用于调节免疫的突变型hivnef的制作方法

专利名称：用于调节免疫的突变型hiv nef的制作方法
技术领域：
本发明涉及人或猿免疫缺陷病毒辅助蛋白的免疫抑制功能用于制备疫苗的用途。特别地，本发明涉及包括Nef蛋白的疫苗组合物。
尽管超过20年的科学研究已致力于找到针对HIV(人免疫缺陷病毒)的疫苗，但令人信服的对抗HIV的预防手段仍有待发现。因此，已开展了抗-HIV疫苗的超过20项的临床实验，并且迄今为止，它们中没有一个已显示预防感染的足够有效性。
Nef(负调节因子)是HIV或SIV的27-35kDa调节蛋白。在其各种功能中，Nef特别涉及下调在人类中A和B型(HLA-A和HLA-B)的MHC(主要组织相容性复合物)I类分子(MHC-I)的表达。Nef的这种特性已显示对突变敏感，然而，HIV-INef在氨基酸位置93处的突变已证实对调节其MHC-I下调特性是无效的(Ali等人(2003)J.Immunol.1713999-4005)。Nef还涉及正常表达在T辅助细胞表面上的CD4分子的下调。此外，Nef还下调成熟的MHCII类分子的表达并上调未成熟的MHCII类分子的表达。所有这些调节都是Nef干扰正常细胞运输并且特别是干扰内吞-降解途径的结果(Le Gall等人(1998)Immunity8483-495)。
Nef作为HIV或SIV的抗原之一，已单独或与其他抗原组合地包括在几种疫苗组合物中，例如在WO01/00232或WO03/011334中所描述。然而，这些方法均未被证实有效。由于施用了Nef而引起的缺乏针对HIV或SIV的有效免疫应答可能与Nef的尚未被鉴定的功能有关，然而针对HIV或SIV的活性疫苗的产生最可能需要引起针对Nef的有效免疫应答。
因此，本发明的目的之一是使HIV或SIV的免疫抑制特性与Nef蛋白联系起来。
本发明的另一目的涉及Nef蛋白中免疫抑制结构域的鉴定。
本发明的进一步目的是提供包含经修饰的Nef蛋白的药物组合物或疫苗组合物。
本发明涉及Nef蛋白的免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变在调节所述蛋白质的免疫抑制特性的用途，特别是体外或离体用途。
在体内，Nef蛋白尤其是在感染了HIV(例如HIV-1或HIV-2)的个体或感染了SIV的猿中发现的。
如本文所希望的，突变涉及有意带给Nef蛋白的至少一个氨基酸的置换、插入或删除，或涉及就大多数Nef蛋白(即，至少约80％已鉴定的Nef蛋白)而言在给定Nef蛋白中天然发生的至少一个氨基酸的置换、插入或删除。
根据本发明，如果给定蛋白具有抑制其所存在的生物体的免疫系统的倾向，则认为它具有免疫抑制特性。特别地，所述给定蛋白的免疫抑制特性可以通过下述在Mangeney&Heidmann(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9514920-5和Mangeney等人(2001)J Gen.Virol.822515-8中所述的一般程序来测量。即，建立表达或特别是分泌所述给定蛋白到细胞内或细胞外间隙中的稳定肿瘤细胞系，并移植到小鼠上，并且在几天后将肿瘤尺寸(A蛋白质)与从移植了不表达或特别是不分泌所述给定蛋白的肿瘤细胞系的小鼠获得的肿瘤尺寸(A无)进行比较。如果表达或特别是分泌给定蛋白的肿瘤的尺寸显著大于不表达或特别是不分泌性肿瘤的尺寸，则认为该给定蛋白是免疫抑制的。给定蛋白的免疫抑制特性还可以通过其免疫抑制指数[(A蛋白质-A无)/A无]来表征。如果给定蛋白的免疫抑制指数是正数，那么认为该给定蛋白是免疫抑制的，并且如果其免疫抑制指数等于零或为负数，则认为该给定蛋白基本上没有免疫抑制活性。
本发明起于已由本发明人确定的HIV或SIV的免疫抑制特性与Nef蛋白之间的关联。换句话说，本发明起于Nef蛋白的免疫抑制功能的鉴定，而且所述功能显示为细胞内和细胞外功能。进一步地，本发明人已显示，Nef的免疫抑制功能不依赖于Nef诱导的CD4或MHC-I下调。
因此，在一个优选实施方案中，本发明涉及Nef蛋白的免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变用于调节所述蛋白的免疫抑制特性的用途，条件是所得到的突变型蛋白呈现相对于无突变的Nef蛋白来说基本上保留的CD4和/或MHC-I下调功能。
如本文所希望的，术语“基本上保留的CD4和/或MHC-I下调功能”表示，在相应的携带本发明突变的Nef蛋白中保留了给定Nef蛋白的至少60％，特别是至少80％的CD4和/或MHC-I下调功能。
CD4和MHC-I的下调可以通过测量表达CD4或MHC-I的细胞的荧光来确定，所述细胞转化了增加量的编码所述给定蛋白的核酸并接触抗-CD4或抗-MHC-I荧光抗体。此类方法是本领域技术人员众所周知的并在下文实施例中特别描述。
免疫抑制蛋白的免疫抑制结构域被定义为所述蛋白的这样的区域，其负责将其免疫抑制活性赋予所述蛋白，并且特别地，它由所有具有这样的性质的氨基酸构成，即所述氨基酸的突变具有调节所述蛋白的免疫抑制特性的倾向。
如本文所希望的，术语“调节给定蛋白的免疫抑制特性”涉及所述蛋白的免疫抑制特性的增加或减少。
在一个优选实施方案中，本发明涉及Nef蛋白的免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变用于抑制所述蛋白的免疫抑制特性的上述用途。根据这个实施方案，Nef蛋白呈现免疫抑制特性。
如本发明所希望的，给定蛋白的免疫抑制特性的抑制产生基本上没有免疫抑制活性的蛋白质，即该蛋白质具有等于零或为负数的免疫抑制指数。
缺乏免疫抑制性的Nef蛋白特别有利于制造抗-HIV或抗-SIV疫苗。实际上，包含根据本发明的缺乏免疫抑制性的Nef蛋白的疫苗组合物在预防HIV或SIV感染时特别有效，因为它们有效地刺激免疫应答，和特别是产生针对Nef蛋白的抗体并引发针对表达Nef蛋白的感染细胞的细胞免疫应答。因此，当在HIV或SIV感染的最初步骤期间Nef在生物体中被释放或被感染细胞表达时，免疫应答的这种刺激阻止了Nef的后续免疫抑制作用。因此，由Nef蛋白传送的免疫抑制作用的缺乏阻止HIV或SIV的早熟感染循环生效并且促进免疫系统清除病毒，所述免疫抑制作用起于针对Nef引起的免疫应答。
特别地，根据本发明的疫苗组合物比现有技术的含Nef的组合物更有效地诱导来自免疫系统的抗-HIV或抗-SIV应答，因为本文公开了，非突变型Nef自身就是免疫系统的抑制剂。
在另一优选实施方案中，本发明涉及上述用途，以获得在其免疫抑制结构域中发生突变的Nef蛋白或其片段，从而制备希望用于预防和/或治疗病毒性疾病的药物或疫苗，条件是所述片段包括所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域。
如本文所希望的，病毒性疾病包括由病毒感染引起的所有疾病或综合征，例如AIDS。此外，根据本发明的疫苗意欲在预防或治疗上使用。
在另一优选实施方案中，本发明涉及上述用途，其中Nef蛋白的结构基本上被保留。
根据本领域技术人员众所周知的方法，相对于其天然对应物在其免疫抑制结构域中发生突变的Nef蛋白结构的基本保留可以通过例如将所述突变型Nef蛋白的圆二色谱、RMN谱、X射线衍射图或任何其他物理化学特性与其所来源的天然Nef蛋白进行比较来确定。应当注意，如本文所希望的，突变型Nef蛋白所来源的天然Nef蛋白呈现免疫抑制活性。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及上述用途，其中Nef蛋白的表位，尤其是构象表位基本上被保留。特别是B-细胞表位以及T-细胞表位被保留。
更特别地，本发明涉及上述用途，其中位于Nef蛋白的免疫抑制结构域之外的表位，特别是构象表位基本上被保留。
相对于其天然对应物，在其免疫抑制结构域中发生突变的Nef蛋白的表位的基本保留可以通过例如检查已知结合天然Nef蛋白的抗体是否同样也结合相应的Nef突变体来确定。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及上述用途，其中Nef蛋白的除了其免疫抑制特性之外的细胞内功能特性基本上被保留。
更优选地，本发明涉及上述用途，其中Nef蛋白的CD4和/或MHC-I下调功能基本上被保留。
Nef蛋白的除了其免疫抑制特性之外的细胞内功能特性涉及蛋白质的非免疫抑制功能，所述非免疫抑制功能只有在所述蛋白位于细胞里面时才起作用。此类功能特别包括下调CD4和MHC-I的表达。
给定蛋白对CD4和MHC-I表达的下调可以通过测量表达CD4或MHC-I的细胞的荧光来确定，所述细胞转化了增加量的编码所述给定蛋白的核酸并且与抗-CD4或抗-MHC-I荧光抗体接触。此类方法是本领域技术人员众所周知的并且在下文实施例中特别描述。
本发明还涉及消除Nef蛋白的免疫抑制特性的方法，其包括-通过至少一个氨基酸的删除、置换或插入来突变所述Nef蛋白的免疫抑制结构域，-通过体内免疫抑制性测定法检查所述免疫抑制活性的消除。
所述体内免疫抑制性测定法相应于上述的测定法。
上述方法的一个优选实施方案包括进一步的步骤，即检查Nef蛋白的结构和/或表位，特别是位于免疫抑制结构域之外的表位是否基本上被保留。
上述方法的另一优选实施方案包括进一步的步骤，即检查Nef蛋白的结构和/或表位，特别是位于免疫抑制结构域之外的表位，和/或CD4和/或MHC-I下调功能是否基本上被保留。
Nef蛋白的结构和/或表位，和/或CD4和/或MHC-I下调功能的基本保留可以如上所述进行确定。
本发明特别涉及药物组合物或疫苗组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的蛋白质或多肽作为活性物质，所述蛋白质或多肽包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成，其中·所述Nef蛋白的免疫抑制结构域通过至少一个氨基酸的删除、置换和/或插入进行突变，条件是所述Nef蛋白基本上没有免疫抑制活性，和·所述片段包括所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域并且基本上没有免疫抑制活性。
特别地，邻近于所述片段的各自N-末端和C-末端的序列可以与邻近于在其所来源的Nef蛋白中所述片段的各自N-末端和C-末端的序列相同。
在上述药物组合物或疫苗组合物的一个特别实施方案中，包含Nef蛋白片段的蛋白质或多肽是这样的，即邻近于所述片段的各自N-末端和/或C-末端的序列与邻近于在其所来源的Nef蛋白中所述片段的各自N-末端和/或C-末端的序列不同。
更特别地，在上述药物组合物或疫苗组合物的另一实施方案中，包含Nef蛋白片段的蛋白质或多肽是这样的，即·邻近于所述片段N-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中所述片段N-末端的序列，或·邻近于所述片段C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中所述片段C-末端的序列，或·邻近于所述片段的各自N-末端和C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中所述片段的各自N-末端和C-末端的序列。
根据本发明的突变型Nef蛋白或其片段被认为是免疫抑制缺陷的。
本发明还涉及药物组合物或疫苗组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的蛋白质或多肽作为活性物质，所述蛋白质或多肽包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成，其中·所述Nef蛋白的免疫抑制结构域通过至少一个氨基酸的删除、置换和/或插入进行突变，条件是所述Nef蛋白基本上没有免疫抑制活性，和Nef蛋白的CD4和/或MHC-I下调功能基本上被保留，以及·所述片段包括所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域并且基本上没有免疫抑制活性。
在上述药物组合物或疫苗组合物的一个优选实施方案中，Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白第一个α螺旋的N-末端延伸至第二个α螺旋的c-末端的氨基酸序列之中。
Nef蛋白的结构特别描述于Arold等人(1997)Structure51361-72和Grzesiek等人(1997)Protein Science61248-63中。根据Arold等人(1997)和Grzesiek等人(1997)，Nef蛋白的二级结构元件以及特别是其α螺旋的命名基于Nef蛋白核心结构域的结构描述。
在上述药物组合物或疫苗组合物的另一优选实施方案中，Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸，特别是从第81位氨基酸至第140位氨基酸的序列之中，并且特别是·包括在从HIV-1Nef蛋白序列第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是从第81位氨基酸至第118位氨基酸的序列之中，或·包括在从HIV-2Nef蛋白序列第104位氨基酸至第150位氨基酸，特别是从第104位氨基酸至第140位氨基酸的序列之中。
本领域技术人员可以很容易地获得Nef蛋白序列。例如，图4中显示了几种HIV-1、HIV-2或SIV Nef蛋白序列。
更优选地，在上述药物组合物或疫苗组合物中，HIV-1Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第90位氨基酸至第113位氨基酸，特别是从第90位氨基酸至第112位氨基酸的序列中。
在上述药物组合物或疫苗组合物的一个特别实施方案中，Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在与从SEQ ID NO1第80位氨基酸至第120位氨基酸，特别是从SEQ ID NO1第81位氨基酸至第117位氨基酸，更特别是从SEQ ID NO1第90位氨基酸至第112位氨基酸的氨基酸序列同源的序列之中。
SEQ ID NO1相应于Wain-Hobson等人(1985)Cell409-17所述的Nef蛋白的氨基酸序列(HIV-1株系LAI)。
根据本发明，如果两个序列可以通过使用例如Altschul等人，Nucleic Acids Res.(1997)253389中所述算法或通过使用ClustalW软件而对准，则认为它们是同源的，所述Clustal W软件是本领域技术人员众所周知的且描述于例如Thompson等人，Nucleic Acids Res.(1994)224673-4680中。
特别地，如果两个序列之间的氨基酸同一性百分数等于或大于约35％，则认为所述两个序列是同源的。
例如，图4表示由Clustal W软件所获得的来源于HIV-1、HIV-2或SIV的几种Nef蛋白的序列比对。方框内的序列与从SEQ ID NO1第81位氨基酸至第118位氨基酸的氨基酸序列同源。
在上述药物组合物或疫苗组合物的另一特别实施方案中，Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在所述Nef蛋白的、长度为26或27个氨基酸的序列之中，所述长度为26或27个氨基酸的序列的N-末端是五肽AX1DX2S并且所述长度为26或27个氨基酸的序列的C-末端是氨基酸L，其中X1代表任意氨基酸，特别是I、V、L、F或R，和X2代表任意氨基酸，特别是M、L或F。
此类序列的实例显示于图4中。
在本发明的另一特别实施方案中，上述药物组合物或疫苗组合物包含作为活性物质的包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽，所述Nef蛋白或其片段包括下述序列AX1DX2SX3X4X5KX6X7GX8LX9G(SEQ ID NO3)其中X1代表I、L、V、F或R，X2代表M、L或F，X3代表H、D或F，X4代表F或L，X5代表I或L，X6代表不同于E的任意氨基酸，特别是R，X7代表K、Q或R，
X8代表G或没有氨基酸，X9代表E、D或R。
SEQ I D NO3包括Nef的免疫抑制结构域。
此类序列的实例显示于图4中。
根据本发明的一个特别优选的实施方案，上述药物组合物或疫苗组合物包含作为活性物质的包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽，其中与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸可以如下进行确定比对上述蛋白质或多肽的序列与SEQ ID NO1(例如使用ClutalW软件)，并选择与SEQ ID NO1的第93位氨基酸对准的氨基酸。例如图4显示了与来源于HIV-1、HIV-2或SIV的几种Nef蛋白的SEQID NO1第93位氨基酸同源的氨基酸。有利地，与SEQ ID NO1第93位氨基酸同源的氨基酸的单置换产生基本上缺乏免疫抑制性的Nef突变体。
根据本发明的另一特别优选的实施方案，上述药物组合物或疫苗组合物包含作为活性物质的包含HIV-1Nef蛋白或其片段或者由HIV-1Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽，其中所述HIV-1Nef蛋白序列的第93位氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
根据本发明的另一特别优选的实施方案，上述药物组合物或疫苗组合物包含作为活性物质的Nef蛋白，其中与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
例如，如图6B中所述，与HIV-1Nef的位置93同源的位置相应于SIV株系mac239 Nef的位置125(SEQ ID NO22)，以及SIV株系mac239 Nef中位置125处的E被置换成R产生免疫抑制缺陷型Nef突变体(SEQ ID NO23)。
根据本发明的一个最优选的实施方案，上述药物组合物或疫苗组合物包含相应于SEQ ID NO2的突变型Nef蛋白作为活性物质。
在本发明的另一优选实施方案中，上述药物组合物或疫苗组合物的特征在于，当Nef蛋白包括在所述药物组合物或疫苗组合物中时，所述Nef蛋白的结构基本上被保留。
在本发明的另一个优选实施方案中，上述药物组合物或疫苗组合物的特征在于，当Nef蛋白包括在所述药物组合物或疫苗组合物中时，Nef蛋白的表位，例如B细胞或T细胞表位，特别是构象表位基本上被保留。
更特别地，本发明涉及上述药物组合物或疫苗组合物，其中位于Nef蛋白的免疫抑制结构域之外的表位，特别是构象表位基本上被保留。
