专利名称：编码p185neu蛋白质序列变体的质粒及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含编码p185neu蛋白质的截短形式和嵌合形式的DNA序列的质粒载体，以及其在抗表达p185neu蛋白质的Her-2/neu(ErbB-2)-阳性肿瘤的DNA接种中的用途。本发明的质粒能够引发抗表达p185neu蛋白质的肿瘤的保护性免疫应答，该保护性免疫应答基于抗体和/或T淋巴细胞诱导。本发明还涉及包含此类质粒的药物组合物及其在p185neu-阳性肿瘤的预防性或治疗性治疗中的用途。
背景技术：
由于赘生性细胞异常表达一些蛋白质，它们通常不同于正常细胞。由于此异常表达，一些蛋白质可以作用为肿瘤相关抗原(TAA)。这是因为宿主免疫系统可以识别这些异常并且引发可以保护宿主免于肿瘤发作和发展的免疫应答。作为抗肿瘤免疫治疗的靶标，TAA必须●在瘤生长的某些阶段具有致病作用；●即使在当肿瘤产生不再表达主要组织相容性复合体(HLA)糖蛋白的克隆变体时，也可以被免疫系统检测；●被抗体和T淋巴细胞识别。
近年来，已经在人癌中发现了一些TAA。在它们中，Her-2/neu(ErbB2)癌基因的蛋白质产物p185neu是免疫治疗特别适合的靶标(Lollini和Forni，2003，Trends Immunol.2462)。p185neu是膜受体，属于I类受体酪氨酸激酶家族，该家族还包括表皮生长因子受体(EGF-R或ErbB-1)和在细胞增殖和分化中起关键作用的其他相关受体(ErbB-3、ErbB-4)(Hynes和Stern，1994，BBA 1198165)。
可以将p185neu受体蛋白质再分为三个结构域胞外结构域(EC结构域)、跨膜结构域(TM结构域)和胞质内结构域(IC结构域)。近来，已经公开了人和大鼠p185neu蛋白质的EC结构域晶体结构。已经描述了此结构域由4个亚结构域(I/L1、II/CR1、III/L2和IV/CR2)组成，总共有大约630个氨基酸。另外，还说明了p185neu蛋白质具有刚性构象，这允许其与其他ErbB受体相互作用、二聚化，并且即使该蛋白质没有直接结合配体也能诱导增殖信号的转导(Cho等人，2003，Nature 421756)。
Her-2/neu(ErbB2)癌基因参与胚胎器官发生和上皮生长的正常过程，尽管其在成体中仅以微弱水平表达(Press等人，1990，Oncogene 5953)。在人中，此癌基因的过量表达主要是由于基因扩增引起的。Her-2/neu(ErbB2)癌基因在大约30％的乳癌中过量表达，并且此类过量表达与更快的肿瘤增殖相关(Slamon等人，1989，Science 244707)。在已经提出的不同方案中，DNA接种似乎是引发抗Her-2/neu-阳性肿瘤的免疫应答的有效方法。尽管p185neu蛋白质是“自身”抗原，即在体内正常存在的蛋白质，患有p185neu-阳性乳癌的患者通常表现出细胞和体液的免疫应答(Signoretti等人，2000，J.Natl.Cancer Inst.231918；Disis等人，1994，Cancer Res.5416；Peoples等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.美国92432)。针对p185neu蛋白质的抗肿瘤免疫治疗的一个目标是在有预先存在的免疫应答的患者中增加应答强度，或在未检测到此应答的患者中产生免疫应答。p185neu蛋白质是“自身”抗原的事实使得该疫苗必须能够克服免疫耐受状态。
本专利申请的发明人率先使用了DNA接种并且评估了DNA接种在引发对自发乳癌和移植性Her-2/neu-阳性肿瘤的免疫保护中的功效。这些研究已经证明了癌前病变的预防和治疗是可达到的目标。特别地，在旨在预防转基因小鼠中由于大鼠Her-2/neu癌基因(FVB/neuT小鼠和BALB-neuT小鼠)引起自发乳癌发展的实验中，已经表明与编码全长p185neu蛋白质的质粒或仅编码其EC结构域(分泌的抗原)的质粒相比，编码大鼠p185neu蛋白质EC和TM结构域的质粒能够引发更有效的保护(Amici等人，2000，Gene Ther.7703；Rovero等人，2000，J.Immunol.1655133)。