专利名称：用于治疗癌症的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗某些肿瘤的、包含多元酚例如矢车菊苷配质(procyanidins)及其衍生物的组合物及其使用方法，更通常地说，是在肿瘤细胞中引起超磷酸化(hyperphosphorylation)的细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用，其中所述蛋白质的超磷酸化促使细胞转化。
背景技术：
原花青素类(proanthocyanidins)由于其广泛的生物学活性在医药和营养领域非常引人注目(例如美国专利号6,638,971)。目前申请人已经发现矢车菊苷配质及其衍生物的特异性抗癌特性和它们对涉及调节细胞周期的蛋白质的调节的影响。这样的蛋白质的实例为Cdc2、AKT、分叉头转录因子(forkhead transcription factor)、p53和pRb。
Cdc2是控制细胞周期和细胞凋亡两者中的重要的蛋白激酶[Konishi，Y.et al.，Molec.Cell，91005-1016，2002]。Cdc2 Tyr15残基的磷酸化作用抑制其功能并产生对导致细胞凋亡的紫杉醇(Taxol)的耐药性[Tan，M.et al.，Molec.Cell，9993-1004，2002]。
由已知的致癌基因编码的AKT，也称为蛋白激酶B，是在促进广泛的细胞类型的存活中起核心作用的丝氨酸/苏氨酸激酶[Khwaja，A.，Nature，pp.33-34(1990)]。AKT的抑制作用引起人卵巢癌细胞的细胞凋亡，证明AKT可能是用于癌症治疗和其它增殖性疾患的重要目标[Zang，Q.Y.，et al.，Oncogene，19(2000)]。实际上，AKT通常用作卵巢癌和乳腺癌的标志。AKT通过使分叉头转录因子(FKHR)在氨基酸位置Ser256上磷酸化(导致对FKHR功能的抑制)促进细胞存活[Brunet，A.，et al.，Cell，96857-868(1999)]。AKT介导的FKHR的Ser256的磷酸化通过减低FKHR控制的Fas配体的表达抑制细胞凋亡[Jackson，J.G.et al.，Oncogene，1984574-4581，2000；Nakamura，N.et al.，Mol.Cell.Biol.，208969-8982，2000；Rena，G.et al.，EMBO J.，212263-2271，2002]。
与恶性化有关的早期基因变化涉及调节细胞周期过程的基因并且由于视网膜神经胶质瘤(pRb)和p53细胞周期通路的缺陷，这些变化常常导致肿瘤细胞中的G1关卡的丢失[Lomazzi，M.et al.，NatGenet.，31190-194，2002]。这些蛋白质的转录后的修饰似乎是它们功能调节的重要机制。
例如，p53的Ser392的磷酸化作用通过使p53四聚物形成稳定而激活特异性的DNA结合功能[Keller，D.M.et al.，Molec.Cell，7283-292，2001；Fiscella，M.，et al.，Oncogene，93249-3257，1994]。有报道几种应激刺激也使Ser392(小鼠中的Ser389)磷酸化。另外，最近的对人肿瘤中的p53磷酸化的分析显示在被分析的10个位点中，Ser15、Ser81和Ser392残基的超磷酸化和乙酰化作用存在于最常见的修饰中[Minamoto，T.K.，et al.，Oncogene，203341-3347，2001]。人肿瘤中的p53在Ser392的增强的磷酸化作用是经常发生的[Furihata，M.et al.，J.Pathos.，19782-88，2002]。
pRb的丝氨酸残基也关键地涉及到G1/S转换中。已知细胞周期蛋白(cyclin)D-Cdk4使pRb在Ser780和可能在Ser795磷酸化[Kitagawa，M.，et al.，EMBO J.，157060-7069，1996；Panigone，S.et al.，Oncogene，194035-4041，2002]。已有报道，转化生长因子β(TGF-β)和视黄酸两者通过使pRb在Ser780、Ser795和Ser807/811脱磷酸化引起G1细胞周期停留[Hu，X.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，276930-939，2000；Dimbert，A.et al.，Blood，992199-2206，2002]。
因此，细胞周期调节蛋白是用于肿瘤治疗有用的标靶。目前，在本领域中需要能够靶向使这些蛋白质超磷酸化和/或过度表达以预防和/或治疗增殖性生长的化合物。现在已经发现本发明的化合物及其组合物对于这些应用是有效的。
发明概述本发明涉及用于治疗某些肿瘤，特别是某些癌症的组合物、产品和方法，更通常地说，涉及诱导肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用。
一方面，本发明涉及包含本发明化合物例如矢车菊苷配质或其衍生物的组合物，例如药物、食物、食物添加剂或膳食补充剂。所述组合物可任选包含另外的化学治疗剂，或可与另外的化学治疗剂联合给予。包含以上所提到的组合物的包装产品以及用于治疗肿瘤的标签和/或说明书也在本发明的范围之内。
另一方面，本发明涉及诱导肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白，例如Cdc2、FKHR、p53和pRb的脱磷酸化的方法，其中所述蛋白质的超磷酸化促使转化。
在又一方面，本发明涉及通过给予哺乳动物，例如人或脊椎动物，有效量的矢车菊苷配质或其衍生物治疗肿瘤(其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用)的方法。总之，本发明涉及通过给予有效量的本发明化合物治疗哺乳动物，例如人或脊椎动物的肿瘤的方法。癌症的非限制性的实例为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌。
在再一方面，本发明涉及一种方法，该方法包括(i)绘制(profiling)患者的细胞周期调节蛋白，例如Cdc2、AKT、FKHR、p53、细胞周期蛋白D1和pRb的过度表达和/或超磷酸化状态，和(ii)通过给予有效量的本发明化合物治疗表现为这些蛋白质的超磷酸化和/或过度表达的患者。
图的简述
图1A-C表示经五聚物处理的人乳腺癌细胞的LPS(分层蛋白扫描)多孔板和免疫印迹分析的结果。A)以100μg/mL的五聚物(T)处理48和72小时的MDA MB-231细胞和以DMSO(C)处理的对照细胞的LPS斑点印迹(LPS dot blot)；B)与在A)中相同样本的蛋白质印迹；C)从它们的磷酸化状态以抗体独立检定的Cdc2、FKHR、p53和pRb的再探测膜(reprobed membranes)的蛋白质印迹。为了测试荷载(loading)的相等性，印迹以GAPDH再探测。结果为使用相同的蛋白质样本的两个独立的免疫印迹分析的代表。
图2A-B表示以五聚物处理的人乳腺癌细胞中的p53的高分辨图。A)以五聚物处理48和72小时的MDA-MB-231细胞和相应的以DMSO处理的对照组的LPS免疫印迹；B)在从A)的单独的实验中以五聚物和DMSO处理72小时的MDA MB-231、MDA MB-468和MCF-7细胞的LPS免疫印迹。为了测试荷载的相等性，印迹以GAPDH探测。数据为使用相同的蛋白质样本的两个独立的免疫印迹分析的代表。
图3表示以五聚物处理的人乳腺癌细胞中的pRb(使用LPS-免疫印迹技术)的高分辨图。为了测试荷载的相等性，印迹以GAPDH探测。数据为使用相同的蛋白质样本的两个独立的免疫印迹分析的代表。
详细描述所有的专利、专利申请和在申请中引用的参考文献通过引用结合于本文。如果有任何矛盾，以本公开内容为准。
本发明涉及包含有效量的具有下式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)的组合物
其中n是从2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如通过酯键，被酚的部分任选取代。
上式中的单体单元可经由4→6和4→8键结合。糖可选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖优选单糖或二糖。酚部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。衍生物的实例包括苷、五倍子酸酯、酯、化合物An的氧化产物等。氧化产物可如在美国专利号5,554,645(其相应的部分通过引用结合于本文)中公开的那样制备。
在一个实施方案中，组合物包含有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)
其中n是从2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6和C-8上；和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
上式中的单体单元可经由4→6和4→8键结合。糖可选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖优选单糖或二糖。酚的部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。衍生物的实例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化产物等。
对产品和在本发明的方法中有用的化合物实例包括其中整数n是3-18；2-12；3-12；2-5；4-12；5-12；4-10或5-10的化合物。在一些实施方案中，化合物是矢车菊苷配质四聚物或五聚物。
在一个实施方案中，聚合体化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)具有下式 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6和C-8上；和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；所述糖在任何位置上，例如通过酯键，被酚的部分任选取代。
