烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其应用的制作方法

文档序号:3476482阅读:239来源:国知局
专利名称:烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域
本发明涉及昆虫基因工程技术领域,特别是涉及一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白(Helicoverpa assulta Fatty Acid Binding Protein,缩写为Hass-FABP)基因及其应用。
背景技术
1972年Ockneir等在研究大鼠小肠脂肪酸吸收的调节时,在肠粘膜上发现了脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein,FABP),后来发现这种蛋白广泛存在于动物的心肌、小肠、肝脏、脂肪组织、脑和表皮中,已发现的FABP包括心肌型(H-FABP)等9种。FABP大约由126-134个标准氨基酸组成,相对分子质量大约为11-16kDa。FABP的主要功能是参与细胞内脂肪酸及其他一些疏水配基的运输,可将脂肪酸(优先结合长链脂肪酸)运输到β氧化、甘油三酯或磷酸合成的位点,促进细胞合成脂肪酸,并在代谢内环境中起重要作用。近年来,已用大量的实验方法对FABP的转运功能进行了研究。这些方法包括分子水平的体内脂肪酸转运模型;对脂肪酸的摄取和由基因控制的FABP不同种类、数量体内细胞转运的研究;同时对缺乏特异FABP表达的动物组织细胞进行检测。已经清楚知道FABP周围包围了大量的相关蛋白,一些除脂肪酸外,还结合了疏水的配体。近来,对FABP的组织分布,配体亲和力和特异性,以及其结构特性进行了集中研究,结果均表明FABP参与细胞脂质代谢。目前,脂肪酸结合蛋白的研究主要在高等动物中进行,而对昆虫研究较少,已报道的仅有烟草天蛾(Manduca sexta)、果蝇(Drosophila melanogaster)、家蚕(Bombyxmori)和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)等,研究表明FABP基因在昆虫中存在一定的同源性。
烟夜蛾(Helicoverpa assulta)又名烟草夜蛾、烟青虫、烟实夜蛾,是一种世界性的烟草害虫。该虫具有分布广、食性较杂、繁殖力较强和兼性滞育等特点。在我国除西藏外,各省、市区均有发生,以危害烟草及辣椒最重。国内各烟区均有分布,其中以黄淮烟区、华中烟区、西南烟区的云南、贵州和四川等地烟草,发生世代多、发生量较大。由于使用化学防治方法引起的环境压力以及害虫产生的抗药性等问题,利用其他方法控制此虫已成为当前防治的热点。

发明内容
本发明的目的提供一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其编码的蛋白质。
本发明的技术方案是一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的全长cDNA序列,具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因编码的蛋白,编码长为132个氨基酸残基,其氨基酸序列为1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在对烟夜蛾及其他鳞翅目害虫防治中的应用。
烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在烟夜蛾基因芯片中的应用。
烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在合成新的脂肪酸结合蛋白基因中的应用。
利用烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在获得抗烟夜蛾及其他鳞翅目害虫转基因植物中的应用。
获得烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的克隆过程包括如下步骤
(1)总RNA提取(2)引物设计,设计并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
(3)RT-PCR扩增(4)PCR产物的克隆和鉴定(5)序列测定和分析。
本发明的积极有益效果(1)提供了一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其编码的蛋白质。
(2)对烟夜蛾及其他鳞翅目害虫防治的应用脂肪酸结合蛋白的主要作用是对脂肪酸及其衍生物的摄取、细胞内转运、氧化、脂化或合成等一系列脂肪代谢中发挥作用。利用Hass-FABP基因对蛋白的调控,控制虫体内脂肪酸的比例,从而控制昆虫的生长和发育,达到控制虫害的目的。
(3)基因芯片的制作可将Hass-FABP基因的克隆用于烟夜蛾基因芯片制作,应用与烟夜蛾及其他鳞翅目昆虫等研究中。根据Hass-FABP基因cDNA序列设计PCR引物,在含本基因的克隆中扩增Hass-FABP基因的全长cDNA,或扩增编码细胞外结构域的基因特异性强的区段,进行基因芯片的制作。
(4)烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在合成新的脂肪酸结合蛋白基因中的应用目前,昆虫类的脂肪酸结合蛋白基因研究比较少,需要利用其他昆虫的基因序列设计并合成引物。
(5)获得抗烟夜蛾及鳞翅目害虫转基因植物利用基因工程技术,可以外导外源基因在植物表达的载体,将由干扰正常表达的基因导入植物细胞,可获得抗虫的转基因细胞系及转基因植株。
四.