Chen等人(1998，Cancer Res.581965)报道了类似的数据。另外，已经表明当肌内接种质粒时，如果随后接着非常短的电脉冲，那么将强烈增加用DNA质粒接种的功效(Quaglino等人，2004，Cancer Res.642858)。其他作者已经说明了编码全长p185neu蛋白质的质粒(根据需要突变以使其不具有酪氨酸激酶活性)有效预防了p185neu-阳性癌细胞移植后肿瘤的发作(Wei-Zen等人，1999，Int.J.Cancer 81748)。已经证明了同样的质粒是非常有效的，即使是缺乏用于在内质网中蛋白质加工的前导信号，它们也导致了p185neu抗原的胞质定位。当使用编码由于前导信号存在而定位在膜中的p185neu蛋白质的质粒时，保护依赖于依靠抗体的免疫应答。相反，如果疫苗不包含前导信号并且因此p185neu蛋白质位于转染细胞的胞质中而不是它们的质膜中，观察到T淋巴细胞介导的免疫应答(Pilon等人，2001，J.Immunol.1673201)。另外，通过使用具有前导信号的质粒和那些其中缺失了此前导信号的质粒而得到的组合接种在防止肿瘤生长中更有效(Piechocki等人，2001，J.Immunol.1673367)。这证明了在p185neu-阳性癌的预防中在体液应答和细胞应答之间存在协同作用(Reilly等人，2001，Cancer Res.61880)。
已经证明通过对肿瘤排斥起协同作用的一些效应子免疫系统机制(T辅助细胞和T杀伤细胞、抗体、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、天然杀伤细胞、Fc受体、IFN-γ和穿孔蛋白)的参与，用编码EC和TM结构域(EC-TM质粒)的质粒接种不仅在预防自发p185neu-阳性癌中有效，而且在治疗直径为2mm的肿瘤块中也有效(Curcio等人，2003，J.Clin.Invest.1111161)。
发明内容
已经构建了编码大鼠p185neu蛋白质的全长TM结构域和EC结构域的减少部分的一些质粒。将通过缺失NH2-末端240个碱基对(bp)或该长度的倍数得到的截短的质粒使用在旨在防止移植的大鼠过量表达p185neu蛋白质的肿瘤细胞(TUBO细胞)生长的实验中。此外，通过将人ErbB2cDNA的NH2-末端部分添加到截短形式的大鼠蛋白质的编码序列中以重构全蛋白质序列，由此产生编码嵌合p185neu蛋白质形式的一系列质粒。
在用编码全长EC和TM结构域的质粒接种后实现的保护主要是由于抗体的产生，尽管通过使用编码截短形式的大鼠p185neu蛋白质的质粒达到的保护在很多情形中与显著性的抗体产生不相关。
在体内实验结果的基础上，选择能够诱导强的抗体和T淋巴细胞介导的免疫应答的质粒。
一方面，本发明涉及包含p185neu蛋白质片段编码序列或嵌合的p185neu蛋白质的编码序列的质粒，所述p185neu蛋白质片段编码序列选自SEQ ID NO1-5；所述嵌合p185neu蛋白质的编码序列选自SEQ IDNO6-12(编码人和大鼠p185neu蛋白质的基因的参考序列储存在GeneBank中，登录号分别为M11730和X03362)。
将编码本发明p185neu蛋白质的截短形式和嵌合形式的DNA序列插入到适合用于哺乳动物特别是人中的任何质粒载体中。除了上述编码序列外，质粒可以包含位于编码序列上游的调控转录的功能性元件(特别是启动子，优选是CMV启动子)、转录起始和终止序列、选择性标记，优选是氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因、CpG基序、聚腺苷酸化位点，以及任选的增强子或转录激活子。调控转录的元件必须适合于在哺乳动物特别是人中使用的载体。
另一方面，本发明涉及包含如上所定义的DNA质粒以及可药用载体和赋形剂的药物组合物。可选地，该组合物可以包含编码截短形式和嵌合形式的p185neu蛋白质的两种或多种不同的质粒的混合物。适于肠胃外施用的药物组合物(优选是注射溶液形式)优选用于DNA接种。DNA接种的原理和方法是本领域技术人员已知的，并且描述在例如Liu，2003；J.Int.Med.253402中。
