黄芪总苷提取物及其制备方法

文档序号:3476255阅读:900来源:国知局
专利名称:黄芪总苷提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及黄芪总苷提取物,具体地,是以药材黄芪为原料的提取物,及含有该提取物的药物组合物及其制备方法,属药物领域。
背景技术
中药黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.)中含有活性较强的三萜皂苷、黄酮类、多糖类、氨基酸和微量元素。黄芪总皂苷,是由中药黄芪提取分离总皂苷而获得的中药有效部位提取物,即黄芪总苷。该药物具有强心功能可用于治疗心衰;尤其具有扶正祛邪、益气养元、养心通脉的功能,用于心气虚损、血脉瘀阻之病毒性心肌炎,症见胸闷、心前区隐痛、心悸、头晕、气短、乏力、脉沉弱、细涩或结代者。其中黄芪甲苷(astragaloside IV)为其主要活性成分。药理学实验表明黄芪甲苷有抗炎、镇痛、镇静作用,并增加血浆中的cAMP和再生肝DNA的含量等作用。
另外的黄芪甲苷同系物有乙酰黄芪皂甙I(Acetylastragaloside I,1),黄芪皂甙I(astragaloside I,2),异黄芪皂甙I(isoastragaloside I,3),异黄芪皂甙II(Isoastragaloside II,4),黄芪皂甙II(astragaloside II,5);黄芪甲甙(astragaloside IV,6),结构式见参考文献1、2。许多研究文献报道化合物1,2,3,4,5在碱性溶液中可能会发生乙酰基转移和去乙酰基作用,如化合物4可能会发生乙酰基转移转化为5,也可能会去乙酰基转化为6。
专利CN1425674公开黄芪总苷的制备方法,为水提-大孔树脂分离法,所得的黄芪总苷提取物中黄芪总苷含量为80-98%,黄芪甲苷含量为50-80%,在制备过程中,用碱性水溶液脱色,使黄芪甲苷同系物部分转化成黄芪甲苷;专利CN1470241公开了一种黄芪甲苷药物组合物,其黄芪甲苷的含量在50%以上,尤其大于75%;专利CN1444949公开黄芪总苷提取物,含黄芪总苷达85-90%,总苷转移率在80%-85%,采用醇提-大孔树脂分离-水液饱和的正丁醇萃取-大孔树脂分离-甲醇溶解,硅澡土搅拌。以上工艺中均采用了碱水处理,使黄芪甲苷同系物部分转化成黄芪甲苷。
众所周知,黄芪甲苷为黄芪皂苷的指标成分,但并一定是黄芪甲苷含量越高越好。植物中获得的一系列同系物间往往有协同作用,所以一般不使用植物中的有效纯化合物,而使用植物有效部位。使同系物按一定比例保留在原药材的有效部位提取物中从而在药效和生产成本等方面达到最佳效果,就显得非常重要。

发明内容
本发明的技术方案是提供了一种新的黄芪皂苷提取物,本发明还提供了该黄芪皂苷提取物的制备方法、含有该黄芪皂苷提取物的药物组合物及其制备方法。
本发明提供了黄芪总苷提取物,其中黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-100%,黄芪甲苷的百分含量占总提取物的6-50%。
进一步地,黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-90%,其中黄芪甲苷的百分含量占总提取物的15-50%。
更进一步地,黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-90%,其中黄芪甲苷的百分含量占总提取物的20-50%。
上述黄芪总苷提取物,它是以药材黄芪为原料,按如下方法制备a、以中药黄芪,加水煎煮或10-80%乙醇渗漉,合并煎煮液或渗漉液,减压浓缩,得黄芪浓缩液;b、将a步骤制备的提取液冷却后进行醇沉、静止,过滤得滤液,滤液通过吸附树脂柱、弃去流出液,用水洗至流出液至无色,弃去水洗液;c、将b步骤的水洗后的吸附树脂柱用甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇或含水丙酮中的一种或多种洗脱,收集洗脱液,浓缩;d、将c步骤的浓缩液加醇醇沉,过滤,收集滤液;浓缩干燥,即得黄芪总苷提取物。
进一步地,它是以药材黄芪为原料,按如下方法制备a.以中药黄芪,加水煎煮或10-80%乙醇渗漉,合并煎煮液或渗漉液,减压浓缩,得黄芪浓缩液;b、将a步骤的浓缩液加乙醇至含醇量达50%-80%,在0℃-5℃冷藏静置,24~36小时,滤过,滤液浓缩至每毫升相当于0.5-1.0克生药,冷藏静置,24~36小时,滤过;取滤液通过大孔吸附树脂柱,水洗至近无色;c、用稀乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至无醇味,冷藏静置,滤过;d、将c步骤的浓缩液加乙醇至含醇量达70%-90%,冷藏静置,滤过,回收乙醇,煮沸,滤过,即得黄芪总苷提取物。