上式中的单体单元可经由4→6和4→8键结合。糖可选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖优选单糖或二糖。酚的部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。衍生物的实例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化产物等。
在另一个实施方案中，聚合体化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)具有下式 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6和C-8上；和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
上式中的单体单元可经由4→6和4→8键结合。糖可选自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。糖优选单糖或二糖。酚的部分选自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、五倍子酸、羟基苯甲酸和芥子酸。衍生物的实例包括苷、五倍子酸酯、酯、氧化产物等。
五聚物的实例可为[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表儿茶素和C是儿茶素。
在一个实施例中，五聚物具有下式 可以使用纯化的单个的五聚物和五聚物混合物。纯度可以例如至少约为50％，或至少约为60％，或至少约为70％，或至少约为80％，或至少约为90％，或至少约为92％，或至少约为95％，或至少约为98％，或至少约为99％。可以使用以上纯度的任何式An的化合物、其盐和衍生物。
使用方法本发明涉及用于某些肿瘤，特别是某些癌症的治疗的方法，更通常地说，涉及诱导在肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用。依据在此描述的方法所要治疗的癌症的非限制性的实例为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌和胰腺癌。在本申请中描述的任何化合物可被用于实施在此描述的方法。
在某些实施方案中，本发明提供诱导、促进或刺激肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用(其中所述蛋白质的超磷酸化促使转化)的方法，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)接触 其中n是从2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如通过酯键，被酚的部分任选取代。
例如，上述方法可涉及化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)的应用，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Z和Y是氢。在上述方法的一些实施方案中，式An中的糖优选单糖或二糖。适合的糖的实例为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。酚的部分的实例如上所述。
在一个实施方案中，诱导、促进或刺激肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用(其中所述蛋白质的超磷酸化促使转化)的方法包括使肿瘤细胞与有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)接触 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6和C-8上；和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
五聚物的实例可为[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表儿茶素和C是儿茶素。
在一个实施例中，五聚物具有下式
如在此所使用的，“细胞周期调节蛋白”为或者直接或者间接地调节细胞周期的蛋白质。直接调节细胞周期蛋白质的实例为Cdc2、p53和视网膜神经胶质瘤蛋白(pRb)，间接调节细胞周期的蛋白质的实例为分叉头转录因子(FKHR)。因此，在某些实施方案中，诱导、促进或刺激肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用的方法将会涉及Cdc2、p53、pRb和/或FKHR。更具体地说，该方法涉及诱导、促进或刺激在氨基酸位置Tyr15的超磷酸化Cdc2、在氨基酸位置Ser392的超磷酸化p53、在氨基酸位置Ser256的超磷酸化FKHR和在氨基酸位置Ser780、Ser795和Ser807/811中至少一个超磷酸化pRb的脱磷酸作用。
词组“超磷酸化细胞周期调节蛋白”指的是那些磷酸化状态是异常的(即不像在正常功能的细胞中发现的那样)引起蛋白质功能改变和细胞周期变化的细胞周期调节蛋白。应该理解“超磷酸化”促使正常细胞向肿瘤细胞转化，即它是导致肿瘤生成和细胞的肿瘤表型的起主要作用的因子。
本发明还涉及治疗其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤的方法，包括给予罹患所述肿瘤的人或脊椎动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物) 其中n是从2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如通过酯键，被酚的部分任选取代。
例如，上述方法可涉及给予化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Z和Y是氢。在上述方法的一些实施方案中，式An中的糖优选单糖或二糖。适合的糖的实例为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿戊糖。酚部分的实例如上所述。
在一个实施方案中，治疗其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤的方法，该方法包括给予罹患所述肿瘤人或脊椎动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物) 其中n是5；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6和C-8上；和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
五聚物的实例可为[EC-(4β→8)]4-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-EC、[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→8)-C和[EC-(4β→8)]3-EC-(4β→6)-C，其中EC是表儿茶素和C是儿茶素。
在一个实施例中，五聚物具有下式
如在此所使用的，“治疗”意为例如通过减缓疾病进程、延长存活时间、降低死亡风险和/或诱导相关的细胞周期调节蛋白的磷酸化状态可量化的减少，改善现有的病症，例如，其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤。
以上的治疗方法涉及，例如治疗其中Cdc2、p53、pRb和/或FKHR的超磷酸化促使肿瘤表型的肿瘤。更具体地，该方法可涉及其中在氨基酸位置Tyr15的超磷酸化Cdc2、在氨基酸位置Ser392的超磷酸化p53、在氨基酸位置Ser256的超磷酸化的FKHR和/或在氨基酸位置Ser780、Ser795和Ser807/811中至少一个上超磷酸化的pRb促使肿瘤表型的肿瘤的治疗。所要治疗的肿瘤的实例为乳腺癌、卵巢癌和结肠癌。
词组“其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤“指的是在其发展中超磷酸化细胞周期调节蛋白至少是导致肿瘤发生的因素之一的肿瘤。
本发明还包括在罹患至少在氨基酸位置Ser392上超磷酸化的过度表达p53的肿瘤的人中，治疗肿瘤，特别是癌症的方法。这样的癌症的实例为乳腺癌和结肠癌。
还提供治疗人或脊椎动物中过度表达AKT激酶的癌症的方法。这样的癌症的实例为过度表达AKT的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌或结肠直肠癌。过度表达AKT激酶的患者适于用本发明化合物治疗，因为作为癌症预兆性标志之一的AKT，使在氨基酸位置Ser256的FKHR磷酸化并抑制之，因而阻止细胞走向细胞凋亡。本发明化合物还适于和AKT抑制剂一起的联合疗法。AKT抑制剂的实例包括SRI国际实验药物SR13668。
还提供治疗人或脊椎动物的过度表达细胞周期蛋白D1的肿瘤，特别是癌症的方法。这样的癌症的实例为过度表达细胞周期蛋白D1的乳腺癌；这样的过度表达发生在约50％的乳腺癌患者中。细胞周期蛋白D1在肿瘤发生和分化中起关键作用。细胞周期蛋白D1基因编码使肿瘤抑制蛋白质pRb磷酸化和失活的全酶的调节亚单位。因此，过度表达细胞周期蛋白D1的患者适合用本发明化合物治疗。本发明化合物还适于和靶向细胞周期蛋白D1的化学治疗剂一起的联合疗法。这样的药物的实例为抑制细胞周期蛋白D1的视黄醛衍生物、维生素A的天然的和合成的衍生物。参见Petty et al.，Lung Cancer，2003 Aug；41 Suppl 1S155-61，其临床前和临床研究的描述通过引用结合于本文。
在罹患对紫杉醇(Taxol)的治疗产生耐药的癌症的人或脊椎动物中治疗肿瘤，特别是癌症的方法也在本发明的范围中。通过ErbB2使Cdc2的Tyr15磷酸化将抑制Cdc2的激活并产生对紫杉醇(paclitaxel)导致的细胞凋亡的抵抗。因为本发明化合物可使在Tyr15的Cdc2脱磷酸化，因此可治疗对紫杉醇耐药的患者。本发明化合物可单独给予或在与紫杉醇联合疗法中一起给予。