使用编码p185neu截短形式和嵌合形式的质粒从而针对p185neu-阳性(Her-2/neu-、ErbB-2-阳性)肿瘤进行预防性和治疗性接种具有多种改善其功效的优点。对于编码截短形式的质粒，这些优点是1)可以得到仅编码确定的TAA部分的疫苗，希望针对所述TAA部分产生免疫应答；该疫苗具有较小的机会引发自身免疫现象。
2)仅诱导一些所选择形式的免疫应答，即抗体介导的形式或T淋巴细胞介导的形式。
3)通过彼此结合编码不同截短形式的cDNA片段(不必是顺序的)，可以产生组合了具有所定义免疫原性的多重表位的疫苗。
通过组合来自不同动物物种的截短形式的p185neu生成的嵌合质粒可用于a)用编码待免疫的相同物种(例如人)的蛋白质决定簇的质粒的接种，其能够引发特异性的高亲和性应答；b)将编码待免疫的相同物种的抗原决定簇的质粒与编码来自其他物种的抗原决定簇的cDNA序列组合，抗原决定簇表现基本类似，但是不同在于来自其他物种的那些决定簇引发了更强的免疫应答，因此克服了耐受状态。这些异源决定簇(被识别为部分外源的)作为诱导促进更强的应答和细胞因子释放的辅助决定簇；c)将编码相同物种的抗原决定簇的质粒与cDNA序列组合，所述cDNA序列通过编码其他物种的决定簇在一些个体中引起heteroclytic决定簇，该决定簇更高亲和性地结合HLA分子并且诱导具有更高亲和性的更强的免疫应答；d)具有组合了a)的优点和来自b)和c)的那些优点的疫苗。
将本发明的适当配制的DNA质粒用在下列的预防性或治疗性治疗中表现出发展p185neu-阳性癌高危险性的人或动物，或者患有p185neu-阳性原发肿瘤、其复发或转移瘤的患者。当肿瘤还不明显时，预防是首要的；当肿瘤处于其初期作为癌前病变时，预防是次要的；或如果观察到了肿瘤复发或转移过程，预防是第三位的。
可用本发明质粒或组合物治疗的肿瘤主要是上皮来源的那些，特别是肺、卵巢和乳腺腺癌；鳞状头部和颈部癌，以及更普遍地为表达p185neu蛋白质的肿瘤。
发明详述编码截短形式的大鼠p185neu蛋白质的质粒的构建将质粒主链pCMV3.1(在我们实验室中从来自Invitrogen，Milan，意大利的pcDNA3.1起始得到的)用来产生编码大鼠p185neu蛋白质的全长TM结构域和EC结构域缩短部分的DNA质粒。pCMV3.1包含大鼠Her-2/neu 5’UTR核苷酸序列(其被转录但是未被翻译)和前导序列(neuL)。使用pCMV-EC-TM载体(Amici等人，2000，Gene Ther.，7703；Rovero等人，2000，J.Immunol.，1655133)作为模板、T7引物作为有义寡核苷酸(寡核苷酸#1)，以及具有末端EcoRI位点的寡核苷酸(寡核苷酸#2)作为反义寡核苷酸，通过DNA的酶促扩增，得到大鼠p185neu蛋白质的分泌信号DNA片段。在纯化和用HindIII和EcoRI限制酶消化后，将扩增的片段克隆到已经用同样的酶消化的pCMV3.1质粒中，因此得到pCMV3.1-neuL。随后，将编码大鼠p185neu蛋白质EC结构域缺失片段和全长TM结构域的7种不同的序列符合读框地插入到用EcoRI和XbaI限制酶消化的pCMV3.1-neuL载体中。将这样得到的新质粒称作pCMV3.1-neuL-rEC1-TM(-70个氨基酸)(
图1)、pCMV3.1-neuL-rEC2-TM(-150个氨基酸)(图2)、pCMV3.1-neuL-rEC3-TM(-230个氨基酸)(图3)、pCMV3.1-neuL-rEC4-TM(-310个氨基酸)(图4)、pCMV3.1-neuL-rEC5-TM(-390个氨基酸)(图5)、pCMV3.1-neuL-rEC6-TM(-470个氨基酸)(图6)和pCMV3.1-neuL-rEC7-TM(-550个氨基酸)(图7)。这些质粒中的第一个编码的片段减少70个氨基酸(包括分泌信号氨基酸序列在内)。所有其他片段逐个减少80个氨基酸。
使用7种不同的都具有末端EcoRI的限制性位点的有义寡核苷酸(寡核苷酸#3-#9)，和能够识别在pCMV3.1多克隆位点3’端的被称作“pcDNA3.1/BGH反向引发位点”(830-850nt)的位点的反义寡核苷酸，通过DNA的酶促扩增，产生这些片段。使用pCMV-EC-TM载体(Amici A.等人2000，Gene Ther.7703；Rovero等人，2000，J.Immunol. 1655133)作为用于PCR的DNA模板。在用EcoRI和XbaI限制酶酶促消化后，将扩增产物克隆到pCMV3.1-neuL质粒中。