其中,c步骤所用的大孔树脂为非极性或/和弱极性大孔吸附树脂,型号为树脂可选用HPD100、HPD300、D101、HPD100A、HPD700、LD140以及其他类型的大孔吸附树脂,或以上不同型号的大孔吸附树脂按一定比例混合。
其中,c步骤中所述的洗脱液是50-98%乙醇。
本发明还提供了该黄芪总苷提取物的方法,它包括如下步骤取处方量黄芪,加水10倍量煎煮三次,每次1小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩至每1ml相当于原生药1-2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达60%,冷藏静置24小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通过HPD100柱,水洗至近无色,用75%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达85%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过即得。
本发明还提供了一种药物组合物,它是含有由治疗有效量黄芪总苷提取物为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
其中,所述的制剂是丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。
本发明还提供了该药物组合物在制备治疗或预防病毒性心肌炎、心力衰竭药物中的应用。
本发明提取物中黄芪总苷的重量百分含量占提取物的80-100%,其中黄芪甲苷占黄芪总苷的6-50%。本工艺的基础工艺路线为本提取方法采用水提-醇沉-大孔吸附树脂柱吸附-醇沉方法。以黄芪甲苷含量作为评价指标,在整个工艺过程中没有用碱水处理,最大限度地保留了中药黄芪中黄芪甲苷的同系物。总苷含量高、纯度高,溶解性大于黄芪甲苷,并具有更明确的质量控制指标,尤其可以制备含量高的黄芪注射液、不用添加任何助溶剂和稀释剂。该方法与现有技术相比具有成本低、无有机溶剂残留、以及生产过程中无环境污染,黄芪总苷中黄芪甲苷同系物溶解性大于黄芪甲苷,在病毒心肌炎小鼠的治疗中具有协同增效作用。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式
,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。


图1黄芪总苷和注射液薄层层析对比示意图,其中,a、黄芪总苷薄层层析;b、注射液薄层层析;c、乙酰黄芪皂甙I薄层层析;d、黄芪皂甙I薄层层析;e、异黄芪皂甙I薄层层析;f、异黄芪皂甙II薄层层析;g、黄芪皂甙II薄层层析;h、黄芪甲甙薄层层析;i、黄芪药材薄层层析;j、黄芪甲甙同系物薄层层析。
具体实施例方式
实施例1本发明黄芪总苷提取方法黄芪药材符合中国药典2000年版第一部249页黄芪项下有关规定,且黄芪药材中黄芪甲苷照高效液相色谱法进行检测,黄芪药材含黄芪甲苷(C41H68O14)不得少于0.06%。
取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,内蒙古产),加水8倍量煎煮三次,每次1.5小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达80%,冷藏静置48小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通HPD100A,水洗至近无色,用95%洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达90%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物1。
实施例2本发明黄芪总苷提取方法取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,陕西省产),加水12倍量煎煮两次,每次2小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达90%,冷藏静置48小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通HPD700,水洗至近无色,用80%洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达80%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物2。
