专利名称：：一种针对人opn基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有特异性肿瘤治疗的RNA干扰片段制备方法。眾议不RNAi的高度特异性和相对宽松的设计条件，使RNAi不仅可以应用于基因功能研究，更广泛的，RNAi将被应用到基于基因组序列的核酸药物研究和药物耙标验证中。截止2000年末，共计215个基于基因水平治疗的药物在研，其中87个为基因治疗药物，62个为DNA疫苗，35个为针对RNA的反义核酸和核酶。具体数据见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>截止2000年底，基于基因组的在研药物分布表由上表可见，RNA攻击核酸制药迄今为止是以反义核酸为主，核酶技术为辅的一个领域。1997年ISIS制药公司的抗病毒反义核酸药物得到美国医药食品管理局的批准，为反义核酸药物的发展提供了先例。近年高等动物功能基因组研究正在以更快的速度为反义核酸药物的发展提供靶基因，使反义核酸药物的适用范围从癌症向传染病，心血管疾病，炎症及自身免疫等多方面扩张。2001年8月ISIS将蛋白激酶C的反义核酸药物以2亿美元的高价转让给大制药公司EliLilly,2002年4月，世界第二大反义核酸药物公司Genta将其bc1-2的反义核酸药物以4.8亿美元的高价转让给大制药公司Aventis标志了反义核酸药物的发展走向成熟并进入制药业的主流。这不仅是反义核酸的成功，而更重要的是以RNA攻击为手段的制药思路和领域的成功。与反义核酸药物相比，siRNA在体外显示了非常优越的性质。siRNA和非常好的反义核酸对基因的表达抑制都可以达到在80-90%以七，但筛选这样的siRNA要相对容易的多。而且，达到同样水平的表达抑制所需的siRNA比反义核酸浓度低10—IOO倍。不仅如此，siRNA对基因表达抑制的有效时间也比反义核酸有较大的延长(从两天延长到5-7天)。siRNA在体外显示的这些优越性质，如果能在RNA攻击制药中体现出来，将为着-领域注入强大的生命力和价值。从哲学的角度，siRNA这一有效的基因操作手段和RNA攻击这一成熟的制药领域的结合是不可避免的。siRNA—旦进入制药，首先将在病毒性传染病如HIV和癌症如白血病的治疗方面形成巨大的经济效益。中国在这两个方面有以百亿计的市场，世界在癌症和病毒性传染病的治疗方面还存在大的空白，siRNA的介入可以产生很好的社会作用。如果中国在这一领域实现突前发展，对提高中国制药业在加入WTO后的竞争力有重要意义。吉凯基因早在2002年就开始RNA干扰开发和相关技术研究，针对OPN基因制备的可以抑制肿瘤细胞生长的siRNA是长期研究的结果之一。
发明内容本发明的目的在于利用RNA干扰技术，制备一种可以用于肿瘤基因治疗的核心分子，这种核心基因治疗分子是以RNA干扰技术作为基础的。本发明的上述目的是通过下述技术方案实现的A.从genebank中调取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem软件预测有效的siRNA位点；C.合成12个针对0PN基因的siRNA;D.12个siRNA转染293T细胞；E.RT-PCR检测这些siRNA对OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western检测这些siRNA对OPN基因的蛋白表达水平的抑制作用；G.筛选mRNA水平和蛋白质水平抑制作用超过90%的siRNA。H.该siRNA是本权利要求书要求的专利材料。I.对该siRNA进行LNA化学修饰，增加其稳定性。J.将该siRNA构建入病毒载体，进行细胞学和动物水平实验研究。所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human0PN基因)，其特征在于其序列为5，GCAGCTTTACMCMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5'CCATTCTGATGAATCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3'5，GATGCCMCGATTCCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTGAMTTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5'GTTGTCCAGCMTTMTM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3'所述的siRNA结构为s画5，p,N隨剛,國國湖,國TT3，本发明的优选方案为所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human0PN基因)基于RNA干扰原理；所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human0PN基因)针对OPN基因；和传统基因抑制技术相比较，本发明具有以下有益效果使用RNA干扰技术，可以提高对目的基因的特异性，可以提高对目的基因的抑制效率，可以对目的基因的抑制效率实施不同抑制效率的选择。附闺说明图1为RNA干扰作用原理图图2为siRNA结构图图3为siRNA制备流程图具体实施方式从genbank调取目的基因信息LOCUSDEFINITIONACCESSIONVERS腦KEYWORDSSOURCEORGANISMREFERENCEAUTHORSTITLEJOURNALPUBMEDREMARKREFERENCEAUTHORSTTLEJOURNALPUBMED0005821616bpmRNAlinearPRI03-DEC-2006Homosapienssecretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivation1)(SPP1),transcriptvariant2，.NM—000582—000582.2GI:38146097Homosapiens(human)HomosapiensEukaryota:Metazoa;Chordata;Craniata;Vertebrata;Euteleostomi;Mammalia;Eutheria;Euarchontoglires;Primates;H即lorrhini;Catarrhini;Hominidae;Homo.1(bases1to1616)Kita，Y.,Natsugoe，S.