在本发明的另一个优选实施方案中，上述药物组合物或疫苗组合物的特征在于，当Nef蛋白包括在所述药物组合物或疫苗组合物中时，除Nef蛋白的免疫抑制特性以外的细胞内功能特性基本上被保留。
更优选地，本发明涉及上述药物组合物或疫苗组合物，其中Nef蛋白的CD4和/或MHC-1下调功能基本上被保留。
本发明还涉及在上述药物组合物或疫苗组合物中所限定的蛋白质或多肽。
特别地，本发明涉及由SEQ ID NO2或SEQ ID NO31所表示的蛋白质。
本发明还涉及药物组合物或疫苗组合物，其包含编码例如上述蛋白质或多肽的核酸作为活性物质。
本发明还涉及编码在上述药物组合物或疫苗组合物中所限定的蛋白质或多肽的核酸序列。
特别地，本发明涉及编码由SEQ ID NO2或SEQ ID NO31所表示的蛋白质的核酸序列。
本发明还涉及上述蛋白质或多肽或者上述核酸在制备希望用于预防和/或治疗病毒性疾病例如HIV感染的药物或疫苗中的用途。
在本发明的一个优选实施方案中，包含上述蛋白质或多肽作为活性物质的上述药物或者上述药物组合物或疫苗组合物还包含至少一种HIV蛋白或脂肽，或其片段，所述HIV蛋白或脂肽特别选自gp41、gp120、gp140、gp160、Env、Gag、Pol、Rev、RT、Vpu或Tat。
在本发明的一个优选实施方案中，包含编码例如上述蛋白质或多肽的核酸作为活性物质的上述药物或者上述药物组合物或疫苗组合物还包含至少一种编码HIV蛋白或其片段的核酸，所述核酸特别是选自编码gp120、gp140、gp160、Env、Gag、Pol、Rev、RT、Vpu或Tat的核酸。
在包含编码例如上述蛋白质或多肽的核酸作为活性物质的上述药物或者上述药物组合物或疫苗组合物的另一优选实施方案中，核酸是裸露的或包括在载体中，所述载体特别选自金丝雀痘病毒载体、腺病毒载体或麻疹病毒载体。
本发明还涉及如上所述的蛋白质或多肽在制备下述物质中的用途-针对如上限定的所述蛋白质或多肽的多克隆或单克隆抗体或其片段，例如Fab或F(ab)′2片段，-针对如上限定的所述蛋白质或多肽的scFv多肽，-针对如上限定的所述蛋白质或多肽的适体(aptamer)，-针对如上限定的所述蛋白质或多肽的结合肽。
上述抗体或抗体片段、scFv多肽、适体或结合肽的制备过程是本领域技术人员众所周知的。至于结合肽，它们还可以根据本领域技术人员众所周知的方法例如核糖体或噬菌体展示方法进行制备。
本发明还涉及针对本发明所涉及的上述蛋白质或多肽的抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，条件是所述抗体或其片段、scFv多肽、或适体不结合与本发明所涉及的上述蛋白质或多肽不同的蛋白质或多肽。
如本文所希望的，上述抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽特异性地结合根据本发明的蛋白质或多肽，换言之，它们是根据本发明的蛋白质或多肽的特异性配体。特别地，这些配体的特异性是这样的，即它们结合根据本发明的蛋白质或多肽，但不结合根据本发明的所述蛋白质或多肽通过突变而从其衍生的蛋白质。
本发明还涉及制备Nef蛋白的突变体的方法，其中-在第一个步骤中，通过至少一个氨基酸的删除、插入或置换来突变从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸的序列，-在第二个步骤中，检查在第一个步骤中获得的所述突变型Nef蛋白的免疫抑制特性，并选择缺乏免疫抑制特性的突变体。
根据这种方法获得的突变体是免疫抑制缺陷型突变体。
在用于制备Nef蛋白突变体的上述方法的一个优选实施方案中，在第三个步骤中，检查在第二个步骤中获得的突变型Nef蛋白的CD4和/或MHC-I下调功能，并选择相对于所述Nef蛋白来说基本上保留了CD4和/或MHC-I下调功能的突变型Nef蛋白。
在用于制备Nef蛋白突变体的上述方法的另一优选实施方案中，所述经突变的序列的范围为-HIV-1蛋白序列的第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是第90位氨基酸至第112位氨基酸，或-HIV-2Nef蛋白序列的第104位氨基酸至第150位氨基酸。
在用于制备Nef蛋白突变体的上述方法的另一优选实施方案中，Nef蛋白序列通过编码所述Nef蛋白的核酸序列的定向诱变而进行突变。
在用于制备Nef蛋白突变体的上述方法的另一优选实施方案中，如上所述根据Mangeney&Heidmann(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9514920-5和Mangeney等人(2001)J.Gen.Virol.822515-8中所述的一般程序检查突变型Nef蛋白的免疫抑制特性，特别是测量上述免疫抑制指数并选择免疫抑制指数等于零或为负数的突变型Nef蛋白。
给定蛋白对CD4和/或MHC-I表达的下调可以通过测量表达CD4或MHC-I的细胞的荧光来确定，所述细胞转化了增加量的编码所述给定蛋白的核酸并且与抗-CD4或抗-MHC-I荧光抗体接触。此类方法是本领域技术人员众所周知的并且在下文实施例中特别描述。
本发明还涉及易于通过上述方法制备的Nef蛋白突变体，和涉及包含与药物学上可接受的载体相联合的所述Nef蛋白突变体的药物组合物。
本发明还涉及包含Nef蛋白的免疫抑制结构域或由Nef蛋白的免疫抑制结构域构成的新蛋白质或多肽，条件是，如果存在，那么邻近于在所述蛋白质或多肽中的免疫抑制结构域的各自N-末端和/或C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中的免疫抑制结构域的各自N-末端和/或C-末端的序列。
更特别地，在上述新蛋白质或多肽的一个实施方案中·邻近于免疫抑制结构域N-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中免疫抑制结构域N-末端的序列，或·邻近于免疫抑制结构域C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中免疫抑制结构域C-末端的序列，或·邻近于免疫抑制结构域的各自N-末端和C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中免疫抑制结构域的各自N-末端和C-末端的序列。
在本发明的一个特别实施方案中，如上所述的新蛋白质或多肽呈现CD4和/或MHC-I下调功能。
构成或包含在上述新蛋白质或多肽中的Nef免疫抑制结构域相对于天然发生的Nef蛋白的免疫抑制结构域来说可以是经突变的或未经突变的。
因此，在一般情况下，如果上述新蛋白质或多肽所包含的或构成上述新蛋白质或多肽的Nef免疫抑制结构域无突变地来源于一般呈现免疫抑制特性的天然发生的Nef蛋白，则上述新蛋白质或多肽可以是免疫抑制的。
新蛋白质或多肽还可包含Nef免疫抑制结构域或由Nef免疫抑制结构域构成，所述Nef免疫抑制结构域相对于其天然形式来说是突变的。这种突变就Nef免疫抑制结构域的免疫抑制特性而言可以是沉默的，这在一般情况下意味着它不影响Nef免疫抑制结构域的免疫抑制特性，或者该突变可以使得免疫抑制结构域是免疫抑制缺陷的，如影响Nef免疫抑制结构域的上述突变的情况一样。
进一步地，在某些特殊情况下，免疫抑制结构域还可来源于缺乏免疫抑制特性的天然发生的Nef变体。
在上述新蛋白质或多肽的一个优选实施方案中，Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白第一个α螺旋的N-末端延伸至第二个α螺旋的C-末端的氨基酸序列之中。
在上述新蛋白质或多肽的另一优选实施方案中，Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸，特别是从第81位氨基酸至第140位氨基酸的序列之中，并且特别是·包括在从HIV-1Nef蛋白序列第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是从第81位氨基酸至第118位氨基酸的序列之中，或·包括在从HIV-2Nef蛋白序列第104位氨基酸至第150位氨基酸，特别是从第104位氨基酸至第140位氨基酸的序列之中。
更优选地，在上述新蛋白质或多肽中，HIV-1Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第90位氨基酸至第113位氨基酸，特别是从第90位氨基酸至第112位氨基酸的序列中。
在上述新蛋白质或多肽的另一优选实施方案中，Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在与从SEQ ID NO1第80位氨基酸至第120位氨基酸，特别是从SEQ ID NO1第81位氨基酸至第117位氨基酸，更特别是从SEQ ID NO1第90位氨基酸至第112位氨基酸的氨基酸序列同源的序列之中。
在上述新蛋白质或多肽的一个特别优选的实施方案中，Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在所述Nef蛋白N-末端的、长度为26或27个氨基酸的序列之中，所述长度为26或27个氨基酸的序列的N-末端是五肽AX1DX2S并且所述长度为26或27个氨基酸的序列的C-末端是氨基酸L，其中X1代表任意氨基酸，特别是I、V、L、F或R，和X2代表任意氨基酸，特别是M、L或F。
在本发明的一个优选实施方案中，构成或包含在上述新蛋白质或多肽中的Nef免疫抑制结构域是非突变的，这样的结构域被认为是非突变的，并且来源于天然具有免疫抑制性的Nef蛋白。有利地，包含或由这样的非突变的结构域所构成的新蛋白质或多肽是免疫抑制的。
在另一优选实施方案中，新蛋白质或多肽由下述HIV-1Nef片段之一构成
80-120 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO32)81-120 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO33)82-120 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO34)83-120 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO35)84-120 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO36)85-120 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO37)86-120 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO38)87-120 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO39)88-120 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO40)89-120 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQGY(SEQ ID NO41)90-120 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWTYHTQGY(SEQ ID NO42)80-119 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO43)81-119 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO44)82-119 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO45)83-119 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO46)84-119 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO47)85-119 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO48)86-119 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO49)87-119 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO50)88-119 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO51)89-119 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ LD NO52)90-119 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQG(SEQ ID NO53)80-118 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO54)81-118 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO55)82-118 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO56)83-118 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO57)84-118 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO58)85-118 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO59)86-118 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO60)87-118 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO61 )88-118 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO62)89-118 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO63)90-118 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHTQ(SEQ ID NO64)80-117 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO65)81-117 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO66)82-117 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHISQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO67)83-117 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO68)84-117 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO69)85-117 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ I DNO70)86-117 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO71)87-117 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO72)88-117 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO73)89-117 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYHT(SEQ ID NO74)90-117 FLKEKGGLEGLIHSQIRRQDILDLWTYHT(SEQ ID NO75)80-116 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO76)81-116 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO77)82-116 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO78)83-116 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO79)84-116 AVDLSIHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO80)85-116 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO81)86-116 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO82)87-116 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO83)88-116 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO84)