实施例3本发明黄芪总苷提取方法取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,山西省产),加水8倍量煎煮两次,每次1.5小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达85%,冷藏静置48小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通LD140,水洗至近无色,用75%洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达85%,冷藏静置36小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物3。
实施例4本发明黄芪总苷提取方法取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,甘肃陇南产),加水10倍量煎煮三次,每次1小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达60%,冷藏静置24小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通HPD100,水洗至近无色,用80%洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达85%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物4。
实施例5本发明黄芪总苷提取方法取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,甘肃陇南产),加水10倍量煎煮三次,每次1小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达60%,冷藏静置24小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通过HPD300柱,水洗至近无色,用75%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达85%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物5。
实施例6本发明黄芪总苷提取方法取处方量黄芪饮片(2-4mm厚片,甘肃陇南产),加水10倍量煎煮三次,每次1小时,合并煎煮液,滤过,滤液减压浓缩(温度70℃;真空度-0.08Mpa)至每1ml相当于原生药2g,用95%乙醇沉淀至含醇量达60%,冷藏静置24小时,滤过,取滤液回收乙醇,冷藏静置24小时,滤过。取滤液通过柱D101,水洗至近无色,用75%乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至10g生药/ml,冷藏静置24小时,滤过;加95%乙醇至含醇量达85%,冷藏静置24小时,滤过;回收乙醇,煮沸30分钟,加水至规定量(12.5g生药/ml),密封,冷藏24小时以上,滤过,检验,即得黄芪总苷提取物6。
实施例7本发明黄芪总苷提取物中黄芪总苷、黄芪甲苷的测定黄芪总苷提取物中黄芪甲苷采用蒸发光散射检测HPLC法检测。黄芪总苷采用紫外分光光度法检测,香草醛-乙醇作为显色剂时。
表1本发明黄芪总苷提取物中黄芪总苷、黄芪甲苷的含量(mg/ml)

采用所述的黄芪总苷制备方法不同的参数,可得到不同的产品,其中黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-100%,黄芪甲苷的百分含量占总提取物的6-50%。
实施例8本发明黄芪总苷中黄芪甲苷及其同系物制备及鉴定按实施例2方法所得的黄芪总苷2500ml,依次用乙酸乙酯(2000ml×4)、正丁醇(2000ml×4)进行萃取,得乙酸乙酯萃取物39g,正丁醇萃取物62g。对乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析(Φ85mm,1100g),氯仿-甲醇(30∶1-2∶1)梯度洗脱,每瓶接收500ml洗脱剂,共计130份。fr.56-61析出化合物1(70mg),fr.97-100析出化合物4(230mg)。