，0kumura，H.,Matsumoto,M.,Uchikado，Y.,Setoyama,T.,Owaki，T.，Ishigami,S.andAikou,T.ExpressionofosteopontininoesophagealsquamouscellcarcinomaBr.J.Cancer95(5)，634-638(2006)16880782GeneRIF:TheevaluationofOsteopontinexpressionisusefulforpredictingthemalignantpropertiesofesophagealsquamouscelcarcinoma.2(bases1to1616)Cook，A丄，Chambers,A.F.，Turley,E.A.andTuck,A.B.Osteopontininductionofhyaluronansynthase2expressionpromotesbreastcancermalignancyJ.Biol.Chem.281(34),24381-24389(2006)16807238REMARKGeneRIF:.OPN-transfectedcellsexpresshighlevelsofhyaluronansynthase2,whichisassociatedwithincreasedHAproductionandmatrixretentionandisnecessaryfortumorcelladhesiontobonemarrowendothelialcellsandanchorage-independentgrowthREFERENCE3(bases1to1616)AUTHORSSeth,D.,Gorrell，M.D.,Cordoba,S.,McCaughan，G.W.andHaber，P-S.TITLEIntrahepaticgeneexpressioninhumanalcoholichepatitisJOURNALJ.H印atol.45(2),306-320(2006)PUBMED16797773REMARKGeneRIF:Real-timeRT-PCRconfirmedup-regulationofIL-8,osteopontin,andTNFRSF14anddown-regulationofSAMeSandCD209inAH,REFERENCE4(bases1to1616)AUTHORSMaeno,Y.,Nakazawa，S.,Daole,D.,VanTuan，N.，Giang,N.D.，VanHanh,T.andTaniguchi，K.TITLEOsteopontinisinvolvedinThl-mediatedimmunityagainstPlasmodiumfalciparuminfectioninaholoendemicmalariaregioninVietnamJOURNALActaTrop.98(3)，305-310(2006)PUBMED16765311REMARKGeneRIF:resultssuggestthatOPNmightsuppressmultiplicationofPlasmodiumfalciparumthroughThelper1cells-mediatedimmuner6spons6sREFERENCE5(bases1to1616)AUTHORSNakamura,H.，Honda，H.,Inada，Y.，Kato,N.,Kato，K.，Kitazawa，LandSugisaki,T.TITLEOsteopontinexpressioninvascularsmoothrausclecellsinpatientswithend-stagerenaldiseaseJOURNALTherApherDial10(3),273-277(2006)PUBMED16817793REMARKGeneRIF:hyperphosphatemiaorazotemiaisassociatedwiththeexpressionofosteopontininvascularsmoothmusclecellsinpatientswithESRDREFERENCE6(bases1to1616)AUTHORSKohri,K.,Suzuki'Y.，Yoshida，K.,Yam画to,K.，Amasaki，N.'Yamate，T.,Umekawa，T.,Iguchi，M.，Sinohara,H.andKurita,T.TITLEMolecularcloningandsequencingofcDNAencodingurinarystoneprotein,whichisidenticaltoosteopontinJOURNALBiochem.Biophys.Res.Commun.184(2)，859—864(1992)PUBMED1575754REFERENCE7(bases1to1616)AUTHORSShiraga，H.，Min,W.'VanDusen，W.丄，Clayman,M.D.,Miner,D.,Terrell,C.H.,Sherbotie，J.R.,Foreman,J.W.,Przysiecki,C.,Neiison,E.G.etal.