专利名称：一种柴胡药材的提取分离方法
技术领域：
本发明属于医药领域，具体而言是涉及柴胡提取、分离标准化。
背景技术：
目前，在全球范围内，中草药都有一定的市场，随着人们对健康要求认识水平的增高以及人口的老龄化，亚健康状态化，人们更加渴望回归自然，利用纯天然程度高的药物治疗、预防一些化学合成药物所不能解决的问题，因此天然植物药的应用超出它原来民族传统文化的背景。从天然药物中寻求副作用小、且物美价廉的药物成为世界各国医药企业所追逐的目标。欧共体对草药进行了统一立法，加拿大和澳大利亚等国草药地位已经合法化，美国政府也已起草了植物药管理办法，开始接受天然药物的复方混合制剂作为治疗药，这些为中药作为治疗药进入国际医药市场提供了良好的国际环境。另一方面，随着全球经济一体化进程的加快，特别是我国正式加入WTO，中国医药市场融入国际医药大市场的广度和深度将进一步加剧。面临强大跨国医药集团的激烈竞争以及日本、韩国、印度、泰国等亚洲国家传统医药产品和德国、法国等欧洲国家植物药的巨大冲击，我国传统中药产生的众多产品由于尚不能符合国际医药市场的标准和要求而被拒之门外。
中药材提取的标准化和中药制备方法的标准化是中成药走向国际市场或者真正实现大工业生产的关键环节，也是中国医药工作者和国外研究天然植物药的科研人员一直努力研究的方向。目前关于中药的提取方法是中药领域研究的重点，科研人员一直将研究的目光着重于采用何种方法才能从中药材中获得的更多的有效成分，因此目前的中药材提取的局面是针对不同的中药材其有效成分的提取方法也不同，而针对不同的中药材采用不同的提取方法需要有大量不同的提取设备用于支持中药材的提取，这不适于中药材提取的标准化。
柴胡，为伞形科(Umbelliferae)柴胡属(Bupleurum)植物。全世界有柴胡属植物200种，我国已报道有42种，17变种及7变形(程必强，喻学俭.云南热带亚热带香料植物.昆明云南大学出版社，1995.69-73)。《中华人民共和国典》(1995年版)规定北柴胡Bupleurum chineseDC.和南柴胡B.scorzonerifolium Willd.为药用柴胡。前者主产于辽宁、甘肃、河北、河南、山东等地，后者主产于湖北、四川、江苏、安徽等地。柴胡根中主要成份为柴胡皂苷，其次含有植物甾醇、侧金盏花醇，以及少量挥发油、多糖；地上部分主要含黄酮类、少量皂苷类、木脂素类、香豆素类成分。柴胡皂苷具有镇痛、镇静、抗炎等生理活性；目前发现柴胡多糖有抗炎、降血脂、增强免疫功能和抗病毒等作用，还有较强的抗溃疡作用(张永文.柴胡果胶多糖的结构与药理活性研究进展J.国外医学中医中药分册，1996，18(4)20-23.)，对肝炎以及SLE、肾炎及类风湿等自身免疫疾病具有重要的临床价值。黄酮类具有增强毛细管功能的作用等。
如何确定一种提取、分离标准化方法，使柴胡中的药物活性成分不仅能够提取完全，还可以通过分离方法进一步分离所获得的药物活性成分。该提取、分离标准化的确立是目前中药实现现代化的关键因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柴胡提取、分离标准化。具体的说就是将柴胡提取物分成若干组分，每个组分包含几个主要化合物，由这些药材组分构成了一个药材组分库。对药材组分库能够进行药物筛选，从而发现新药。
为了实现柴胡提取的现代化、标准化，本发明人通过大量的试验，对目前柴胡的有效成分的提取方法进行归纳和整理，以寻求一种可标准化的提取方法，即在该提取条件下采用该标准提取方法对柴胡进行提取，可以最大限度的获得中药中的有效成分。
本发明所采用的柴胡提取、分离标准化是本发明人通过试验，对同一味中药材采用不同的提取方法进行比较后，所得到的可适于工业化生产的柴胡提取、分离标准化。
本发明可以通过下列步骤实施(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液fr.1；在药渣中加入乙醇，加热提取得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热提取得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏后，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6；将提取液fr.2浓缩成浸膏后，用甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度的甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换中等浓度的甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用纯甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺用制备液相色谱继续分离前面工艺中得到的fr.5和fr.8。色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，在相应的时间段收集馏分，获得经过了进一步分离的各个组分。
优选地，本发明可以通过下列步骤实施(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入5～12倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.1；在药渣中加入5～12倍量70％乙醇，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏后，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6；将提取液fr.2浓缩成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用2～10％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换40～80％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺用制备液相色谱继续分离前面工艺中得到的fr.5和fr.8。色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为10ml/min，柱温为室温，在相应的时间段收集馏分，获得经过进一步分离的各个组分。
最佳地，本发明可以通过下列步骤实施(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入8倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.1；在药渣中加入8倍量70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6。将提取液fr.2浓缩成浸膏，用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺本发明中为了从步骤(2)中获得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具体的有效成分，用制备液相色谱继续分离fr.5和fr.8。
fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；
40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；fr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；组分fr.87，收集时间38.0-45.0min；为了获得具体的柴胡有效成分，最佳的本发明提取分离方法为(1)提取工艺称取柴胡药材250g，将其粉碎后过筛，然后加入8倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.1。在药渣中加入8倍量70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.2。在药渣中最后加入水，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩得36.6g浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，浓缩得6.3g样品，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6。将提取液fr.2浓缩得29.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，浓缩得2.8g样品，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺本发明中为了从步骤(2)中获得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具体的有效成分，用制备液相色谱继续分离fr.5和fr.8。
fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果取组分fr.5共1.1g，用乙醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；23mg；组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；35mg组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；27mg组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；22mg组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；20mg组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；50mg组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；108mg组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；31mgfr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；
15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果取组分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；560mg；组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；10mg；组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；90mg；组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；86mg；组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；91mg；组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；16mg；组分fr.87，收集时间38.0-45.0min；15mg.
本发明中，柴胡各组分中所含化合物见表1，其分析鉴定方法参见实施例三。
表1.柴胡各组分中所含化合物
以上柴胡、提取溶液在工业化提取时可按照相应的比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或减小，但其重量配比比例不变。
本发明所建立的提取、分离标准化可以适用于目前中药中的任何一种中药材，例如可用于阿魏、艾叶、安息香、柏子仁、鳖甲、槟榔、薄荷、蓖麻子、萹蓄、补骨脂、板蓝根、荜茇、巴豆、巴戟天、北豆根、北沙参、白及、白头翁、白芍、白芷、白附子、白茅根、白果、白前、白扁豆、白蔹、白鲜皮、白薇、半边莲、半枝莲、半夏、百合、冰片、蝉蜕、楮实子、常山、椿皮、穿山甲、穿心莲、赤小豆、赤石脂、赤芍、苍术、苍耳子、沉香、垂盆草、侧柏叶、草乌、草乌叶、草豆蔻、草果、川贝母、川牛膝、川乌、川芎、川楝子、车前子、丹参、淡豆豉、党参、淡竹叶、杜仲、独活、胆南星、大蓟、大腹皮、牡丹皮、煅石膏、冬瓜皮、冬虫夏草、地龙、地肤子、地骨皮、熟地黄、地锦草、地榆、当归、灯心草、丁香、刀豆、大青叶、大枣、大黄、鹅不食草、莪术、儿茶、榧子、浮萍、萆解、覆盆子、佛手、附子、茯苓、防己、防风、番泻叶、蜂蜜、蛤蚧、桂枝、葛根、藁本、高良姜、骨碎补、谷芽、谷精草、狗脊、枸杞子、枸骨叶、钩藤、甘松、甘草、甘遂、瓜蒌、瓜蒌子、瓜蒌皮、关木通、干姜、炮姜、干漆、鹤虱、黄芪、黄精、海藻、槐花、海风藤、荷叶、黄芩、黄连、黄柏、花椒、何首乌、虎杖、胡黄连、厚朴、化橘红、火麻仁、合欢皮、合欢花、红大戟、红花、黑芝麻、菊花、僵蚕、桔梗、橘核、姜黄、鸡血藤、鸡冠花、金果榄、金沸草、金荞麦、金钱草、金银花、降香、荆芥、韭菜子、决明子、款冬花、诃子、苦杏仁、苦参、苦楝皮、莱菔子、雷丸、凌霄花、鹿衔草、漏芦、路路通、莲子、络石藤、芦荟、芦根、两头尖、两面针、连翘、灵芝、罗布麻叶、罗汉果、荔枝核、龙胆、龙眼肉、老鹳草、墨旱莲、麻黄、蔓荆子、满山红、满山红油、密蒙花、梅花、麻黄、麦冬、麦芽、玫瑰花、明党参、马鞭草、马兜铃、马钱子、马钱子粉、马勃、马齿苋、木瓜、木香、木贼、南沙参、女贞子、牛蒡子、牛膝、藕节、蒲公英、蒲黄、枇杷叶、佩兰、片姜黄、瞿麦、秦皮、拳参、芡实、羌活、青木香、青风藤、青皮、青葙子、青蒿、青黛、茜草、牵牛子、前胡、千年健、千金子、秦艽、蕤仁、肉豆蔻、肉苁蓉、肉桂、人参、人参叶、石菖蒲、锁阳、桑叶、商陆、桑椹、蛇床子、桑白皮、桑枝、桑枝、桑寄生、娑罗子、酸枣仁、射干、苏合香、沙苑子、使君子、柿蒂、砂仁、山豆根、山茱萸、山药、山慈菇、山楂、小蓟、升麻、水牛角、水牛角浓缩粉、石韦、石决明、石斛、石榴皮、生姜、丝瓜络、三七、三棱、葶苈子、菟丝子、桃仁、通草、檀香、天花粉、天竺黄、天南星、天麻、天葵子、太子参、土荆皮、土茯苓、吴茱萸、威灵仙、王不留行、五加皮、五味子、五倍子、瓦楞子、乌药、乌梅、夏天无、续断、旋覆花、豨莶草、薤白、夏枯草、辛夷、香加皮、香附、香橼、香薷、小茴香、仙茅、仙鹤草、玄参、玄明粉、西洋参、血余炭、血竭、徐长卿、淫羊藿、益母草、银杏叶、薏苡仁、银柴胡、远志、芫花、郁李仁、郁金、鱼腥草、茵陈、鸦胆子、月季花、玉竹、延胡索、浙贝母、猪牙皂、紫苏子、紫菀、紫花地丁、紫草、猪苓、皂角刺、知母、泽兰、泽泻、珍珠母、枳实、栀子。
