Cd20抗体变体及其用途的制作方法

专利名称：：Cd20抗体变体及其用途的制作方法CD20抗体变体及其用途本申请要求2005年2月7日提交的美国临时申请流水号60/651,111、2005年6月10日提交的美国临时申请流水号60/689,404和2005年7月25日提交的美国临时申请流水号60/702,571的权益，在此完整收入这些申请作为参考。发明领域本发明涉及抗CD20抗体及其它们在治疗B细胞相关疾病方面的用途。发明背景淋巴细胞是数种白细胞群之一；它们特异性识别并响应外来抗原。有三大类淋巴细胞B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)和天然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是负责生成抗体和提供体液免疫的细胞。B细胞在骨髓中成熟，然后离开骨髓并在其细胞表面表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异的抗原时，该细胞开始快速分裂，且其后代分化成记忆B细胞和称作"浆细胞"的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命，并继续表达与最初的亲代细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，改为生成分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应器分子。CD20抗原(也称为人B淋巴细胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B淋巴细胞(pre-B)和成熟B淋巴细胞上、分子量约35kD的疏水性跨膜蛋白质(Valentine&a/"J肠/.C/ze肌264(19):11282-11287(1989);Einfeld"a/.,五Affi(9J7(3):711-717(1988))。该抗原还在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达(Andersonda/.,S/ood63(6):1424-1433(1984))，但在造血干细胞、原B细胞(pro-B)、正常浆细胞或其它正常组织上没有找到(Tedder"a/.,J/mm柳o/.135(2):973-979(1985))。认为CD20调节细胞周期起始和分化的激活过程中的早期步骤(Tedder"a/.,swpra)，并可能发挥钙离子通道的功能(Tedderefa/.，JCe〃.S/oc/zem.14D:195(1990))。考虑到CD20在B细胞淋巴瘤中表达，该抗原已经成为治疗此类淋巴瘤的有用治疗靶。美国有超过300,000人患有B细胞NHL，而且每年新诊断超过56,000例。例如，作为针对人CD20抗原的遗传工程嵌合鼠/人单克隆抗体，rituximab(RJTUXAN⑧)抗体(可以从Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California,U.S.购买)用于治疗患有复发性或顽固性^^级或滤泡性CD20阳性B细胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。rituximab就是1998年4月7日公告的美国专利No.5,736,137(Andersona/.)和美国专利No.5,776,456中称为"C2B8"的抗体。作用机制的体外研究表明RITUXAN⑧结合人补体并通过补体依赖性细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系(ReffWa/.,83(2):435-445(l"4))。此外，它在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定法中具有显著活性。体内临床前研究显示RITUXAN⑧从猕猴的外周血、淋巴结和骨髓中消减B细胞，可能是通过补体和细胞介导的过程(Reffd"/.，5/ood83(2):435-445(1994))。指明用于治疗NHL的其它抗CD20抗体包括连接有放射性同位素钇-90的鼠抗体Zevalin(IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA)、偶联有1-131的另一种完全鼠的抗体Bexxar(Corixa,WA)。CD20还是治疗自身免疫病的有用靶抗原。也已在B细胞和自身抗体表现出在疾病病理生理学中发挥作用的多种非恶性自身免疫病中研究了rituximab。EdwardseZ1a/.,fi/oc/z倒.5bc.7><3肌30:824-828(2002)。rituximab据报道潜在减轻例如类风湿性关节炎(RA)(Leandroaa/.，j朋.W/zew肌ZXs.61:883-888(2002);EdwardsWa/.,^/znto脸訓.46(Suppl.9):S46(2002);Stahla/"j肌W/2e皿他62(SuppU):OP004(2003);Emerya/.,i/zew肌48(9):S439(2003》、狼疱(Eisenberg,爿W/zW"si仏77^r.5:157-159(2003);Leandroa/.，Jr^w7力Si/zewm.46:2673-2677(2002);Gormana/.,13:312-316(2004))、免疫性血小板减少性紫癥(D'ArenaW丄y—o腿44:561-562(2003);Stasi"a/.，肠oJ98:952-957(2001);Saleh"a/.,(9"co/.27(Supp.l2):99-103(2000);Zaiada/.，i/aemato/g/ca87:189-195(2002);Ratanatharathorne/a/.