■TITLEInhibitionofcalciumoxalatecrystalgrowthinvitrobyuropontin:anothermemberoftheasparticaci.d-richproteinsuperfamilyJOURNALPr()c.Natl.Acad.ScLU.S.A.89(1),426-430(1992)PUBMED1729712REFERENCE8(bases1to1616)AUTHORSYoung,M.F.，Kerr，J.M.,Termine，J.D.，Wewer,U.M.,Wang,M.G.，McBride，0.W.andFisher,L.W.TITLEcDNAcloning,mRNAdistributionandheterogeneity,chromosomallocation,andRFLPanalysisofhumanosteopontin(OPN)JOURNALGenomics7(4)，491-502(1990)PUBMED1974876REFERENCE9(bases1to1616)AUTHORSFisher,L.W.,McBride,0.W.，Termine,J.D.andYoung，M.F.TITLEHumanbonesialoprotein.DeducedproteinsequenceandchromosomallocalizationJOURNALJ.Biol.Chem.265(4)，2347-2351(1990)PUBMED2404984REFERENCE10(bases1to1616)AUTHORSEtheridge，L.L.TITLEInmemoriam:EllaThompsonJOURNALJPractNurs26(3)，10(1976)PUBMED1107524COMMENTVALIDATEDREFSEQ:Thisrecordhasundergonepreliminaryreviewofthesequence,buthasnotyetbeensubjecttofinalreview.ThereferencesequencewasderivedfromCB117856.1,BF699765.1，BX648003.1andAF052124.1.OnNov3,2003thissequenceversionreplacedgi:4759165.PublicationNote:ThisRefSeqrecordincludesasubsetofthepublicationsthatareavailableforthisgene.PleaseseetheEntrezGenerecordtoaccessadditionalpublications.FEATURESLocation/Qualifierssource1..1616/organism="Homosapiens*"/mol—type="mRNA〃/db—xref=〃taxon:9606w/chromosome=〃4w/map="4q21-q25〃gene1..1616/gene="SPPl〃/note=〃secretedphosphoprotein1(osteopontin,bonesialoproteinI,earlyT-lymphocyteactivationi);synonyms:OPN,BNSP，BSPI，ETA-1,MGC110940"/db—xref="GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255〃/db—xref=〃HPRD:01325"/db—xref="MW:166490"CDS166..1068/gene="SPPl〃/go—component=〃extracellularmatrix(sensuMetazoa)[pmid1107524];extracellularregion[pmid1107524];extracellularspace"/go—function=〃cytokineactivity;growthfactoractivity[pmid1107524];integrinbinding;proteinbinding"/go_process=〃anti—邻optosis;celladhesion;cell—cellsignaling[pmid1107524];cell-matrixadhesion;inductionofpositivechemotaxis[pmid1107524];leukocytechemotaxis[pmid1107524];negativeregulationofbonemineralization[pmid1729712];ossification[pmid10766759]:positiveregulationofTcellproliferation[pmid1107524];regulationofmyeloidcelldifferentiation[pmid1107524];T-helper1typeimmuneresponse[pmid1107524]"/note="isoformbisencodedbytranscriptvariant2;osteopontin;secretedphosphoprotein-1(osteopontin,bonesialoprotein);SPP1/CALPHA1fusion;osteopontin/iramunoglobulinalpha1heavychainconstantregionfusionprotei,/codon—start=l/product=wsecretedphosphoprotein1isoformb〃/protein—id="NP—000573.1〃/db—xref=〃GI:4759166〃/db—xref=〃CCDS:CCDS3626.1"/db—xref=〃GeneID:6696"/db—xref="HGNC:11255"/db_xref=〃HPRD:01325〃Mb—xref=〃MIM:166490