专利名称：胸腺四肽活性异构体及制备方法以及医药用途的制作方法
技术领域：
本发明公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，同时还公开了其在制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物中的应用，属于生物制药技术领域。
背景技术：
目前的生物技术已从胸腺激素中分离、纯化了几种胸腺肽，包括含有49个氨基酸残基的胸腺生成素II、由28个氨基酸残基构成的胸腺素α1和胸腺九肽等。天然序列胸腺三肽(TP-3)、四肽(TP-4)、五肽(TP-5)是胸腺生成素II的残基片段，文献报道它们仍具有胸腺生成素的活性。
实验证明，胸腺肽在小肠可部分吸收，并能提高免疫功能。但胸腺五肽在体内易被各种酶类水解，如胰蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等，因此体内半衰期只有30秒。对于健康个体来讲，肽类激素在体内起到调节作用后迅速被清除是很正常的，但对于患者而言，需要给药治疗时，半衰期短对治疗不利。
增强肽类激素的稳定性，延长它的半衰期以提高疗效，这是肽类激素的一个普遍需要解决的问题，所以改造肽类激素的结构、增加它们在体内的稳定性、提高生物利用度是本发明要解决的问题。
发明内容
本发明公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，适用于工业化生产。
本发明还公开了上述异构体的医药用途，用于制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物。
该发明公开的胸腺四肽活性异构体包括一项或多项下列特征化合物具有氨基酸序列X-Arg-Lys-Y-Val，X为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性；Y为Asp或Glu。
胸腺四肽活性异构体，其结构为胸腺四肽氨基酸序列Arg-Lys-Asp-Val或Arg-Lys-Glu-Val中的Lys或Glu被其相应的β-或γ-氨基酸取代的氨基酸序列。
胸腺四肽活性异构体氨基酸序列表
本发明中异构体的制备方法以通常的Fmoc固相肽合成法合成。
以氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，工艺过程包括溶胀—脱保护—偶联—脱保护偶联循环—切割。所说的溶胀是将接肽树脂和DMF加入柱反应器中，室温振摇，接肽树脂溶胀后抽干，用DMF洗涤后再抽干；所说的脱保护是脱去接肽树脂上的芴甲氧羰基(Fmoc)保护基，方法是在溶胀后的接肽树脂中加入脱Fmoc保护基溶液，室温振摇，抽干后用DMF洗涤再抽干；所说的偶联是向柱反应器中加入一种氨基酸衍生物和缩合剂，再加入DMF，避光室温振摇，反应0.3-20小时，抽干后用DMF振摇洗涤再抽干；所说的脱保护偶联循环是交替重复脱保护和偶联过程，偶联重复次数由短肽的链长决定，每次偶联所加入的氨基酸衍生物原料由短肽的组成决定，脱保护的重复次数比偶联重复次数多一次；所说的切割是脱氨基酸侧链保护基及从接肽树脂上裂解肽，即向抽干后的柱反应器中加入切割试剂，在(25--20)℃振荡(1-5)小时，过滤除去接肽树脂，滤液抽真空浓缩，浓缩液加入乙醚/石油醚振荡，置于(0--20)℃放置0.2-2小时，离心，倒去上清，沉淀真空干燥，得产品。
上述工艺过程中，接肽树脂可以使用Fmoc-NH-SAL树脂、PAL树脂、Wang树脂、Fmoc-酰胺树脂。氨基酸衍生物可以是Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-β-Asp-otBu、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-γ-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH等。接肽树脂与氨基酸衍生物的摩尔比为1∶(2-5)。氨基酸偶联使用的缩合剂可以是苯并三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)，按摩尔比2∶(1-3)∶(2-6)混合制成；氨基酸衍生物与缩合剂按摩尔比为1∶(1--1.2)。切割试剂主要成分是三氟乙酸。脱Fmoc保护基溶液可以是(15-25)％的哌啶/DMF溶液；所说的用DMF振摇洗涤再抽干需要反复进行(5-8)次，每次振摇(2-6)分钟。
为了得到纯品，在切割工艺过程之后，还需进行纯化过程。所说的纯化是采用高效液相色谱层析纯化，收集主峰。A泵溶液为0.1％的三氟乙酸水溶液，B泵溶液为0.1％的三氟乙酸、(60-80)％乙腈水溶液，进行梯度洗脱——以总流速(1-5)ml/分钟，在(10-60)分钟内，A泵流速由(100--60)％改变为(50-20)％，B泵流速由(0-40)％改变为(50-80)％，同时采用双波长监测，波长为214nm和385nm。
本发明的积极效果在于对TP-4的结构进行了改造，设计了活性肽异构体，在TP-4原有结构的基础上，将其氨基酸序列中部分氨基酸用相应的β-、γ-氨基酸代替，所得改造结构后的活性肽在保持原有活性的基础上，大大提高其稳定性，延长体内半衰期，提高其生物利用度，这对肽类药物的开发将具有重要意义。
通过测定它们的活性及体内外稳定性，对它们的药理、药效进行了研究。实验结果表明这些异构体在保持了原有活性的基础上稳定性大大提高。这一发明为胸腺肽活性机理的研究及新药开发提供了理论依据。
本发明对胸腺四肽活性异构体的体外活性和和体外稳定性作了测定。
人外周血淋巴细胞和猪胸腺T淋巴细胞的表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，简称为E受体，其使T细胞可与SRBC形成玫瑰花结，这是成熟T细胞的特征之一。细胞经45℃加热1h或用胰酶处理可脱去E受体。胸腺肽可以促进脱E受体的T细胞重新合成E受体，因此可用脱E受体的E花环实验来测定胸腺肽的活性。
胸腺生成素能够增加T细胞在各种抗原或致有丝分裂原如ConA等激活后产生干扰素(IFN)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-3(IL-3)等多种淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平。淋巴细胞增殖实验是评估受检淋巴细胞功能的常用和主要指标，也是考核药物活性的有效手段。
体外血浆中稳定性的测定
将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，结果它们比正常结构半衰期均长。
实验测定结果表明胸腺四肽活性异构体体外免疫活性保持或者高于胸腺五肽(TP-5)的水平。胸腺四肽活性异构体稳定性增强，半衰期大大提高。
本发明对胸腺四肽活性异构体作了一般药理学实验，结果表明对动物神经系统、心血管系统和呼吸系统均无显著影响。
本发明还对胸腺四肽活性异构体作了药效学实验，动物实验中显示具有显著的免疫增强作用、抗肿瘤作用和抗氧化作用。其效果比胸腺五肽(TP-5)的有显著提高。