可使用本发明化合物和至少一种另外的化学治疗剂实施以上任何方法。除了以上所提到的化学治疗剂，也可使用例如AKT和细胞周期蛋白D1抑制剂，生长因子抑制剂。表皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素生长因子受体(IGFR)和Her-2的抑制剂是典型范例。这样的药物的实例为酪氨酸激酶受体的抑制剂，例如C225，一种抗EGFR单克隆抗体(Overholser et al.，Cancer 2000 Jul 1；89(1)74-82)和曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin，Genentech)，一种有效的和给过度表达该受体的乳腺癌患者的抗ErbB2受体的单克隆抗体处方药；结合位点在酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶上的三磷酸腺苷的竞争性抑制剂，例如ZD1839(还已知为吉非替尼(gefitinib)或易瑞沙(Iressa)，参见www.clinicaltrials.gov)；OSI-774(TarcevaTM；参见Prados et al.，9thASCO Annual Meeting，Chicago，IL，Msy 31-June 3，2003(ClinicalStudy，Abstract No.394)；CI-1033，ErbB2抑制剂(参见clinicaltrials.gov)，以上的参考资料通过引用结合于本文。
在一些实施方案中，可给予本发明化合物，以提高化学治疗剂和/或方法的应答。为了此目的，也可使用非药物的剂型，例如膳食补充剂和食物。
本发明还包括在具有发展肿瘤的风险的患者(其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用)中，通过给予本发明化合物，引起超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用预防(化学预防)肿瘤，特别是癌症的方法。
术语“预防”意为降低与发展疾病有关的风险，包括减少疾病的发生。
词组“具有发展肿瘤的风险的患者”意为与其它健康的人群比较，具有在有发展肿瘤的风险因子的人群中增加肿瘤的可能性特征的患者。风险因子可以是暴露于紫外射线或接触化学剂。
以上的描述方法可用于人或脊椎动物，例如狗、猫和马。
因此，以下的应用在本发明的范围之内。如上所定义的化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于引起在肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用(其中所述蛋白质的超磷酸化促使转化)的药物、食物、营养保健品(nutraceutical)或膳食补充剂的制备中的应用。如上所定义的化合物An，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于治疗其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤的药物、食物、营养保健品或膳食补充剂的制备中的应用。细胞周期调节蛋白的实例为Cdc2、p53、FKHR和pRb。
以下的应用为一些实施方案的代表。如在此定义的式An化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于治疗过度表达至少在氨基酸位置Ser392上被超磷酸化的p53的肿瘤的药物、食物、营养保健品或膳食补充剂的制备中的应用。如在此定义的式An化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于治疗过度表达细胞周期蛋白D1的肿瘤的药物、食物、营养保健品或膳食补充剂的制备中的应用。如在此定义的式An化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于治疗过度表达AKT的肿瘤的药物、食物、营养保健品或膳食补充剂的制备中的应用。如在此定义的式An化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物)，在用于治疗对以紫杉醇(Taxol)治疗耐药的癌症的药物、食物、营养保健品或膳食补充剂的制备中的应用。
以上描述的方法还可包括，通过例如测试其超磷酸化待治疗的细胞周期调节蛋白的磷酸化状态，确定治疗的有效性。
本发明的优势在于它对肿瘤特别是癌症的治疗提供了个性化给药方法。对于每位患者，可评价他/她的细胞周期调节蛋白的表达和磷酸化状态以及适合的可以应用的本发明化合物和方法。因此，对患者的描图和随后对他们的治疗的方法也在本发明的范围之内。
本领域内的专业技术人员应该理解，可使用本领域内熟知的方法和试剂测定被绘图(profiled)的和/或待治疗的患者的过度表达。例如，可采用适合的抗体(例如抗AKT或抗细胞周期蛋白D1抗体)，使用蛋白质印迹法，或者，如果过度表达在转录水平，采用适合的核酸探针，使用DNA(Southern)和RNA(Northern)印迹法检测过度表达。可使用识别磷酸化的氨基酸残基的抗体检测超磷酸化作用。这些方法的实例也示于实施例3中。
通过本领域内的专业技术人员采用在此提供的指导原则和本领域内的常识，可确定有效量。例如，有效量可以在例如哺乳动物体内达到生理学上相关的浓度。这样的生理学上相关的浓度可至少为20毫微摩尔(nM)，优选至少约为100nM和更优选至少约为500nM。在一个实施方案中，在哺乳动物例如人的血液中，至少达到约1毫摩尔。可给予从约50mg/天至约1000mg/天，优选从约100-150mg/天至约900mg/天，和最优选从约300mg/天至约500mg/天的如在此定义的式An化合物。然而，可使用高于以上提到的量。
作为给药方案，治疗/预防性给药可连续进行，即持续有效的时间，例如，每天、每月、每两月、每半年、每年，或如需要，以如专业的执业医师确定的某些其它的给药方案所需的这样的时间。给药可连续进行至少所需要的时间周期，以减少超磷酸化至治疗相关的水平。优选地，每天，最优选每天两或三次，例如早晨和晚上给予组合物，以维持哺乳动物体内有效的化合物水平。为了获得最有益的结果，可给予组合物至少约30天，或至少约60天。这些给药方案可周期性地重复。
组合物和制剂本发明的化合物可由不同来源，源于天然(例如Theobroma属、Herrania属)或由合成方法制备。在某些实施方案中，该化合物源自可可，包括可可黄烷醇类和/或可可矢车菊苷配质低聚物。除可可多元酚之外，或作为其替代，组合物可包含非可可来源的多元酚，其具有与可可多元酚相同或相似的结构和/或性质。
在此使用的术语“可可多元酚”(CP)指的是多元酚性(polyphenolic)物质例如以可可豆类为特征的黄烷醇类和它们相关的低聚物。换言之，可可多元酚、可可黄烷醇或可可矢车菊苷配质低聚物可为不管其来源的任何这样的多元酚、黄烷醇或矢车菊苷配质低聚物，其具有天然存在于可可中的多元酚、黄烷醇或矢车菊苷配质的结构式。在一个实施方案中，这些化合物可从可可豆类或可可成分中提取。术语“黄烷醇”包括单体儿茶素和表儿茶素。儿茶素和表儿茶素的低聚物被称为矢车菊苷配质。任何在此提到的多元酚应该被理解为也一并和单独应用于黄烷醇类和矢车菊苷配质，反之亦然。
术语“可可成分”指的是包含可可固体，例如巧克力液体和部分或完全脱脂的可可固体(例如饼块或粉末)的源于无壳的可可尖(nibs)的物质。
用于本发明的多元酚可为天然来源的，例如，源于可可豆或另一种天然来源的多元酚，或通过合成制备的。本领域技术人员基于可用性和成本可选择天然的或合成的多元酚。多元酚可以以含有可可多元酚，例如，含在巧克力中的巧克力液体的可可成分的形式被包含在组合物中，或可以独立于可可成分，例如，作为提取物、提取部分、分离的和纯化的单一的化合物、合并的提取部分或由合成制备的化合物被加入。
矢车菊苷配质低聚物可具有从2至约18，优选从2至约12和最优选从2至约10个单体单元。作为选择，低聚物可有从3-18，优选3-12和更优选3-10个单体单元；或从5-18，优选5-12和更优选5-10个单体单元。例如，低聚物可为二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物、九聚物和十聚物。在低聚物中，单体经由(4→6)和/或(4→8)的内黄烷(interflavan)键连接。具专有性的(exclusively)(4→8)键的低聚物是线性的；而至少一个(4→6)键的存在导致支链的低聚物。包含至少一个非天然的键(6→6)、(6→8)和(8→8)的低聚物也在本发明范围之内。这种非天然存在的低聚物的合成在2000年10月19日作为WO 00/61547公开的国际申请号PCT/US00/08234中有描述，其相关的部分通过引用结合于本文。任何本发明化合物中的黄烷-3-醇(单体的)单元可为(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素和它们各自的差向异构体(例如(-)-儿茶素和(+)-表儿茶素))。
可可多元酚可通过从可可豆类、可可尖或可可成分例如巧克力液体、部分脱脂的可可固体和/或完全脱脂的可可固体提取制备。优选地，从完全或部分脱脂的可可粉制备提取物。可使用从任何Theobroma、Herrania种或其种间和种内杂交的豆类。可从发酵的、正在发酵的或未发酵的豆类制备提取物，发酵的豆类有最少量的可可多元酚而未发酵的有最多的可可多元酚。豆类的选择可基于豆类发酵因子作出，例如，提取物可从具有发酵因子约275或更少的豆类加工得到。通过如在作为WO 98/09533发表的国际申请号PCT/US97/15893中所述(其中相关的部分通过引用结合于本文)，控制发酵的程度，可使在可可成分和其提取物中的多元酚的水平最优化。
可从可可成分中提取可可多元酚，所述的可可成分通过使用加工可可的传统方法(例如，在Industrial Chocolate Manufacture and Use，ed.Beckett，S.T.，Blackie Acad.&Professional，New York，1997，例如在第1、5和6章中所描述的)或使用在Kealey等的美国专利号6,015,913中描述的与传统方法对比保护可可成分中的多元酚(通过防止它们免受破坏)的改良的加工方法加工而得。改良的可可加工方法省略了传统的焙烧步骤。因此，可通过采用以下步骤得到可可成分(a)以足够的时间和温度加热可可豆以使可可壳变得松软而不焙烧可可尖；(b)从可可壳中精选(winnowing)可可尖；(c)螺旋压榨可可尖和(d)回收包含受保护水平的可可多元酚的可可脂和部分脱脂的可可固体。该方法比传统加工方法保留了相当高水平的矢车菊苷配质低聚物。通过该方法生产的可可固体可包含多于每克脱脂固体含20,000μg的总黄烷醇和/或矢车菊苷配质；优选多于25,000μg/g，更优选多于28,000μg/g和最优选多于30,000μg/g。作为本发明的目的，总黄烷醇和/或矢车菊苷配质的量如在实施例2中所述确定。