"/translation=〃MRIAVICFCLLGITCAIPVKQADSGSSEEKQLYNKYPMVATWLNPDPS讽QNLLAPQTLPSKSNESHD刚DD船DEDDDDHVDSQDSIDSNDSDDVDDTDDSHQSDESHHSDESDELVTDFPTDLPATEVFTPVVPTVDTYDGRGDSVVYGLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHMESEELNGAYKAIPVAQDLNAPSDTOSRGKDSYETSQLDDQSAETHSHKQSRLYKRKANDESNEHSDVIDSQELSKVSREFHSHEFHSHEDMLVVDPKSKEEDKHLKFRISHELDSASSEVN"STS416..611/gene=〃SPPl〃/standard—腦e-〃PMC351321P4〃/db—xref="UniSTS:273245"STS662..1313/gene=〃SPPl〃/standard—name=〃SPPl—3239〃/db—xref=〃UniSTS:462569〃STS756..994/gene=〃SPPl"/standard—n柳e-〃SHGC—59479〃/db一xref=〃UniSTS:41951〃STSSTSSTSORIGIN6〗12〗18〗24]30〗36〗42]48]54〗60〗66〗72〗78〗8490〗96J102〗腦114〗120〗126〗132138]144]15015611156..1288/gene=〃SPPl〃/standard—name="D4S3132"/db—xref=〃UniSTS:81923"1266..1475/genesppi"/standard—nameSHGC4-1078"/db—xref=〃UniSTS:77951"1359..1485/gene=〃SPPl〃/standard—翻e:〃SHGC-36594〃/dbxref="UniSTS:4033"ctccctgtgtcagcagcagcttgcagccttEltttgCttttagttctg鄉cctgacccatgaaagccatgcaggactccatctgatgagtctgccagc朋ggtgatagtgcagtaccctgggtgcatacacgtgggaaggC3C33gC3gtgtgattgatatttcgtattttacaatttctaacatga犯ttaactaatgtaasgcttcagttaatatttgcccacttaaatgtat3tttttaagaatttgtggtggagg3agg鄉aggcCtC8gCC8朋gcctcctaggaaaagcagctctcagaagcattgactcg朋ctcaccattcccgaagtttttggtttatggaggccatcccacagttatgagtcaggaactstatgctggtCtC3tg犯ttcactttgcatgcttctttctgtttgataatggttstgtctttattctctcgttgtgstt已gtggtgtc犯tttttactgctgtctgcagcagagcscagccgccgacc肌catcacctgtttacaacaaag犯tctcctatgattgttggatcgactctgattgatgaatctcsctccagttactgaggtcEtcgaggacatccgttgcccagaacggigtcagt33gCgg333ttccaaagtctgtagacccc￡lg￡lt3gtgC3cagtttattgtagtttagttatgttcattcaacattt;tattctttttgtgttgcttatttagcatttaaa3tCgtCggg3gg朋aactcagccataccagtacccagatggccccacagagatga卿tggatgt柳tggatgaactgggtccccacaggacctgaacgctggatg獄gccaatgatgagccgtgaattcttctgaggggtaaaaatgcgttg组gtgtgtggcttcagtcactataagtgtg犯t犯gttttcccac狐记33鄉诏ttctggg鄉ccagactcgtctsccatgagttaaacaggcctgtggccaccccttccaagatg8tg3ccaacactgatgatc过ctgatttagtttcgcetgtgg,gcgacgccttctgaagagtgctgatccacagccatttatagcaiatatctatttgtggaaactccatgca朋cta犯gca^ieic犯tcttttgtttatctUtatxggttgt:ccaggcttggttgtctcaggccag幼ttgC3gtgtgattctggaatggct犯actaagtccaactgtggacagcttctcaccagtcccacggactgatggccgaacctgacatcttgggacagc^CCC3C3gCgcattccgattga3tttcm;;Hgtctgga^Ctgt犯3CUlt:cactgtattaatetcttttHttgaatgt肌针对OPN设计可能有效的siRNA靶点:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>GTCAGGMCTTTCCAMGT274542.86%GCMTGAGCATTCCGATGT271847.62%TGCTGGTTGTAGACCCCAA280847.62%CCCTTCCMGTAAGTCCM217552.38%GATTATATMGCGG嵐GC1.568833.33%TGTAGATGACACTGATGAT1.528738.腦AAGCTAATGATGAGAGCAA1.570338.