专利名称：生产一种白细胞介素类似物的方法
技术领域：
本发明涉及一种人白细胞介素2类似物和利用基因工程技术生产该类似物的方法。
背景技术：
白细胞介素2(也称T细胞生长因子，本文简称IL2)是T细胞在凝集素或同种抗原刺激下产生的一种淋巴因子，IL2可以使T细胞在体外长期生长时保持功能不变。此外IL2促进胸腺细胞有丝分裂，使裸鼠脾细胞重新生成T细胞依赖抗原的抗体(T细胞替换因子)，促进杀伤细胞分化和增殖(杀伤辅助因子)。已经利用IL2克隆出杀伤T细胞克隆、辅助T细胞克隆和自然杀伤细胞克隆。除直接应用与T细胞或自然杀伤细胞克隆外，IL2可以用于某种抗原特异的杀伤T细胞的选择性生长，例如杀伤T细胞在体外识别一种肿瘤抗原并破坏肿瘤细胞。向动物体内注射利用IL2刺激出的肿瘤特异性杀伤T细胞，可能抑制和防止肿瘤生长。IL2还可以刺激IFNγ生成并激活自然杀伤细胞。
以上实验数据显示IL2可作为一种抗肿瘤制剂。IL2可以恢复缺少胸腺功能的裸鼠中辅助T细胞的功能或恢复均一细胞诱导的杀伤T细胞，因此IL2可以用于治疗免疫性疾病。
重组人白细胞介素2在临床上治疗癌性胸腹腔积液以及肾癌、黑色素瘤等疾病已经得到应用，随着应用的深入，逐渐呈现出不足1)剂量偏低，疗效不显著，重组人白细胞介素-2因其疏水性等问题难以制成高剂量制品，造成临床效果不明显；2)杂质含量较高，天然hIL-2基因序列所编码的rhIL-2蛋白一级结构中含三个半胱氨酸(Cys)，分别位于58、105和125位，其中第58和105位Cys的巯基形成的二硫键对rIL-2生物学活性至关重要，125Cys的巯基呈游离状态，很不稳定，在某些情况下可与58或105位的巯基错配形成杂质，从而使IL-2活性降低，影响用药效果。
在IL2序列的125位进行氨基酸改造，例如将原来的Cys替换为丙氨酸或丝氨酸，改造后的氨基酸不会与第58或105位Cys错配，大大降低杂质含量，此类产品已经在临床上获得应用。此外，上世纪八十年代协和发酵株式会社公开了在IL2蛋白的第1至第5位氨基酸缺失可以提高IL2的生物活性。因此一种N端缺失并且在第125位突变的白细胞介素2类似物具有更高的生物活性和更低的杂质含量。
通过细菌表达制备白细胞介素2的方法是已知的。常规方法基于蛋白质在大肠杆菌(E.Coli)中表达后以包涵体的形式或直接存在于细胞质中。对于以包涵体形式存在的白细胞介素2，由于蛋白分子不能正确折叠而没有生物活性，必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，再进行离子交换层析、亲和层析、反相高效液相层析、分子排阻层析等步骤纯化才能获得可用于临床的制品。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。
目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是(1)复性效率低。传统的复性方法包括稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5～20％，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。(2)生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。
上世纪九十年代初，我国首先有报道将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素γ、重组人粒细胞集落刺激因子、重组牛朊病毒等重组蛋白的纯化工艺中。此后，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也有用于蛋白质的复性和同时纯化中。但应用疏水色谱法对白细胞介素2类似物同时进行复性和纯化的方法尚未见报道。疏水色谱法应用蛋白质表面某一部分具有疏水性、在高盐浓度下与凝胶骨架上交联的丁基、苯基结合的原理。
与传统的稀释法及透析法比较，用疏水色谱法进行白细胞介素2类似物复性的优点是①在进样后可很快除去变性剂；②由于凝胶骨架上疏水基团对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量，显著降低聚体和单体杂质含量；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，疏水色谱法复性可以提高白细胞介素2类似物的纯度、降低杂质含量，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种人白细胞介素2类似物和利用基因工程技术生产该类似物的方法。本发明进一步提供一种应用柱上复性的方法制备白细胞介素2类似物的方法。本发明进一步提供一种纯化比活性不低于1×108国际单位/毫克蛋白的白细胞介素2类似物的方法。