89-116 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO85)90-116 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIYH(SEQ ID NO86)80-115 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO87)81-115 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO88)82-115 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO89)83-115 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO90)84-115 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO91)85-115 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO92)86-115 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO93)87-115 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO94)88-115 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO95)89-115 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO96)90-115 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWIY(SEQ ID NO97)80-114 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO98)81-114 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO99)82-114 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO100)83-114 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO101)84-114 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO102)85-114 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO103)86-114 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO104)87-114 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO105)88-114 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO106)89-114 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO107)90-114 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLWI(SEQ ID NO108)80-113 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO109)81-113 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO110)82-113 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO111)83-113 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO112)84-113 AVDISHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO113)85-113 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO114)86-113 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO115)87-113 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO116)88-113 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO117)89-113 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO118)90-113 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDLW(SEQ ID NO119)80-112 TYKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO120)81-112 YKAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO121 )82-112 KAAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO122)83-112 AAVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO123)84-112 AVDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO124)85-112 VDLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO125)86-112 DLSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL (SEQ ID NO126)87-112 LSHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO127)88-112 SHFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO128)89-112 HFLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO129)90-112 FLKEKGGLEGLIHSQRRQDILDL(SEQ ID NO130)或由与所述HIV-1Nef片段具有至少80％序列同一性，优选90％同一性的同源肽序列之一构成。
本发明还涉及包含所述HIV-1Nef片段或同源肽序列的新蛋白质或多肽，条件是，如果存在，那么邻近于在所述蛋白质或多肽中的HIV-1Nef片段的各自N-末端和/或C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中的HIV-1Nef片段的各自N-末端和/或C-末端的序列。
在另一优选实施方案中，新蛋白质或多肽由下述HIV-2Nef片段之一构成104-150 RVPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO131)105-150 VPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO132)106-150 PLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO133)107-150 LREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO134)108-150 REMTYRIARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO135)109-150 EMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO136)110-150 MTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO137)111-150 TYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO138)112-150 YRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO139)113-150 RLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO140)114-150 LARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO141)115-150 ARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO142)116-150 RDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO143)117-150 DMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO144)118-150 MSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO145)119-150 SHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO146)120-150 HLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG(SEQ ID NO147)121-150 LIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEEG (SEQ ID NO148)104-149 RVPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO149)105-149 VPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO150)106-149 PLREM TYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO151)107-149 LREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO152)108-149 REMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO153)109-149 EMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO154)110-149 MTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO155)111-149 TYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO156)112-149 YRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO157)113-149 RLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO158)114-149 LARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO159)115-149 ARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO160)116-149 RDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO161)117-149 DMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO162)118-149 MSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO163)119-149 SHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO164)120-149 HLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO165)121-149 LIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKEE(SEQ ID NO166)104-148 RVPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO167)105-148 VPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO168)106-148 PLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDVLRRRRLDIYLEKE(SEQ ID NO169)107-148 LREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO170)108-148 REMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO171)109-148 EMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDWLEKE(SEQ ID NO172)110-148 MTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO173)111-148 TYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO174)112-148 YRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO175)113-148 RLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO176)114-148 LARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO177)115-148 ARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO178)116-148 RDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO179)117-148 DMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO180)118-148 MSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO181)119-148 SHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO182)120-148 HLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO183)121-148 LIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEKE(SEQ ID NO184)104-147 RVPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEK(SEQ ID NO185)105-147 VPLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEK(SEQ ID NO186)106-147 PLREMTYRLARDMSHLIKEKGGLEGLYYSDRRRRVLDIYLEK(SEQ ID NO187)
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本发明还涉及包括所述HIV-2Nef片段或同源肽序列的新蛋白质或多肽，条件是，如果存在，那么邻近于在所述蛋白质或多肽中的HIV-2Nef片段的各自N-末端和/或C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中的HIV-2Nef片段的各自N-末端和/或C-末端的序列。
在上述新蛋白质或多肽的另一特别优选的实施方案中，免疫抑制结构域通过至少一个氨基酸的删除、置换和/或插入进行突变，并且特别地与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。有利地，这样的新蛋白质或多肽缺乏免疫抑制活性。
在上述新蛋白质或多肽的另一个特别优选的实施方案中，HIV-1Nef蛋白的免疫抑制结构域通过由不同于E的任意氨基酸替代所述HIV-1Nef蛋白序列的第93位氨基酸而进行突变，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
本发明还涉及其特征在于它编码如上所述的新蛋白质或多肽的核酸。
本发明还涉及如上所述的新蛋白质或多肽的肽模拟物。
本发明还涉及针对从Nef蛋白的第80位氨基酸至第150位氨基酸的序列的抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，并且特别是·针对从HIV-1Nef蛋白序列的第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是从第90位氨基酸至第120位氨基酸的序列，·针对从HIV-2Nef蛋白序列的第104位氨基酸至第150位氨基酸的序列。
本发明还涉及针对上述新蛋白质或多肽的抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，条件是所述抗体或其片段、scFv多肽、或适体不结合其中免疫抑制结构域相应于如上限定的所述新蛋白质或多肽的免疫抑制结构域的Nef蛋白。
如本文所希望的，上述抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽对于根据本发明的新蛋白质或多肽(即根据本发明的包含Nef蛋白的免疫抑制结构域的蛋白质或多肽)来说是特异的。特别地，这些抗体或其片段、scFv多肽、或适体不结合在其天然背景中的Nef蛋白的免疫抑制结构域，即这些抗体或其片段、scFv多肽、或适体不结合天然的Nef蛋白。
本发明还涉及药物组合物或疫苗组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的上述新蛋白质或多肽，或编码所述新蛋白质或多肽的上述核酸作为活性物质。