應ATGATGAGAGCAATGAGCA1.570938.10%ACGACTCTGATGATGTAGA1.527442.86%ACCGMGTTTTCACTCCAG1.538442.86%AGGACAGTTATGAAACGAG1.562242.86%ATGAGCATTCCGATGTGAT1.572142.86%TTGACTCGMCGACTCTGA1.526547.62%CACTGATGATTCTCACCAG1.529647.62%CTGATGATTCTCACCAGTC1.529847.62%TTCTCACCAGTCTGATGAG1.530547.62%GTCTGATGAGTCTCACCAT1.531447.62%CATATGATGGCCGAGGTGA1.542147.62%CTCCATTGACTCGMCGAC1.526052.38%CCTGCCAGCMCCGMGTT1.537452.38%CACATGGMAGCGAGGAGT1.553152.38%GATGCTGTGGCCACATGGC1.511157.14%CAGCCAGGACTCCATTGAC1.525157.14%GACCTGACATCCAGTACCC1.548457.14%CCTGAACGCGCCTTCTGAT1.558757.14%CAGCCGTGGGAAGGACAGT1.561157.14%GCCGTGGGMGGACAGTTA1.561357.14%GCCGTGAATTCCACAGCCA1.576657.14%GATAMCACCTG織TTTC1.584033.33%GTAAGGAAGMGAT総CA1.582938.10%GGMGAAGATAAACACCTG1.583338.應TTAGATAGTGCATCTTCTG1.587338.10%TGATATCGATGATGMGAT1.521533.33%TATGGATGATGAAGATGAT1.521833.33%TTCTGATGMTCTGATGAA1.533233.33%合成12对siRNA;耙序列为5，GCAGCTTTACAACMATACCC3，5'TCTCCTTGCGCCACAGAAT3'5，GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3，5'CCATTCTGATGMTCTGAT3，5，GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCAACGATTCCTCCT3'5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3，5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3'5，Tcaggccagttgcagccttct3，5，GTTGTCCAGCMTTAATM3，5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，转染293细胞；活细胞计数用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升(一般稀释倍数为100倍)，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。细胞株的冻存取培养23天生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2X1062X107/ml。在lml细胞冻存管中加入0.5ml细胞悬液，0.4ral小牛血清和0.lml二甲基亚砜(或甘油)，混匀后密封。置4-Cl小时，一2(TC2小时，然后直接放入液氮中或置液氮蒸汽上过夜后浸入液氮中。细胞复苏从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。迅速放入盛有5(TC水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，置温箱培养。次日更换一次培养液后再继续培养。细胞传代弃去旧培养液，加入5mL灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。加入2mL胰酶消化液，消化l-2min直到细胞完全消化下来。加入含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM培养基5ml，用刻度吸管吹打数次，将瓶壁上的细胞冲洗下来。混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。装染弃去细胞液，加5mlPBS洗一次。加2ml胰酶消化1-2分钟。弃去胰酶，加3-4mlMEM(不含血清)吹打均匀。将细胞滴加于6孔培养板中(每孔2ml)，使培养24小时后，细胞融合度控制在4050%。对于6孔板的每个孔，用2ug质粒DNA与245plDMEM混合。将LipofectAMINE2000试剂轻柔摇匀，取5jxiLipofect層INE2000试剂在另一管中与245ji1DMEM混合，在室温下温育5分钟。把稀释后的shRNA与稀释后的LipofectAMINE2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。混合后，在室温下温育20分钟，以便形成shRNA与LipofectAMINE2000稀释液的转染复合物。把shRNA与LipofectAMINE2000的混合液加入培养细胞，轻柔前后推摇培养板以混匀液体。然后将培养板送入细胞培养箱。在检测RNAi效果(即检测靶基因的mRNA和蛋白质水平)之前，一般无需换培养液。但如果以上转染试剂用量时有明显细胞毒性(如黏附细胞在转染4小时后出现明显较多细胞死亡)，那么可以在转染满3小时但不满4小时，将培养板中所有培养基弃去，并加入新鲜培养基(可以使用含血清的培养基)。