具体步骤包括1)合成编码白细胞介素2类似物核苷酸序列的基因，2)细菌细胞的发酵，3)包涵体的提取和纯化，4)疏水色谱法复性和纯化包涵体，5)离子交换层析，6)凝胶排阻层析。
本发明不限于使用大肠杆菌，也包括使用能够表达包涵体形式的异源蛋白的任何原核微生物。
发明详述表达重组人白细胞介素2类似物的基因利用化学方法合成。将IL2类似物基因片段连接入商业化原核表达质粒中，这些质粒包括但不限于pTrc、pBAD、pTac、pET、pT7、pL等；将重组质粒转染入宿主菌，这些宿主菌包括但不限于DH5α、JM109、JM103、HB101等。
步骤1发酵本发明方法中进行发酵的菌株在使用之前以冷冻干燥物形式保存以维持其表达能力。使用时，用适当缓冲溶液溶解后接种于固体培养基上，扩大至所需要量后开始发酵。
发酵条件包括合适的培养基、温度、pH值、溶解氧等。发酵培养基是商业化且可以有效使用的已知培养基。优选的是含有蛋白胨、酵母提取物、甘油、磷酸缓冲盐等的混合培养基。培养基中添加一种或几种抗生素。优选的是50-200μg/ml的氨苄青霉素。发酵温度是适宜原核微生物生长的30-42℃。本发明中优选的是37℃。发酵期间pH应保持在中性(6.4-7.4)。发酵过程中罐压为常压，溶解氧保持在20-60％，优选的是50％。由于在搅拌下进行发酵，优选使用消泡剂。
发酵过程中，随着微生物生长，培养物的光密度增加。根据光密度可以监测发酵进展程度。通常选择测量光密度的波长为600nm。本发明的方法中，将微生物培养至对数期时开始诱导表达。通常微生物在这一时期600nm的光密度可达到1以上，本发明中优选的是光密度达到15以上时开始诱导。根据所选用的质粒，诱导的方法包括加入诱导剂或改变培养温度。诱导时间2-10小时，本发明中优选的是加入诱导剂异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导3-6小时。
诱导结束后，离心培养物，取细胞进行下列步骤。
步骤2提取和纯化包涵体表达的白细胞介素2类似物以不溶解的包涵体的形式存在于细胞质中。因此，本发明提供了细胞裂解、包涵体回收和洗涤。
洗涤细胞并悬浮于适当的缓冲液中，优选含有0.001mol/L乙二胺四乙酸及其钠盐(EDTA)和二硫苏糖醇(DTT)的中性或弱碱性(pH6.5-9.0)缓冲液。用冻/融、弗氏压碎器、超声处理或其它类似已知技术裂解细胞。向裂解后的细胞悬浮液中加入上述缓冲液。低温(2-10℃)高速(10000-15000rpm)离心10-40分钟，弃掉上清液，沉淀用上述缓冲液悬浮。重复离心和悬浮步骤。获得的包涵体用含有DTT的变性剂溶解。本发明中优选的是含有0.001mol/L DTT的8mol/L尿素(pH6.5-9.0)。
步骤3包涵体的复性和纯化溶解的包涵体装入疏水层析柱。可以使用任何商业化的疏水层析介质，只要其容量、填料和流速的特征类似于Phenyl Sepharose6 Fast Flow层析柱、ButylSepharose4 Fast Flow层析柱、OctyleSepharoe4 Fast Flow层析柱、Macro-PrepMethyl HIC Support层析柱、Macro-Prep t-Butyl HIC Support层析柱等。本发明优选的是Butyl Sepharose4 Fast Flow层析柱。应用含有DTT的变性剂洗涤并平衡该色谱柱，复性是通过降低变性剂的浓度并在适当浓度的氧化剂存在下实现的。本发明中优选的是用5-20倍柱体积的线性梯度由8mol/L尿素-0.001mol/L DTT过渡到2mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽，最后用0.1mol/L PBS-2mol/L尿素(pH7.5)洗脱蛋白。通过测定280nm的吸光度来自动监测各物质的洗脱。
步骤4离子交换层析收集富含活性形式的白细胞介素2类似物的来自前面步骤的组分装入离子交换层析柱上。可以使用任何商业化离子交换层析介质，只要其容量、填料和流速的特征与本发明所述方法条件相容。本发明中优选的是SP-Sepharose或CM-Sepharose。应用无机盐等度洗脱可以除去部分杂质并将目的蛋白浓缩。本发明优选的是用0.1-0.3mol/LNaCl洗脱目的蛋白。
步骤5凝胶排阻层析收集富含活性形式的白细胞介素2类似物的来自前面步骤的组分装入凝胶排阻层析柱上。可以使用任何商业化凝胶排阻层析介质，只要其容量、填料和流速的特征与本发明所述方法条件相容。本发明中优选的是Sephacyl S-200。应用凝胶排阻的特性可以除去单体或聚体杂质并去除残余的有机溶剂或无机盐。本发明优选的是用0.01mol/L磷酸盐缓冲液洗脱目的蛋白。