Fr.2-5合并为A(2.3g)进行硅胶柱层析(Φ35mm,110g),石油醚-丙酮(5∶1-3∶1)梯度洗脱,每100ml洗脱剂接收一瓶,Fr.26-56合并为B(6g)进行ODS反向柱层析(Φ40mm,200g),甲醇-水(30-70%)梯度洗脱,每100ml洗脱剂接收一瓶,其中fr.B38-49合并为BE(1.2g),硅胶柱层析(Φ35mm,60g)进行纯化,氯仿-甲醇(15∶1)洗脱,Fr.66-81合并为C(5.5g)进行ODS反向柱层析(Φ40mm,200g),甲醇-水(40-90%)梯度洗脱,每100ml洗脱剂接收一瓶,其中fr.C26-29合并为CA(2.2g),硅胶柱层析(Φ40mm,110g)进行纯化,氯仿-甲醇(11∶1)洗脱,从fr.CA9-23得到化合物2(1.21g)。Fr.82-88合并为D(5.1g)进行ODS反向柱层析(Φ40mm,200g),甲醇-水(40-90%)梯度洗脱,每100ml洗脱剂接收一瓶,fr.D30-40合并为DA(2.9g),硅胶柱层析(Φ45mm,150g)进行纯化,氯仿-甲醇(11∶1)洗脱,从fr.DA16-28得到化合物3(0.95g),对正丁醇部分进行硅胶柱层析(Φ85mm,1250g),氯仿-甲醇(12∶1-1∶1)梯度洗脱,每瓶接收500ml洗脱剂,共计145份。Fr.32-35析出化合物5(8mg),fr.41-46析出化合物8(100mg),fr.54-72析出化合物14(338g),fr.79-95析出化合物5(1.40g),fr.106-120析出化合物6(2.13g)。
乙酰黄芪皂甙I(1),白色粉末(MeOH);1H和13C NMR数据(溶剂pyridine-d5)与参考文献1、2相同;ESIMS m/z 933.9[M+Na]+,1843.7[2M+Na]+。
黄芪皂甙I(2),白色粉末(MeOH);1H和13C NMR数据(溶剂pyridine-d5)与参考文献1、2相同;ESIMS m/z 891.8[M+Na]+,1759.6[2M+Na]+。
异黄芪皂甙I(3),白色粉末(MeOH);1H和13C NMR数据(溶剂pyridine-d5)与参考文献1、2相同ESIMS m/z 891.9[M+Na]+,1759.8[2M+Na]+。
异黄芪皂甙II(4),白色粉末(MeOH);1H和13C NMR数据(溶剂pyridine-d5)与参考文献1、2相同;ESIMS m/z 849.7[M+Na]+,1675.6[2M+Na]+。
黄芪皂甙II(5),白色粉末(MeOH);1H和13C NMR数据(溶剂pyridine-d5)与参考文献1、2相同;ESIMS m/z 849.6[M+Na]+。
黄芪甲甙(6),白色粉末(MeOH);mp 282-283℃;ESIMS m/z 807.7[M+Na]+,1592.6[2M+Na]+。
熔点仪为Beckman数字熔点仪;质谱仪为Finnigan LCQDECA;核磁仪为BrukerAM-400,TMS作为内标。柱层析所用硅胶(200-300目)由青岛海洋化工厂生产,反向材料ODS(Cosmosil 75C18-OPN,)由Nacalai tesque公司生产。
实施例9注射液的制备注射液组成黄芪总苷 50g磷酸二氢钠 0.45g氯化钠 9g(共制成1000ml)取黄芪总苷、氯化钠和磷酸二氢钠,加注射用水至200-800ml,加入0.1%-0.2%活性炭,煮沸30分钟后,滤过,加注射用水至1000ml,用饱和氢氧化钠溶液调pH至7.2-8.2,超滤,灌封,灭菌,检验,即得。
用于治疗心肌炎、心力衰竭,静脉滴注,每日100ml,或遵医嘱。每支含黄芪总苷以黄芪甲苷计,不得少于90.0mg。黄芪甲苷不得少于20.0mg。
表2本发明黄芪总苷注射液质量考察结果

+-呈正反应,V-表示符合规定结论采用本发明黄芪总苷提取物制备注射液在不使用助溶剂和助稀释剂的情况下,同样可以达到制剂的质量要求,而且在安全性上更可靠。本领域的技术人员知道,在某些特别的制剂中,辅料的使用一方面能够使制剂稳定,质量达到要求,但另一方面又可能造成过敏等副作用,因此,采用本发明黄芪总苷提取物制备注射剂时,因其本身的特殊性质,可以不使用一些必须的辅料,消除了安全隐患,达到了意想不到的有益效果。
实施例10原药材、黄芪总苷和注射液薄层层析对比分别按原药材、黄芪总苷和成品供试品制备方法制备供试品。取适量供试品水浴上蒸干,残渣加甲醇0.5ml使溶解,作为供试品溶液。另取实施例3所得的化合物1、2、3、4、5、6对照品,加甲醇制成每1ml含1mg的溶液,作为对照品溶液。TLC所用薄层板为GF254(Qingdao Marine Chemical Co.)和RP-18 254(Merck),展开体系为CHCl3-MeOH(5∶1),喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃烘至斑点显色清晰,结果显示三者图谱基本一致,见附图1,说明黄芪总苷、注射液工艺最大限度地保留了中药黄芪中黄芪甲苷的同系物。黄芪甲苷同系物在水中的溶解度远远大于黄芪甲苷,而在水中的溶解度大在制药中优势是显而易见的。