多元酚可从以上指出的来源，或任何其它含多元酚或黄烷醇或矢车菊苷配质的来源中，使用多元酚溶解于其中的溶剂提取。适合的溶剂包括水或有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇和乙酸乙酯。也可使用溶剂的混合物。当使用水作为溶剂时，可例如使用乙酸稍微酸化。一些溶剂的实例为水和有机溶剂的混合物，例如甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。有机溶剂的水溶液可包含，例如，从约50％至约95％的有机溶剂。因此，可使用约50％、约60％、约70％、约80％和约90％的有机溶剂的水溶液。溶剂还可包含少量的，例如，约0.5％至约1.0％的量的酸例如乙酸。提取物的组合物，矢车菊苷配质低聚物的表征(representation)(即低聚物的分布)和量将依赖于溶剂的选择。例如，水提取物主要包含单体，乙酸乙酯提取物包含单体和低级低聚物，主要为二聚物和三聚物，而甲醇、乙醇或丙酮水溶液的提取物包含单体和一定范围内的较高级低聚物。用于单体以及较高级矢车菊苷配质低聚物提取的溶剂之一为约70％的丙酮。然而，任何包含多元酚的提取物在本发明中都是有用的。可可多元酚的提取方法为在本领域内已知的和在例如，Romanczyk等的美国专利号5,554,645和作为WO 97/36497发表的国际申请号PCT/US97/05693中有描述。因此，在一个实施方案中，通过将可可豆类细化为可可粉、使粉脱脂、提取可可多元酚和纯化提取物制备可可提取物。可通过使可可豆类和果肉冷冻干燥、去果肉和除去冷冻干燥可可豆类的壳和碾磨去壳的豆类制备可可粉。
可可多元酚提取物可以例如通过除去咖啡因和/或可可碱纯化，和通过凝胶渗透色谱和/或高效液相色谱(HPLC)进一步纯化。对于高级矢车菊苷配质低聚物，可使用凝胶渗透色谱(例如在Sephadex LH-20上)浓缩提取物。例如，直到所选的低聚物开始从柱中洗脱之后，才可收集包含单体和低级低聚物的洗出液。这样的提取物的实例为本领域内已知的和在作为WO 97/36497发表的国际申请号PCT/US97/05693的实施例5中描述，其中相关的部分通过引用结合于本文。通过使用制备型HPLC，例如，正相HPLC，提取物可被分馏为例如包含以重量计至少50％的单体或特别的低聚物的单体的和低聚物的馏份。当特别的馏份包含单体或任何低级低聚物(例如二聚物、三聚物或四聚物馏份)，则该馏份包含以重量计约90-95％的特别的低聚物馏份。在分离之后，可汇合想要的馏份，以得到所选的低聚物例如包含低聚物3-10或5-10的组合。本领域内技术人员参考本说明书中的指导、本领域内的常识和例如在Romanczyk等的美国专利号5,554,645和作为WO 97/36497发表的国际申请号PCT/US97/05693中所教导的，可控制色谱的条件以获得想要的矢车菊苷配质分布图。
单体馏份一般包含单体表儿茶素和儿茶素的混合物；以及低聚物馏份一般包含二聚物(在二聚物馏份中)、三聚物(在三聚物馏份中)、四聚物(在四聚物馏份中)等的混合物。单体和低聚物的混合物出现于分离的馏份中，因为可可包含各单体、二聚物等的多于一种的类型。作为构筑矢车菊苷配质的嵌段(blocks)的两个单体，表儿茶素和儿茶素，以及连接低聚物中单体的化学键的结果，出现低聚物的变异性。因此，可可二聚物主要为B2和B5，其中的每个包含两个表儿茶素的单体。可使用反相HPLC，例如采用C18柱，可得到各单体和低聚物。
可可多元酚可作为可可提取物，例如源于溶剂的提取物、可可馏份、分离的化合物或以包含有效量的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质的可可成分或巧克力的形式用于本发明的组合物中。可使用传统的可可加工方法制备，但是优选使用在Kealey等的美国专利号6,015,913中描述的方法制备可可成分。作为选择，为了提高可可多元酚的水平，可使用从具有约275或更少的发酵因子的可可豆类制备的巧克力液体和可可固体。这些成分具有比用传统可可加工方法(例如用焙烧法)和完全发酵的豆类所可获得的更高的可可多元酚含量。巧克力可使用常规技术从以上所述的成分制备或使用在巧克力制备过程中为了保留可可多元酚的改良的方法，如在作为WO 99/45788发表的国际申请号PCT/US99/05414中描述的方法(其通过引用结合于本文)制备。由以下的非传统方法中的至少一种制备的巧克力在此指的是“具有保留量的可可多元酚的巧克力”(i)从正在发酵的或未发酵的可可豆类制备可可成分；(ii)在可可成分制备过程中保留可可多元酚；和(iii)在巧克力制备过程中保留可可多元酚。
合成的矢车菊苷配质也可应用和通过在本领域内已知的方法和如在例如作为WO 99/19319发表的国际申请号PCT/US98/21392中描述的方法(其中相关的部分通过引用结合于本文)制备。
黄烷醇和/或矢车菊苷配质衍生物也可是有用的。这些包括单体和低聚物的酯例如五倍子酸酯(例如表儿茶素五倍子酸酯和儿茶素五倍子酸酯)；与糖部分例如单-或二糖部分(例如β-D-葡萄糖)，例如在以上式的X、Y和/或Z位置衍生的化合物；葡糖化(glycosylated)单体和低聚物和它们的混合物；矢车菊苷配质单体和低聚物的代谢物，例如硫酸化的、葡萄糖醛酸化的和甲基化的形式，但不包括通过结肠微生物丛代谢产生的矢车菊苷配质的酶裂解产物。所述衍生物可来自天然来源或经合成制备。
本发明的组合物可用作药物、食物、食物添加剂或膳食补充剂。组合物可包含载体、稀释剂或赋形剂。根据预定的应用，可选择载体、稀释剂或赋形剂以适合人或脊椎动物的应用，食物、添加剂、补充剂或药物中的应用。组合物可任选包含另外的癌症治疗剂。
在此使用的“食物”是基本上含有用于有机体维持生长、修复和生命过程和提供能量的蛋白质、碳水化合物和/或脂肪的物质。食物还可包含补充性物质例如矿物质、维生素和调味剂，参见Merriam-Webster′s Collegiate Dictionary，10th Edition，1993。术语食物包括适合于人或动物消费的饮料。在此使用的“食物添加剂”如由FDA(美国食品药品管理局)在21C.F.R.170.3(e)(1)中所定义并且包括直接和间接的添加剂。在此使用的“药物”为医用药品。参见Merriam-Webster′sCollegiate Dictionary，10th Edition，1993。药物还可指药剂。在此使用的“膳食补充剂”为意欲补充膳食的产品(除了烟草制品外)，其具备或包含一种或多种以下膳食成分维生素、矿物质、草药或其它的植物性药材、氨基酸、用于由人通过增加每天总摄取补充到膳食的膳食物质，或这些成分的浓缩物、代谢物、要素(constituent)、提取物或组合。
任何常规食物包括任何通过使之存在多元酚或其衍生物，例如甲基化的化合物或代谢的下游产物，和任选与另一种癌症治疗/化学预防剂联合的已经改良的饮料。还可存在其它化合物，例如L-精氨酸、钙、钾、镁和抗氧化剂例如维生素E和维生素C，任何B族维生素、类胡罗卜素、瓜耳胶和/或单或多不饱和脂肪酸(例如ω-3)。
所述改良或者(i)通过添加多元酚或其衍生物到不含可可多元酚的食物中，或者(ii)当食物传统上可含有可可多元酚，例如例如巧克力时，通过提高多元酚水平超过用传统方法制备的食物的水平来实现。这种增进可由下列方法实现，通过添加例如为提取物、馏份或从中分离的和纯化的化合物的形式的另外的多元酚例如可可多元酚；通过加入与另一个含多元酚的成分(例如坚果皮)组合的可可多元酚；通过控制如上所述的可可成分的加工和可可豆的选择，以保留用于制备食品的可可成分中的可可多元酚；或通过控制如上所述的巧克力制备过程。因此，与相相对的常规食物(包括饮料)比较，这些食物(包括饮料)包含“提高了水平的多元酚”(包括可可矢车菊苷配质)。当巧克力制备商将含有可可多元酚的可可提取物添加到其以前商业上可获得的产品中时，出现具有提高了的多元酚水平的巧克力的实例。食物还可被指为“高可可多元酚食物”，即它们含有比它们的传统对应品更高的多元酚水平。
含有可可多元酚，或任何在此描述的化合物，和任选另一种肿瘤/癌症治疗剂的食物可适合于人或脊椎动物使用，并且包括宠物食物。食物可不同于糖食，然而，优选的低胆固醇食物为糖食例如认证的标准(standard of identity(SOI))和非SOI巧克力，例如牛奶、甜和半甜巧克力包括黑巧克力、低脂巧克力和可为巧克力覆盖糖果的糖果。其它的实例包括烘烤产品(例如核仁巧克力饼(brownie)、烘烤小吃、小甜点(cookie)、饼干)、调味品、格兰诺拉麦片饼(granola bar)、太妃口嚼糖(toffee chew)、代餐玉蜀黍棒(meal replacement bar)、涂于面包、饼干上的食物(spread)、糖浆、混合粉末饮料(powder beveragemix)、可可或巧克力风味的饮料、布丁、大米饼、什锦米饭(rice mix)、美味酱油等。如果想要，食物可为巧克力或可可风味的。食品可为巧克力和糖果棒，例如含有坚果(例如，花生、胡桃、杏仁、和榛子)的格兰诺拉麦片。需要指出的是将带皮的坚果加入在此描述的食物中也可增加总多元酚含量，因为，例如，花生皮含约17％的黄烷醇和矢车菊苷配质和杏仁皮含约30％的黄烷醇和矢车菊苷配质。在一个实施方案中，将坚果皮加入巧克力糖果的奶油杏仁糖(nougat)中。
在某些实施方案中，无巧克力的食品含有从至少约5微克/g至约10mg/g，和例如至少5微克/g食品，优选至少10微克/g，更优选至少100微克/g的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质低聚物。如果想要，非巧克力食品可包含比那些在以下描述的巧克力食品中发现的更高得多的水平的可可矢车菊苷配质。