本发明还涉及包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段组成的蛋白质或多肽在制备希望用于预防或治疗需要抑制免疫系统的病理状态例如过敏反应、自身免疫性疾病或移植排斥的药物中的用途，其中所述蛋白质或多肽呈现免疫抑制活性。
在一个有利的实施方案中，本发明涉及如上所述的新蛋白质或多肽在制备希望用于预防或治疗需要抑制免疫系统的病理状态例如过敏反应、自身免疫性疾病或移植排斥的药物中的上述用途，其中所述新蛋白质或多肽呈现免疫抑制特性。
本发明还涉及包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽在筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物中的用途。
本发明还涉及如上所述的新蛋白质或多肽在筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物中的用途。
有利地，具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的此类化合物可以用作抗病毒剂。
如本文所希望的，待筛选的化合物可以具有任何化学性质。特别地，待筛选的化合物包括在化学化合物库中。
在如上所述的新蛋白质或多肽的上述用途的一个优选实施方案中，Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列相应于未突变的序列。
本发明还涉及具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物。此类化合物可以用于制造药物组合物，所述药物组合物特别希望用于预防或治疗病毒性疾病，例如HIV或SIV感染。
这些化合物的免疫抑制-抑制活性可以通过在化合物不存在或存在下测量给定Nef蛋白的免疫抑制指数来确定。当在化合物存在下给定Nef蛋白的免疫抑制指数相对于在所述化合物不存在下相同Nef蛋白的免疫抑制指数来说是减少的时，则认为所述化合物具有免疫抑制-抑制活性。
本发明还涉及Nef蛋白的免疫抑制结构域的配体在筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物中的用途，所述配体例如为抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽。
本发明还涉及筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物的方法，包括下述步骤-使Nef蛋白或其包含Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段、或者如上所述的新蛋白质或多肽与待筛选的化合物接触，-选择与所述Nef蛋白的免疫抑制结构域或其包含所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段的免疫抑制结构域、或者如上所述的新蛋白质或多肽的免疫抑制结构域结合的化合物，-任选地检查所选择的化合物是否抑制Nef蛋白的免疫抑制活性。
在本发明的一个优选实施方案中，上述筛选方法包括下述步骤-使Nef蛋白或其包含Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段、或者如上所述的新蛋白质或多肽与待筛选的化合物以及与所述免疫抑制结构域的配体接触，所述配体例如为抗体、scFv多肽、适体或结合肽，-选择阻止所述配体与所述Nef蛋白或所述Nef片段、或者如上所述的新蛋白质或多肽结合并且不结合所述配体的化合物，-任选地检查所选择的化合物是否抑制Nef蛋白的免疫抑制活性。
本发明还涉及筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物的方法，其中选择出结合Nef蛋白或其片段的化合物，并检查所述选择出的化合物是否抑制所述Nef蛋白的免疫抑制活性。
本发明还涉及根据上述本发明筛选方法而选择出的化合物。
附图简述

图1图1显示野生型Nef(白色柱)及其E93R突变体(灰色柱)的免疫抑制指数(纵轴)。
图2图2显示转化了所示量(横轴，以μg表示)的野生型Nef表达载体(黑色圆圈，实线)或E93R Nef突变体表达载体(白色圆圈，虚线)的HeLa细胞的CD4表达下调(纵轴，任意单位)。
图3图3显示转化了所示量(横轴，以μg表示)的野生型Nef表达载体(黑色圆圈，实线)或E9 3R Nef突变体表达载体(白色圆圈，虚线)的293T细胞的MHC-I表达下调(纵轴，任意单位，左侧为Nef，右侧为E93R Nef突变体)。
图4图4显示由Clustal W软件产生的来自独立的HIV-1、HIV-2或SIV分离物的Nef氨基酸序列的序列比对。方框内是包括免疫抑制结构域的Nef蛋白序列的一部分。粗体是相应于或与SEQ I D NO1(NEF_HIVB1)的E93同源的氨基酸。星号表示保守氨基酸的位置；单点表示基本上保守的氨基酸的位置；双点表示具有类似物理化学特性的氨基酸的位置。
图5图5显示HIV-1株系LAI Nef及其3个片段(1-89、80-120和113-206)的免疫抑制指数。HIV-1株系LAI的部分序列显示在该图上部，并标有数个氨基酸的位置以及片段的位置。野生型Nef及每个片段的免疫抑制活性的存在(+)或不存在(-)标明在右侧(免疫抑制指数)。
图6A和图6B图6A显示了HIV-1株系A1 Nef(左侧柱)和HIV-2株系ST Nef(右侧柱)的免疫抑制指数(纵轴)。
图6B显示了SIV株系mac239 Nef(左侧柱)和相应的E125R突变体(右侧柱)的免疫抑制指数(纵轴)。
实施例实施例1克隆编码野生型Nef和E93R Nef突变体的基因通过PCR从pCDNA3-Nef(Peden K.，Emerman M.和Montagnier L.1991，Virology185(2)661-672)(O.Schwartz赠与，InstitutPasteur，France)重新获得HIV-1株系LAI Nef，其中使用高保真PfxPlatinum聚合酶(Invitrogen)及下述引物5′-ATACATGGCCCAGCCGGCCGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGT-3′(SEQ ID NO4)
和5′-ATACATGGATCCACGCGTTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG-3′(SEQ ID NO5)。
扩增产物用SfiI和BamHI消化，并连接入用相同酶打开的pSecTag2A载体(Invitrogen)中。随后用下述引物扩增出在载体中的前面具有输出信号序列的Nef5′-ATACATACCGGTATGGAGACAGACACACTCCTGCTATG-3′(SEQ ID NO6)，和5′-ATACATGGATCCACGCGTTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG-3′(SEQ ID NO7)。
产物用AgeI和MluI消化，并连接到用相同酶消化的逆转录病毒载体pDFG-MoTMtag(Mangeney&Heidmann(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9514920-5)中，以获得表达输出型HIV-Nef(SEQ ID NO17)的pDFG-expNef(SEQ ID NO16)。
随后通过连接3个下述片段将突变E93R引入pDFG-expNef中，以产生表达输出型E93R Nef(SEQ ID NO19)的pDFG-expNefE93R(SEQ IDNO18)1)载体的AgeI-MluI片段；2)通过下述引物获得并经AflII消化的PCR产物5′-ATACATACCGGTATGGAGACAGACACACTC-3′(SEQ Id NO8)和5′-ATACATCTTAAGAAAGTGGCTAAGATCTACAGCTGCC-3′(SEQ ID NO9)；3)通过下述引物获得并经AflII和MluI消化的PCR产物5′-ATACATCTTAAGCGAAAGGGGGGACTGGAAGGG-3′(SEQ ID NO10)和5′-ATACATACGCGTTCAGCAGTTCTTGAA-3′(SEQ Id NO11)。
然后用下述引物从pDFG-expNef载体重新获得Nef及其突变体E93R5′-ATACATGTCGACCCAACTAGAACCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAG-3′(SEQ ID NO12)，和5′-ATACATACGCGTTCAGCAGTTCTTGAA-3′(SEQ ID NO13)。
产物用SalI和MluI消化，并连接到用XhoI和MluI消化的phCMV-envT(Blaise等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.10013013-8)中，以分别产生表达Nef(SEQ ID NO1)的phCMV-Nef(SEQ ID NO20)和表达E93R Nef(SEQ ID NO2)的phCMV-NefE93R(SEQ ID NO21)。
类似地，从pDFG-expNef和pDFG-expNefE93R中分别提取编码含输出信号序列的Nef和E93R Nef突变体的序列，并插入到phCMV中，以产生phCMV-expNef(SEQ TD NO14)和phCMV-expNefE93R(SEQ ID NO15)。
实施例2测定野生型Nef和E93R Nef突变体的免疫抑制指数根据Mangeney&Heidmann(1998)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.9514920-5和Mangeney等人(200I)J.Gen.Virol.822515-8中所述一般程序测量Nef及其E93R突变体的免疫抑制指数。
简而言之，用质粒pDFG-expNef和pDFG-expNefE93R，或任选地用质粒phCMV-expNef和phCMV-expNefE93R分别稳定转化MCA205细胞。然后将表达野生型Nef、表达E93R Nef突变体或者不表达外源蛋白的106个MCA细胞注射到Balb/c小鼠中，并每隔一天测量肿瘤面积。7-8天后，测定免疫抑制指数。
将蛋白质的免疫抑制指数计算为(A蛋白质-A无)/A无，其中A蛋白质和A无分别是用表达目的蛋白(即Nef或E93R Nef突变体)和不表达外源蛋白的MCA细胞获得的峰肿瘤面积。
结果显示于图1中。如可以看出的，Nef的免疫抑制指数为大约0.6，这表示表达Nef的肿瘤的大小比正常肿瘤大1.6倍，因此证实Nef是抑制抗肿瘤免疫应答的免疫抑制蛋白。相反地，E93R Nef突变体的免疫抑制指数是负数，因此证实这种突变体没有免疫抑制活性，并且表达这种Nef突变体的肿瘤与正常肿瘤相比更易被免疫系统识别并消除。
实施例3Nef及其E93R突变体下调CD4的表达用1μg CMV-CD4(Janvier等人(2001)J.Virol.753971-6)和所示量的phCMV-Nef或phCMV-NefE93R共转染HeLa细胞。然后使用偶联了PC5的抗-人CD4抗体(IM2636，Immunotech)通过FACS测量CD4表达。图2中显示的结果表明，野生型Nef和E93R Nef突变体下调CD4表达至相似程度。这暗示E93R Nef突变体的结构相对于野生型Nef的结构没有变化。
实施例4Nef及其E93R突变体下调MHC-I的表达用1μg CMV-HLA A2(Le Gall等人(2000)J.Virol.749256-66)和所示量的phCMV-Nef或phCMV-NefE93R共转染293T细胞。使用偶联了PE的抗人MHC-I抗体W6/32(eBioScience)通过FACS测量MHC-I表达。
图3中显示的结果表明，野生型Nef和E93R Nef突变体下调MHC-I表达至相似程度。这也暗示E93R Nef突变体的结构相对于野生型Nef的结构没有变化。
实施例5确定野生型Nef的免疫抑制结构域的定位基于Nef的三维结构，已设计了HIV-1株系LAI的Nef蛋白的下列3个片段以便确定Nef的免疫抑制结构域的定位1)从第1号残基延伸至第89号残基的片段，2)从第80号残基延伸至第120号残基的片段，3)从第113号残基延伸至第206号残基的片段。
片段2包括推定的免疫抑制结构域，而片段1和3不包括这个结构域。根据HIV-1Nef蛋白的已知核心结构(PBD，条目1EFN)，片段2从推定的Nef免疫抑制结构域开始以两个方向延伸以便包括完整的2个α螺旋结构域，所述2个α螺旋结构域包括推定的Nef免疫抑制结构域。
使用克隆入pCDNA3载体(Peden K.，Emerman M.和Montagnier L.1991，Virology185(2)661-672)中的Nef基因作为模板及下述引物对通过PCR产生编码那些片段的DNA·对于片段1-atacatggcccagccggccggtggcaagtggtcaaaaagtagt(SEQ D NO22)-atacatacgcgttcagtggctaagatctacagctgcctt(SEQ ID NO23)，·对于片段2-atacatggcccagccggccacttacaaggcagctgtagatcttagc(SEQIDNO24)-atacatacgtcgttcagccttgtgtgtggtagatccac(SEQ ID NO25)，·对于片段3-atacatggcccagccggccgatatccttgatctgtggatctaccac(SEQ ID NO26)-atacataacgcgttcagcagttcttgaagtactccgg(SEQID NO27)PCR产物用SfiI和MluI消化并克隆到用相同酶打开的pDFG-expNef中，产生这些片段与人Ig K轻链的细胞外输出信号肽的基因融合。因此，所得的构建物表达HIV-1Nef的细胞外定位的片段。它们用于实施例2中所述的体内免疫抑制测定法中。正的指数(+)表示所考虑的片段具有体内免疫抑制特性，而低于或等于零的指数(-)表示所考虑的片段缺乏此类特性。
如图5中所图解说明的，从HIV-1Nef蛋白的残基90延伸至残基120的片段显示出体内免疫抑制特性。因此，这个片段包括Nef的免疫抑制结构域。片段1和3显示，这种免疫抑制结构域可以被进一步缩小至氨基酸90-112。
实施例6测定另外的野生型Nef蛋白的免疫抑制指数如实施例2中所述，测定HIV-1株系A1 Nef(SEQ ID NO28)和HIV-2株系ST Nef(SEQ ID NO29)的Nef免疫抑制指数。
如所预期的，结果表明这些Nef蛋白也具有免疫抑制性(图6A)。
实施例7测定SIV Nef及其E125R突变体的免疫抑制指数如实施例2中所述，测定SIV株系mac239野生型Nef(SEQ ID NO30)及其E125R突变体(SEQ ID NO31)的免疫抑制指数。SIV mac239Nef中的E125R突变与上述HIV-1 LAI的E93R突变同源，并且依照与实施例1中所述的相似的程序引入。
结果表明，SIV Nef蛋白具有免疫抑制活性，而E→R突变体完全缺乏此类活性(图6B)。
序列表<110> INSTITUT GUSTAVE ROUSSYCENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUEUNIVERSITE PARIS XI<120>用于调节免疫的突变型HIV NEF<130>WOB 04 CGIGR NEFI<160>274<170>PatentIn version3.1<210>1<211>206<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒1型<400>1Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val1 5 10 15Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala20 25 30Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr35 40 45Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu50 55 60Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr65 70 75 80Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly85 90 95Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu100 105 110Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr115 120 125Pro GIy Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys130 135 140Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu145 150 155 160Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro165 170 175
Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His180 185 190His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys195 200 205<210>2<211>206<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>E93R HIV-1Nef突变体<400>2Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val1 5 10 15Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala20 25 30Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr35 40 45Ala Ala Thr Asn Ala Ala CyS Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu50 55 60Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr65 70 75 80Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Arg Lys Gly Gly85 90 95Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu100 105 110Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr115 120 125Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys130 135 140Leu Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu145 150 155 160Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro165 170 175Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His180 185 190