用pCMV3.1-neuL-rEC4-TM质粒接种以及用编码全长EC和TM结构域的pCMV3.1-neuL-rEC-TM质粒接种保护了100％的BALB/c小鼠免于发展由TUBO细胞接种诱导的肿瘤。另一方面，用编码前3个截短形式的p185neu蛋白质的pCMV3.1-neuL-rEC1-TM、pCMV3.1-neuL-rEC2-TM和pCMV3.1-neuL-rEC3-TM质粒接种保护了70-80％的BALB/c小鼠。编码第5个截短形式的pCMV3.1-neuL-rEC5-TM质粒保护50％的BALB/c小鼠，而编码第6个和第7个截短形式的pCMV3.1-neuL-rEC6-TM和pCMV3.1-neuL-rEC7-TM质粒没有诱导出保护。得到的结果证明了由定位在胞质中的p185neu蛋白质截短形式激活的细胞应答在抗肿瘤预防中是充分的。但是，细胞和体液应答的组合激活可用来得到更有效的治疗(Rielly等人，2001，Cancer Res.61880)。为了实现抗体产生，接种必须用编码p185neu蛋白质的全长EC和TM结构域的质粒来进行。用编码缺乏氨基酸1-310的第4个截短p185neu形式的pCMV3.1-neuL-rEC4-TM质粒接种仍能够赋予全保护，但是抗体应答比pCMV3.1-neuL-rEC-TM质粒低10倍(表1)。
表1
能够编码p185neu蛋白质的7种不同融合形式的嵌合人-大鼠质粒(HuRT1-7)的构建HLA具有的大多数表位位于p185neu蛋白质的第一个亚结构域(I/L1)。因此，构建编码人ErbB2蛋白质序列的嵌合质粒以诱导针对这些表位的特异性免疫应答，所述的人ErbB2蛋白质序列从NH2端(EC结构域的最外侧部分)开始逐渐增长。通过将人ErB2 cDNA的缺失部分添加到编码大鼠p185neu蛋白质截短形式中来产生这些新质粒(被称作HuRT，人大鼠跨膜)。
用HindIII和EcoRI限制酶消化编码大鼠p185neu蛋白质的全长TM结构域和EC结构域的减少片段的前5个截短质粒。将通过PCR及在其末端消化得到的5种不同的人cDNA片段克隆到这5个截短的质粒中，从而保持阅读框。通过使用pcDNA3.1erbB2质粒作为模板，扩增产生待插入的编码人p185neu蛋白质部分的cDNA片段，其包含5’UTR区和穿过内质网的分泌信号。将6个寡核苷酸用作引物。对于所有六种引物，有义寡核苷酸是相同的，并且对应着T7引物(寡核苷酸#1)，而设计5种反义寡核苷酸使得它们识别在序列逐渐靠前的位置中的人ErbB2癌基因cDNA(寡核苷酸#11-#15)。在纯化以及用HindIII和EcoRI限制酶消化后，将扩增的片段插入相应的质粒(pCMV3.1-rEC1-TM、pCMV3.1-rEC2-TM、pCMV3.1-rEC3-TM、pCMV3.1-rEC4-TM、pCMV3.1-rEC5-TM)，所述质粒已经预先用相同的限制酶消化。以这种方式得到了5个编码长度为689个氨基酸的嵌合蛋白质的新质粒(pCMV3.1-HuRT1-5)，其中的两个氨基酸(Glu-Phe)属于用来连接人和大鼠DNA的EcoRI限制性位点。这些嵌合质粒编码的蛋白质通过增加人p185neu蛋白质部分和减少大鼠p185neu蛋白质部分而彼此不同。
为了得到编码大鼠p185neu蛋白质的第6和第7个截短形式的嵌合质粒，构建2个新质粒，其中由于EcoRI限制性位点存在于人ErbB2基因序列中的第1450位，使用除EcoRI外的克隆位点。通过使用由有义寡核苷酸(寡核苷酸#16)和反义寡核苷酸(寡核苷酸#17)构成的合成序列修饰pCMV3.1，从而删除了PmeI酶的两个限制性位点中的一个并且倒转了位于其多克隆位点中的HindIII和NheI限制酶的限制性位点。将这样得到的新质粒主链称作pCMV3.1H/N。通过使用pCMV-EC-TM质粒(Amici等人，2000，Gene Ther.，7703；Rovero等人，2000，J.Immunol.，1655133)作为模板，以及在其末端具有NheI限制性位点的2个不同的有义寡核苷酸(寡核苷酸#18和#19)，以及反义寡核苷酸#10来扩增产生大鼠p185neu蛋白质的第6和第7个截短形式的片段。