巧克力糖食可为牛奶或黑巧克力。在某些实施方案中，巧克力包含，基于产品中的脱脂可可固体的总量计，每克巧克力至少3,600微克，优选至少4,000微克，优选至少4,500微克，更优选至少5,000微克和最优选至少5,500微克的本发明化合物(例如可可矢车菊苷配质)。在其它的实施方案中，基于产品中的脱脂可可固体的重量计，巧克力包含每克至少6,000微克，优选至少6,500微克，更优选至少7,000微克和最优选至少8,000微克的可可矢车菊苷配质和尤其更优选10,000微克/g。
牛奶巧克力糖食，基于牛奶巧克力产品中的脱脂可可固体的总量计，每克牛奶巧克力可包含至少1,000微克，优选至少1,250微克，更优选至少1,500微克和最优选至少2,000微克的可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质。在优选的实施方案中，牛奶巧克力包含，基于牛奶巧克力产品中的脱脂可可固体的总量计，每克牛奶巧克力至少2,500微克，优选至少3,000微克，更优选至少4,000微克和最优选至少5,000微克可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质。
食品中的L-精氨酸的量可变化。具体地，可可包含每100克部分脱脂的可可固体中1-1.1克L-精氨酸。其范围可从每100克可可中0.8至1.5。在一些实施方案中，本发明的巧克力食品包含比天然地出现在可可成分中的更高的量的L-精氨酸。一旦已知在食品中使用的可可成分和L-精氨酸的量，本领域普通专业技术人员可易于确定最终产品中的L-精氨酸总量。食品将通常包含至少5微克/g，优选至少30微克/g或至少60微克/g，尤其更优选至少200微克/g食品。
可以单份食物(serving)提供本发明的多元酚例如黄烷醇类和/或矢车菊苷配质的每日有效量。因此，糖食(例如巧克力)可包含至少约100mg/份食物(例如150-200、200-400mg/份食物)可可矢车菊苷配质。
含有本发明的化合物的药物，任选与另一种癌症治疗剂联合，可以多种途径例如经口、舌下、颊、鼻、直肠、静脉、胃肠外和局部给予。本领域技术人员将能够确定适合的给药模式以使式An化合物和任选的另一种癌症治疗剂最大地传递至肿瘤部位。因此，适合于每一种类型给药的剂型包括在本发明的范围内并且包括固体、液体和半固体剂型，例如片剂、胶囊剂、明胶胶囊剂(gelcaps)、散装(bulk)的或单位剂量粉末或颗粒剂、乳剂、混悬剂、贴剂、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂或胶浆剂(jellies)。缓释剂型也在本发明范围内并且可如在美国专利号5,024,843；5,091,190；5,082,668；4,612,008和4,327,725中描述的(其中相关的部分通过引用结合于本文)那样制备。适合的制药上可接受的载体、稀释剂或赋形剂通常为本领域内已知并且可易于由本领域技术人员所确定。片剂，例如，可包含有效量的含多元酚的组合物和任选的载体，例如山梨醇、乳糖、纤维素或磷酸二钙。
包含可可黄烷醇和/或矢车菊苷配质和任选另一种癌症治疗剂的膳食补充剂可使用本领域内已知的方法制备和可包含，例如，营养素例如磷酸二钙、硬脂酸镁、硝酸钙、维生素和矿物质。
还在本发明范围之内的是制成品(article)例如包含本发明的组合物(例如食物、膳食补充剂、药物)的包装产品和指示本发明的化合物的存在或增加了含量，或该组合物直接应用于治疗其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤(例如癌症)的标签。该包装产品可包含组合物和用于治疗其中的细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤(例如癌症)的说明书。用于使用的标签和/或说明书可指在本申请中描述的任何使用的方法，在某些实施方案中，使用的标签和/或说明书指导本发明化合物用于治疗过度表达p53(其在至少氨基酸位置Ser392处超磷酸化)的肿瘤；过度表达细胞周期蛋白D1的肿瘤；过度表达Akt的肿瘤；或对紫杉醇(Taxol)的治疗耐药的肿瘤。
适合用于的联合疗法的制成品(例如包装产品或药盒)也在本发明范围之内，其包括至少一个容器和至少一种本发明化合物(例如其中n是5的式An化合物；矢车菊苷配质五聚物)。该制成品还包含至少一种另外的化学治疗剂(即不同于式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物(包括氧化产物))，所述化学治疗剂可作为分开的组合物、在分开的容器中提供，或与本发明化合物混合在一起提供。
在下列的非限制性实施例中进一步描述本发明。
实施例实施例1-提取和纯化提取和纯化可如在Romanczyk等的美国专利号6,670,390(其通过引用结合于本文)中描述的那样进行。下面重现某些相关的部分。
矢车菊苷配质提取过程方法1使用由Jalal和Collin(′Polyphenols of Mature Plant，Seedling andTissue Cultures of Theobroma Cacoa，Phytochemistry，6，1377-1380，1977)描述的方法的改进方法，从脱脂的、未发酵的、冷冻干燥的可可豆类提取矢车菊苷配质。从与2×400mL 70％丙酮/去离子水然后是400mL 70％甲醇/去离子水聚集的50克批次的脱脂可可中提取矢车菊苷配质。汇集提取物并于45℃用保持在部分真空下的旋转蒸发器通过蒸发除去溶剂。以去离子水稀释得到的水相至1L和用400mLCHCl3提取2遍。丢弃溶剂相。然后水相用500mL乙酸乙酯提取4遍。将任何得到的乳状液于10℃通过在2,000x的Sorvall RC 28S离心分离机上离心30min.破乳。向合并的乙酸乙酯提取物中加入100-200mL去离子水。于45℃用保持在部分真空下的旋转蒸发器通过蒸发除去溶剂。使得到的水相于液N2下冷冻，随后在LABCONCO冷冻干燥系统上冷冻干燥。从不同的可可基因型得到的粗制矢车菊苷配质的得率列于表1。
表1粗制矢车菊苷配质得率
方法2作为选择，用70％丙酮水溶液从脱脂的、未发酵的、冷冻干燥的可可豆类提取矢车菊苷配质。使10克的脱脂的原料与100mL溶剂匀浆5-10min。于4℃下使该淤浆以3000xg离心15分钟，使上清液通过玻璃棉。使滤液于部分真空下经历蒸馏和使得到的水相于液N2下冷冻，随后在LABCONCO冷冻干燥系统上冷冻干燥。粗制矢车菊苷配质的得率范围为15-20％。
不希望受到任何特别的理论的限制，应该相信粗品得率的不同反映所遇到的不同的基因型、地理来源、园艺品种和制备方法的差异。
可可矢车菊苷配质的部分纯化A.凝胶渗透色谱法使如上所述得到的矢车菊苷配质通过液相色谱在Sephadex LH-20(28×2.5cm)上部分纯化。借助从去离子水进入甲醇的梯度分离。起先的梯度组合从15％甲醇的去离子水开始，其后以每30min.的梯级方式，用25％甲醇的去离子水、35％甲醇的去离子水、70％甲醇的去离子水和最后100％甲醇的梯度液。收集黄嘌呤生物碱(咖啡因和可可碱)的洗脱后的流出液作为单个的馏份(fraction)。馏份产生无黄嘌呤生物碱的次馏份，其经历进一步细分馏得到指定为MM2A直到MM2E的五个次馏份。于45℃用保持在部分真空下的旋转蒸发器通过蒸发从每个次馏份中除去溶剂。使得到的水相于液N2下冷冻和在LABCONCO冷冻干燥系统上冷冻干燥过夜。
大约有100mg的原料以这种方法细分馏。色谱条件柱；28×2.5cm Sephadex LH-20，流动相甲醇/水梯度，15∶85、25∶75、35∶65、70∶30、100∶0每步1/2小时间隔，流速；1.5mL/min，检测器；UV在λ1＝254nm和λ2＝365nm，绘图速度0.5mm/min，柱荷载；120mg。
B.半制备型高效液相色谱(HPLC)方法1.反相分离如上所述得到的矢车菊苷配质通过半制备型HPLC部分纯化。Hewlett Packard 1050 HPLC系统配备多种波长检测器，具有1mL注射回路的Rheodyne 7010注射阀装备有Pharmacia FRAC-100馏份收集器。在与Phenomenex 10μODS UltracarbTM(60×10mm)保护柱(guard column)连接的Phenomenex UltracarbTM10μODS柱(250×22.5mm)上进行分离。流动相组成为A＝水；B＝甲醇，在以下线性梯度条件下使用[时间，％A]；(0，85)、(60，50)、(90，0)和(110，0)，流速为5mL/min。化合物通过UV于254nm检测。通过馏份收集在定时的间隔或手动收集各峰或选择的色谱区域，用于进一步纯化和后续的评价。注射荷载范围为从25-100mg的原料。
方法2.正相分离如上所述得到的矢车菊苷配质提取物通过半制备型HPLC部分纯化。Hewlett Packard 1050 HPLC系统、设置于254nm的Millipore-Waters Model 480LC检测器配备设置于峰模式的Pharmacia Frac-100馏份收集器。在与Supelco 5μm Supelguard LC-Si保护柱(20×4.6mm)连接的Supelco 5pm Supelcosil LC-Si柱(250×10mm)上进行分离。矢车菊苷配质通过在以下条件下经线性梯度洗脱(时间，％A，％B)；(0，82，14)、(30，67.6，28.4)、(60，46，50)、(65，10，86)、(70，10，86)随后10min的再平衡。流动相组合为A＝二氯甲烷；B＝甲醇和C＝乙酸∶水(1∶1)。使用流速为3mL/min。通过UV于254nm检测成分和记录在Kipp&Zonan BD41记录仪上。注射体积的范围为溶解于0.25mL 70％丙酮水溶液的100-250μL的10mg的矢车菊苷配质提取物。通过馏份收集在定时的间隔或手动收集各峰或选择色谱区域用于进一步纯化和后续的评价。
HPLC条件250×10mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)半制备型柱；20×4.6mm Supelco Supelcosil LC-Si(5μm)保护柱；检测器Waters LC；分光光度计型号480@254nm；流速3mL/min；柱温室温；注射250μL的70％丙酮水溶液提取物。
梯度