试验例1细胞增殖实验1、细胞悬液的制备昆明鼠取脾放入D-Hank’液中研磨释放T细胞，再用D-Hank’液洗涤三次，最后用IMEM培养基稀释至细胞浓度为2.5×107个/ml。
2、反应体系取细胞100μl，样品(50μg/ml)50μl加入96孔板中，二氧化碳培养箱中作用4小时，加入ConA50μl作用44小时后，体系中加入MTT20μl作用4小时，2000转/分离心5分钟。加入DMSO振摇20分钟，酶标仪570nm比色，计算刺激率。
细胞增殖实验结果
结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408对细胞增殖的影响与TP-5相当或略高于TP-5。
试验例2体外血浆中稳定性的测定为测定各异构体的体外稳定性，我们将样品在血浆中37℃进行酶解，然后用HPLC分析水解产物，并与正常结构进行比较，结果它们比正常结构半衰期均长。
方法新鲜人血浆37℃水浴活化30分钟，再加入样品，使样品的终浓度为50μg/ml，37℃水浴水解，每间隔1分钟取样品种400μl，加入醋酸400μl终止反应。样品用HPLC检测水解产物的浓度，求算出半衰期。
测定结果
结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408的体外稳定性明显好于TP-5。
试验例3免疫增强作用1、对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响将小鼠随机分为组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、模型组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组和模型组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。于实验第6天，各组小鼠尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g，于注射后2及20min分别从眼眶静脉丛取血20μl，加到2ml 0.1％Na2CO3溶液中摇匀，在680nm处测定光密度，计算吞噬指数K和吞噬活性α。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射可明显增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
2、对免疫抑制小鼠血清溶血素抗体生成的影响动物分组给药同实验1，在给药第1天，每只小鼠用5％鸡红细胞0.2ml腹腔注射进行免疫，于实验第6天，各组小鼠眼眶静脉丛取血20μl，加入1ml生理盐水中摇匀，再加入5％鸡红细胞0.5ml，在冰浴中加入0.5ml补体(1∶10新鲜豚鼠血清)，在37℃恒温水浴中温育30min，在冰浴中终止反应3min，2000rpm离心10min，取上清1ml，加入3ml都氏液，室温静置10min后，在540nm处测光密度值。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增加环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠血清溶血素抗体的生成，作用明显强于对照TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对免疫抑制小鼠血清溶血素抗体生成的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射可明显增加环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠血清溶血素抗体的生成，作用明显强于对照TP-5 20μg/kg。
3、体内对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响将小鼠随机分为组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。于实验第6天，末次给药1h后，所有小鼠脱颈椎处死。取脾按上述方法制备脾细胞，同上法培养后测定。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对小鼠脾淋巴细胞增殖具有显著促进作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
体内胸腺免疫活性肽对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响(x±s)
与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射对小鼠脾淋巴细胞增殖具有显著促进作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
试验例4抗肿瘤作用1、对荷S180肿瘤小鼠的影响将50只小鼠随机分为5组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、阳性药组、给药组。各组小鼠在无菌条件下，将S180瘤株(培养7日，1∶4稀释)接种在小鼠右侧腋下0.2ml/只。给药组按20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组腹腔注射20mg/kg 环磷酰胺，每日一次，连续6日，末次给药1h后，称各组小鼠体重，脱颈处死小鼠。取瘤称重。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对S180移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为26～48％。
胸腺活性肽对荷S180肿瘤小鼠的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射对S180移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为28～41％。
2、对荷H22肿瘤小鼠的影响实验过程同上，接种瘤株为H22瘤株。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对H22移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为29～49％。
胸腺活性肽对荷H22肿瘤小鼠的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射对H22移植性小鼠肿瘤生长有明显的抑制作用，抑制率为28～43％。
3对荷瘤小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)的影响动物分组给药同1，按文献方法[2]测定血清IL-2含量。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射可明显增加荷S180肿瘤小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)水平，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。表明胸腺活性肽具有提高荷瘤小鼠T细胞生长因子作用。