His Val Ala Arg Glu Leu His Pro G1u Tyr Phe Lys Asn Cys1 95 200 205<210>3<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Nef免疫抑制结构域共有序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(2)<22 3>I，L，V，F或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(4)..(4)<223>M，L，或F<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(6)..(6)<223>H，D，或F<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(7)..(7)<223>F或L<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(8)..(8)<223>I或L<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>不同于E的任意氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(11)..(11)<223>K，Q，或R<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>G或无氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(15)
<223>E，D，或R<400>3Ala Xaa Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Gly Xaa Leu Xaa Gly1 5 10 15<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>4atacatggcc cagccggccg gtggcaagtg gtcaaaaagt agt43<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>5atacatggat ccacgcgttc agcagttctt gaagtactcc gg 42<210>6<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>6atacataccg gtatggagac agacacactc ctgctatg 38<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>7atacatggat ccacgcgttc agcagttctt gaagtactcc gg 42<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物
<400>8atacataccg gtatggagac agacacactc 30<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>9atacatctta agaaagtggc taagatctac agctgcc 37<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>10atacatctta agcgaaaggg gggactggaa ggg 33<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>11atacatacgc gttcagcagt tcttgaa 27<210>12<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>12atacatgtcg acccaactag aaccatgggt ggcaagtggt caaaaagtag50<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物<400>13atacatacgc gttcagcagt tcttgaa 27<210>14
<211>5361<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Nef表达载体<400>14gcggccgctc tagagagctt ggcccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca 60tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt 120aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 240taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 300agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 360cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 420tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 480tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 540gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 600caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 660aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac 720gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggtcg accgatcctg 780agaacttcag ggtgagtttg gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat 840tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct 900tgtatcacca tggaccctca tgataatttt gtttctttca ctttctactc tgttgacaac 960cattgtctcc tcttattttc ttttcatttt ctgtaacttt ttcgttaaac tttagcttgc1020atttgtaacg aatttttaaa ttcacttttg tttatttgtc agattgtaag tactttctct1080aatcactttt ttttcaaggc aatcagggta tattatattg tacttcagca cagttttaga1140gaacaattgt tataattaaa tgataaggta gaatatttct gcatataaat tctggctggc1200gtggaaatat tcttattggt agaaacaact acaccctggt catcatcctg cctttctctt1260tatggttaca atgatataca ctgtttgaga tgaggataaa atactctgag tccaaaccgg1320gcccctctgc taaccatgtt catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc1380tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct cgacggatcc ctcgacccaa1440ctagaaccat ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag1500tagcaataca gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga1560ggtgggtttt ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt1620agatcttagc cactttctta aggaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg1680aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca1740
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<223>E93R Nef突变体表达载体<400>15gcggccgctc tagagagctt ggcccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca 60tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt 120aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 240taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 300agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 360cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 420tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 480tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 540gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 600caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 660aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac 720gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggtcg accgatcctg 780agaacttcag ggtgagtttg gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat 840tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct 900tgtatcacca tggaccctca tgataatttt gtttctttca ctttctactc tgttgacaac 960cattgtctcc tcttattttc ttttcatttt ctgtaacttt ttcgttaaac tttagcttgc1020atttgtaacg aatttttaaa ttcacttttg tttatttgtc agattgtaag tactttctct1080aatcactttt ttttcaaggc aatcagggta tattatattg tacttcagca cagttttaga1140gaacaattgt tataattaaa tgataaggta gaatatttct gcatataaat tctggctggc1200gtggaaatat tcttattggt agaaacaact acaccctggt catcatcctg cctttctctt1260tatggttaca atgatataca ctgtttgaga tgaggataaa atactctgag tccaaaccgg1320gcccctctgc taaccatgtt catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc1380tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct cgacggatcc ctcgacccaa1440ctagaaccat ggggtgggag cagcatctcg agacctggaa aaacatggag caatcacaag1500tagcaataca gcagctacca atgctgcttg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga1560ggtgggtttt ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt1620agatcttagc cactttctta agcgaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg1680aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca1740gaactacaca ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct1800agtaccagtt gagccagata aggtagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt1860
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<223>表达与输出信号序列融合的Nef的pDFG-expNef载体<400>16ggatccgcgg gattagtcca atttgttaaa gacaggatat cagtggtcca ggctctagtt 60
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<223>与输出信号序列融合的Nef<400>17Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Gly Gly Lys Trp Ser Lys20 25 30Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala35 40 45Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys50 55 60His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr ASn Ala Ala Cys65 70 75 80Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr85 90 95Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu100 105 110Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser115 120 125Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly130 135 140Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr145 150 155 160
Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp165 170 175Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro180 185 190Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp195 200 205Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His210 215 220Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys225 230<210>18<211>10216<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表达与输出信号序列融合的E93R Nef突变体的pDFG-expNefE93R载体<400>18ggatccgcgg gattagtcca atttgttaaa gacaggatat cagtggtcca ggctctagtt 60ttgactcaac aatatcacca gctgaagcct atagagtacg agccatagat aaaataaaag 120attttattta gtctccagaa aaagggggga atgaaagacc ccacctgtag gtttggcaag 180ctagcttaag taacgccatt ttgcaaggca tggaaaaata cataactgag aatagagaag 240ttcagatcaa ggtcaggaac agatggaaca gctgaatatg ggccaaacag gatatctgtg 300gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gaacagctga atatgggcca 360aacaggatat ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc 420cagatgcggt ccagccctca gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc 480aaggacctga aatgaccctg tgccttattt gaactaacca atcagttcgc ttctcgcttc 540tgttcgcgcg cttctgctcc ccgagctcaa taaaagagcc cacaacccct cactcggggc 600gccagtcctc cgattgactg agtcgcccgg gtacccgtgt atccaataaa ccctcttgca 660gttgcatccg acttgtggtc tcgctgttcc ttgggagggt ctcctctgag tgattgacta 720cccgtcagcg ggggtctttc acatgcagca tgtatcaaaa ttaatttggt tttttttctt 780aagtatttac attaaatggc catagtactt aaagttacat tggcttcctt gaaataaaca 840tggagtattc agaatgtgtc ataaatattt ctaattttaa gatagtatct ccattggctt 900tctacttttt cttttatttt tttttgtcct ctgtcttcca tttgttgttg ttgttgtttg 960tttgtttgtt tgttggttgg ttggttaatt tttttttaaa gatcctacac tatagttcaa 1020
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<223>与输出信号序列融合的E93R Nef突变体<400>19Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Gly Gly Lys Trp Ser Lys
20 25 30Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala35 40 45Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys50 55 60His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys65 70 75 80Ala Trp Leu Glu Ala Gln Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Pro Val Thr85 90 95Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu100 105 110Ser His Phe Leu Lys Arg Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Ile His Ser115 120 125Gln Arg Arg Gln Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr His Thr Gln Gly130 135 140Tyr Phe Pro Asp Trp Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Pro Gly Val Arg Tyr145 150 155 160Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro Val Glu Pro Asp165 170 175Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser Leu Leu His Pro180 185 190Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp195 200 205Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Val Ala Arg Glu Leu His210 215 220Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys225 230<210>20<211>5443<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表达Nef的phCMV-Nef载体<400>20gcggccgctc tagagagctt ggcccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca 60
tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt 120aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 240taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 300agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 360cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 420tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 480tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 540gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 600caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 660aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac 720gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggtcg accgatcctg 780agaacttcag ggtgagtttg gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat 840tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct 900tgtatcacca tggaccctca tgataatttt gtttctttca ctttctactc tgttgacaac 960cattgtctcc tcttattttc ttttcatttt ctgtaacttt ttcgttaaac tttagcttgc 1020atttgtaacg aatttttaaa ttcacttttg tttatttgtc agattgtaag tactttctct 1080aatcactttt ttttcaaggc aatcagggta tattatattg tacttcagca cagttttaga 1140gaacaattgt tataattaaa tgataaggta gaatatttct gcatataaat tctggctggc 1200gtggaaatat tcttattggt agaaacaact acaccctggt catcatcctg cctttctctt 1260tatggttaca atgatataca ctgtttgaga tgaggataaa atactctgag tccaaaccgg 1320gcccctctgc taaccatgtt catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc 1380tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct cgacggatcc ctcgacccaa 1440ctagaaccat gggtggcaag tggtcaaaaa gtagtgtggt tggatggcct actgtaaggg 1500aaagaatgag acgagctgag ccagcagcag atggggtggg agcagcatct cgagacctgg 1560aaaaacatgg agcaatcaca agtagcaata cagcagctac caatgctgct tgtgcctggc 1620tagaagcaca agaggaggag gaggtgggtt ttccagtcac acctcaggta cctttaagac 1680caatgactta caaggcagct gtagatctta gccactttct taaggaaaag gggggactgg 1740aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag atatccttga tctgtggatc taccacacac 1800aaggctactt ccctgattgg cagaactaca caccagggcc aggggtcaga tatccactga 1860cctttggatg gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata 1920aaggagagaa caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca tggaatggat gaccctgaga 1980
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ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc4020atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg4080cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct4140tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa4200aaagcgggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt4260atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg4320cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc4380gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa4440agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt4500gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt4560caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag4620ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta4680tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat4740aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctaaa ttgtaagcgt taatattttg4800ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc4860ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt4920tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc4980tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg5040tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga5100aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg5160ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg5220ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg5280cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt5340tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgagcgcgcg5400taatacgact cactataggg cgaattggag ctccaccgcg gtg 5443<210>21<211>5443<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>表达E93R Nef突变体的phCMV-NefE93R载体<400>21gcggccgctc tagagagctt ggcccattgc atacgttgta tccatatcat aatatgtaca 60tttatattgg ctcatgtcca acattaccgc catgttgaca ttgattattg actagttatt 120
aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 180aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 240taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 300agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 360cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 420tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 480tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 540gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 600caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 660aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctggaga cgccatccac 720gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag cctccggtcg accgatcctg 780agaacttcag ggtgagtttg gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat 840tcatgttata tggagggggc aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct 900tgtatcacca tggaccctca tgataatttt gtttctttca ctttctactc tgttgacaac 960cattgtctcc tcttattttc ttttcatttt ctgtaacttt ttcgttaaac tttagcttgc1020atttgtaacg aatttttaaa ttcacttttg tttatttgtc agattgtaag tactttctct1080aatcactttt ttttcaaggc aatcagggta tattatattg tacttcagca cagttttaga1140gaacaattgt tataattaaa tgataaggta gaatatttct gcatataaat tctggctggc1200gtggaaatat tcttattggt agaaacaact acaccctggt catcatcctg cctttctctt1260tatggttaca atgatataca ctgtttgaga tgaggataaa atactctgag tccaaaccgg1320gcccctctgc taaccatgtt catgccttct tctctttcct acagctcctg ggcaacgtgc1380tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattcct cgacggatcc ctcgacccaa1440ctagaaccat gggtggcaag tggtcaaaaa gtagtgtggt tggatggcct actgtaaggg1500aaagaatgag acgagctgag ccagcagcag atggggtggg agcagcatct cgagacctgg1560aaaaacatgg agcaatcaca agtagcaata cagcagctac caatgctgct tgtgcctggc1620tagaagcaca agaggaggag gaggtgggtt ttccagtcac acctcaggta cctttaagac1680caatgactta caaggcagct gtagatctta gccactttct taagcgaaag gggggactgg1740aagggctaat tcactcccaa cgaagacaag atatccttga tctgtggatc taccacacac1800aaggctactt ccctgattgg cagaactaca caccagggcc aggggtcaga tatccactga1860cctttggatg gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata1920aaggagagaa caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca tggaatggat gaccctgaga1980gagaagtgtt agagtggagg tttgacagcc gcctagcatt tcatcacgtg gcccgagagc2040tgcatccgga gtacttcaag aactgctgaa cgcgtcaggt gcaggctgcc tatcagaagg2100