得到如下馏份馏份 类型1二聚物2三聚物3四聚物4五聚物5六聚物6七聚物7八聚物8九聚物9十聚物10 十一聚物11 十二聚物12 高级低聚物实施例2黄烷醇/矢车菊苷配质的测定矢车菊苷配质如下述定量使用商业上可获得的(-)-表儿茶素，和通过在Hammerstone，J.F.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)490-496；Lazarus，S.A.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(9)；3693-3701和Adamson，G.E.et al.，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188中描述的方法得到的纯态的二聚物至十聚物制得组合的标准物。使用在之前引用的Adamson文献中所描述的正相HPLC方法，采用荧光在激发波长和发射波长分别为276nm和316nm检测分析使用这些化合物的标准储备溶液。聚合所得的峰和它们的总面积以包括从所有在任何一类低聚物之内的异构体发挥作用的因素和使用二次方程式拟合产生校准曲线。单体和较小的低聚物具有几乎线性的图，其与之前采用的线性回归一致，以产生基于单体的和基于二聚物的校准曲线。
然后将这些校准曲线用于计算在如下制备的样本中的矢车菊苷配质的水平首先，使用三份正己烷提取物(每份45mL)使可可或巧克力样本(约8克)脱脂。接着，用5mL的丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)提取1克的脱脂的原料。然后通过比较从由如上所述(使用纯化的低聚物)得到的具有校准曲线的样本的HPLC数据，测定在脱脂的原料中的矢车菊苷配质的量。使用Association of Official AnalyticalChemists(AOAC Official Method 920.177)的标准化方法测定样本(对于巧克力使用1克样本规格或对于液体使用半克样本规格)的脂肪的百分比。然后计算在原始样本(具有脂肪)中的总矢车菊苷配质水平的量。在每个样本被测试之前进行校准以避免柱-柱差异。
实施例3实验过程细胞培养人乳腺癌细胞系MDA MB-231、MDA MB-436、MD MB-468、SKBR-3和MCF-7从Lombardi Comprehensive Cancer Center(LCC)Tissue Culture Shared Resource获得。MDA MB-231、MDA MB-436、MD MB-468和SKBR-3为p53-变异的雌激素受体(ER)-阴性细胞。MDA MB-231在K-ras致癌基因中还包含突变种。MCF-7细胞系为ER-阳性和对p53不变异的。将细胞在包含补充了10％胎牛血清(FBS)(Quality Biological，Gaithersburg，MD)的DMEM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)的完全培养基中生长。另外，用于MCF-7的培养基包含非必需氨基酸(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)。
无限增殖化(immortalized)人乳腺上皮细胞(HMECs)、MCF-10A、184A1N4和184B5、在8通道的正常的、有限寿命的(finite-life-span)HMECs(1001-8，CC-2551)，最初源于乳房成形术的乳腺组织，从Clonetics-Bio Whittaker，Inc.(Waskersville，MD)购得。也可使用由通过将c-MYC、ErbB2和RAS致癌基因导入MCF-10A细胞(MCF-10A-ErbB2/Ras细胞和MCF-10A-c-Myc)生成的细胞系。
将MCF-10A细胞系(伴有非变异的p53的自然地无限增殖化的、非肿瘤发生的人乳腺上皮细胞系)维持于补充了5％马血清(Gibco)、20ng/mL EGF(Upstate Biotechnology Incorporated，Lake Placid，NY)、10μg/mL胰岛素(Biofluids，Rockyille，MD)和500ng/mL氢化可的松的F-12/DMEM培养基中。同样的培养基用于MCF-10A-ErbB2/Ras细胞(Ciardiello，F.et al.，Mol Carcinog,643-52.1992)和MCF-10A-c-Myc细胞(Sheen，J-H.et al.，Mol.Cell.Biol.，221819-1833，2002)。
184A1N4细胞系(在此后为″A1N4″)是源于HM Cs的原代培养的非肿瘤发生的细胞系和以苯并芘(由Dr.M.R.Stampfer，University ofCalifornia，Berkley，CA提供)(Stampfer，M.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822394-2398，1985)获得终身免疫的。将这些细胞维持于含有0.5％FBS、0.5μg/mL的氢化可的松(Biofluids)、5μg/mL胰岛素和10ng/mL的EGF的IMEM培养基中。
184B5系是无限增殖化的、源于由用苯并芘(由Dr.M.R.Stampfer提供)获得无限增殖化HMECs的原代培养的非肿瘤发生的细胞系和维持于Clonetics乳腺上皮细胞培养基(MEGM)中。
依据供应商的说明书，将正常人HMECs维持于补充有每ml 52μg的牛垂体提取物、10ng/mL的人EGF、5μg/mL的胰岛素和0.5μg/mL的氢化可的松的乳腺上皮细胞生长培养基(CC-3152)(Clonetics)中并使之于37℃在伴有低浓度(0.1-0.2％)CO2设置的孵育器中生长。
试剂和抗体HPLC-纯化的低聚五聚物的矢车菊苷配质如在实施例1中所述制备。五聚物矢车菊苷配质约为92-95％纯。通过首先将五聚物溶解于20μL DMSO中，随后以完全培养基稀释至2mL制备五聚物的储备液。取无菌过滤的等分试样，使终浓度为100μg/mL。
兔多克隆聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)(H-250)从Santa CruzBiotechnology Inc.，(Santa Cruz，CA)获得。α-微管蛋白抗体从Neomarkers，Fremont，CA获得。所有用于蛋白质组学(proteomics)分析的抗体从Cell Signaling(Beverly，MA)、Upstate Biotechnology(LakePlacid，NY)、Neomarkers(Fremont，CA)和Santa Cruz(Santa Cruz，CA)获得(表2)。参考表2，指定为“小鼠”的Abs为单克隆Abs和指定为“兔”的Abs为多克隆Abs。ECL检测试剂从Amersham(Arlington Heights，IL)获得。
通过结晶紫试验对细胞增殖的评价将每孔一份1×103细胞置于96孔盘(Corning Costar，Cambridge，MA)中。于两种不同细胞密度(每孔放置1×103和2×103)评价HMECs、A1N4和184B5细胞的原代培养物。细胞附着细胞24小时后，以浓度为100μg/mL的五聚物处理孔中的细胞(一式三份)。在相同板上的细胞以相应的对照物(i)包含DMSO的培养基，和(ii)无添加物的培养基处理。
细胞经处理1、2、3、6、8和10天，但在一些实验中，在处理后的第2、3、4、7和10天收集样本。每次处理做三份。在每个时间点按如下收集样本移去培养基并于室温下向每孔加入50μL的结晶紫溶液(0.1％的结晶紫的0.1M柠檬酸溶液)并将板孵育15分钟，随后用去离子水洗涤。将板于室温下干燥过夜。次日，通过向每个孔添加100μL的0.1M柠檬酸钠溶液使板退色。将板孵育一个小时。在Ultramark微板成像系统(BioRad，Philadelphia，PA)上于550nm读出样本的光密度(OD)。重复该实验两次，得到每个样本的九个测量值的平均值。使用t检验分析确定统计学显著性。
线粒体膜电位使用ApoAlertTM线粒体膜传感器药剂盒(Clonetech Inc.，Palo Alto，CA)测定线粒体膜电位。于适当的培养基中，将MDA MB-231、MCF-7、MDA MB-468、MDA MB-436、SKBR-3、MCF-10A、MCF-10A-c-Myc和AIN4细胞生长至60-70％汇合(在25cm2的盘中)。次日，以含有(i)五聚物(100μg/mL，或在一些实验中用25μg/mL)，(ii)带有DMSO的培养基，或(iii)只有培养基的完全培养基置换完全培养基。最初，使细胞在五聚物存在下生长1、2、3、6、12和24小时，但仅选择1、2和6个小时的处理用于后续的研究。合并所有漂浮的和粘附的细胞，然后将细胞分成等份放入流动细胞计数管中。依照制备商的说明书，每管分析1×106细胞。在LombardiComprehensive Cancer Center Core Flow Cytometry Shared ResourceFacility分析样本。
液体样本在多孔板(LPS/MWP)中的分层蛋白扫描分层蛋白扫描(LPS)是使用多孔板[Englert，C.R.et al.，CancerRes.，601526-1530，2000]，以高通量的方式筛选液体蛋白质样本的方法，并由20/20Gene Systems，Inc.，(Rockville，MD)引导。简言之，使细胞分层并将蛋白质提取物装载至真空歧管(vacuum manifold)的孔中和通过一叠(stack)膜转移。从每组样本中，产生最多至五个斑点印迹膜。
用或不用100μg/mL五聚物处理MDA MB-231人乳腺癌细胞48和72个小时。使细胞分层于LPS/MWP溶胞缓冲液(20/20GeneSystems，Inc.)中。使用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。将10和20μg的每个蛋白质样本双份下载到斑点印迹微滤仪(BioRad，Philadelphia，PA)并按照制备商(20/20GeneSystems)的建议通过5层膜的叠层转移。转移后，于室温下，将所有的膜在1mg/mL EZ-Link Sulfo-NHS-生物素溶液以1x PBS中进行生物素化作用10分钟(Pierce)。
