LNCaP细胞上清液汇集物(pool)接触，所述的细胞上清液用Vidas检测仪测定(总PSA试剂盒，bioMérieux，法国)含有约500μg的总PSA。
2次通过亲和柱后，保留含有未结合的PSA的级分(称为F1)，并且将被抗体结合的PSA用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.8)洗脱，随后用2MTris(pH 8)中和至pH 7.2。因而获得了用抗体5D 3D11或抗体6C8D8免疫纯化的游离形式的PSA。
1.3用抗体5D3D11或抗体6C8D8免疫纯化后测定上清液中的游离形式的PSA的含量1.3.1.用二维电泳分析通过二维电泳和蛋白质印迹法分析包含在源于免疫纯化的多种级分中的PSA。
在第一维的分离期间，在变性和还原条件下，蛋白质根据它们的等电点(PI)通过等电聚焦(IEF)在固定在沉积细带(bandelettes)(Immobiline Dry-strip pH 3-10，18cm，非线性，Pharmacia)上的pH梯度上迁移。将0.5μg PSA加入至10μl含有10％的SDS和2.3％的DTT(1，4-二硫苏糖醇)的溶液中，并将该混合物在96℃下加热5分钟。然后用再水化溶液(8.3M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)，100mM DTT，2％Servalyt 4-9，1mg/ml橙G)将样品补足至500μl，并在20cm-长的玻璃试管中与细带接触。然后用石蜡油覆盖整个体系并孵育过夜。在8小时内于以线性的方式从100-3500V增加的电压下进行分离，并且在80-100kVh期间进行6000V下的聚焦步骤。
然后将在其等电点聚焦的蛋白质在第二维中根据其大小分离，该分离是根据常规的蛋白质电泳技术，利用SDS-PAGE电泳，在大的均质的12％的丙烯酰胺凝胶上以每胶40mA进行5-6小时。
将根据第二维分离后获得的凝胶通过在CAPS/甲醇缓冲液(3-[环己基氨基]-1-丙磺酸)中，保持15℃的温度，于1A的电流下过夜而转移至PVDF膜(聚偏三氟乙烯(polyvinylidene trifluoride)；Millipore)上。将该膜在含有0.05％的Tween 20和5％的脱水脱脂乳的TBS(Tris缓冲盐水，15mM Tris，pH 8，140mM NaCl)中于4℃下过夜饱和。将以前鉴定用于检测所有形式的PSA的抗-PSA抗体13C9E9(Charrier J.P.，等，2001，Electrophoresis，22，1861-1866)在饱和溶液中稀释至10μg/ml，并加入至膜上。37℃下孵育1小时后，将膜用饱和溶液洗涤3次(5分钟)，并让其与偶联有过氧化物酶的抗-小鼠抗体缀合物(JacksonImmunoResearch，West Grove，美国)接触，所述缀合物在饱和溶液中稀释至1/5000。然后将它们在环境温度下孵育1小时，并在饱和溶液中洗涤3次。通过使用化学发光底物(Pierce)，在Fluor S中孵育膜，并进行图像采集(根据样品在1分钟到1小时之间)来检测免疫反应性。然后用Multi-Analyst软件(Biorad)处理获得的图像。
这些凝胶的照片复制于图1中，其中照片A对应使用抗体5D3D11，照片B对应使用抗体6C8D，以及照片C对应抗体11E5C6(Michel S.等，1999，同上)，其为用作比较的抗-总PSA抗体。
该附图显示，通过与用抗-总PSA抗体11E5C6免疫纯化的PSA比较，用抗体5D3D11免疫纯化的PSA含有十分少的裂解或截短的形式。相反，这些形式在用抗体6C8D8免疫纯化的PSA中以大得多的比例存在。
1.3.3通过PSA的N-末端测序来表征免疫纯化的酶原和成熟形式的PSA根据本领域技术人员熟知的技术，将5-8μg用抗体5D3D11或6C8D8免疫纯化的细胞PSA在还原条件下在SDS-PAGE凝胶上进行分离，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将PSA条带用3％TCA(三氯乙酸)中的0.25％丽春红S溶液染色，并将相应于成熟PSA的条带(约30kDa)切下并让其在Procise 292A蛋白质测序仪(Applied Biosystems)上进行埃德曼(Edman)降解。
获得的结果显示，用抗体5D3D11免疫纯化的PSA仅含有成熟形式(IVGG...)，而用抗体6C8D8免疫纯化的PSA含有成熟形式以及proPSA(-7)和proPSA(-5)。
1.3.4免疫纯化的细胞PSA的酶促活性的测量用100μl在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的10μg/ml的链霉抗生物素蛋白溶液在37℃下包被黑色Nunc Maxisorp ELISA板(与荧光检测相容)的孔2小时，并用含有2mg/ml BSA(牛血清白蛋白)的TBS(50mMTris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl)于37℃下封闭2小时。将孔用TBS-0.05％Tween洗涤3次后，引入100μl在TBS-BSA中稀释至10μg/ml的生物素化的抗-总PSA抗体。抗-总PSA抗体可以是不修饰PSA的酶促活性的抗体11E5C6(Michel S.等，1999，同上)，或是抗体8G8F5(bioMérieux，法国)。