图1不同来源的FABP基因氨基酸序列比对。
使用Clustal W和Genedoc软件对烟夜蛾FABP氨基酸与其它哺乳动物及昆虫FABP的氨基酸进行多重联配,结果表明,烟夜蛾的FABP延伸蛋白与鳞翅目近缘种美洲棉铃虫FABP的同源性高达96%,与烟草天蛾和家蚕的同源性分别达到了42%和40%。与双翅目的果蝇、哺乳动物马和牛的FABP同源性为32%,与人的FABP同源性为27%。
图中英文含义H.assulta烟夜蛾H.zea美洲棉铃虫M.Sexta烟草天蛾B.mori家蚕E.caballus马B.Taurus牛H.sapiens人D.melanogaster果蝇。图中黑色代表100%同源性;灰色代表80%同源性。
图2其他物种的FABP基因的进化关系。
进化树分析更清晰的表明了Hass-FABP基因在进化过程中与其他昆虫与动物的亲缘关系,进化树所需要的序列全部来自于NCBI中GenBank的基因数据库。
五.
具体实施例方式实施例烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的克隆过程1.实施例所用材料(1)供试昆虫烟夜蛾由河南农业大学植物保护学院昆虫实验室用人工饲料单管饲养获得。
(2)菌种及质粒pGEM-T Easy vector购自TaKaRa公司,大肠杆菌JM109均为本实验室保存。
(3)主要试剂及工具酶总RNA抽提试剂RNAiso Reagent、用于RT-PCR的One Step RNA PCR Kit、质粒小样快速抽提试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶HindIII和EcoR I,均购自TaKaRa公司,X-gal、IPTG试剂由Sangon公司生产,其它均为国产或进口分析纯试剂。
2.实施例所采用的方法(1)总RNA提取选用5龄烟夜蛾幼虫,取50mg脂肪体和血淋巴,在去除RNA酶的离心管中进行研磨,使用TaKaRa公司的RNAiso Reagent试剂,按照说明书进行总RNA的提取。
(2)引物设计根据GenBank中已登录的美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)脂肪酸结合蛋白基因核苷酸序列(GenBank登录号为AF074436)设计并合成引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(3)RT-PCR.以上述提取的总RNA为模板,按照One Step RNA PCR Kit说明书进行RT-PCR扩增。反应条件为50℃反转录30min;94℃变性2min;接着进行30个循环,循环条件为94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 1min,最后72℃延伸10min。扩增完毕后,用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化,并回收目的片段。
(4)PCR产物的克隆和鉴定按使用说明将回收的PCR产物克隆到pGEM-TEasy vector,然后转化大肠杆菌JM109,蓝白斑筛选,随机挑取一白色菌落,培养后提取质粒(质粒提取使用TaKaRa公司质粒小样快速抽提试剂盒),用HindIII和EcoR I双酶切方法,鉴定重组克隆pGEM/Hass-FABP。
(5)序列测定和分析DNA的序列测定在TaKaRa公司进行。
序列测定和结果分析表明,烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因开放式阅读框架全长399bp,编码为132个氨基酸残基,预测分子量为15.0KDa,等电点为5.83(http//www.expasy.ch/)。该基因已在GenBank中登记,登录号为DQ299942。
序列表<110>河南农业大学<120>烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其应用<160>2<210>1<211>399<212>DNA<213>烟夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>1atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc 60aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc 120aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt 180gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag 240accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac 300agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc 360aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa399<210>2<211>132<212>PRT<213>烟夜蛾(Helicoverpa assulta)<400>2Met Ala Phe Phe Gly Lys Glu Tyr Lys Phe Glu Lys Gln Glu Asn15 10 15Phe Glu Asp Phe Val Asn Ala Leu Gly Leu Thr Pro Glu Gln Thr20 25 30Gln Gly Tyr Leu Ala Tyr Thr Pro Thr Leu Lys Phe Thr Gln Asp35 40 45Gly Asp Ser Tyr Thr Val Ile Thr Ile Thr Pro Lys Thr Lys Ser