tggtggctgg tgtggccaat gccctggctc acaaatacca ctgagatctt tttccctctg2160ccaaaaatta tggggacatc atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga2220aatttatttt cattgcaata gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc ggaaggacat2280atgggagggc aaatcattta aaacatcaga atgagtattt ggtttagagt ttggcaacat2340atgcccatat gctggctgcc atgaacaaag gttggctata aagaggtcat cagtatatga2400aacagccccc tgctgtccat tccttattcc atagaaaagc cttgacttga ggttagattt2460tttttatatt ttgttttgtg ttattttttt ctttaacatc cctaaaattt tccttacatg2520ttttactagc cagatttttc ctcctctcct gactactccc agtcatagct gtccctcttc2580tcttatggag atccctcgac ggatcggccg caattcgtaa tcatgtcata gctgtttcct2640gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt2700aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc2760gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg2820agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg2880gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca2940gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac3000cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac3060aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg3120tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac3180ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat3240ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag3300cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac3360ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt3420gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt3480atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc3540aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga3600aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac3660gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc3720cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct3780gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca3840tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct3900ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca3960ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc4020
atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg4080cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct4140tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa4200aaagcgggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt4260atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg4320cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc4380gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa4440agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt4500gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt4560caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag4620ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta4680tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat4740aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctaaa ttgtaagcgt taatattttg4800ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc4860ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt4920tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc4980tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg5040tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga5100aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg5160ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg5220ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg5280cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt5340tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgagcgcgcg5400taatacgact cactataggg cgaattggag ctccaccgcg gtg 5443<210>22<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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Asp Lys Leu Gly Gly Glu Tyr Leu Gln Ser Gln Glu Gly Ser Gly Arg35 40 45Gly Gln Lys Ser Pro Ser Cys Glu Gly Arg Arg Tyr Gln Gln Gly Asp50 55 60Phe Met Asn Thr Pro Trp Arg Ala Pro Ala Glu Gly Glu Lys Gly Ser65 70 75 80Tyr Lys Gln Gln Asn Met Asp Asp Val Asp Ser Asp Asp Asp Asp Leu85 90 95Val Gly Val Pro Val Thr Pro Arg Val Pro Leu Arg Glu Met Thr Tyr100 105 110Arg Leu Ala Arg Asp Met Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu115 20 125Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile Tyr130 135 140Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Gly Asp Trp Gln Asn Tyr Thr His145 150 155 160Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Lys Phe Phe Gly Trp Leu Trp Lys Leu165 170 175Val Pro Val Asp Val Pro Gln Glu Gly Asp Asp Ser Glu Thr His Cys180 185 190Leu Val His Pro Ala Gln Thr Ser Arg Phe Asp Asp Pro His Gly Glu195 200 205Thr Leu Val Trp Arg Phe Asp Pro Thr Leu Ala Phe Ser Tyr Glu Ala210 215 220Phe Ile Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Tyr Lys Ser Gly Leu Pro Glu225 230 235 240Asp Glu Trp Lys Ala Arg Leu Lys Ala Arg Gly Ile Pro Phe Ser245 250 255<210>30<211>263<212>PRT<213>猿免疫缺陷病毒<400>30Met Gly Gly Ala Ile Ser Met Arg Arg Ser Arg Pro Ser Gly Asp Leu1 5 10 15
Arg Gln Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Leu20 25 30Gly Glu Val Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Pro Gly Gly Leu Asp Lys35 40 45Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Gly Gln Lys Tyr Asn Gln Gly Gln50 55 60Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Glu Glu Arg Glu Lys Leu65 70 75 80Ala Tyr Arg Lys Gln Asn Met Asp Asp Ile Asp Glu Glu Asp Asp Asp85 90 95Leu Val Gly Val Ser Val Arg Pro Lys Val Pro Leu Arg Thr Met Ser100 105 110Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly115 120 125Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile130 135 140Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asp Tyr Thr145 150 155 160Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Lys Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys165 170 175Leu Val Pro Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Glu His180 185 190Tyr Leu Met His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly195 200 205Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Thr Leu Ala Tyr Thr Tyr Glu210 215 220Ala Tyr Val Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser225 230 235 240Glu Glu Glu Val Arg Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Leu Asn Met245 250 255Ala Asp Lys Lys Glu Thr Arg260
<210>31<211>263<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>E125R SIV Nef突变体<400>31Met Gly Gly Ala Ile Ser Met Arg Arg Ser Arg Pro Ser Gly Asp Leu1 5 10 15Arg Gln Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Leu20 25 30Gly Glu Val Glu Asp Gly Tyr Ser Gln Ser Pro Gly Gly Leu Asp Lys35 40 45Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Gly Gln Lys Tyr Asn Gln Gly Gln50 55 60Tyr Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Glu Glu Arg Glu Lys Leu65 70 75 80Ala Tyr Arg Lys Gln Asn Met Asp Asp Ile Asp Glu Glu Asp Asp Asp85 90 95Leu Val Gly Val Ser Val Arg Pro Lys Val Pro Leu Arg Thr Met Ser100 105 110Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Arg Lys Gly Gly115 120 125Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile130 135 140Tyr Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gln Asp Tyr Thr145 150 155 160Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Lys Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys165 170 175Leu Val Pro Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Glu His180 185 190Tyr Leu Met His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly195 200 205Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Thr Leu Ala Tyr Thr Tyr Glu210 215 220
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<223>112-144 HIV-2Nef片段<400>247Tyr Arg Leu Ala Arg Asp Met Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly1 5 10 15Leu Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25 30Tyr<210>248<211>32