按照本发明方法所获得的柴胡有效成分可以制成药剂学上任何一种形式，包括针剂和口服制剂。其中针剂包括注射液、滴注液、粉针剂；口服制剂包括颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。
对于本领域技术人员而言，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，本发明实施例仅作为示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进，例如所选用的溶液可以是其他低级醇或者是其他有机溶剂，但只要使用本发明所述的提取方法，均在本发明保护范围之内。
下面给出柴胡指纹图谱，柴胡水溶性各组分紫外光谱图、柴胡水溶性各组分质谱图、柴胡脂溶性各组分紫外光谱图、柴胡脂溶性各组分质谱图旨在进一步说明本发明，但对本发明并不构成限制。
图1柴胡指纹图谱图2柴胡水溶性各组分紫外光谱3柴胡水溶性各组分质谱4柴胡脂溶性各组分紫外光谱5柴胡脂溶性各组分质谱图具体实施方式
以下通过具体实施方式
来进一步说明本发明，不以任何形式构成对本发明的限制。
实施例一(1)提取工艺称取柴胡药材250g，将其粉碎后过筛，然后加入5倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流2小时，提取3次，合并滤液得提取液fr.1。在药渣中加入10倍量70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.2。在药渣中最后加入水，加热回流1.5小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩得35.6g浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，浓缩得5.8g样品，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6。将提取液fr.2浓缩得26.3g浸膏，取2.6g浸膏用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，浓缩得2.6g样品，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺本发明中为了从步骤(2)中获得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具体的有效成分，用制备液相色谱继续分离fr.5和fr.8。
fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果取组分fr.5共1.2g，用乙醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；22mg；组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；36mg组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；25mg组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；20mg组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；19mg组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；46mg组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；100mg组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；33mgfr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果取组分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；530mg
组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；12mg组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；92mg组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；88mg组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；90mg组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；16mg组分fr.87，收集时间38.0-45.0min；16mg实施例二(1)提取工艺称取柴胡药材500g，将其粉碎后过筛，然后加入10倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流3小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.1。在药渣中加入8倍量70％乙醇，加热回流2小时，提取3次，合并滤液得提取液fr.2。在药渣中最后加入水，加热回流2.5小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩得70.6g浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，浓缩得5.3g样品，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6。将提取液fr.2浓缩得27.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，浓缩得2.8g样品，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺本发明中为了从步骤(2)中获得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具体的有效成分，用制备液相色谱继续分离fr.5和fr.8。
fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果取组分fr.5共2.4g，用乙醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；43mg组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；65mg组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；47mg
组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；42mg组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；40mg组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；90mg组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；208mg组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；51mgfr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果取组分fr.8共2.7g，用20％的甲醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；760mg组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；19mg组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；160mg组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；156mg组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；171mg组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；26mg组分fr.87，收集时间38.0-45.0min；25mg。
实施例三一、柴胡药材的提取分离(1)提取工艺称取柴胡药材250g，将其粉碎后过筛，然后加入8倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.1。在药渣中加入8倍量70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.2。在药渣中最后加入水，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3。
(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩得36.6g浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，浓缩得6.3g样品，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6。将提取液fr.2浓缩得29.3g浸膏，取3.0g浸膏用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，浓缩得2.8g样品，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9。
(3)制备分离工艺本发明中为了从步骤(2)中获得柴胡提取物中fr.5和fr.8更加具体的有效成分，用制备液相色谱继续分离fr.5和fr.8。
fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果取组分fr.5共1.2g，用乙醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；23mg；组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；35mg组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；27mg组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；22mg组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；20mg组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；50mg组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；108mg组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；31mgfr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果取组分fr.8共1.6g，用20％的甲醇溶解进样，由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下
组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；560mg；组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；10mg；组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；90mg；组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；86mg；组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；91mg；组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；16mg；组分fr.87，收集时间38.0-45.0min；15mg.