在用限制酶NheI和PmeI酶促消化后，将扩增产物克隆到pCMV3.1H/N质粒中，因此得到新的pCMV3.1H/N-rEC6-TM和pCMV3.1H/N-rEC7-TM质粒。使用pcDNA3.1erbB2质粒作为模板，T7引物作为有义寡核苷酸(寡核苷酸#1)，以及两种引物(设计其使得它们在适当的位置识别cDNA并且在其末端具有NheI限制性位点)(寡核苷酸#20和#21)作为反义寡核苷酸，通过扩增得到待插入以产生嵌合的pCMV3.1H/N-HuRT6和pCMV3.1H/N-HuRT7质粒的编码人p185neu蛋白质部分的cDNA片段。
在纯化以及用HindIII和NheI限制酶消化后，将扩增片段插入到预先用同样限制酶消化的相应质粒(pCMV3.1H/N-rEC6-TM；pCMV3.1H/N-rEC7-TM)中。以这种方式得到了2个新的嵌合pCMV3.1H/N-HuRT6和pCMV3.1H/N-HuRT7质粒，其编码长度为689个氨基酸的蛋白质，它们的2个氨基酸(Val-Ser)属于用来连接人和大鼠DNA的NheI限制性位点。
这些操作得到下列质粒·pCMV3.1-HuRT1质粒(图8)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的70个氨基酸、属于EcoRI位点的2个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的618个氨基酸·pCMV3.1-HuRT2质粒(图9)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的150个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的538个氨基酸·pCMV3.1-HuRT3质粒(图10)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的230个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的458个氨基酸·pCMV3.1-HuRT4质粒(图11)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的310个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的378个氨基酸·pCMV3.1-HuRT5质粒(图12)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的390个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的298个氨基酸·pCMV3.1H/N-HuRT6质粒(图13)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的470个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的218个氨基酸·pCMV3.1H/N-HuRT7质粒(图14)，其编码人p185neu蛋白质EC结构域的550个氨基酸和大鼠p185neu蛋白质的138个氨基酸。
通过用7个新质粒(pCMV3.1-HuRT1-5和pCMV3.1H/N-HuRT6-7)免疫小鼠，得到了这些质粒编码的嵌合人-大鼠蛋白质的膜表达的间接证据。来自所有接种小鼠的血清具有抗嵌合人和大鼠p185neu蛋白质的特异性抗体。另外，用编码7种不同的嵌合蛋白质的质粒接种的动物被保护免于TUBO细胞和/或人p185neu蛋白质-过量表达的肿瘤细胞(D2F2-E2细胞)的致死接种。
实施例实施例1pCMV3.1-HuRT5质粒的构建将编码大鼠p185neu蛋白质的第5个截短形式的pCMV3.1-rEC5-TM质粒用HindIII和EcoRI限制酶(BioLabs，Beverly，MA)消化，以删除5’UTR区和neuL序列。
