专利名称：一种麦胚凝集素的制备方法及其在抑制乳腺癌活性中的应用的制作方法
技术领域：
一种麦胚凝集素的制备方法及其在抑制乳腺癌活性中的应用，属于小麦副产品精深加工技术领域。
背景技术：
小麦胚是小麦加工的副产物，每年产量在200多万吨以上，这是一项颇为可观的资源，值得开发和利用。麦胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin，WGA)是一种高度保守性的甲壳素结合凝集素，WGA在谷物中的含量虽然很少，但是具有多种重要的生物学活性，尤其是抑癌活性。但长期以来，我国麦胚加工仅处于一种满足人、畜营养的初级加工状态，加工产品结构单一，综合利用水平低，深加工水平远远低于发达国家。
以麦胚作为原料，通过盐析、热处理和亲和层析方法制备麦胚凝集素，麦胚凝集素作为一种具有独特性能的淀粉产品在食品、日化等行业可以进一步开发利用，这样可提高麦胚的综合利用价值和小麦加工业的经济效益。但其制备工艺还可进一步改进，其应用还有待进一步开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种麦胚凝集素的制备方法，所得麦胚凝集素具有较高的红细胞凝集活性及乳腺癌细胞增殖抑制活性。
本发明的技术方案先将麦胚进行初粉碎成麦胚粗粉，再将麦胚粗粉进行脱脂、细粉碎、超声强化酸提、盐析、热处理、超滤、亲和层析，将具有红细胞凝集活性的组分透析脱盐，冷冻干燥即为麦胚凝集素。
(1)麦胚原料的粉碎原料粉碎后的粒径越小，后续的脱脂和酸提就越彻底，粕中残留的麦胚凝集素越少。所以要将原料先粗粉碎，要求过20目筛网，然后再细粉碎。
(2)脱脂用石油醚、预冷丙酮各两次脱脂，要求麦胚中残脂不超过2％。
(3)溶剂挥发于室温下放置48小时至察觉不到溶剂气味。
(4)细粉碎脱脂后的麦胚粗粉进一步粉碎，要求过60目筛。
(5)超声强化酸液浸提细粉碎后的麦胚粉加甲酸溶液，甲酸溶液浓度为0.3～0.5M，麦胚粉与甲酸溶液的质量比控制为1∶9～1∶11，超声强度为30W/cm2，于室温下提取0.5～1.5小时。
料液比麦胚粉与酸的质量比例为1∶10左右，加酸量增加虽然可提高麦胚凝集素的提取率，但同时也会增加后续盐析的难度，因此比较适宜的料液比不宜过高。
超声强度超声强度为30W/cm2左右，超声强度增加虽然可提高麦胚凝集素的速度和提取率，但同时也会影响WGA结构及活性，因此比较适宜的超声强度不宜过高。
提取时间在提取时间0.5～1.5h之间提取液的总活力较高，而总蛋白质较低，所以选取的提取时间在此范围内为宜。
甲酸浓度在甲酸浓度0.3～0.5mol/L之间总活力较高，而总蛋白质较低，所以选取的甲酸浓度在此范围内为宜。
(6)离心除沉淀于4℃，25000g条件下离心20分钟，保留上清液。
(7)盐析用硫酸铵40％饱和度盐析，4℃过夜，然后于4℃，25000g离心20分钟，保留沉淀；沉淀总活力随着硫酸铵饱和度的增大而增加，当硫酸铵浓度升至40％左右时，沉淀总活力达到最大值，此后基本保持这一数值。而总蛋白随着硫酸铵饱和度的增大而持续增加。为了兼顾提取WGA的纯度和得率，选用40％的硫酸铵饱和度沉淀WGA。
(8)选择性热处理将硫酸铵分级后的沉淀溶于水，于65℃热处理10min，然后于4℃，25000g离心20min除去沉淀物，可最大限度除去杂蛋白，而麦胚凝集素活性损失最低。保留上清液。
(9)超滤脱盐、除杂蛋白、对缓冲液平衡。
WGA分子量为17～25kD之间，因此用分子截留值为50kD的中空纤维超滤管进行超滤，超滤压力为0.2Mpa，除去分子质量较大的杂蛋白；透过液再用分子截留值为10kD的中空纤维超滤管进行超滤，超滤压力为0.3Mpa，10kD的超滤过程重复一次，除去分子质量较小的杂蛋白，同时完成脱盐、对缓冲液平衡。当超滤浓缩至截流液为100mL/kg麦胚时，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05MTris-HCl缓冲液，继续超滤浓缩至截流液为100mL/kg麦胚，整个超滤过程均在常温下进行。