实施例11本发明药物组合物胶囊剂的制备每粒胶囊的组成黄芪总苷(实施例2制得) 100g淀粉80g(共制成1000粒)按上述比例取、淀粉,混匀,装胶囊。每粒装180mg。
每粒含黄芪总苷以黄芪甲苷计,不少于80.0mg。
实施例12片剂的制备片剂组成黄芪总苷(实施例2制得) 100gHPMCLV100 30g乳糖70g硬脂酸镁1g(共制成1000片)将黄芪总苷、HPMC、乳糖混匀,以75%乙醇为粘合剂制湿颗粒,过22目筛,50℃干燥3h,22目筛整粒,加入硬脂酸镁混匀压片,每片重0.15g。
每片含黄芪总苷以黄芪甲苷计,不得少于80.0mg。
以下通过药效学试验证明本发明有益效果试验例1黄芪总苷对戊巴比妥钠引起猫急性心力衰竭的治疗作用及作用强度2~4kg动物猫(北京通利动物饲养厂提供体重,雌雄兼用)分为正常对照组、阳性药组(西地兰)、黄芪总苷提取物1大剂量组、中剂量和小剂量,一共5组,每组7~8只。3%戊巴比妥钠(北京化学试剂公司,批号020402,以生理盐水配制成)腹腔注射30mg/kg麻醉,颈静脉插管用于恒速滴注3%戊巴比妥钠,股静脉插管用于恒速滴注受试药物,连接心电图(ECG)肢导、气管插管、连接人工呼吸机,呼吸频率为26次/min,潮气量为29~70ml,开胸,左心室插管,连接压力换能器。ECG、左心室内压(LVP)及左心室内压微分(LVdp/dt)经Rm6240C生物信号采集处理系统连续记录于计算机中。动物手术后稳定30分钟的各项数值作为正常基础值。
以左心室内压最大上升速率(LVdp/dtmax)作为心肌收缩性指标,静脉恒速滴注3%戊巴比妥钠后,LVdp/dtmax逐渐下降,当下降到26.6~66.5kPa(200~500mmHg),5min无上升倾向,视为形成急性心衰,然后静脉恒速滴注0.2ml/min受试药物,空白对照组滴注生理盐水,阳性药组滴注去乙酰毛花甙注射液(西地兰,上海旭东海普药业有限公司,批号010901,临用前以无菌生理盐水稀释至所需浓度)0.1mg/ml,黄芪总苷提取物1大剂量12.5g药材/ml,中剂量1g药材/ml,小剂量0.5g药材/ml。
3%戊巴比妥钠恒速静脉注射致猫心衰后,恒速静脉注射黄芪总苷三个浓度(12.5g生药/ml,1g生药/ml,0.5g生药/ml),西地兰0.1mg/ml及生理盐水对照组,LVSP及LVdp/dtmax最大上升差值见表3。
表3黄芪总苷恒速静注前后对心衰猫LVdp/dtmax及LVSP最大上升差值的影响

注与生理盐水对照组比*P<0.05。
从表3可见,以3%戊巴比妥钠致猫急性心衰,黄芪总苷浓度0.5g药材/ml恒速注射0.2ml/min,左心室内压峰值(LVSP)及左心室内压最大上升速率(LVdp/dtmax)的上升幅度高于生理盐水对照组(P<0.05),并显著延长动物存活时间(P<0.01)。黄芪总甙1g生药/ml浓度恒速注射0.2ml/min,心衰猫LVSP和LVdp/dtmax上升的幅度与生理盐水对照组比无显著差别(P>0.05),但显著延长动物存活时间(P<0.01)。黄芪总甙12.5g生药/ml对LVSP、LVdp/dtmax和动物存活时间均无明显影响(P>0.05)。
试验例2黄芪总苷体内治疗小鼠CVB3心肌炎试验小鼠CVB3心肌炎模型的建立BALB/C小鼠(6周龄,体重16-18g/只,由华西医学中心实验动物管理中心提供,动物合格证(1996)川实动质管第75号)每组10只,共三组。分别采用10-2/ml、10-4/ml和10-6/ml三个浓度的CV B3病毒液注入小鼠腹腔,0.2ml/只,。第7天观察小鼠的心率、存活情况和心肌组织病理学检测,确定注射CV B3ID50为10-4/ml病毒液0.2ml,可引起较典型的小鼠病毒性心肌炎。
黄芪总苷治疗小鼠CVB3心肌炎试验共分为六个实验组(1)正常对照组,10只,不作任何处理;(2)病毒感染组,20只,腹腔注入CV B310-4/ml 0.2ml,不用药;(3)黄芪总苷提取物4:20只,注入CVB30.2ml 2h后,用0.63g药材/ml黄芪总苷,0.1ml/10g体重;(4)黄芪总苷提取物5:20只,注入CVB30.2ml 2h后,用1.25g药材/ml黄芪总苷,0.1ml/10g体重;(5)黄芪总苷提取物6:20只,注入CVB30.2ml 2h后,用2.5g药材/ml黄芪总苷,0.1ml/10g体重;(6)药物对照组,10只,注入CVB30.2ml 2h后,注入病毒唑0.1g/kg,每日一次。
在第8天,取小鼠眼眶血,分离血清,供检测血清磷酸肌酸激酶(CK)、乳酸脱氨酶(LDH)和病毒中和抗体。处死小鼠后,称重,取心脏。