将对应于缺乏5’UTR区和neuL序列的pCMV3.1-rEC5-TM质粒的4794bp的DNA条带用琼脂糖凝胶电泳分离并且用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，意大利)洗脱。通过PCR得到5’UTR区、前导序列和编码人ErbB2基因缺失部分的序列的cDNA。将pcDNA3.1ErbB2质粒用作模板，T7引物(寡核苷酸#1)用作有义寡核苷酸，以及在其5’末端具有EcoRI限制性位点的引物(寡核苷酸#15)用作反义寡核苷酸。使用Finnzymes(CELBIO，Milan，意大利)的试剂和校正Taq聚合酶进行PCR反应。PCR反应后，通过常规方法纯化和沉淀扩增的DNA，其重悬在50μlH2O中，并且用HindIII和EcoRI限制酶消化。通过使用T4 DNA连接酶(BioLabs，Beverly，MA)的连接反应克隆人ErbB2相关部分的编码cDNA片段和线性的pCMV3.1-rEC5-TM质粒。
之后使用连接产物来转化已经用氯化钙技术使其处于感受态的大肠杆菌(E.coli)细菌的DH5α菌株。
通过碱裂解分析这样得到的克隆以检测包含嵌合pCMV3.1-HuRT5质粒的克隆。
随后通过Sanger测序方法，使用ABI PRISM 310 Genetic Analyzer自动测序仪(Applied Biosystem)分析pCMV3.1-HuRT5，以评估编码ErbB2基因的人序列部分插入到编码大鼠p185neu蛋白质的第5个截短形式的质粒中已经正确发生并且没有改变阅读框。
寡核苷酸列表#1 T7引物(SEQ ID No13)#2 neu前导区反义EcoRI(SEQ ID No14)#3 rECD1有义EcoRI(SEQ ID No15)#4 rECD2有义EcoRI(SEQ ID No16)#5 rECD3有义EcoRI(SEQ ID No17)#6 rECD4有义EcoRI(SEQ ID No18)#7 rECD5有义EcoRI(SEQ ID No19)#8 rECD6有义EcoRI(SEQ ID No20)#9 rECD7有义EcoRI(SEQ ID No21)#10 pcDNA3.1/BGH反向引发位点(SEQ ID No22)#11 His-Myc有义EcoRI突变(SEQ ID No23)#12 His-Myc反义EcoRI(SEQ ID No24)#13 70 erbB2反义EcoRI(SEQ ID No25)#14 150 erbB2反义EcoRI(SEQ ID No26)#15 230 erbB2反义EcoRI(SEQ ID No27)#16 310 erbB2反义EcoRI(SEQ ID No28)#17 390 erbB2反义EcoRI(SEQ ID No29)
#18 HindIII-NheI有义(SEQ ID No30)#19 HindIII-NheI反义(SEQ ID No31)#20 rECD6有义HheI(SEQ ID No32)#21 rECD7有义HheI(SEQ ID No33)#22 470 erbB2反义HheI(SEQ ID No34)#23 550 erbB2反义HheI(SEQ ID No35)实施例2体内测试动物使用大约7周龄的BALB/c品系雌性小鼠用于所有实验。小鼠来自Charles River Laboratories(Calco，Milan，意大利)，在那里将它们无菌饲养并且根据欧洲共同体(European Community)设立的法律来培养。