(10)部分水解甲壳素亲和层析选用层析柱L∶D为30∶1左右，规格为2.6×70cm，洗脱流速30mL/h，上样浓度40mg/mL。先将甲壳素部分水解装柱片状甲壳素烘干、磨碎成粉后，依次用0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L NaHCO3溶液于常温下分别处理15min，再用0.01mol/L HCl溶液于95℃恒温条件下保温2h，然后用1mol/L NaOH溶液调pH至中性，用蒸馏水洗涤除去溶液中的盐，处理后的甲壳素对pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液平衡后装柱；将(9)中最后得到的超滤截流浓缩液上样，先用pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白，然后用3M脲-0.5M HCOOH洗脱麦胚凝集素，检测洗脱液的A280nm，分部收集，保留有红细胞凝集活性的组分。
(11)透析脱盐及冷冻干燥将得到的有红细胞凝集活性的组分依次在室温条件下对流水透析、在4℃条件下对去离子水透析，至透过液中加入1％AgNO3溶液不出现沉淀，然后冷冻干燥得到麦胚凝集素。
本发明的麦胚凝集素制备方法，其特点是采用超声强化提取技术提高提取速度和提取率，采用超滤技术同时实现脱盐、除杂蛋白和对缓冲液平衡。
本发明方法制备的麦胚凝集素在抑制乳腺癌活性中的应用，麦胚凝集素对大鼠乳腺癌细胞株MCF-7、胰岛素依赖型人乳腺癌细胞株MCF-7有增殖抑制作用，最大抑制率均出现于加药72小时后，在2.5～80μg/mL剂量范围内，当剂量高于20μg/mL时，对于SHZ在加药24小时后全部死亡，10μg/mL剂量的最大抑制率达到50％；而对于MCF-7，80μg/mL剂量的最大抑制率为34％。
本发明的有益效果采用本发明方法生产的麦胚凝集素纯度、得率高，工艺效率较高。本发明工艺设计科学合理，操作简便易行，对环境无污染，为利用麦胚凝集素开发抑癌药物提供了研究基础，可提高麦胚深加工利用价值和相关产业的经济效益。
图1麦胚凝集素制备工艺流程示意图。
图2WGA对MCF-7的增殖抑制作用。
图3WGA对SHZ的增殖抑制作用。
具体实施例方式
实施例1取新鲜小麦胚500g，磨碎过20目筛，2L预冷石油醚(bp 40-60℃)脱脂两次，2L预冷丙酮脱脂两次，室温下使溶剂自然挥发至气味消失。磨碎后过60目筛，用9倍0.5M甲酸溶液，超声强度30W/cm2，室温下搅拌提取0.5h，然后于4℃，25000g离心20min。上清液用硫酸铵40％饱和度盐析，4℃过夜，4℃，25000g离心20min。沉淀溶于500mL水，65℃，10min热处理，4℃，25000g离心20min，去除沉淀物，得到上清液。上清液超滤先用2.5cm×20cm，分子截留值为50kD的中空纤维超滤管进行超滤，超滤压力为0.2MPa；透过液再用分子截留值为10kD的中空纤维超滤管进行超滤脱盐，超滤压力为0.3MPa，重复一次，当超滤浓缩至截流液为50mL时，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液，继续超滤浓缩至50mL，整个超滤过程均在常温下进行。亲合层析，柱规格为2.6×70cm，洗脱流速30mL/h，得到的有红细胞凝集活性的组分依次在室温条件下对流水透析、在4℃条件下对去离子水透析，至透过中加入1％AgNO3溶液不出现沉淀，然后冷冻干燥得到成品麦胚凝集素。
实施例2取新鲜小麦胚500g，磨碎过20目筛，2L预冷石油醚(bp 40-60℃)脱脂两次，2L预冷丙酮脱脂两次，室温下使溶剂自然挥发至气味消失。磨碎后过60目筛，用11倍0.3M甲酸溶液，超声强度30W/cm2，室温下搅拌提取1.5h，然后于4℃，25000g离心20min。上清液用硫酸铵40％饱和度盐析，4℃过夜，4℃，25000g离心20min。沉淀溶于500mL水，65℃，10min热处理，4℃，25000g离心20min，去除沉淀物，得到上清液。上清液超滤先用2.5cm×20cm，分子截留值为50kD的中空纤维超滤管进行超滤，超滤压力为0.2MPa；透过液再用分子截留值为10kD的中空纤维超滤管进行超滤脱盐，超滤压力为0.3MPa，重复一次，当超滤浓缩至截流液为50mL时，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液，继续超滤浓缩至50mL，整个超滤过程均在常温下进行。亲合层析，柱规格为2.6×70cm，洗脱流速30mL/h，得到的有红细胞凝集活性的组分依次在室温条件下对流水透析、在4℃条件下对去离子水透析，至透过中加入1％AgNO3溶液不出现沉淀，然后冷冻干燥得到成品麦胚凝集素。