在37℃下孵育2小时后，用TBS-0.05％Tween洗涤孔，并引入在TBS-BSA中稀释至2.5μg/ml的、用抗体5D3D11或6C8D8免疫纯化的PSA，并且在4℃下孵育过夜。然后将孔用TBS-0.05％Tween再次洗涤，并用上面描述的TBS-BSA(含有0.15M的NaCl)或用其中NaCl浓度升至1.5M的TBS-BSA孵育15分钟。然后倒空孔，并让其与100μl在含有0.15M或1.5M的NaCl的TBS-BSA中稀释至300μM的荧光底物Mu-HSSKLQ-AFC(Enzyme System Products，ICN的子公司)接触。随后用Fluoroskan测读仪(Thermolabs Systems)在37℃下于30分钟内追踪酶促动力学(激发390nm，发射510nm；1次测量/分钟)。PSA的酶促活性相应于获得的曲线的斜率。
结果显示于下面的表1中表1
将酶促活性表示为荧光单位×1000/分钟。
该表显示，用抗体5D3D11免疫纯化的PSA具有可检测的酶促活性。该活性在存在1.5M NaCl时增加。用抗体8G8F5捕获PSA也增加了PSA的酶促活性。
用抗体6C8D8免疫纯化的PSA，就其自身而言，在存在1.5M NaCl和存在抗体8G8F5时仅具有可检测的残余活性，显示这种免疫纯化形式的PSA是不可活化的。
该实施例证明，在LNCaP细胞中的PSA的可活化游离形式之中，发现了根据本发明方法可以检测的可活化游离形式。
实施例2用来自患有前列腺腺癌的患者的血清检测PSA的可活化游离形式使用的血清汇集物由30种来自患有前列腺癌的患者的血清组成。该汇集物的PSA浓度是总PSA71ng/ml；游离PSA12ng/ml，这些浓度用Vidas仪器测定。
2.1.血清的免疫纯化将1.2节中描述的树脂用作已经连接了抗体5D3D11和6C8D8的固体支持物。将50μl这些树脂与1ml上面描述的血清汇集物接触，4℃下搅动过夜。然后离心该管，保留含有未结合的PSA的级分，用PBS-0.5％Tween洗涤树脂3次(合并洗涤级分并保留)，然后将被抗体5D3D11或6C8D8结合的PSA用200μl含有1mg/ml BSA的0.1M甘氨酸(pH 2.2)洗脱5分钟，并用2M Tris(pH 8)中和至pH 7.2。
2.1.从血清中免疫纯化出的PSA的酶促活性的测量用100μl在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中的10μg/ml的链霉抗生物素蛋白溶液在37℃下“包被”黑色Nunc Maxisorp ELISA板(与荧光检测相容)的孔2小时，并用含有2mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)的TBS(50mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15M NaCl)在37℃下封闭2小时。将孔用TBS-0.05％Tween洗涤3次后，引入100μl在TBS-BSA中稀释至10μg/ml的生物素化的抗-总PSA抗体。抗-总PSA抗体可以是о抗体11E5C6，其不修饰PSA的酶促活性，о或抗体8G8F5，其增加捕获的PSA的酶促活性。
37℃下孵育2小时后，用TBS-0.05％Tween洗涤孔，并且引入100μl用抗体5D3D11或6C8D8从血清中免疫纯化出的PSA，并在4℃下孵育过夜。然后用TBS-0.05％Tween再次洗涤孔，并用其中NaCl浓度增至1.5M的TBS-2mg/ml BSA孵育15分钟。然后倒空孔，并将其与100μl在含有1.5M的NaCl的TBS-BSA中稀释至400μM的荧光底物Mu-KGISSQY-AFC(Enzyme System Products，ICN的子公司)接触。用Fluoroskan测读仪(Thermolabs Systems)在37℃下于2小时内追踪酶促动力学(激发390nm，发射510nm；1次测量/分钟)。PSA的酶促活性相应于获得的曲线的斜率。
结果显示于下面的表2中表2
酶促活性表示为荧光单位×1000/分钟。
*直接从血清测量的活性(未免疫纯化)受到低估，因为活化的PSA立即与血清ACT复合。
该表显示，能够测量从血清中免疫纯化出的PSA的酶促活性因此血清含有可活化游离PSA。
总是可以清楚地注意到用抗体5D3D11免疫纯化的PSA和用抗体6C8D8免疫纯化的PSA之间在活性上的明显不同，显示抗体5D3D11特异性地识别可活化游离PSA。
实施例3抗体5D3D11在用于区分前列腺的BPH和腺癌的诊断测试中的用途对于含量测定，使用Vidas仪器，其作了调整以包括合适的测定试剂，但根据供应商(bioMérieux，法国)的说明书使用。
3.1患者血清中的可活化PSA的含量测定将抗体5D3D11在三明治型测试中用作捕获抗体。用偶联至碱性磷酸酶的抗-总PSA抗体5D5A5检测被捕获的PSA。该技术方案如在上面描述。