肌内施用，随后是体内电穿孔为了避免疼痛和胫肌的不必要收缩，通过腹膜内注射300μl的Avertin麻醉每只小鼠，所述的Avertin是由0.58克2，2，2-三溴乙醇(Sigma-Aldrich)和310μl叔戊醇(Aldrich)在39.5ml去离子H2O中组成的溶液。削开麻醉小鼠的胫肌，并且在每块肌肉中接种20μl包含25μg DNA的溶液。临用前根据F.Pericle博士的说明(Valentis，Inc.，The Woodlands，Texas，美国)制备该包含DNA的溶液。此溶液包含浓度为1.25mg/ml的质粒DNA，浓度为6mg/ml的聚-L-谷氨酸钠盐(Sigma-Aldrich，S.r.l.，Milan，意大利)，浓度为150mM的氯化钠(Fluka，BioChemika，Buchs，瑞士)，并且添加无内毒素的蒸馏水(Nucleare Free Water，Promega Corporation)至终体积为1ml。接种后大约5分钟，使用在腿侧面四边形排列的分开3mm的两个钢电极，将由Electro Square Porator电穿孔仪(T820，BTX，San Diego，CA，美国)产生的两次电脉冲(强度为375V/cm2，每次持续25毫秒)应用到小鼠的两块胫肌。在接种肿瘤细胞前21天和7天，在每只动物中进行两次通过电穿孔的基因免疫。
肿瘤细胞的接种用0.2ml包含2×105TUBO细胞的悬液接种到小鼠左侧。
体内肿瘤生长评估通过每周触诊评估肿瘤生长，并且用标准尺沿着两垂直直径测量肿瘤大小。将尺寸大于1毫米的肿瘤块认为是肿瘤。将肿瘤生长监控100天(从肿瘤接种开始)，或者直到肿瘤尺寸在直径上超过10毫米(此时处死动物)。得到的结果证明了嵌合pCMV3.1-HuRT5质粒能够100％保护接种的BALB/c小鼠免于TUBO细胞的致死接种(表2)。
表2
存在于接种动物血清中的抗-p185neu抗体的评估在接种肿瘤细胞前一天，从用嵌合的pCMV3.1-HuRT5质粒接种的动物中采血。分析血清以评定大鼠抗-p185neu抗体的存在。将血清与过量表达大鼠p185neu的细胞在4℃下孵育45分钟。在用被称作洗涤缓冲液的溶液洗涤后，将样品与抗-小鼠免疫球蛋白FITC-缀合的抗体在4℃下孵育20分钟，用洗涤缓冲液洗涤，并且用FACScan细胞荧光测定仪(BectonDickinson Immunocytometry Systems，Mountain View，California，美国)分析，所述洗涤缓冲液由包含0.2％的牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Milan，意大利)和0.1％叠氮化钠(NaN3，Sigma，Milan，意大利)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)组成。同时，将相同的细胞与浓度递减的单克隆抗-c-ErbB2/c-neu抗体(Ab4，癌基因)孵育，从而可以得到通过cytofluorimeter分析得到的荧光强度和动物血清中抗-p185neu抗体浓度之间的关系。得到的数据显示所有接种的动物表现出高水平的抗-大鼠p185neu抗体，因此嵌合pCMV3.1-HuRT5质粒能有效诱导对移植的p185neu-阳性肿瘤的排斥以及引发特异性抗体应答。
序列表<110>AMICI，AUGUSTOMARCHINI，CRISTINAQUAGLINO，ELENACAVALLO，FEDERICAFORNI，GUIDO<120>编码P185NEU蛋白质序列变体的质粒及其治疗用途<130>7353MEUR<160>35<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1951<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>1ccgggccgga gccgcaatga tcatcatgga gctggcggcc tggtgccgct gggggttcct 60cctcgccctc ctgccccccg gaatcgcgga attcctctca ttcctgcagg acatccagga 120agttcagggt tacatgctca tcgctcacaa ccaggtgaag cgcgtcccac tgcaaaggct 180gcgcatcgtg agagggaccc agctctttga ggacaagtat gccctggctg tgctagacaa 240ccgagatcct caggacaatg tcgccgcctc caccccaggc agaaccccag aggggctgcg 300ggagctgcag cttcgaagtc tcacagagat cctgaaggga ggagttttga