连续iv不同剂量的黄芪总苷对CVB3心肌炎小鼠心脏重量及心脏表面病变的影响,结果见表4。
表4黄芪总苷对心肌炎小鼠心脏重量及心脏表面病变的影响(X±S)

注与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
从表4可见,正常对照组小鼠与模型组小鼠心脏重量、系数比有显著差异(p<0.01),模型组小鼠体重下降,而正常组体重是增重,两者有显著差异,且表面无出血点,表明小鼠病毒性心肌炎模型可靠。连续iv黄芪总苷6.3、12.5、25g(生药)/kg.d7天,结果三种剂量黄芪总苷小鼠的心脏重量、系数、出血点、出血斑均较模型组有明显抑制,对体重亦较模型组显著增加(p<0.01),表明黄芪总苷对CV B3致小鼠病毒性心肌炎有显著抑制作用,表现出对小鼠心脏有良好的保护作用。保护作用的强弱与iv剂量有明显的剂量依赖性。
连续iv不同剂量的黄芪总苷对CVB3心肌炎小鼠血清CK和LDH酶活性的影响,结果见表5。
表5黄芪总苷对心肌炎小鼠血清中CK、LDH酶活性(X±SD)的影响

注与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
从表5可见,模型组的CK和LDH均较正常组显著升高,p均小于0.01。表明CV B3心肌炎可引起CK、LDH显著升高,而黄芪总苷各组的CK、LDH均较模型组有显著降低,表明连续iv黄芪总苷可阻止心肌炎病毒所致的CK、LDH升高。
连续iv不同剂量的黄芪总苷对CV B3心肌炎小鼠血清中和抗体和心肌细胞中CV3滴度的影响,结果见表6。
表6黄芪总苷对小鼠血清中和抗体和CV B3滴度的影响

注与模型组比较,中和抗体或滴度差达4倍时,表明诊断意义,即p<0.01。
从表6可见,正常组的血清中均未查出中和抗体和CV B3病毒,而模型组的中和抗体和滴度分别为1∶32、1∶16,表明CV3病毒引起心肌炎小鼠的中和抗体和心肌细胞中CV B3升高,黄芪总苷中、高剂量组对中和抗体抑制均非常显著(p<0.01),三种剂量的黄芪总苷对心肌CV B3滴度抑制均非常显著。表明黄芪总苷对心肌炎小鼠的中和抗体及心肌细胞CV B3有良好的调节作用。
连续iv不同剂量的黄芪总苷对小鼠CV B3心肌炎心肌病理组织积分的影响,结果见表7。
表7黄芪总苷对小鼠心肌病理组织积分的影响

注与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01。
从表7可知,连续iv黄芪总苷6.3、12.5、25g(药材)/kg.d对CVB3心肌炎小鼠病理积分(炎性浸润及坏死)有显著的抑制,表明黄芪总苷对心肌炎致小鼠的病理损伤有良好的保护作用。
用黄芪总苷治疗小鼠柯萨奇病毒性心肌炎能降低血清磷酸肌酸激酶、乳酸脱氨酶水平和中和抗体,降低心肌细胞的病毒滴度,减轻病毒对心肌细胞的损伤。显示黄芪总苷对柯萨奇病毒具有杀伤作用,对心肌细胞有较好的保护作用。
体内试验表明对感染CV B3病毒性心肌炎BALB/C小鼠iv不同剂量的黄芪总苷6.3、12.5、25g(生药)/kg.d,连续7天,结果心肌炎小鼠的血清CK、LDH、中和抗体、心脏系数、心肌细胞中CV B3滴度及炎性浸润面积坏死程度,与模型组比p均小于0.01,表明黄芪总苷具有较好的抗CV B3所致病毒性心肌炎作用。
试验例3 毒理学试验一次尾静脉注射给予小鼠黄芪总苷的半数致死量为184.2g(生药)/kg。黄芪总苷大鼠长期毒性试验表明给药7周中、低剂量组使大鼠的红细胞数、血红蛋白含量及红细胞压积增高,血糖显著增高,各给药组的其余血液学、生化学指标无异常。解剖动物时未发现肉眼可见的病理变化,脏器系数正常。
犬长期毒性试验显示给药初期中、高剂量组动物出现明显的呕吐和搔痒症状,搔痒症状在给药后很快消失,二周后大部分动物不再出现呕吐症状。除高、中剂量引起血糖降低外,对血液生化指标均未见明显影响。
从上数据中可以看出本发明的黄芪总苷治疗病毒心肌炎小鼠的有效剂量为0.077、0.038、0.019g/kg.d,而参考文献3报道黄芪甲苷治疗小鼠心肌炎小鼠的有效剂量0.5g/kg天,而0.056g/g天,0.17g/kg天治疗小鼠心肌炎无效。可以看出黄芪甲苷治疗小鼠心肌炎的有效剂量大于黄芪总苷。证明黄芪总苷中黄芪甲苷同系物在治疗病毒心肌炎小鼠有协同增效作用。
上述药效学试验说明,采用本发明方法制备的黄芪总苷,保留了黄芪甲苷同系物,发挥协同增效作用,该黄芪总苷可制备成药学上常用的的各种制剂,尤其是注射剂时,不用添加任何助溶剂和稀释剂,为临床提供了黄芪总苷的新选择途径。
参考文献1.Isao Kitagawa et al.Saponin and Sapogenol.Chem.Pharm.Bull.1983,31(2),689-697.