胸腺活性肽对荷S180肿瘤小鼠血清IL-2的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射可明显增加荷S180肿瘤小鼠血清白细胞介素-2(IL-2)水平，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。表明胸腺活性肽具有提高荷瘤小鼠T细胞生长因子作用。
试验例5胸腺活性肽抗氧化作用1、对小鼠脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的影响将60只小鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半。分为对照组、模型组、阳性药组、给药组。给药组20μg/kg静脉注射胸腺活性肽，对照组和模型组按10ml/kg静脉注射等体积生理盐水，阳性药组按20μg/kg静脉注射TP-5，每日一次，连续6日。末次给药1h后，模型组和给药组按10ml/kg腹腔注射0.1％CCl4豆油溶液，正常组腹腔注射同体积豆油，禁食16h后，取脑、肝和胸腺组织，按Lowry法测定蛋白质含量，按TBA法测定脂质过氧化产物-丙二醛含量。胸腺免疫活性肽20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脑、肝和胸腺脂质过氧化产物-丙二醛升高均有明显的降低作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对小鼠脂质过氧化产物-丙二醛(MDA)的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脑、肝和胸腺脂质过氧化产物-丙二醛升高均有明显的降低作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
2、胸腺活性肽对小鼠超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响取实验10.1小鼠肝组织和血清，按试剂盒方法测定SOD活性。胸腺活性肽20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脂质过氧化肝组织和血清SOD活性的降低均具有明显的增强作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
胸腺活性肽对小鼠SOD活性的影响(x±s)
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408 20μg/kg静脉注射对CCl4引起小鼠脂质过氧化肝组织和血清SOD活性的降低均具有明显的增强作用，作用明显强于对照药TP-5 20μg/kg。
试验例6玫瑰花结实验
1、T细胞的制备取新鲜猪胸腺剪碎，100目筛过滤，用D-Hank’液洗涤，滤液中加入淋巴细胞分离液，2000转离心20分钟，吸取T细胞，用D-Hank’液稀释至细胞浓度为2.5×106个/ml。
2、绵羊红细胞的制备取绵羊血1ml，用D-Hank’液洗涤三次，1500转/分离心3分钟，得到红细胞，再将其稀释至细胞浓度为2.5×107个/ml。
3、玫瑰花结的生成取T细胞200μl加入样品(50μg/ml)100μl，30℃保温1小时，再加入绵羊红细胞200μl，4℃过夜。
用反应液涂片，显微镜下计数。
结论胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408的免疫活性相当于或略高于TP-5。
具体实施例方式
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1LW401的固相合成LW401Arg-Lys-β-Asp-Val
原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-β-Asp-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，Fmoc-β-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例2LW402的固相合成LW402Arg-β-Lys-Asp-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc Asp otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，Fmoc-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例3LW403的固相合成LW403Arg-Lys-γ-Glu-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-γ-Glu-otBu、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-γ-Glu-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例4LW404的固相合成LW404Arg-γ-Lys-Asp-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-β-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Asp-otBu、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例5
LW405的固相合成LW405Arg-β-Lys-β-Asp-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-β-Lys-(Boc)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-β-Asp-otBu、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例6LW406的固相合成LW406Arg-β-Lys-γ-Glu-Val
