专利名称：藤霉素的纯化方法
技术领域：
本发明一般涉及药理学活性免疫抑制剂和抗微生物三环类大环内酯，特别是回收和纯化藤霉素(tacrolimus)(I)的方法。
发明背景藤霉素(I)即(17-烯丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04，9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮)是一种由链霉菌属发酵产生的三环大环内酯，其用于治疗移植物排斥危机、自身免疫疾病、感染性疾病等。
EP 0184162公开了通过发酵和化学合成制备藤霉素及其衍生物的方法。具体而言，除了藤霉素外，用链霉菌属(Streptomyces sp)发酵还产生17-乙基衍生物(II)即(17-乙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04.9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮)，通常称为FK520
以及17-丙基衍生物(III)即(17-丙基-1，14-二羟基-12-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-23，25-二甲氧基-13，19，21，27-四甲基-11，28-二氧基-4-氮杂三环-[22.3.1.04.9]二十八-18-烯-2，3，10，16-四酮) 除了藤霉素及其副产物的化学物理特征外，EP 0184162还公开了其萃取、纯化和回收方法。具体而言，从发酵培养液回收产物借助已知萃取技术实现，如使用常规溶剂从发酵培养液或培养基(mycelium)提取活性物质；用离子交换阴离子和阳离子树脂和非离子吸附树脂进行吸附/洗脱；在常规色谱载体如硅胶、氧化铝和纤维素上进行纯化；用活性炭脱色、结晶和重结晶。
根据EP 0184162，从发酵培养液萃取和回收藤霉素及其副产物如下进行-用溶剂(如丙酮和甲醇)从培养基和/或发酵培养液中提取；-通过非离子吸附树脂(特别是HP-20)纯化；
-将经纯化的溶液蒸发为油；-通过硅胶纯化(特别是来自Fuji Devison Co.的12级硅胶)；重复两或三次以获得粉末；-通过制备型HPLC纯化，以分离上述杂质。
使用非离子吸附树脂的纯化步骤以及使用硅胶的那些纯化步骤可除去发酵培养液中含有的绝大部分化合物(即由微生物产生的物质、无机盐和自原料衍生的物质)，其中杂质(II)和(III)通过制备型HPLC除去，这在工业规模上的产率和应用性的确较差。
US 6492513教导了通过用银盐(特别是硝酸银)预处理的离子交换阳离子树脂净化藤霉素的杂质(II)和(III)。使用银盐分离具有相同碳原子数的不饱和脂肪酸的顺-反异构体由文献中已知(J.Chromatography，149(1978)417)。银盐与不饱和化合物形成π-络合物，因此根据它们的构象分离。US6492513的方法允许将藤霉素(其具有17-烯丙基侧链)与具有17-饱和侧链的两种杂质分离，因为由于形成银络合物，藤霉素较其他两种杂质在阳离子型离子交换树脂上更易保留。
US 6576135教导了借助非离子吸附树脂、特别是具有以下部分结构的非离子吸附树脂分离藤霉素分杂质(II)和(III)， 其中R为氢或卤素原子。
由文献中已知衍生自藤霉素的若干降解产物(Y.Namiki等人，Cromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月)。
这些降解产物已经存在于发酵培养液中，并且取决于工作条件可在各萃取阶段中增加。
US 6492513和US 6576135的方法允许分离藤霉素和杂质(II)和(III)，但不能分离其他降解产物。
发明详述现已发现，借助C18反相硅胶，可以方便地将藤霉素作为银络合物(IV)纯化以除去降解杂质， 具体而言，本发明的方法包括将链霉菌属的发酵产物溶解于含有银离子的水/有机溶剂混合物中，并在C18反相硅胶柱上洗脱溶液。
银离子在溶液中自银盐释放，优选硝酸银或高氯酸银。银离子的浓度优选为0.05至1.30mol/1，更优选0.20至0.30mol/1。
溶解待纯化产物的溶剂混合物中的有机溶剂是藤霉素于其中可溶的有机溶剂，优选选自丙酮、甲醇和乙腈。
C18反相硅胶的量是粗产物重量的8倍，优选12-14倍。藤霉素-银的π-络合物的洗脱施使用与溶解所用相同的溶剂混合物进行，逐渐增加有机溶剂的量并从色谱柱收集适当的级分。洗脱液中银离子的浓度范围为0.05mol/1至1.30mol/1。反相硅胶是具有不同粒度的C18硅胶，优选5-15μm和70-230μm。用于分析洗脱级分的分析方法是文献中公开的分析方法(Y.Namiki等人，Cromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月)，其中通过计算RRT可以鉴定杂质(II)、(III)和其他降解杂质。
本发明的方法也可包括使用非离子树脂的色谱纯化和使用正相硅胶的色谱纯化，例如根据EP 0184162。这些纯化步骤可在C18反相硅胶纯化之前或之后进行。根据特别优选的实施方案，这些进一步的纯化可在之前进行，如下文详细所述。
将适当过滤的发酵培养液或培养基用藤霉素于其中可溶的有机溶剂萃取，例如酮类或醇类，优选丙酮和甲醇；对萃取产物进行非离子吸附树脂的吸附色谱，然后进行正相硅胶色谱，以从衍生自发酵培养液的其他化合物(由微生物产生的物质、无机盐和子原料衍生的物质)纯化藤霉素、杂质(II)和(III)以及降解产物。将所得产物溶解于水-有机溶液中并于C18反相硅胶柱上洗脱，以回收藤霉素-银π-络合物(IV)，将其用藤霉素于其中可溶的有机溶剂萃取，例如乙酸乙酯。将萃取产物浓缩并用已知方法结晶。