，j朋.TWed133:275-279(2000》、纯红细胞再生障碍(Auner"a/.,J.//aemato/.116:725-728(2002))、自身免疫性贫血(Zaja"/.,/Taewafo/og/ca87:189-195(2002),i力i吴见f/aemato/og/ca87:336(2002))、冷凝集素疾病(Layios15:187-8(2001);BerentsenWa/.，103:2925-2928(2004);BerentsenWa/"乂//aemato/.115:79-83(2001);Bauduer,//aewato/.112:1083-1090(2001》Damianiefa/"5r.7".//ae附ato/.114:229-234(2001》、重度胰岛素耐受的B型综合征(Coll&a/.,WJMed350:310-311(2004》、混合性冷球蛋白血症(DeVita"a/.，JW/zr/fei/zew附.46(Suppl.9):S206/S469(2002))、重症肌无力(Zaja"a/.，A^wrafogv55:1062-63(2000);Wylam"/尸e&a化143:674-677(2003))、韦格纳氏肉芽肿(Specks""/.,KA函&脸画"细44:2836-2840(2001))、顽固性寻常型天疱裔(Dupuye/1JrcA.Dermato/.140:91-96(2004))、il月几炎(Levine，^W/^/zfei^ewm.46(Suppl.9):S1299(2002》、斯耶格伦氏综合征(Somer"a/.,JW/zn'fe&i/7ewmatow49:394-398(2003))、活动性II型混合性冷球蛋白血症(Zaja"a/.，肠W101:3827-3834(2003))、寻常型天疱痴(Dupay""/.，i/.D簡她/.140:91-95(2004))、自身免疫性神经病(Pestronkda/"/7Vewra/.A^wmswrg.i^yc/^f^y74:485-489(2003))、瘤外视性眼阵挛-肌阵挛综合征(Pranzatelli""/.，A^wro/o^60(Suppl.l)P05.128:A395(2003))、及复发-緩和型多发性石更化(RRMS)(Crossefa/"(abstract)"PreliminaryResultsfromaphaseIItrialofrituximabinMS",美国多发性硬化研究与治疗委员会第八次年会，20-21(2003))的体征和症状。已在类风湿性关节炎(RA)患者中进行了II期临床试验，提供了有关rituximab的安全性和功效的48周5艮踪it据。Emery"a/.,JW/zr/toW/2ewm.48(9):S439(2003);Szczepanski"a/.,y^/zn'to朋函.48(9):S121(2003)。将患者随机平分为四个治疗组曱氨蝶呤、仅rituximab、rituximab加曱氨蝶呤、以及rituximab加环磷酰胺(CTX)。rituximab的治疗方案为第1天和第15天静脉内施用1克。关注用rituximab进行治疗的出版物包括PerottaandAbuel,"ResponseofchronicrelapsingITPof10yearsdurationtorituximab",Abstract#3360Blood10(1)(part1-2):p.88B(1998);Perottaetal.，"Rituxaninthetreatmentofchronicidiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP)"，Blood94:49(abstract)(1999);Matthews,R.，"MedicalHeretics",NewScientist(7April,2001);Leandroetal""Clinicaloutcomein22patientswithrheumatoidarthritistreatedwithBlymphocytedepletion",AnnRheumDis，supra;Leandroetal""Lymphocytedepletioninrheumatoidarthritis:earlyevidenceforsafety,efficacyanddoseresponse",ArthritisandRheumatism44(9):S370(2001);Leandroetal.,"AnopenstudyofBlymphocytedepletioninsystemiclupuserythematosus",ArthritisandRheumatism,46:2673-2677(2002)，其中在2周期间，每名患者接受两次500mgrituximab输注、两次750mg环石寿酰胺输注、和高剂量口服皮质类固醇，其中两名接受治疗的患者分别在第7和8个月时复发，且已经用不同方案复治；^Veideetal.，"Successfullong-termtreatmentofsystemiclupuserythematosuswithrituximabmaintenancetherapy",Lupus12:779-782(2003)，其中用rituximab治疗一名患者(375mg/m2x4,以一周为间隔)，且每5-6个月投递更多的rituximab应用，然后每三个月接受375mg/m2rituximab的维持疗法，而且用rituximab成功的治疗了患有顽固性SLE的第二名患者，且每三个月^妻受维持疗法，两名患者对rituximab疗法都有4交好的响应；EdwardsandCambridge,"SustainedimprovementinrheumatoidarthritisfollowingaprotocoldesignedtodepleteBlymphocytes",Rheumatology40:205-211(2001);Cambridgeetal.,"Blymphocytedepletioninpatientswithrheumatoidarthritis:serialstudiesofimmunologicalparameters",ArthritisRheum.46(Suppl.9):SI350(2002);Edwardsetal""B-lymphocytedepletiontherapyinrheumatoidarthritisandotherautoimmunedisorders",supra;Edwardsetal""Efficacyandsafetyofrituximab，aB-celltargetedchimericmonoclonalantibody:Arandomized,placebocontrolledtrialinpatientswithrheumatoidarthritis",ArthritisandRheumatism46(9):SI97(2002);LevineandPestronk,"IgMantibody-relatedpolyneuropathies:B-celldepletionchemotherapyusingrituximab",Neurology52:1701-1704(1999);DeVitaetal.，"EfficacyofselectiveBcellblockadeinthetreatmentofrheumatoidarthritis",Arthritis&Rheum46:2029-2033(2002);Hidashidaetal""TreatmentofDMARD-refractoryrheumatoidarthritiswithrituximab",展示于theAnnualScientificMeetingoftheAmericanCollegeofRheumatology,Oct24-29,NewOrleans,LA2002;Tuscano,J.,"Successfultreatmentofinfliximab-refractoryrheumatoidarthritiswithrituximab",展示于theAnnualScientificMeetingoftheAmericanCollegeofRheumatology,Oct24-29,NewOrleans,LA2002;MartinandChan,"PathogenicrolesofBcellsinhumanautoimmunity;insightsfromtheclinic",Immunity20:517-527(2004);SilvermanandWeisman,"RituximabTherapyandAutoimmuneDisorders,ProspectsforAnti-BCellTherapy",ArthritisandRheumatism48:1484-1492(2003》KazkazandIsenberg,"AntiBcelltherapy(rituximab)inthetreatmentofautoimmunediseases",Currentopinioninpharmacology4:398-402(2004》VirgoliniandVanda,"Rituximabinautoimmunediseases",Biomedicine&pharmacotherapy58:299-309(2004);Klemmeretal""TreatmentofantibodymediatedautoimmunedisorderswithaAntiCD20monoclonalantibodyRituximab",ArthritisAndRheumatism48:(9)9,S(SEP),page:S624-S624(2003);Kneitzetal.,"EffectiveBcelldepletionwithrituximabinthetreatmentofautoimmunediseases",Immunobiology206:519-527(2002》Arzooetal.，"Treatmentofrefractoryantibodymediatedautoimmunedisorderswithananti-CD20monoclonalantibody(rituximab)",AnnalsoftheRheumaticDiseases61(10):922-4(2002);CommentinAnnRheumDis.61:863-866(2002》LakeandDionne,"FutureStrategiesinImmunotherapy",在《Burger'sMedicinalChemistryandDrugDiscovery》中(2003byJohnWiley&Sons,Inc.),论文在线粘贴曰期2003年1月15日(Chapter2"Antibody-DirectedImmunotherapy");LiangandTedder,WileyEncyclopediaofMolecularMedicine,Section:CD20asanImmunotherapyTarget,论文在线粘贴日期15January,2002题为"CD20，，;Stockingeretal.，附录4A题为"MonoclonalAntibodiestoHumanCellSurfaceAntigens",Coliganetal.