使用用抗体5D3D11免疫纯化的精液PSA并根据供应商推荐的方法进行标准化测试并测定总PSA的量。该测试的检测界限是0.05ng/ml的活性PSA/ml。浓度范围为0-1.5ng/ml的标准曲线显示于图2中。该曲线，其接近一条直线，证明了使用识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位的结合配偶体进行含量测定使得能够以良好的灵敏性检测可活化游离PSA。
3.2患者血清中的(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的含量测定重复上面描述的操作方法，除了将抗-游离PSA抗体6C8D8用作用于捕获血清中的非活性游离PSA形式的捕获抗体，并且将偶联至碱性磷酸酶的抗-总PSA抗体11E5C6用作检测抗体，其在本情况下识别裂解的游离PSA形式和变性的游离PSA形式。
3.3使用可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率用于更好地区分前列腺癌和BPH用177份含有PSA的患者血清进行回顾性研究。这些血清对应-89份明确确定了总PSA水平、肿瘤等级、Gleason评分和可能的有关随后进行的治疗(放射性疗法、激素疗法、前列腺切除术或未知)的信息的前列腺癌，-65份良性增生，
-23份正常前列腺(具有＞2.5ng/ml的PSA水平，但是活组织检查阴性)。
计算这些血清的用上面的含量测定法获得的可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率，并且这些值在图3的A部分的图上显示。
如图3的A部分中显示的，对具有在2.5-10ng/ml之间的总PSA水平的血清使用0.66的阈值，可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率使得能够辨别22/33的癌症(67％)、19/19的正常前列腺(100％)和27/28的BPH(96％)。
为了比较，使用两种Vidas试剂盒(总PSA试剂盒和游离PSA试剂盒，bioMérieux，法国)并根据供应商推荐的用法计算游离PSA/总PSA的比率。结果在图3的图表的B部分中显示。该B部分显示，对于0.15-0.25的值存在不确定区域。
3.4本发明方法的灵敏性3.4.1对于包括在现有技术的方法的不确定区域内的血清对于28份用现有技术的方法获得的属于不确定区域的血清施用本发明方法获得的可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率在图4中显示。
该图证明，对于其中游离PSA/总PSA的比率在0.15-0.25之间的血清、其中用已知的方法不能区分癌和BPH的血清，可活化PSA/(裂解的游离PSA+变性的游离PSA)的比率使得能够辨别13/15的癌(80％)、7/7的BPH(100％)和6/6的正常前列腺(100％)。
3.4.2对于具有低于2.5ng/ml的PSA水平的血清选取20份具有低于2.5ng/ml的PSA水平的来自患有癌(11份)或患有BPH(9份)的患者的血清，并在图5中显示可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率值。
该图证明，对于具有低于2.5ng/ml的PSA水平的血清，用可活化PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率区分前列腺癌和BPH仍旧有效。
3.5检测抗体的更改对8份血清，即5份患有前列腺癌的患者的血清和3份患有BPH的患者的血清，重复上面的操作方法，除了将抗体11E5C6(Michel S.等，1999，同上)用作检测抗体。
结果在图6中指出，其中用抗体5D5A5作为用于检测可活化PSA的抗体而得到的可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率值显示于曲线的A部分，以及用相同的血清但使用抗体11E5C6作为检测抗体而获得的可活化游离PSA/(变性的游离PSA+裂解的游离PSA)的比率值显示于B部分。
该图证明，无论使用什么检测抗体均明确地存在阈值，并且该阈值取决于检测中使用的抗体。
实施例4用能以非特异性方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体检测生物样品中的PSA的可活化游离形式1.使用的样品使用了9份其总PSA的浓度范围为157-3.8ng/ml的单独的血清，所述的血清来自Liège的CHU，或来自位于Lyon的 desArmées，Desgenettes。
2.使用抗体11E5C6免疫纯化PSA2.1.用珠偶联抗体将预先对于链霉抗生物素蛋白(DynabeadsM-280链霉抗生物素蛋白，Dynal)敏化的108个珠即150μl珠溶液引入至管中，并用500μl已经加入了0.5％Tween 20的0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，0.15MNaCl，0.1％BSA(缓冲液D+0.5％T)洗涤3次。每次洗涤在环境温度下进行5分钟，在轮状装置上进行以便保持溶液均质。