吸附树脂纯化使用市售可得的吸附树脂进行，优选Mitsubishi化学品公司(系列号SP200 o SP800)或Rohm和Haas(XAD系列)制造的那些树脂。优选的溶剂是酮类和醇类，更优选丙酮和甲醇。
正相硅胶色谱纯化使用具有不同颗粒大小、优选70-230目的市售可得的硅胶进行。溶剂优选为链烷烃、酯类、酮类和醇类，更优选正己烷和乙酸乙酯。
萃取和结晶按照文献中公开的藤霉素的溶剂萃取和回收方法进行。优选地，将含有经纯化的藤霉素-银π-络合物的溶液在真空下浓缩，以除去有机溶剂，随后用0.5-3体积的有机溶剂、优选乙酸乙酯萃取。将有机相用1体积的去离子水洗涤2-3次，随后浓缩至小体积。将所得溶液溶解于有机溶剂、优选乙腈后，通过加入去离子水使藤霉素沉淀为单水合物晶体。所得晶体经表征为高纯度(按照Y.Namiki等人，Chromatographia Vol.40，N°5/6 1995年3月所报道的方法，HPLC面积％＞99％)。
本发明的方法相对于已知方法在产率、杂质分离的选择性以及终产物的量方面特别有优势。就产率而言，本发明方法中每单位粗产物所要求的色谱载体(C18反相硅胶)的量显著低于(约5-8倍)US 6576135中所公开的量(其中色谱载体为HP20ss)。粗产物与C18反相硅胶的重量百分比为5-8％，而在US 6576135的方法中，粗产物与色谱载体HP20ss的重量百分比为1％。每单位重量的色谱载体承载更高量的产物，使得能够在工业规模的产率和消耗方面获得显著改进。终产物的量以及纯化阶段的体积同样被减少5-8倍，因此由银盐(特别是硝酸银)所致的消耗也得以降低。
因此，C18反相硅胶的单一色谱步骤提供了工业规模上高纯度的终产物。
现借助一些实施例更为详细地解释本发明。
实施例实施例1-萃取和吸附树脂纯化将50升发酵培养液加至50升丙酮和1kg过滤助剂Dicalite。于室温搅拌1小时后，过滤浆液。将所得透明溶液吸附于2升吸附树脂XAD 16(由Rohm和Haas制造)。将活性物质用6升25/75水/丙酮洗脱。浓缩所得溶液以除去丙酮。将水相(1.5升)用1.5升乙酸乙酯萃取。分离各相，将有机相浓缩为油。
实施例2-硅胶纯化将油相加至180g硅胶(0.063-0.200mm Merck)和180ml乙酸乙酯。将混合物搅拌，随后蒸发至粉末，将其加载于含有1升硅胶(0.063-0.200mmMerck)/正己烷的柱子上。用4升正己烷、然后4升75/25正己烷/乙酸乙酯、最后用10升乙酸乙酯洗脱，以完成纯化。收集洗脱的级分，并将它们各自于C18柱上通过HPLC分析，用水/乙腈作为洗脱剂。汇集富含活性物质的级分并浓缩，得到黄白色固体(12g)。
实施例3-藤霉素-银π-络合物的溶解和纯化将实施例2的固体(12g，含8.5g藤霉素)溶于400ml含有30g AgNO3的50/50水/丙酮溶液中。使溶液通过200ml C18反相硅胶15μm(由Grace-Amicon制造)。之后，用1000ml含有51g AgNO3的50/50水/丙酮溶液、最后用250ml 20/80水/丙酮溶液洗脱柱子。将洗脱液分为各级分，按照Y.Namiki等人，Chromatography Vol.40，N°5/6 1995年3月所报道的分析方法进行分析。下表报告了各个C18反相硅胶纯化步骤过程中藤霉素浓度的变化和杂质的变化。
合并级分2、3、4和5并浓缩至400ml。加入400ml乙酸乙酯，然后分离有机相，用400ml去离子水洗涤3次。将有机相浓缩至小体积(10-15ml)。
实施例4-藤霉素的回收将根据实施例3所获得的溶液加至700ml乙腈。于25℃的温度缓慢加入(1-2小时)1200ml去离子水，并将溶液冷却至5℃，然后在该温度静置12-14小时。过滤后，获得7.0g高纯度藤霉素(HPLC面积％＞99％)。
表
权利要求
1.纯化藤霉素(I)的方法， 包括将链霉菌属的发酵产物溶解于含有银离子的水/有机溶剂混合物中，并在C18反相硅胶柱上洗脱溶液。
2.权利要求1所述的方法，其中的银离子从银盐释放。
3.权利要求2所述的方法，其中的银盐是硝酸银或高氯酸银。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中的银离子浓度为0.05至1.30mol/l。
5.权利要求4所述的方法，其中的浓度为0.20至0.30mol/l。
6.根据以上权利要求任一项的方法，其中的有机溶剂选自丙酮、甲醇和乙腈。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其还包括使用非离子树脂的色谱纯化阶段和使用正相硅胶的色谱纯化阶段。
全文摘要
本发明涉及从链霉菌属发酵培养液纯化和回收藤霉素(I)即(17－烯丙基－1，14－二羟基－12－[2－(4－羟基－3－甲氧基环己基)－1－甲基乙烯基]－23，25－二甲氧基－13，19，21，27－四甲基－11，28－二氧基－4－氮杂三环－[22.3.1.0
文档编号C07B63/00GK101048415SQ200580037031
公开日2007年10月3日 申请日期2005年10月24日 优先权日2004年11月3日
发明者W·卡布里, P·派索尼, J·罗来多, L·莫拉 申请人:安蒂比奥蒂科斯有限公司