权利要求
1.一种麦胚凝集素的制备方法，其特征是先将麦胚作为原料进行初粉碎成麦胚粗粉，再将麦胚粗粉进行脱脂、细粉碎、超声强化酸提、盐析、热处理、超滤、亲和层析，将具有红细胞凝集活性的组分透析脱盐，冷冻干燥即为麦胚凝集素；(1)原料粉碎原料麦胚进行初粉碎成麦胚粗粉，要求过20目筛；(2)脱脂分别用石油醚、预冷丙酮各两次脱脂，要求麦胚中残脂不超过2％；(3)溶剂挥发于室温下放置48小时至察觉不到溶剂气味；(4)细粉碎脱脂后的麦胚粗粉进一步粉碎，要求过60目筛；(5)超声强化酸液浸提细粉碎后的麦胚粉加甲酸溶液，甲酸溶液浓度为0.3～0.5M，麦胚粉与甲酸溶液的质量比控制为1∶9～1∶11，超声强度为30W/cm2，于室温下提取0.5～1.5小时；(6)离心除沉淀于4℃，25000g条件下离心20分钟，保留上清液；(7)盐析用硫酸铵40％饱和度盐析，4℃过夜，然后于4℃，25000g离心20分钟，保留沉淀；(8)热处理沉淀溶于水，用水量为1L/kg麦胚，65℃水浴处理10分钟，然后于4℃，25000g条件下离心20分钟，保留上清液；(9)超滤(8)中得到的上清液先用分子截留值为50kD的中空纤维超滤管进行超滤，超滤压力为0.2MPa；透过液再用分子截留值为10kD的中空纤维超滤管进行超滤脱盐，超滤压力为0.3MPa，10kD的超滤过程重复一次，当超滤浓缩至截流液为100mL/kg麦胚时，加入5倍量pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液，继续超滤浓缩至截流液为100mL/kg麦胚，整个超滤过程均在常温下进行；(10)亲和层析先将甲壳素部分水解装柱片状甲壳素烘干、磨碎成粉后，依次用0.05mol/L HCl溶液、0.05mol/L NaHCO3溶液于常温下分别处理15分钟，再用0.01mol/L HCl溶液于95℃恒温条件下保温2小时，然后用1mol/LNaOH溶液调pH至中性，用蒸馏水洗涤除去溶液中的盐，处理后的甲壳素对pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液平衡后装柱；将(9)中最后得到的超滤截流浓缩液上样，先用pH7.8的3M脲-0.05M Tris-HCl缓冲液洗脱杂蛋白，然后用3M脲-0.5M HCOOH洗脱麦胚凝集素，检测洗脱液的A280nm，分部收集，保留有红细胞凝集活性的组分；(11)透析脱盐及冷冻干燥将得到的有红细胞凝集活性的组分依次在室温条件下对流水透析、在4℃条件下对去离子水透析，至透过液中加入1％AgNO3溶液不出现沉淀，然后冷冻干燥得到麦胚凝集素。
2.根据权利要求1所述麦胚凝集素的制备方法，其特征是采用超声强化提取技术提高提取速度和提取率，采用超滤技术同时实现脱盐、除杂蛋白和对缓冲液平衡。
3.用权利要求1所述方法制备的麦胚凝集素在抑制乳腺癌活性中的应用，其特征是麦胚凝集素对大鼠乳腺癌细胞株SHZ、胰岛素依赖型人乳腺癌细胞株MCF-7有增殖抑制作用，最大抑制率均出现于加药72小时后，在2.5～80μg/mL剂量范围内，当剂量高于20μg/mL时，对于SHZ在加药24小时后全部死亡，10μg/mL剂量的最大抑制率达到50％；而对于MCF-7，80μg/mL剂量的最大抑制率为34％。
全文摘要
一种麦胚凝集素的制备方法及其在抑制乳腺癌活性中的应用，属于小麦副产品精深加工技术领域。本发明以麦胚为原料，经粉碎、脱脂、细粉碎、超声强化酸提、盐析、热处理、超滤、亲和层析，将具有红细胞凝集活性的组分脱盐后冻干即为麦胚凝集素(WGA)。通过细胞培养试验确定WGA对大鼠乳腺癌细胞株SHZ、胰岛素依赖型人乳腺癌细胞株MCF－7的增殖均具有抑制作用。本发明工艺设计科学合理，操作简便易行，对环境无污染，为利用麦胚凝集素开发抑癌药物提供了研究基础，可提高麦胚深加工利用价值和相关产业的经济效益。
文档编号C07K1/00GK1948337SQ200610097429
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月8日 优先权日2006年11月8日
发明者单良, 姚惠源, 张晖, 陈正行 申请人:江南大学