于4℃，将膜与示于表1中的抗体(1∶500或1∶1000稀释)一起孵育过夜。次日，膜用含吐温20(0.1％)(TBST缓冲液)的Tris-缓冲盐水洗涤并于室温下在FluoroLink Cy 5-标记的链球菌抗生物素蛋白(1∶500，Amersham)和荧光素标记的次级抗-鼠或抗-兔抗体(1∶2,000，分子探针，Eugene，OR)的混合物中孵育60分钟，随后在TBST中洗涤。使膜干燥并在Typhoon扫描仪(Amersham)上扫描，并用ImageQuant软件(Amersham)分析所得到的图像。数据用Excel绘图和用JMP(SAS Institute，Inc.，Cary，NC)进行统计分析。施行等级类聚分析以评价被分为对照组和处理组样本的分离。
表2.用于LPS-多孔板分析的抗体
免疫印迹法对LPS/MWP结果的确认受五聚物影响的蛋白质，如通过LPS检测的，由免疫印迹法作进一步分析。应用对抗下列蛋白质的抗体Cdc2(Tyr15)、FKHR(Ser256)、p53(Ser37、Ser46和Ser392)、PKC-δ(Ser643)、PKC-θ(Ser643/676)、pRb(Ser795和Ser807/811)、SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)和Stat 5(Tyr694)(所有抗体从Cell Signaling获得)。
将来自经五聚物处理的MDA MB-231、MDA MB-468和MCF-7细胞蛋白质小球和相应的经DMSO处理的对照物溶解于含1％SDS的PBS中并用于5瓦特功率下的超声波处理15秒钟。然后于10,000rpm离心样本并将上清液移入干净试管中。如上所述地测定蛋白质浓度。10μg的每个蛋白质样本通过PAGE于4-20％梯度凝胶(BioRad，Philadelphia，PA)上分离。依照制备商(20/20Gene Systems)的说明书将凝胶转移至或者PVDF膜(BioRad)或者P-FILM膜(10层膜的叠层)。在用初级抗体孵育之前，使PVDF膜封闭于0.5％的酪蛋白溶液(VectorLaboratories，Burlingame，CA)中1个小时。在用初级抗体孵育之前，P-FILM膜不需要封闭。于4℃下，以1∶500稀释的初级抗体孵育膜过夜，在TBST中洗涤膜5分钟三次，以HRP-共轭的次级抗体孵育，再洗涤和于添加了ECL的试剂(Amersham)中孵育。信号在BIOMAX MR胶片(Kodak，Rochester，NY)上显现。在与初级抗体孵育后，使膜在抗GAPDH抗体(1∶500稀释；Chemicon，Temecula，CA)中孵育。这种蛋白质的存在用与碱性磷酸酯酶DuoLux底物(VectorLaboratories)共轭的次级抗体显现。
作为对照，依照制备商(Cell Signaling)的说明书，剥离用于探测Cdc2、FKHR、p53和pRb的PVDF膜。剥离后，在TBST缓冲液中洗涤膜四次(每次5分钟)，如上所述的封闭，再洗涤和于4℃下在初级抗体中孵育过夜。所用的初级抗体为抗总Cdc2(1∶1000稀释，CellSignaling)、抗总FKHR(1∶1000稀释，Cell Signaling)、抗内源性的p53(1∶1000，Cell Signaling)和抗内源性的pRb(1∶1000，Santa Cruz)。次日，洗涤膜并在HRP共轭的次级抗体中孵育，再洗涤和于添加了ECL的试剂(Amersham)中孵育。信号如前述检测。为了测试荷载的相等性，用如上所述的抗GAPDH抗体(1∶500稀释；Chemicon，Temecula，CA)探测膜。
p53和pRb的高分辩图p53和pRb均包含多磷酸化位点，并且分别评价每个位点，以提供每个蛋白质的潜在功能的更正确的适应征。因此，使用P-FILM技术(20/20Gene Systems，Inc.)完成蛋白质的高分辩功能的图。
使用与那些用于PDVF膜印迹的相同的蛋白质样本。使以100μg/mL的五聚物处理或以对照组DMSO处理的10μg的每个MDAMB-231细胞，在一些情况下为MDA MB-468和MCF-7细胞的蛋白质样本，通过PAGE在4-20％梯度凝胶(BioRad)上分离。按照制备商(20/20Gene Systems，Inc.)的说明书使蛋白质转移至10层膜的叠层。以如由制备商(Cell Signaling)推荐的于1∶1000稀释的抗体探测膜以确认总的和磷酸化的p53(p53 Ser6、Ser9、Ser15、Ser20、Ser37、Ser46和Ser392)。在所有情况下用的次级抗体为抗-兔多克隆的1∶2000(Amersham)。信号在BIOMAX MR胶片(Kodak)上显现。使用以1∶1000稀释的抗磷酸化的pRb(Ser780、Ser795和Ser807/811)和抗pRb多克隆抗体(Cell Signaling)完成pRb的图。在所有情况下用的次级抗体为1∶2000稀释的抗-兔抗体(Amersham)。使用Kodak 1D图像分析软件进行图像分析。采用GAPDH强度使背景校正强度值对荷载标准化。用Excel进行数字分析。
结果五聚物引起的生长抑制人乳腺癌细胞MDA MB-231、MDA MB-436、SKBR-3和MDAMB-468细胞比未转化的、自然地无限增殖化人乳腺上皮MCF-10A细胞(其对五聚物耐药)对五聚物引起的生长抑制更敏感。用五聚物处理后10天，MDA MB-231、MDA MB-436、SKBR-3和MDA MB-468细胞的生长，与用DMSO处理的对照组比较，分别被抑制5倍、4.1倍、5.5倍和4倍。与MCF-10A细胞类似，正常人HMECs对于五聚物的生长抑制剂作用是不响应的，仅被抑制1.4倍。与用DMSO处理的对照组比较，苯并芘-无限增殖化的、未转化的184B5和AIN4细胞的生长被分别抑制2.8倍和7.3倍。在用五聚物处理后的第6天，乳腺癌细胞的大多数为对五聚物表现出显著的敏感，早于无限增殖化184B5细胞，后者于处理后的第10天对五聚物表现出显著的敏感。
五聚物在以上的肿瘤细胞的生长抑制作用独立于p53和ER状态，因为五聚物处理还引起MCF-7细胞的显著的、5.6倍的生长抑制，所述MCF-7细胞含有野生型p53并且为ER-阳性的。还有，五聚物的作用独立于细胞增殖率，因为慢增殖性的MCF-10A细胞(群体倍增时间为31.4hrs)和高增殖性的MCF-10A-c-Myc(群体倍增时间20.4hrs)以及MCF-10A-ErbB2/Ras(比亲代的MCF-10A细胞快四倍的倍增时间)对五聚物引起的生长抑制的抵抗是相等的。
五聚物引起的线粒体膜电位的去极化大多数转化的乳腺癌细胞在用五聚物(表3，表示得自三次实验中的平均数据)处理后表现出线粒体膜的高度去极化。这个发现的例外是MCF-7，在多次试图使用不同的传代细胞后，去极化不能被证明。
表3MMP去极化(％)
*无限增殖化细胞系MDA MB-231细胞对五聚物的反应表现为线粒体膜的高度去极化(平均为58％)，而用DMSO处理的细胞的膜的去极化范围为5-10％。然而，五聚物处理仅导致20％的MCF-10A细胞线粒体膜去极化。DMSO处理仅引起10％MCF-10A线粒体膜去极化。这些结果在期望的背景值范围内。当细胞仅以培养基处理时得到类似的结果。另外，检测到用五聚物处理的MCF-10A-Myc细胞有类似的对膜去极化的抗性。在MDA MB-436、MDAMB-468和SKBR-3细胞中，五聚物还引起显著的线粒体膜去极化(表3)。
在另一个实验中，将MCF-10A和MDA MB-231细胞暴露于五聚物1、2和6个小时。结果显示100μg/mL的五聚物仅在MDA MB-231细胞中引起时间依赖性线粒体膜去极化，类似地，仅MDA MB-231细胞对25和100μg/mL的五聚物表现为剂量依赖性反应。
五聚物引起的PARP表达减少。
为了确定由五聚物引起的线粒体膜的去极化是否导致在人乳腺癌细胞系中的凋亡细胞的死亡，将MDA MB-231和MCF-7细胞用于PARP裂解产品的检测。由于PARP是裂解级联中的下游底物之一，其为极好的细胞凋亡标志[Soldani，C.et al.，Apoptosis，7321-328，2002]。
结果指出PARP的主要带(band)在以五聚物处理MDA MB-231细胞48个小时后仍未被裂解，且对于期望的85kDa裂解产品没有提供证据。在所有未处理的对照组中观测到低于116kDa分子量位置的PARP的未经鉴定的蛋白质带，但是在五聚物处理的细胞中未见有这样的蛋白质带。该结合的重要意义目前不明。
在缺少级联3的MCF-7细胞中，以五聚物处理48个小时，引起完全长度的PARP(116kDa)减小。这个结果可能是由于在这些细胞中的或者级联7或者级联6的作用。然而，没有检测到裂解的PARP片段。目前，五聚物在引起人乳腺癌细胞的细胞凋亡中所起的作用尚有待研究。
五聚物对乳腺癌细胞的靶作用作为潜在的五聚物靶向用于LPS筛选的所选择的蛋白质为那些通常涉及控制细胞生长、增殖、存活和细胞凋亡的蛋白质(参见表1)。总共有45个不同的抗体用于重点在于被测试蛋白质的磷酸化状态，显示它们的活化状态的筛选。
LPS试验结果表明，有8种蛋白质的磷酸化状态受五聚物的影响Cdc2、FKHR、p53、PKC-δ、PKC-θ、pRb、SAPK/JNK和Stat5。在48hrs内，五聚物使5种蛋白质的磷酸化作用减少，而经过五聚物处理72hrs后，所有8种蛋白质的磷酸化作用均减少。
与各自的对照组相比较，并基于密度计量学，在48hrs的处理后Cdc2(Tyr15)的磷酸化作用减少了31％和72hrs的处理后减少45％，在72个小时后FKHR(Ser256)的磷酸化作用减少了63％；处理后的p53(如用抗体混合物在Ser37、46和392检测)的磷酸化作用减少了36％；在48hrs时PKC-δ于Ser643的磷酸化作用减少了22％和72hrs后减少49％；PKC-θ于Ser643/676的磷酸化作用仅在72hrs后即减少49％；于48hrs时pRb于Ser795和Ser807/811的磷酸化作用减少36％和处理后72hrs减少40％；于48hrs时SAPK/JNK于Thr183/Tyr185的磷酸化作用减少34％和于处理后72hrs时减少26％；和于48hrs时Stat5于Tyr694的磷酸化作用减少28％和于72hrs时减少33％。蛋白质p53残基Ser6、Ser9、Ser20和Ser15受五聚物的影响不显著。尽管这些蛋白质的磷酸化作用受五聚物的影响，但是它们的总细胞蛋白质表达并不受影响。统计学分析显示基于蛋白质行为的聚类列于所有在五聚物处理72个小时后用LPS分析的样本中。分析显示对照组和处理组之间存在明显分离。
对于Cdc2-P、FKHR-P、p53-P和pRb的LPS分析的结果示于图1A。