编,在《CurrentProtocolsinImmunology》中(2003JohnWiley&Sons,Inc),在线粘贴日期2003年5月；印刷出版日期2003年2月；PenichetandMorrison,"CDAntibodies/molecules:Definition;AntibodyEngineering",在《WileyEncyclopediaofMolecularMedicineSection:Chimeric:HumanizedandHumanAntibodies》中，在线粘贴日期2002年1月15日；Specksetal""ResponseofWegener'sgranulomatosistoanti-CD20chimericmonoclonalantibodytherapy",Arthritis&Rheumatism44:2836-2840(2001);在线才商要才是交和邀^貪,Koeghetal.,"RituximabforRemissionInductioninSevereANCA-AssociatedVasculitis:ReportofaProspectiveOpen-LabelPilotTrialin10Patients",AmericanCollegeofRheumatology,SessionNumber:28-100,SessionTitle:Vasculitis,SessionType:ACRConcurrentSession,PrimaryCategory:28Vasculitis,Session10/18/2004Eriksson."Short-termoutcomeandsafetyin5patientswithANCA-positivevasculitistreatedwithrituximab",KidneyandBloodPressureResearch26:294(2003);Jayneetal.,"B-celldepletionwithrituximabforrefractoryvasculitis",KidneyandBloodPressureResearch26:294(2003);Jayne,;每净艮88(11thInternationalVasculitisandANCAworkshop),2003AmericanSocietyofNephrology;StoneandSpecks,"RituximabTherapyfortheInductionofRemissionandToleranceinANCA-associatedVasculitis",在《theClinicalTrialResearchSummaryofthe2002-2003ImmuneToleranceNetwork》中，http:〃www.immunetolerance.org/research/autoimmune/trials/stone.html。还可参见Leandroetal.,"BcellrepopulationoccursmainlyfromnaiveBcellsinpatientwithrheumatoidarthritisandsystemiclupuserythematosus",ArthritisRheum.48(Suppl9):SI160(2003)。在人的治疗中使用鼠抗体的一项主要限制在于人抗小鼠抗体(HAMA)应答(参见例力口Miller,R.A.a/.,"MonoclonalantibodytherapeutictrialsinsevenpatientswithT-celllymphoma",62:988-995(1983);Schroff,R.W.wa/.，"Humananti陽murineimmunoglobulinresponseinpatientsreceivingmonoclonalantibodytherapy",C""ceriey.45:879-885(1985))。即使是嵌合分子，其中啮齿类动物抗体的可变区(V)与人恒定区(C)融合，仍然能够引发显著的免疫应答(HACA，人抗嵌合抗体)(Neubergeraa/.，A^wflo"d」314:268-270(1985))。在单克隆抗体的临床使用中克服这些限制的一种有力方法是鼠抗体或非人物种抗体的"人源化"(Jones&a/.,A^/Mre(Xo"cZ.」321:522-525(1986);Riechman&a/.,A^mw(L朋^)332:323-327(1988))。此类抗体预计在施用于患者时产生最低限度的抗原性或没有抗原性，尤其是对于长期治疗。人源化抗CD20抗体已经记载于WO03/068821A2(Hansen"a/.);WO2004103404(Watkins);和WO04/056312(Adams)。人抗CD20抗体已经记载于WO2004/035607(Teeling&a/.)。提供不仅具有最低限度的抗原性而且具有改良的生物学特性和临床功效的治疗性CD20结合抗体将是有益的。本发明满足了这项需求和其它需求。本发明提供了抗CD20抗体，它们克服了当前治疗性组合物的限制以及提供了根据下文详述将显而易见的其它优点。关注CD20抗体的专利和专利出版物包括美国专利5,776，456、5,736，137、5,843,439、6,399,061和6,682,734以及美国专利申请US2002/0197255Al、US2003/0021781Al、US2003/0082172Al、US2003/0095963Al、US2003/0147885Al(Andersonetal.);美国专利6,455,043Bl和WO00/09160(Grillo-Lopez，A.);WO00/27428(Grillo-LopezandWhite);WO00/27433(Grillo-LopezandLeonard);WO00/44788(Braslawskyetal.);WO01/10462(Rastetter,W.);WO01/10461(RastetterandWhite);WO01/10460(WhiteandGrillo-Lopez);US2001/0018041Al、US2003/0180292Al、WO01/34194(HannaandHariharan);美国申请US2002/0006