二、分析2.1试剂与仪器Agilent 1100高效液相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)，配在线真空脱气机、四元低压泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、1946D电喷雾四级杆质谱检测器、Chemstation色谱工作站；R-200型旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；飞鸽牌TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；METTLER-AE240型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。
乙腈为色谱纯试剂(MERCK)，水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团)，乙酸为分析纯(杭州试剂厂)。
2.2分析方法样品来源柴胡组分fr.51 1.37mg、fr.52 1.06mg、fr.53 1.05mg、fr.54 1.40mg、fr.551.20mg、fr.56 1.05mg、fr.57 1.00mg、fr.58 1.22mg。
样品制备样品用1ml乙醇溶解，超声，离心(10000r/min)，备用。
HPLC条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18型色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，以二元流动相进行梯度洗脱。流动相A为0.2％HAc-H2O，流动相B为0.2％HAc-CH3CN；线性梯度为0min，10％B；10min，50％B；30min，95％B。流速为0.5mL/min；柱温为30℃；DAD检测在190-400nm范围内扫描；进样量5μL。
质谱条件正负离子扫描模式，扫描范围100-2000；干燥气(N2气)流速10L/min，雾化温度350℃，毛细管电压3500V，裂解电压100V。
ELSD条件氮气1.41/min，漂移管温度100℃。
样品来源柴胡组分fr.81 1.30mg、fr.82 1.46mg、fr.83 1.20mg、fr.84 1.20mg、fr.851.09mg、fr.86 0.95mg、fr.87 1.30mg。
样品制备样品用1ml 50％甲醇水溶解，超声，离心(10000r/min)，备用。
HPLC条件色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18型色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，以二元流动相进行梯度洗脱。流动相A为0.01％HAc-H2O，流动相B为0.01％HAc-CH3CN；线性梯度为0min，5％B；5min，20％B；30min，50％B；35min，50％B。流速为0.5mL/min；柱温为30℃；DAD检测在190-400nm范围内扫描；进样量5μL。
质谱条件正负离子扫描模式，扫描范围100-2000；干燥气(N2气)流速10L/min，雾化温度350℃，毛细管电压3500V，裂解电压100V。
ELSD条件氮气1.8l/min，漂移管温度105℃。
2.3分析结果分析结果图2是柴胡水溶性各组分紫外光谱图，图3是柴胡水溶性各组分质谱图，图4是柴胡脂溶性各组分紫外光谱图，图5是柴胡脂溶性各组分质谱图。
柴胡组分中各化合物鉴定结果[1-3]见表2。
表2柴胡各组分鉴定结果
1.文献1孟青，郭晓玲，冯毅凡，陈耕夫，梁汉明.柴胡超临界二氧化碳萃取物化学成分气相-质谱联用分析；2005 VOL.16 NO.1；2.文献2李颖等.银川柴胡的化学成分研究；中国野生植物资源，1995年第四期；3.DNP(Dictionary of Natural Products)天然产物数据库。
权利要求
1.柴胡提取、分离标准化方法，包括以下步骤(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液fr.1；在药渣中加入乙醇，加热提取得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热提取得提取液fr.3；(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏后，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6；将提取液fr.2浓缩成浸膏后，用甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用低浓度的甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换中等浓度的甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用纯甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9；(3)制备分离工艺用制备液相色谱分离fr.5和fr.8；色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，在相应的时间段收集馏分，获得经过了进一步分离的各个组分。
2.如权利要求1所述的柴胡提取、分离标准化方法，包括如下步骤(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入5～12倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.1；在药渣中加入5～12倍量70％乙醇，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热回流0.5～3小时，提取1～3次，合并滤液得提取液fr.3；(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏后，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6；将提取液fr.2浓缩成浸膏后，用2～10％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用2～10％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换40～80％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9；(3)制备分离工艺用制备液相色谱分离fr.5和fr.8；色谱柱为制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，流速为10ml/min，柱温为室温，在相应的时间段收集馏分，获得经过进一步分离的各个组分。