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1 5 10 15Gly Leu Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp20 25 30Ile<210>265<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>115-143 HIV-2Nef片段<400>268Ala Arg Asp Met Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly1 5 10 15Leu Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25<210>269<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>116-143 HIV-2Nef片段<400>269Arg Asp Met Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu1 5 10 15Tyr Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25<210>270<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>117-143 HIV-2Nef片段<400>270Asp Met Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Tyr1 5 10 15Tyr Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25<210>271<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
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1 5 10 15Ser Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25<210>272<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>119-143 HIV-2Nef片段<400>272Ser His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser1 5 10 15Asp Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20 25<210>273<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>120-143 HIV-2Nef片段<400>273His Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser Asp1 5 10 15Arg Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20<210>274<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>121-143 HIV-2Nef片段<400>274Leu Ile Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly Leu Tyr Tyr Ser Asp Arg1 5 10 15Arg Arg Arg Val Leu Asp Ile20
权利要求
1.在Nef蛋白的免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变用于调节所述蛋白的免疫抑制特性的用途。
2.根据权利要求1的用途，在Nef蛋白的免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变用于抑制所述蛋白的免疫抑制特性。
3.根据权利要求1或2的用途，以获得在其免疫抑制结构域中发生突变的Nef蛋白或其片段，从而制备希望用于预防和/或治疗病毒性疾病的药物或疫苗，条件是所述片段包括所述Nef蛋白的所述经突变的免疫抑制结构域。
4.根据权利要求1-3中任何一项的用途，其中所述Nef蛋白的结构基本上被保留。
5.根据权利要求1-4中任何一项的用途，其中所述Nef蛋白的表位，特别是构象表位基本上被保留。
6.一种消除Nef蛋白的免疫抑制特性的方法，其包括-通过至少一个氨基酸的删除、置换或插入来突变所述Nef蛋白的免疫抑制结构域，-通过体内免疫抑制性测定法检查所述免疫抑制活性的消除。
7.根据权利要求6的方法，其中在进一步的步骤中检查所述Nef蛋白的结构和/或表位是否基本上被保留。
8.一种药物组合物或疫苗组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的蛋白质或多肽作为活性物质，所述蛋白质或多肽包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成，其中·所述Nef蛋白的免疫抑制结构域通过至少一个氨基酸的删除、置换和/或插入进行突变，条件是所述Nef蛋白基本上没有免疫抑制活性，和·所述片段包括所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域并且基本上没有免疫抑制活性。
9.根据权利要求8的药物组合物或疫苗组合物，其中所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白第一个α螺旋的N-末端延伸至第二个α螺旋的C-末端的氨基酸序列之中。
10.根据权利要求8或9的药物组合物或疫苗组合物，其中所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸的序列之中，并且特别是·包括在从HIV-1 Nef蛋白序列第80位氨基酸至第120位氨基酸的序列之中，或·包括在从HIV-2 Nef蛋白序列第104位氨基酸至第150位氨基酸的序列之中。
11.根据权利要求8-10中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其中所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在与从SEQID NO1第80位氨基酸至第120位氨基酸，特别是从SEQ ID NO1第90位氨基酸至第112位氨基酸的氨基酸序列同源的序列之中。
12.根据权利要求8-11中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其中所述Nef蛋白的经突变的免疫抑制结构域的序列包括在所述Nef蛋白N-末端的、长度为26或27个氨基酸的序列之中，所述长度为26或27个氨基酸的序列的N-末端是五肽AX1DX2S并且所述长度为26或27个氨基酸的序列的C-末端是氨基酸L，其中X1代表任意氨基酸，特别是I、V、L、F或R，和X2代表任意氨基酸，特别是M、L或F。
13.根据权利要求8-12中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其包含作为活性物质的包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽，所述Nef蛋白或其片段包括下述序列AX1DX2SX3X4X5KX6X7GX8LX9G(SEQ ID NO3)其中X1代表I、L、V、F或R，X2代表M、L或F，X3代表H、D或F，X4代表F或L，X5代表I或L，X6代表不同于E的任意氨基酸，特别是R，X7代表K、Q或R，X8代表G或没有氨基酸，X9代表E、D或R。
14.根据权利要求8-13中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其包含作为活性物质的包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽，其中与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
15.根据权利要求8-14中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其包含作为活性物质的Nef蛋白，其中与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
16.根据权利要求8-15中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其包含作为活性物质的相应于SEQ ID NO2的突变型Nef蛋白。
17.根据权利要求8-16中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其特征在于，当Nef蛋白包括在所述药物组合物或疫苗组合物中时，所述Nef蛋白的结构基本上被保留。
18.根据权利要求8-17中任何一项的药物组合物或疫苗组合物，其特征在于，当Nef蛋白包括在所述药物组合物或疫苗组合物中时，所述Nef蛋白的表位，特别是构象表位基本上被保留。
19.一种药物组合物或疫苗组合物，其包含编码例如权利要求8-18中任何一项所限定的蛋白质或多肽的核酸作为活性物质。
20.权利要求8-18中任何一项所限定的蛋白质或多肽，或权利要求19中所限定的核酸在制备希望用于预防和/或治疗病毒性疾病例如HIV感染的药物或疫苗中的用途。
21.权利要求8-18中任何一项所限定的蛋白质或多肽在制备下述物质中的用途-针对权利要求8-18中任何一项所限定的所述蛋白质或多肽的多克隆或单克隆抗体或其片段，例如Fab或F(ab)′2片段，-针对权利要求8-18中任何一项所限定的所述蛋白质或多肽的scFv多肽，-针对权利要求8-18中任何一项所限定的所述蛋白质或多肽的适体，-针对权利要求8-18中任何一项所限定的所述蛋白质或多肽的结合肽。
22.针对权利要求8-18中任何一项所限定的蛋白质或多肽的抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，条件是所述抗体或其片段、scFv多肽、或适体不结合与权利要求8-18中任何一项所限定的蛋白质或多肽不同的蛋白质或多肽。
23.一种制备Nef蛋白的突变体的方法，其中-在第一个步骤中，通过至少一个氨基酸的删除、插入或置换来突变从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸的序列，-在第二个步骤中，检查在第一个步骤中获得的所述突变型Nef蛋白的免疫抑制特性，并选择缺乏免疫抑制特性的突变体。
24.根据权利要求23的制备Nef蛋白的突变体的方法，其中在第三个步骤中，检查在第二个步骤中获得的突变型Nef蛋白的CD4和/或MHC-I下调功能，并选择相对于所述Nef蛋白来说基本上保留了CD4和/或MHC-I下调功能的突变型Nef蛋白。
25.根据权利要求23或24的制备Nef蛋白的突变体的方法，其中所述经突变的序列的范围为-HIV-1蛋白序列的第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是第90位氨基酸至第112位氨基酸，或-HIV-2 Nef蛋白序列的第104位氨基酸至第150位氨基酸。
26.通过根据权利要求23-25中任何一项的方法易于制备的Nef蛋白突变体。
27.药物组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的根据权利要求26的Nef蛋白突变体。
28.一种蛋白质或多肽，其包含Nef蛋白的免疫抑制结构域或由Nef蛋白的免疫抑制结构域构成，条件是，如果存在，那么邻近于在所述蛋白质或多肽中的免疫抑制结构域的各自N-末端和/或C-末端的序列不同于邻近于在其所来源的Nef蛋白中的免疫抑制结构域的各自N-末端和/或C-末端的序列。
29.根据权利要求28的蛋白质或多肽，其中所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白第一个α螺旋的N-末端延伸至第二个α螺旋的C-末端的氨基酸序列之中。
30.根据权利要求28或29的蛋白质或多肽，其中所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在从所述Nef蛋白序列第80位氨基酸至第150位氨基酸的序列之中，并且特别是·包括在从HIV-1 Nef蛋白序列第80位氨基酸至第120位氨基酸的序列之中，·包括在从HIV-2 Nef蛋白序列第104位氨基酸至第150位氨基酸的序列之中。
31.根据权利要求28-30中任何一项的蛋白质或多肽，其中所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在与从SEQ ID NO1第8O位氨基酸至第120位氨基酸，特别是从SEQ ID NO1第90位氨基酸至第112位氨基酸的氨基酸序列同源的序列之中。
32.根据权利要求28-31中任何一项的蛋白质或多肽，其中所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列包括在所述Nef蛋白N-末端的、长度为26或27个氨基酸的序列之中，所述长度为26或27个氨基酸的序列的N-末端是五肽AX1DX2S并且所述长度为26或27个氨基酸的序列的C-末端是氨基酸L，其中X1代表任意氨基酸，特别是I、V、L、F或R，和X2代表任意氨基酸，特别是M、L或F。
33.根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽，其中所述免疫抑制结构域通过至少一个氨基酸的删除、置换和/或插入进行突变，并且特别地其中与SEQ ID NO1的第93位氨基酸同源的氨基酸由不同于E的任意氨基酸替代，所述任意氨基酸特别是W、F、M、Y、R、H或K，更特别是R、H或K，且优选R。
34.一种核酸，其特征在于，它编码权利要求28-33中所限定的蛋白质或多肽。
35.抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，其针对从Nef蛋白的第8O位氨基酸至第150位氨基酸的序列，并且特别是·针对从HIV-1 Nef蛋白序列的第80位氨基酸至第120位氨基酸，更特别是从第90位氨基酸至第120位氨基酸的序列，·针对从HIV-2 Nef蛋白序列的第104位氨基酸至第150位氨基酸的序列。
36.抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽，其针对权利要求28-33中所限定的蛋白质或多肽，条件是所述抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽不结合其中免疫抑制结构域相应于权利要求28-33中所限定的所述蛋白质或多肽的免疫抑制结构域的Nef蛋白。
37.一种药物组合物或疫苗组合物，其包含与药物学上可接受的载体相联合的权利要求28-33中任何一项的蛋白质或多肽，或根据权利要求34的核酸作为活性物质。
38.包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽在制备希望用于预防或治疗需要抑制免疫系统的病理状态例如过敏反应、自身免疫性疾病或移植排斥的药物中的用途，其中所述蛋白质或多肽呈现免疫抑制活性。
39.根据权利要求36的用途，其中根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽用于制备希望用于预防或治疗需要抑制免疫系统的病理状态例如过敏反应、自身免疫性疾病或移植排斥的药物，其中所述蛋白质或多肽呈现免疫抑制活性。
40.包含Nef蛋白或其片段或者由Nef蛋白或其片段构成的蛋白质或多肽在筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物中的用途。
41.根据权利要求40的用途，其中根据权利要求28-33中任何一项的蛋白质或多肽用于筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物。
42.根据权利要求40或41的用途，所述蛋白质或多肽为根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽，其中所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的序列相应于非突变型序列。
43.Nef蛋白的免疫抑制结构域的配体在筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物中的用途，所述配体例如为抗体或其片段、scFv多肽、适体或结合肽。
44.一种筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物的方法，其包括下述步骤-使Nef蛋白或其包含Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段、或者根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽与待筛选的化合物接触，-选择与所述Nef蛋白的免疫抑制结构域或其包含所述Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段的免疫抑制结构域、或者根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽的免疫抑制结构域结合的化合物，-任选地检查所选择的化合物是否抑制Nef蛋白的免疫抑制活性。
45.根据权利要求44的筛选具有抑制Nef蛋白免疫抑制活性的倾向的化合物的方法，其包括下述步骤-使Nef蛋白或其包含Nef蛋白的免疫抑制结构域的片段、或者根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽与待筛选的化合物以及与所述免疫抑制结构域的配体接触，所述配体例如为抗体、scFv多肽、适体或结合肽，-选择阻止所述配体与所述Nef蛋白或所述Nef片段、或者根据权利要求28-32中任何一项的蛋白质或多肽结合并且不结合所述配体的化合物，-任选地检查所选择的化合物是否抑制Nef蛋白的免疫抑制活性。
46.一种蛋白质，其由SEQ ID NO2或SEQ ID NO31表示。
47.一种核酸，其编码由SEQ ID NO2或SEQ ID NO31表示的蛋白质。
全文摘要
本发明涉及HIV或SIV辅助蛋白免疫抑制结构域中至少一个氨基酸的突变调节所述蛋白免疫抑制活性的用途。
文档编号C07K16/10GK101027084SQ200580027835
公开日2007年8月29日 申请日期2005年8月17日 优先权日2004年8月17日
发明者M·雷纳德, M·曼吉尼, T·海德曼 申请人:古斯达威罗斯研究所, 国家科研中心, 巴黎第十一大学