按照上述方法获得的白细胞介素2类似物大肠杆菌污染物不高于0.0005％，纯度可达到99％以上，比活性可达到1×108国际单位/mg蛋白以上。
具体实施例方式
下面依靠实施例描述本发明，然而，实施例仅仅举例说明，没有限制的目的。
实施例1发酵下列步骤涉及发酵和诱导重组白细胞介素2类似物的方法。
材料培养基由下列组成(每1L)蛋白胨12g酵母提取物24g甘油 4mlKH2PO42.31gK2HPO412.54g50％MgSO4.7H2O 4ml纯化水加适量至1L。
大肠杆菌菌株是DH5αpETIFN。
接种取一管冷冻干燥的DH5αpETIFN悬浮于1ml上述培养基中。悬液涂布LB平板，37℃培养35-50小时后接种于含50μg/ml氨苄青霉素的上述培养基中，置摇床100-300转/分、37℃培养5-10小时，再扩大至接种发酵罐的需要量。
在下列条件下实施发酵培养基上述培养基+50μg/ml氨苄青霉素+10μl/L消泡剂温度37℃溶解氧50％pH6.4-7.4
诱导在下列条件下实施诱导OD600大于15诱导剂1mM IPTG诱导时间3-6小时诱导期间pH值、温度和溶解氧与发酵期间相同。
诱导结束后3000g离心20min收集菌体。
实施例2提取和纯化包涵体材料裂解液0.05mol/L Tris.HCl-0.001mol/L EDTA-0.001mol/L DTT(pH7.5)变性溶液0.05mol/L Tris.HCl-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)超声处理裂解细胞。向裂解后的细胞悬浮液中加入裂解液。低温(2-10℃)高速(14000rpm)离心30分钟，弃掉上清液，沉淀用裂解液悬浮。重复离心和悬浮步骤3次。获得的包涵体用变性溶液溶解。
实施例3包涵体的复性和纯化材料和参数波长280nm层析介质Butyl Sepharose4 Fast Flow上柱样品溶解的包涵体，体积不超过柱体积的10倍流速1cm/min缓冲液A0.1mol/L PBS-2mol/L(NH4)2SO4-8mol/L尿素-0.001mol/L DTT(pH7.5)缓冲液B0.1mol/L PBS-2mol/L(NH4)2SO4-2mol/L尿素-0.005mol/L谷胱苷肽(pH7.5)缓冲液C0.1mol/L PBS-2mol/L尿素(pH7.5)溶解的包涵体装入金属螯合层析柱。用缓冲液A洗涤并平衡该色谱柱。接着用15倍柱体积的线性梯度由缓冲液A过渡到缓冲液B，最后用缓冲液C洗脱蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例4离子交换层析材料和参数波长280nm层析介质SP Sepharose上柱样品前面步骤(实施例3)含活性形式的重组白细胞介素2类似物的洗脱峰流速1cm/min缓冲液A0.02mol/L醋酸盐缓冲液(pH3.0)缓冲液B0.02mol/L醋酸盐缓冲液-0.15mol/L NaCl(pH3.0)收集来自前面步骤的洗脱峰装入离子交换层析柱上。用缓冲液A洗涤并平衡色谱柱，用缓冲液B洗脱目的蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例5凝胶排阻层析材料和参数波长280nm层析介质Sephcryl S-200上柱样品前面步骤(实施例4)含活性形式的重组白细胞介素2类似物的洗脱峰流速0.5cm/min缓冲液0.01mol/L PB-0.02％SDS(pH7.5)
收集来自前面步骤的洗脱峰加入SDS溶液至终浓度0.02％并用NaOH调节pH值至7.5，装入凝胶排阻层析柱上。用缓冲液洗涤并平衡色谱柱后洗脱目的蛋白。通过测定280nm的吸光度来收集洗脱峰。
实施例6污染物、纯度和比活性测定残余大肠杆菌蛋白测定用抗大肠杆菌菌体蛋白抗体包被酶标板，封闭后加入样品和菌体蛋白标准品，37℃孵育2小时，洗板后加入HRP酶联抗大肠杆菌菌体蛋白抗体，37℃孵育1小时，洗板后加入底物，37℃孵育40分钟，加入硫酸终止液终止反应，将酶标板放入酶标仪中，选择492nm波长进行检测，以标准品浓度A为X值，OD492nm为Y值，输入回归方程y＝a+bx中，计算得上述制备的白细胞介素2类似物样品中菌体蛋白残留量为0.0003％。
纯度测定制备SDS-PAGE电泳胶，分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4.5％。样品和样品缓冲液按3∶1的比例混匀后100℃水浴3-5分钟，向加样孔中加入样品10μg。以恒流10mA开始电泳，当溴酚蓝染料前沿进入分离胶后将电流调至20mA，直至溴酚蓝染料到达分离胶底部。电泳胶进行考马斯亮蓝染色。用扫描仪进行扫描处理，上述制备的白细胞介素2类似物纯度为99.6％。