在轮状装置上，将该108个珠与500μl 20μg/ml的抗体11E5C6(bioMérieux，Marcy，法国)，即10μg抗体，在缓冲液D+0.05％T中于环境温度下偶联30分钟。偶联后，加入5μl 10mM的生物素至500μl抗体溶液中，并在轮状装置上于环境温度下孵育30分钟。
为了除去多余的生物素和抗体，然后用500μl缓冲液D+0.5％T在轮状装置上于环境温度下洗涤5次，每次5分钟。
2.2.PSA结合将1ml含有PSA的样品(或是用作对照的稀释的精液PSA，或是血清)引入至含有108珠的管中，并于4℃下孵育过夜。
孵育期后，回收并测定未结合的PSA以便确定剩余的PSA的量。
然后用500μl具有0.5％浓度的Tween 20的缓冲液D进行三次洗涤，以便脱离下非特异性结合的蛋白。
2.3.洗脱用100μl已经加入1mg/ml BSA的0.2M Tris-甘氨酸(pH 2.2)在环境温度下洗脱PSA 5分钟。酸性pH导致PSA-Ab键的断裂。回收的洗脱物用11μl 0.1M Tris pH 9.6中和，以便避免溶液酸性引起的蛋白的降解并保留其酶促活性。
3.测定样品的游离PSA和总PSA的含量使用测量总PSA(TPSA)和游离PSA(FPSA)的含量测定试剂盒，根据供应厂商推荐的用法并根据下述技术方案，用VIDAS仪器(bioMérieux，Marcy，法国)进行该含量测定将分别针对总PSA或游离PSA的特异性抗体连接至锥体( )上。对于这两个测试，检测抗体是偶联至碱性磷酸酶的抗体11E5C6，该碱性磷酸酶催化底物的水解反应而生成产物，所述产物发射的荧光在450nm测量。
每次测试需要200μl样品，该样品存放在小棍上，并在1小时内获得结果。TPSA测定具有0.07ng/ml的PSA的灵敏度并可检测多达100ng/ml的PSA。FPSA测定具有0.05ng/ml的灵敏度并可以检测多达10ng/ml的PSA。
4.PSA的酶促活性的测量4.1捕获抗体的连接用100μl在碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释至10μg/ml的链霉抗生物素蛋白包被ELISA板的孔。然后用250μl已经加入了2mg/ml的BSA的50mM Tris+0.15M NaCl缓冲液，pH 7.5(TBS)(TBS+BSA)对孔进行饱和以避免非特异性结合并因而限制本底噪音。在含有0.05％Tween 20的TBS(TBS+0.05％T)中洗涤3次后，然后加入100μl10μg/ml的生物素化的抗体8G8F5(bioMérieux，Marcy，法国)并在37℃下孵育2小时。该步骤后在TBS+0.05％T中洗涤3次。
4.2.PSA的孵育将85μl稀释于TBS+BSA中的PSA(精液PSA或免疫纯化的血清)引入孔中并在4℃下孵育过夜。然后在TBS+0.05％T中将孔洗涤3次，这使得能够除去未结合的PSA。然后将酶与100μl已经加入了1.5M的NaCl的底物TBS+BSA在37℃下孵育15分钟。
4.3.显影和测定将底物KGISSQY-AFC在已经加入了1.5M NaCl的TBS+BSA中稀释。然后将100μl的这种稀释的底物加至孔中并在37℃下孵育。在37℃下于2小时内，每分钟用Fluoroskan仪(ThermoLabsystem)测量发射的荧光。
酶的酶促活性通过计算动力学的斜率而确定，并表示为荧光单位×1000/分钟。
5.结果结果显示于下面的表3中。
表3
在这些血清中，血清1和血清9源于确定患有前列腺癌的患者，其也得到了本发明方法的证实。
序列表<110>bioMérieux<120>用于检测PSA的可活化游离形式的方法及其用于诊断前列腺的良性病理学和前列腺的腺癌的用途<130>可活化PSA<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>表位<400>1Asp Thr Pro Tyr Pro Trp Gly Trp Leu Leu Asp Glu Gly Tyr Asp1 5 10 1权利要求
1.用于体外诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述的方法的特征在于其包括在来自怀疑患有前列腺良性病理学或患有前列腺腺癌的患者的生物样品中检测PSA的可活化游离形式的步骤。
2.如权利要求1所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于其包括以下步骤i)让能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体与来自怀疑患有前列腺良性病理学或前列腺腺癌的患者的生物样品接触；ii)证明所述的结合配偶体捕获了PSA的可活化游离形式；iii)计算在步骤ii)中检测的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率；和iv)通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选择的并代表了每种病理学的检测界限。