参考图1B，使用免疫印迹确认LPS结果。在这个试验中，五聚物对Cdc2(Tyr15)于48和72hrs时、FKHR(Ser256)于48和72hrs时、p53(Ser37、Ser46和Ser392)于72hrs时和pRb(Ser795和Ser807/811)于48和72hrs时的磷酸化形成有作用。
如通过LPS分析(图1A)和从PVDF膜实验所证明的，Cdc2、FKHR和p53的总蛋白质表达不受五聚物的影响。然而，至于pRb，总的和磷酸化特异性位点均受五聚物的影响(图1C)。用GAPDH表达(图1B和1C)证实荷载的相等性。
使用现行的实验性免疫印迹条件和PVDF膜，通过LPS对五聚物对PKC-δ、PKC-θ、SAPK/JNK和Stat5的作用的初步筛选所得结果未被证实。
五聚物减少p53(Ser392)和pRb(Ser780、Ser795和Ser807/811)磷酸化作用p53和Rb两者均包含大量的磷酸化位点，和每个单独的位点决定独特的蛋白质功能。由于五聚物对G0/G1细胞周期生长停止(其中p53和pRb在控制细胞周期的这个阶段中起关键作用)的作用，采用P-FILM技术(20/20Gene Systems)，对以100μg/mL的五聚物处理MDAMB-231中的这两种蛋白48和72hrs和相应的DMSO处理对照组进行高分辩功能的绘图。该项分析的结果示于图2和3。
如于图2A中所示，在MDA MB-231细胞中的内源性p53表达的水平，经五聚物处理的样本仅于48hrs后稍微减少。基于密度计量学数据，这项减少不显著(数据未显示)。p53的丝氨酸残基的图显示Ser15残基和Ser46的于处理后48h的磷酸化作用仅少量减少(图2A和2B)，而于处理后48和72hrs时均检测出p53 Ser392残基的应答于五聚物的显著的脱磷酸作用(图2A)。通过传统的在PVDF膜上的免疫印迹法得到该结果另外的确证。Ser20残基的磷酸化作用于48hrs时减少，但在以五聚物处理72hrs的样本中不受影响(图2A)。蛋白质荷载的可比性通过监测GAPDH蛋白质表达证实(图2A)。
除了MBA MD-231细胞，于48和72hrs处理的时间段，在以五聚物处理的MDA MB-468(变异的p53)和MCF-7(野生型p53)中评价p53状态。类似于MDA MB-231细胞，内源性p53在MDA MB-468中的表达受五聚物处理的影响不显著(图2B)。当比较时，p53于Ser392的磷酸化百分率在MDA MB-231(53％，与未处理的对照组比较)和MD MB-468细胞(33％，与未处理的对照组比较)中均减少，而在MDAMB-468细胞中Ser15和Ser46未受显著的影响。
在相同的实验条件下，没有检测到对于内源性野生型p53或MCF-7细胞中的磷酸化p53的信号(图2B)。这个结果是所预料的，因为与过度表达的变异的p53(DiCioccio et al.，Cancer GenetCytogenet.，10593-102，1998)对照，野生型p53的内源性水平不易通过免疫印迹检测出。
参考图3，还研究了MDA MB-231细胞中的pRb于Ser780、Ser795和Ser807/811的对五聚物的反应的磷酸化状态。五聚物处理引起内源性pRb的蛋白质表达的减少，可能导致所有被测试的残基于处理后48和72个小时的磷酸化作用的减少。基于GAPDH蛋白质表达，样本荷载相等。
权利要求
1.一种在肿瘤细胞中诱导超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用的方法，其中所述蛋白质的超磷酸化促使细胞转化，该方法包括使肿瘤细胞与有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物接触 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞周期调节蛋白选自Cdc2、分叉头转录因子(FKHR)、p53和视网膜神经胶质瘤蛋白(pRb)。
3.权利要求1的方法，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
4.权利要求2的方法，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
5.权利要求1的方法，其中所述糖是单糖。
6.权利要求2的方法，其中所述糖是单糖。
7.权利要求1的方法，其中n是5。
8.权利要求2的方法，其中n是5。
9.权利要求3的方法，其中n是5。
10.权利要求1-6中任一项的方法，其中n是5。
11.一种治疗其中细胞周期调节蛋白的超磷酸化对肿瘤表型起作用的肿瘤的方法，该方法包括给予罹患所述肿瘤的人或脊椎动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞周期调节蛋白选自Cdc2、分叉头转录因子(FKHR)、p53和视网膜神经胶质瘤蛋白(pRb)。
13.权利要求11的方法，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
14.权利要求12的方法，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
15.权利要求11的方法，其中所述糖是单糖。
16.权利要求12的方法，其中所述糖是单糖。
17.权利要求11的方法，其中n是5。
18.权利要求12的方法，其中n是5。
19.权利要求13的方法，其中n是5。
20.权利要求11-16中任一项的方法，其中n是5。
21.权利要求11的方法，其中所述人罹患以至少在氨基酸位置Ser392的p53过度表达和超磷酸化为特征的癌症。
22.权利要求21的方法，其中所述人罹患乳腺癌或结肠癌。
23.权利要求11的方法，其中所述人罹患过度表达AKT激酶的癌症。
24.权利要求23的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、肝癌或结肠直肠癌。
25.权利要求11的方法，其中所述人罹患过度表达细胞周期蛋白D1的癌症。
26.权利要求25的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
27.权利要求11的方法，其中所述人或脊椎动物罹患对用紫杉醇治疗不敏感的癌症。
28.权利要求21-27中任一项的方法，其中n是5，R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
29.一种治疗过度表达AKT激酶的癌症的方法，该方法包括给予罹患所述癌症的哺乳动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代；其中所述哺乳动物是人或脊椎动物。
30.权利要求29的方法，其中所述哺乳动物是人。
31.权利要求30的方法，该方法包括给予另外的化学治疗剂。
32.权利要求31的方法，其中所述另外的化学治疗剂是AKT抑制剂。
33.一种治疗过度表达细胞周期蛋白D1的癌症的方法，该方法包括给予罹患所述癌症的哺乳动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代；其中所述哺乳动物是人或脊椎动物。
34.权利要求33的方法，其中所述哺乳动物是人。
35.权利要求34的方法，该方法包括给予另外的化学治疗剂。
36.一种治疗对紫杉醇耐药的癌症的方法，该方法包括给予罹患所述癌症的哺乳动物有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代；其中所述哺乳动物是人或脊椎动物。
37.权利要求36的方法，其中所述哺乳动物是人。
38.权利要求37的方法，该方法包括给予另外的化学治疗剂。
39.权利要求38的方法，其中所述另外的化学治疗剂是紫杉醇。
40.一种个性化治疗肿瘤的方法，该方法包括(i)评价患者细胞样本中的细胞周期调节蛋白的表达和磷酸化状态；和(ii)通过给予有效量的具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物治疗表现出Cdc2、p53、FKHR或pRb的超磷酸化和/或p53、AKT或细胞周期蛋白D1过度表达的患者 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代；其中所述患者是人或脊椎动物。
41.一种适合用于联合治疗肿瘤的制成品，它包含(i)至少一个容器；(ii)第一种化合物，其是具有式An的化合物，或其药学上可接受的盐或其衍生物包括氧化产物 其中n是2至18的整数；R和X各自具有或者α或者β立体化学；R是OH、O-糖或O-五倍子酸酯；C-4、C-6和C-8的取代基分别是X、Z和Y，以及单体单元的连接发生在C-4、C-6或C-8上；当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢或糖；和所述糖在任何位置上，例如，通过酯键由酚的部分任选取代；和(iii)第二种化合物，其为不同于第一种化合物的另外的化学治疗剂，其中第二种化合物是在单独的组合物中，在单独的容器中，或与第一种化合物混合。
42.权利要求41的方法，其中第二种化合物是紫杉醇。
43.权利要求41的方法，其中第二种化合物是AKT抑制剂。
44.权利要求41的方法，其中第二种化合物是细胞周期蛋白D1抑制剂。
45.权利要求41的方法，其中第二种化合物是EGFR、IGFR或Her-2抑制剂。
46.权利要求41-45中任一项的方法，其中n是5。
47.权利要求41-45中任一项的方法，其中R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
48.权利要求41-45中任一项的方法，其中n是5，R是OH，和当任何C-4、C-6或C-8不与另一个单体单元相连接时，X、Y和Z是氢。
全文摘要
本发明涉及用于治疗某些肿瘤的、包含多元酚例如矢车菊苷配质及其衍生物的组合物及其使用的方法，更通常地说，是引起在肿瘤细胞中的超磷酸化细胞周期调节蛋白的脱磷酸作用，其中所述蛋白质的超磷酸化促使细胞转化。
文档编号C07D311/78GK1933818SQ200580009441
公开日2007年3月21日 申请日期2005年1月28日 优先权日2004年1月30日
发明者D·拉姆尔亚克, L·J·小罗曼茨克, R·B·迪克逊 申请人:马尔斯公司