比活性测定在96孔细胞培养板上，每孔加入2倍系列稀释的白细胞介素2标准品和白细胞介素2类似物样品50μl。CTLL-2细胞用RPMI1640培养液洗涤3次后配成细胞浓度为6×105个/ml的细胞悬液，加到96孔细胞培养板上，每孔50μl。在含5％CO2的37℃孵箱中培养18-24小时。每孔加入20μl MTT溶液，继续在含5％CO2的37℃孵箱中培养4-6小时。每孔加入裂解液150μl，在含5％CO2的37℃孵箱中保温18-24小时。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以630nm为参比波长，于570nm处测定光吸收度。数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理计算样品活性。按Lowry法测定样品的蛋白浓度，计算样品的比活性。上述制备的重组白细胞介素2类似物的比活性1.2×108IU/mg蛋白。
人白细胞介素2类似物氨基酸序列表1 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp21 Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu41 Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu61 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu81 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu101 Thr Thr Phe Met Cys Glu Thr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg121 Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr。
权利要求
1.一种利用大肠杆菌表达并应用疏水层析纯化和生产一种在氨基酸序列上与人白细胞介素2类似的蛋白的方法，包括下列步骤1)化学合成编码白细胞介素2类似物的核苷酸，2)对含有编码人白细胞介素2类似物核苷酸序列的大肠杆菌进行发酵，3)提取包涵体，4)应用疏水层析柱进行复性和纯化，其特征在于步骤(4)中包涵体的复性在疏水层析柱上完成并同时实现包涵体纯化，并且纯化后的蛋白比活性不低于1×108国际单位/毫克蛋白。
2.根据权利要求1，蛋白类似物具有氨基酸序列Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln LeuGlu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile AsnAsn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys PheTyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys LeuGlu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala GlnSer Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn IleAsn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe MetCys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu AsnArg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
3.根据权利要求1，蛋白类似物在大肠杆菌中表达。
4.根据权利要求1，大肠杆菌表达的蛋白类似物用疏水层析进行复性和纯化。
5.根据权利要求1、4的方法，其中所述的在疏水层析柱上进行复性的条件是降低变性剂的浓度并添加适当的氧化剂。
6.根据权利要求1、4、5的方法，其中所述的变性剂是尿素，还可以是盐酸胍、十二烷基硫酸钠，其中的氧化剂是谷胱苷肽。
7.根据权利要求1，纯化后的蛋白类似物的比活性不低于1×108国际单位/毫克蛋白。
全文摘要
一种利用大肠杆菌表达并应用疏水层析纯化和生产一种在氨基酸序列上与人白细胞介素2类似的蛋白的方法，纯化后的蛋白比活性不低于1×10
文档编号C07K14/435GK101045923SQ20061004622
公开日2007年10月3日 申请日期2006年3月31日 优先权日2006年3月31日
发明者苏冬梅, 阎峰, 侯绪凤 申请人:沈阳三生制药有限责任公司