3.如权利要求2所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于用于步骤i)中的所述结合配偶体能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位。
4.如权利要求2或3所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于用于步骤i)中的所述结合配偶体是抗体或抗体片段。
5.如权利要求2-4之任一项所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于所述结合配偶体捕获PSA的可活化游离形式的证明是使用检测配偶体，优选使用抗-总PSA抗体通过间接检测而进行的。
6.如权利要求2-4之任一项所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于所述结合配偶体捕获PSA的可活化游离形式的证明是通过测定免疫纯化的并活化的PSA的可活化游离形式的酶促活性而进行的。
7.如权利要求2-6之任一项所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于除了能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体之外，其还使用能增加PSA的酶促活性的抗体。
8.如权利要求2-7之任一项所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于用于计算比率的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式是非活性游离形式的PSA或裂解和变性的游离形式的PSA。
9.用于诊断前列腺的腺癌和前列腺的良性病理学的诊断试剂盒，所述试剂盒的特征在于其包括-能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体，和-用于测定除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的手段。
10.如权利要求9所述的诊断试剂盒，所述试剂盒的特征在于所述的结合配偶体能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位，优选是抗体或抗体片段。
11.如权利要求9或10所述的诊断试剂盒，所述试剂盒的特征在于所述的手段是抗体或抗体片段。
12.由能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体和可活化游离形式的PSA组成的缀合物。
13.如权利要求12所述的缀合物，所述缀合物的特征在于所述的结合配偶体能识别由序列SEQ ID No.1模拟的表位。
14.如权利要求12或13所述的缀合物，所述缀合物的特征在于可活化游离形式的PSA被激活。
15.如权利要求1所述的用于诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于其包括以下步骤i)让能以非特异性方式结合至可活化游离PSA的结合配偶体与来自怀疑患有前列腺良性病理学或前列腺腺癌的患者的生物样品接触；ii)通过在活化PSA的可活化游离形式后测定被活化的PSA的游离形式的酶促活性来证明所述结合配偶体捕获了PSA的游离形式；iii)计算在步骤ii)中检测的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率；和iv)通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选择的并代表了每种病理学的检测界限。
16.如权利要求15所述的用于诊断前列腺的良性病理学和前列腺的腺癌的方法，所述方法的特征在于PSA的可活化游离形式的激活是使用能增加PSA的酶促活性的抗体而进行的。
全文摘要
本发明涉及用于体外诊断前列腺的良性病理学或前列腺的腺癌的方法，所述的方法的特征在于其包括在来自怀疑患有前列腺良性病理学或患有前列腺腺癌的患者的生物样品中检测PSA的可活化游离形式的步骤。这种诊断方法可以通过以下步骤实施i)让能特异性结合至可活化游离PSA的结合配偶体与来自怀疑患有前列腺良性病理学或前列腺腺癌的患者的生物样品接触；ii)证明所述的结合配偶体捕获了PSA的可活化游离形式；iii)计算在步骤ii)中检测的PSA的可活化游离形式的量与在取自相同受试者的相同本质的样品中存在的除了可活化游离形式之外的其他PSA形式的量的比率；和iv)通过将在步骤iii)中测定的比率值与预定阈值比较来确定患者是否患有前列腺腺癌或患有前列腺良性病理学，其中所述的阈值是根据所使用比率的类型而选择的并代表了每种病理学的检测界限。
文档编号C07K16/40GK1926433SQ200580006663
公开日2007年3月7日 申请日期2005年3月1日 优先权日2004年3月3日
发明者S·巴瑟尔特－米歇尔, C·洛利夫雷-雷诺 申请人:拜奥默里克斯公司