50 55 60Glu Val Thr Phe Lys Ser Gly Val Glu Phe Asp Asp Asn Asn Ala65 70 75Asn Arg His Cys Lys Thr Thr Tyr Thr Val Ala Gly Asp Thr Ile80 85 90Thr Gln Val Gln Lys Tyr Asp Asp Gly Asn Ser Leu Thr Ile Thr95 100 105Arg Lys Phe Ser Gly Asn Glu Met Val Val Thr Leu Ala Thr Ser110 115 120Lys Trp Asp Gly Val Ala Arg Arg Tyr Tyr Lys Ala125 130 13权利要求
1.一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因,其特征是烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因全长cDNA序列,具有如下所示的399bp的核苷酸序列1 atggcattct ttggcaagga atacaagttt gagaagcagg agaactttga ggatttcgtc61 aatgctttgg gcctcactcc cgagcagact caaggctacc tcgcctacac accgaccctc121 aagttcacgc aagatggtga ctcgtacacc gtgatcacca tcacgcccaa gactaaaagt181 gaagtcacct tcaagtctgg agtcgagttc gatgataaca atgctaaccg acactgcaag241 accacgtaca ccgttgccgg cgacaccatc acccaggtgc agaagtacga tgacggcaac301 agcctgacca tcaccaggaa gttctctggc aacgagatgg ttgtgactct ggcaaccagc361 aaatgggacg gagttgctcg cagatactac aaggcctaa。
2.根据权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因,其特征是烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因编码的蛋白,编码长为132个氨基酸残基,该蛋白的氨基酸序列为1 M A F F G K E Y K F E K Q E N F E D F V21 N A L G L T P E Q T Q G Y L A Y T P T L41 K F T Q D G D S Y T V I T I T P K T K S61 E V T F K S G V E F D D N N A N R H C K81 T T Y T V A G D T I T Q V Q K Y D D G N101 S L T I T R K F S G N E M V V T L A T S121 K W D G V A R R Y Y K A *。
3.含有权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的核苷酸序列的克隆方法,其特征在于为获得烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因核苷酸序列,设计并合成的引物序列如下正向引物5’-GGATCCATGGCATTCTTTGGCAAG-3’反向引物5’-CTCGAGTTAGGCCTTGTAGTATCTG-3’。
4.权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在对烟夜蛾及其他鳞翅目害虫防治中的应用。
5.权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在烟夜蛾基因芯片中的应用。
6.权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在合成新的脂肪酸结合蛋白基因中的应用。
7.利用权利要求1所述的烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因在获得抗烟夜蛾及其他鳞翅目害虫转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明涉及昆虫基因工程技术领域,特别是涉及一种烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因及其应用。烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因全长cDNA为399bp,蛋白质编码为长132个氨基酸残基,预测分子量15.0kDa。烟夜蛾脂肪酸结合蛋白基因的发现,不仅对烟夜蛾及其他鳞翅目害虫的防治具有重要意义,而且对其他昆虫乃至动物的脂肪酸结合蛋白的研究也具有重要意义。
文档编号C07K14/435GK1876816SQ200610017859
公开日2006年12月13日 申请日期2006年5月30日 优先权日2006年5月30日
发明者尹新明, 张涛, 安世恒 申请人:河南农业大学
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