3.如权利要求2所述的柴胡提取、分离标准化方法，包括如下步骤(1)提取工艺称取柴胡药材，将其粉碎后过筛，然后加入8倍量体积比为1∶1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.1；在药渣中加入8倍量70％乙醇，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.2；在药渣中最后加入水，加热回流1小时，提取2次，合并滤液得提取液fr.3；(2)分离工艺将提取液fr.1浓缩成浸膏，用硅胶拌样，采用正相硅胶柱对其进行分离，首先用体积比为50∶1的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，得洗脱液fr.4，然后改换体积比为10∶1的氯仿和甲醇作为流动相，得洗脱液fr.5，最后用甲醇作为流动相，得洗脱液fr.6；将提取液fr.2浓缩成浸膏，用5％甲醇溶解上样，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.7，然后改换70％甲醇作为流动相，得洗脱液fr.8，最后用100％甲醇溶液作为流动相，得洗脱液fr.9；(3)制备分离工艺用制备液相色谱离fr.5和fr.8；fr.5的分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为90％的水，流动相B为10％的乙腈溶液；40min时，流动相A为25％的水，流动相B为75％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；50min时，流动相A为5％的水，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.5分离结果由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.51，收集时间3.0-7.0min；组分fr.52，收集时间7.0-14.9min；组分fr.53，收集时间14.9-21.0min；组分fr.54，收集时间21.0-26.8min；组分fr.55，收集时间26.8-32.2min；组分fr.56，收集时间32.2-41.0min；组分fr.57，收集时间41.0-47.0min；组分fr.58，收集时间47.0-50.0min；fr.8分离条件色谱柱为Agilent制备柱(Zorbax SB-C18；21.2mm×250mm)；采用梯度洗脱，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为10ml/min，柱温为室温，洗脱梯度如下0min时，流动相A为98％的水溶液，流动相B为2％的乙腈溶液；10min时，流动相A为95％的水溶液，流动相B为5％的乙腈溶液；15min时，流动相A为85％的水溶液，流动相B为15％的乙腈溶液；35min时，流动相A为50％的水溶液，流动相B为50％的乙腈溶液；45min时，流动相A为5％的水溶液，流动相B为95％的乙腈溶液；fr.8分离结果由制备液相色谱分离得到的组分及相应的收集时间如下组分fr.81，收集时间4.0-7.0min；组分fr.82，收集时间7.0-9.0min；组分fr.83，收集时间9.0-17.8min；组分fr.84，收集时间17.8-24.0min；组分fr.85，收集时间24.0-33.3min；组分fr.86，收集时间33.3-38.0min；组分fr.87，收集时间38.0-45.0min。
4.如权利要求3所述的柴胡提取、分离标准化方法，其特征在于组分fr.51中主要化合物为2，9-Heptadecadiene-4，6-diyn-1-ol，8CI；(all-Z)form；组分fr.52中主要化合物为Massoialactone或dibenzoburan；组分fr.55中主要化合物为(E，E)-farnesylacetone或podocarp-12-en-14-one或hexahydrofaresylacetone；组分fr.56中主要化合物为2，8，10-Heptadecatriene-4，6-diyn-1-ol；(E，E，E)-form，Ac和decyl decanate；组分fr.57中主要化合物为十八碳烯酸甲酯。
5.如权利要求3所述的柴胡提取、分离标准化方法，其特征在于组分fr.82中主要化合物为3，3’，4，4’-Tetrahydroxylign-7-en-9，9’-olide；(R，E(Z))-form，3’，4’-Methylene，4-Me ether和Guayarol；3’-Me ether和2，9-Heptadecadiene-4，6-diyne-l，8-diol，8CI；(2Z，8S，9Z)-form；3，5，7，9-Tridecatetraene；(3E，5Z，7Z，9E)-form；组分fr.83中主要化合物为agaruspirol；组分fr.84中主要化合物为2-Phenylethanol；O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→2)-b-D-glucopyranoside]；组分fr.85中主要化合物为2-Phenylethanol；O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→2)-b-D-glucopyranoside]；组分fr.86中主要化合物为13，28-Epoxy-11-oleanene-3，16，23-triol；(3b，13b，16a(b))-form，3-O-[b-D-Glucopyranosyl-(1→3)-b-D-fucopyranoside]；组分fr.87中主要化合物为(E，E)-farnesylacetone或podocarp-12-en-14-one或hexahydrofaresylacetone和13，28-Epoxy-11-oleanene-3，16，23-triol；(3b，13b，16a(b))-form，3-O-[b-D-Glucopyranosy]-(1→3)-b-D-fucopyranoside]。
全文摘要
本发明公开了柴胡标准化提取分离方法，采用该方法可较大程度地将中药材中化学成分提取出来并进一步分离获得柴胡中不同极性的化学组分；具体的说就是将柴胡药材按极性分成若干化学组分，每个组分中仅包含几个主要化合物，由这些药材组分构成一个药材组分库。对药材组分库能够进行药物筛选，从而发现新药。该标准化提取分离方法不需要对每个药材都建立一套提取分离方法，大大缩短了药材提取分离的周期，同时也减少人力物力的消耗；该方法简便、推广性好，适用大部分药材。
文档编号C07B63/00GK101073587SQ20061001374
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月18日 优先权日2006年5月18日
发明者程翼宇, 贺庆, 王毅, 王学伟, 李云飞, 水文波, 胡兴江, 葛志伟 申请人:天津天士力制药股份有限公司