tccgtgggaa 360ccctcagctc tgctaccagg acatggtttt gtggaaggac gtcttccgca agaataacca 420actggctcct gtcgatatag acaccaatcg ttcccgggcc tgtccacctt gtgcccccgc 480ctgcaaagac aatcactgtt ggggtgagag tccggaagac tgtcagatct tgactggcac 540catctgtacc agtggttgtg cccggtgcaa gggccggctg cccactgact gctgccatga 600gcagtgtgcc gcaggctgca cgggccccaa gcattctgac tgcctggcct gcctccactt 660caatcatagt ggtatctgtg agctgcactg cccagccctc gtcacctaca acacagacac 720ctttgagtcc atgcacaacc ctgagggtcg ctacaccttt ggtgccagct gcgtgaccac 780ctgcccctac aactacctgt ctacggaagt gggatcctgc actctggtgt gtcccccgaa 840taaccaagag gtcacagctg aggacggaac acagcgttgt gagaaatgca gcaagccctg 900tgctcgagtg tgctatggtc tgggcatgga gcaccttcga ggggcgaggg ccatcaccag 960tgacaatgtc caggagtttg atggctgcaa gaagatcttt gggagcctgg catttttgcc1020ggagagcttt gatggggacc cctcctccgg cattgctccg ctgaggcctg agcagctcca1080agtgttcgaa accctggagg agatcacagg ttacctgtac atctcagcat ggccagacag1140tctccgtgac ctcagtgtct tccagaacct tcgaatcatt cggggacgga ttctccacga1200
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<223>人/褐家鼠嵌合体
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<223>合成的寡核苷酸<400>35catggctagc agacccctgc agtactcggc 30
权利要求
1.用于DNA转移的质粒载体，所述质粒包含编码p185neu蛋白质片段的选自SEQ ID NO.1、2、3、4、5的序列，或编码嵌合p185neu蛋白质的选自SEQ ID NO.6、7、8、9、10、11、12的序列。
2.根据权利要求1的质粒载体，其进一步包含转录启动子。
3.根据权利要求2的质粒载体，其中所述启动子是CMV启动子。
4.根据权利要求1或2的质粒载体，其适用于哺乳动物，特别是人。
5.包含根据权利要求1-3中任一项的质粒载体以及可药用载体和赋形剂的药物组合物。
6.根据权利要求5的组合物，其适合于肠胃外施用。
7.根据权利要求6的组合物，其为可注射溶液的形式。
8.根据权利要求5的组合物，其为DNA疫苗的形式。
9.根据权利要求1-4中任一项的质粒载体用于制备治疗剂的用途，所述治疗剂用于预防或治疗有发展p185neu-阳性肿瘤危险的个体，或患有原发肿瘤、转移瘤或p185neu-阳性肿瘤复发的患者。
10.根据权利要求9的用途，其用于制备DNA疫苗。
全文摘要
本发明描述了包含18文档编号C07K14/71GK101065399SQ200580040057
公开日2007年10月31日 申请日期2005年10月13日 优先权日2004年10月15日
发明者奥古斯托·阿米其, 克里斯蒂纳·马尔其尼, 埃琳娜·夸利诺, 费代里卡·卡瓦洛, 圭多·福尔尼 申请人:奥古斯托·阿米其, 克里斯蒂纳·马尔其尼, 埃琳娜·夸利诺, 费代里卡·卡瓦洛, 圭多·福尔尼