原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-Glu-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，Fmoc-Glu-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-β-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例7LW407的固相合成LW407Arg-γ-Lys-β-Asp-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-β-Asp-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，Fmoc-β-Asp-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例8LW408的固相合成LW408Arg-γ-Lys-γ-Glu-Val 原料Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-γ-Glu-otBu、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH、偶联反应缩合剂为苯骈三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯骈三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)。脱保护剂为20％哌啶/DMF溶液。切割试剂为三氟乙酸。
反应称取Fmoc-Val-Wang树脂在DMF中室温溶胀30分钟，用DMF洗涤三次。加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，Fmoc-γ-Glu-otBu，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，加入Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护。再用DMF洗涤三次，再加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，室温反应3小时，后用DMF洗涤三次，加入20％哌啶/DMF溶液，室温反应1小时脱保护，再用DMF洗涤三次。
切割上述反应的树脂干燥后加入切割试剂为三氟乙酸，室温反应2小时，过滤，滤液在乙醚中沉淀，干燥，得到粗产品。
纯化将粗品溶于水中，用C18反相柱进行纯化，洗脱液为A相为0.1％TFA水溶液，B相为乙腈，流速为20ml/min，检测波长为214nm，收集主峰，冻干，得到纯品。
实施例9分别称取实施例1、2、3、4、5、6、7、8的方法得到胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408各100mg，溶于1000ml 0.9％氯化钠溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌制成产品。
实施例10分别称取实施例1、2、3、4、5、6、7、8的方法得到胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408各100mg，溶于1000ml水中制成水溶液，混合均匀后，分装成0.1mg/ml/支浓度的注射液于药瓶中密封，灭菌，冻干制成成品。
实施例11分别称取实施例1、2、3、4、5、6、7、8的方法得到胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408各100g，药用淀粉0.5kg，按公知的胶囊制备技术和装备制成胶囊，每粒10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下要求。
实施例12分别称取实施例1、2、3、4、5、6、7、8的方法得到胸腺活性异构体LW401、LW402、LW403、LW404、LW405、LW406、LW407、LW408各100g，微晶纤维素560g，无水乳糖380g，硬脂酸镁200g，氧化硅30g，按公知的制片技术和装备制成片剂，每片10mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下要求。
权利要求
1.一种胸腺四肽活性异构体，包括下列特征化合物具有氨基酸序列X-Arg-Lys-Y-Val，X为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性；Y为Asp或Glu；
2.权利要求所述的胸腺四肽活性异构体，其特征在于结构为胸腺四肽氨基酸序列Arg-Lys-Asp-Val或Arg-Lys-Glu-Val中的Lys或Glu被其相应的β-或γ-氨基酸取代的氨基酸序列；胸腺四肽活性异构体氨基酸序列表
3.胸腺四肽活性异构体的制备方法，包括以下步骤以氨基酸衍生物为原料，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，将接肽树脂和DMF加入柱反应器中，室温振摇，接肽树脂溶胀后抽干，用DMF洗涤后再抽干；在溶胀后的接肽树脂中加入脱Fmoc保护基溶液，室温振摇，抽干后用DMF洗涤再抽干；向柱反应器中加入一种氨基酸衍生物和缩合剂，再加入DMF，避光室温振摇，反应0.3-20小时，抽干后用DMF振摇洗涤再抽干；采用交替重复脱保护和偶联脱保护偶联循环；所说的切割是脱氨基酸侧链保护基及从接肽树脂上裂解肽，即向抽干后的柱反应器中加入切割试剂，在25～-20℃振荡1～5小时，过滤除去接肽树脂，滤液抽真空浓缩，浓缩液加入乙醚/石油醚振荡，置于0～-20℃放置0.2～2小时，离心，倒去上清，沉淀真空干燥，得本发明。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于接肽树脂选自Fmoc-NH-SAL树脂、PAL树脂、Wang树脂、Fmoc-酰胺树脂；氨基酸衍生物选自Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-β-Asp-otBu、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-γ-Glu-otBu、Fmoc-β-Lys(Boc)-OH、Fmoc-γ-Lys(Boc)-OH等；接肽树脂与氨基酸衍生物的摩尔比为1∶2～5；氨基酸偶联使用的缩合剂选自苯并三唑-1-氧-三(二甲氨基)磷六氟磷酸盐(BOP)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、N-甲基吗啉(NMM)，按摩尔比2∶1～3∶2～6混合制成；氨基酸衍生物与缩合剂按摩尔比为1∶1～1.2；切割试剂主要成分是三氟乙酸；脱Fmoc保护基溶液为15～25％的哌啶/DMF溶液。
5.胸腺四肽活性异构体在制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种胸腺四肽活性异构体及其制备方法，适用于工业化生产，化合物具有氨基酸序列X－Arg－Lys－Y－Val，X为乙酰基或氢，或任一序列与此氨基酸序列至少有70％以上同源性；Y为Asp或Glu。胸腺四肽活性异构体，其结构为胸腺四肽氨基酸序列Arg－Lys－Asp－Val或Arg－Lys－Glu－Val中的Lys或Glu被其相应的β－或γ－氨基酸取代的氨基酸序列。本发明还公开了上述异构体的医药用途，用于制备免疫调节药物、抗肿瘤药物和抗氧化药物。
文档编号C07K1/04GK1962691SQ20061013168
公开日2007年5月16日 申请日期2006年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者李惟, 王丽萍, 王丽凤, 陈晓光 申请人:吉林大学