2.Isao Kitagawa et al.Saponin and Sapogenol.Chem.Pharm.Bull.1983,31(2),698-708.
3、中国新药与临床杂志2003,22(9)515-519。
权利要求
1.黄芪总苷提取物,其特征在于黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-100%,其中黄芪甲苷的百分含量占总提取物的6-50%。
2.根据权利要求1所述的黄芪总苷提取物,其特征在于黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-95%,其中黄芪甲苷的百分含量占总提取物的15-50%。
3.根据权利要求1或2所述的黄芪总苷提取物,其特征在于黄芪总苷的重量百分含量占总提取物的80-90%,其中黄芪甲苷的百分含量占总提取物的20-50%。
4.一种制备权利要求1-3任一项所述的黄芪总苷提取物的方法,它包括如下步骤a、以中药黄芪,加水煎煮或10-80%乙醇渗漉,合并煎煮液或渗漉液,减压浓缩,得黄芪浓缩液;b、将a步骤制备的浓缩液冷却后进行醇沉、静止,过滤得滤液,滤液通过吸附树脂柱、弃去流出液,用水洗至流出液至无色,弃去水洗液;c、将b步骤的水洗后的吸附树脂柱用甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇或含水丙酮中的一种或多种洗脱,收集洗脱液,浓缩;d、将c步骤的浓缩液醇沉,过滤,收集滤液,浓缩干燥,即得黄芪总苷提取物。
5.根据权利要求4所述的黄芪总苷提取物的制备方法,其特征在于a.以中药黄芪,加水煎煮或10-80%乙醇渗漉,合并煎煮液或渗漉液,减压浓缩,得黄芪浓缩液;b、将a步骤的浓缩液加乙醇至含醇量达50%-80%,在0℃-5℃冷藏静置,24~36小时,滤过,滤液浓缩至每毫升相当于0.5-1.0克生药,冷藏静置,24~36小时,滤过;取滤液通过大孔吸附树脂柱,水洗至近无色;c、用稀乙醇洗脱,收集洗脱液,滤过,回收乙醇并浓缩至无醇味,冷藏静置,滤过;d、将c步骤的浓缩液加乙醇至含醇量达70%-90%,冷藏静置,滤过,回收乙醇,煮沸,滤过,即得黄芪总苷提取物。
6.根据权利要求4或5所述黄芪总苷提取物的制备方法,其特征在于b步骤所用的大孔树脂为非极性或/和弱极性大孔吸附树脂,树脂型号为HPD100、HPD300、D101、HPD100A、HPD700、LD140中的一种或其混合。
7.根据权利要求5所述的黄芪总苷提取物的制备方法,其特征在于c步骤中所述的洗脱液是50-100%乙醇。
8.一种药物组合物,它是含有由权利要求1-3任一项所述的治疗有效量的黄芪总苷提取物为活性成分,加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其特征在于所述的制剂是丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。
10.权利要求8或9所述的药物组合物在制备治疗或预防病毒性心肌炎、心力衰竭药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了一种黄芪总苷提取物,其中,黄芪总苷的重量百分含量占提取物的80-100%,黄芪甲苷的百分含量占总提取物的6-50%。本发明还提供了该黄芪总苷提取物的制备方法,该方法与现有技术相比具有成本低、无有机溶剂残留、以及生产过程中无环境污染等,黄芪总苷中黄芪甲苷同系物在水中的溶解度大于黄芪甲苷,便于制剂,在病毒心肌炎小鼠的治疗中具有协同增效作用。
文档编号C07H1/00GK1854148SQ20061000849
公开日2006年11月1日 申请日期2006年1月26日 优先权日2005年2月6日
发明者刘忠荣, 付铁军, 及元乔, 庞红, 何民, 黄瑜, 李伯刚 申请人:成都地奥九泓制药厂
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