RT-PCR检测0PN的mRNA转录水平；RT1HiOligodT(O.5ug/ul)+2TotalRNA(lug/ul)+6PiDEPC-H20(mixwell470°C,lOmin4立即插入(TC冰水浴中4addllMlmixture4W5XRTbuffer2Wl關d證s0.5RNasin1PiMLV-RTase3.514DEPCH20I42°C，lhr470°C,lOmini0°C42ul用于PCR，其余jC:存在-20°CPCRPCR引物退火温度55°CPCR循环数目28cycles目的片断大小400bpWestern检测0PN的蛋白表达水平；1.加入适量预冷的6XLysisBuffer。2.用预冷的刮刀将细胞刮下，冰上裂解细胞10—15miri。3.超声破碎仪破碎细胞(200W共4次，每次5秒，间隔2秒)4.4。C，12000g，离心15min。5.取上清，测蛋白浓度后，调整为2Pg/W的蛋白终浓度，取20-40Pg蛋白，加入6Xloading上样缓冲液，10(TC煮5-10min。6.SDS-PAGE:根据目的蛋白大小及表达丰度，取一定量蛋台总样品进行相应分离胶浓度的SDS-PAGE。采用Bio-Rad电泳装置将总蛋白进行分离。7.电转移电泳结束后，使用转移电泳装置(Bio-Rad，Richraoad，CA)，在4°C，400mA恒流条件下电转移120分钟，将蛋白样品转移到PVDF膜上。8.封闭用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%牛奶配制成封闭液。室温封闭PVDF膜1小时或4'C过夜。9.一抗孵育用含5X牛奶的TBST分别稀释目的蛋白或者内参Actin—抗。室温下与封闭好的PVDF膜孵育2小时或4"C过夜。10.洗膜TBST洗膜3次，每次10分钟。11.二抗孵育用含5X牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗兔/小鼠二抗。于室温下孵育2小时。12.洗膜TBST洗膜3次，每次10分钟。TBS洗膜一次，10分钟。13.ECL:采用Amersh柳公司ECL+plusTMWesternblottingsystem试剂盒进行显色反应，于暗房中曝光、显影、过水、定影。X光片(柯达)晾千待分析。有效的siRNA使用LNA修饰；修饰后的siLNA转染293细胞(流程描述同前)；RT-PCR检测0PN的mRNA转录水平(流程描述同前)；Western检测OPN的蛋白表达水平(流程描述同前)；保留在mRNA水平和western水平抑制效率均达到90%的siLNA;进行动物实验。权利要求1.一种针对人OPN基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。制备方法包括如下步骤A.从genebank中调取humanOPN基因序列；B.利用GeneChem软件预测有效的siRNA位点；C.合成12个针对OPN基因的siRNA；D.12个siRNA转染293T细胞；E.RT-PCR检测这些siRNA对OPN基因的mRNA的抑制作用；F.Western检测这些siRNA对OPN基因的蛋白表达水平的抑制作用；G.筛选mRNA水平和蛋白质水平抑制作用超过90％的siRNA。H.该siRNA是本权利要求书要求的专利材料。I.对该siRNA进行LNA化学修饰，增加其稳定性。J.将该siRNA构建入病毒载体，进行细胞学和动物水平实验研究。2、根据权利要求1所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对h咖anOPN基因)，其特征在于所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对humanOPN基因)是化学合成的RNA干扰制品，针对OPN基因。3、根据权利要求1所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对humanOPN基因)，其特征在于其序列为5,GCAGCTTTACMCMATACCC3'5'TCTCCTTGCGCCACAGMT3'5'GGACAGTTATGAAACGAGT3，5'GCATTCCGATGTGATTGAT3'5，CCATTCTGATGAATCTGAT3:5'GCCTTATATCGTGATCTGC3，5，GATGCCMCGA竹CCTCCT3，5，CTCTTCGGGATTGTTTCCA3,5，ACACCTG嵐TTTCGTATT3，5，Tcaggccagttgcagccttct3，5,GTTGTCCAGCMTTMTM3,5，GCATCTTCTGAGGTCMTTA3，4、siRNA结构为,5，pNN麵ll,继國誦國TT3，5、根据权利要求1所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human0PN基因),其特征在于所述siRNA在mRNA水平的抑制效率大于90%。6、根据权利要求1所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对human0PN基因)，其特征在于所述siRNA在蛋白质水平的抑制效率大于90%。7、根据权利要求1所述的用于肿瘤基因治疗的siRNA(针对h咖anOPN基因)，其特征在于所述siRNA对肿瘤细胞的生长有明显抑制作用。全文摘要本发明公开了一种针对人OPN基因用于肿瘤基因治疗的短的干扰核糖核酸(shortinterferingRNA，siRNA)。该siRNA使用RNA干扰技术，通过利用短片断的双链RNA促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因沉默的表型，被研究人员应用到疾病治疗领域。OPN基因表达一种多功能蛋白质，参与人肿瘤发生和转移。它广泛存在于正常成人组织和体液中。我们通过实验证明，抑制OPN基因表达之后，肿瘤细胞生长受到明显抑制。文档编号C07H21/02GK101210037SQ20061014796公开日2008年7月2日申请日期2006年12月26日优先权日2006年12月26日发明者曹跃琼申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司