404和WO02/04021(HannaandHariharan);美国申请US2002/0012665Al和WO01/74388(Hanna,N.);美国申请US2002/0058029Al(Ha腿,N.);美国申请US2003/0103971Al(HariharanandHanna);美国申请US2002/0009444Al和WO01/80884(Grillo-Lopez,A.);WO01/97858(White，C.);美国申请US2002/0128488Al和WO02/34790(Reff,M.);WO02/060955(Braslawskyetal.);WO02/096948(Braslawskyetal.);WO02/079255(ReffandDavies);美国专利6,171,586Bl和WO98/56418(Lametal.);WO98/58964(Raju,S.);WO99/22764(Raju，S.);WO99/51642、美国专利6,194,551Bl、美国专利6,242,195Bl、美国专利6,528,624Bl和美国专利6,538,124(Idusogieetal.);WO00/42072(Presta,L.);WO00/67796(Curdetal.);WO01/03734(Grillo-Lopezetal.);美国申请US2002/0004587Al和WO01/77342(MillerandPresta);美国申请US2002/0197256(Grewal,I.);美国申请US2003/0157108Al(Presta，L.);美国专利6,565,827Bl、6，090，365Bl、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminskietal.);美国专利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852Bl(Robinsonetal.);美国专利6,410,391Bl(Raubitscheketal.);美国专利6,224,866Bl和WO00/20864(Barbera-Guillem,E.);WO01/13945(Barbera-Guillem，E.);WO00/67795(Goldenberg);美国申请US2003/0133930Al和WO00/74718(GoldenbergandHansen);WO00/76542(Golayetal.);WO01/72333(WolinandRosenblatt);美国专利6,368,596Bl(Ghetieetal.);美国专利6,306,393和美国申请US2002/0041847A1(Goldenberg，D.);美国申请US2003/0026801Al(WeinerandHartmann);WO02/102312(Engleman，E.);美国专利申请US2003/0068664(Albitaretal.);WO03/002607(Leung,S.);WO03/049694、US2002/0009427Al和US2003/0185796Al(Wolinetal.);WO03/061694(SingandSiegall);US2003/0219818Al(Bohenetal.);US2003/0219433Al和WO03/068821(Hansenetal.);US2002/0136719Al(Shenoyetal.);WO2004/032828(Wahletal.);WO2004/035607(Teelingetal.);US2004/0093621(Shitaraetal.)。还可参见美国专利5,849,898和欧洲申请330,191(Seedetal.);美国专利4,861,579和EP332,865A2(MeyerandWeiss);WO95/03770(Bhatetal.);US2001/0056066(Bugelskietal.);WO2004/035607(Teelingetal.);WO2004/056312(Lowmanetal.);US2004/0093621(Shitaraetal.);WO2004/103404(Watkinsetal.)。关注CD20抗体的出X反物包4舌Teeling,丄etal""CharacterizationofnewhumanCD20monoclonalantibodieswithpotentcytolyticactivityagainstnon陽Hodgkin'slymphomas",Blood,Jim2004;10.1182。发明概述本发明提供了表13和14中列出的结合人CD20并在体内消减灵长类动物B细胞的人源化2H7变体抗体。在具体的实施方案中，hu2H7抗体是型式472、473、511、523和516。在本发明的组合物、方法、制品、配制剂的优选实施方案中，所述人源化2H7抗体是hu2H7.v511或hu2H7.v114。所述抗体在体内有效消减灵长类动物B细胞，该抗体包含SEQIDNO.25的轻链可变区(VO序列和SEQIDNO.8的重链可变区(Vn)序列，但VH-CDR2中有氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代。在一个实施方案中，此抗体还包含VH-CDR3中的替代S100aR。在前述抗体的另一实施方案中，抗体还包含Fc区中至少一处改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代。为了改善ADCC和/或CDC效应器功能，在一个实施方案中，前述抗体还将包含IgGlFc且该IgGlFc包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、及K326A或K326W中任一。在一个实施方案中，前述实施方案的抗体展示出比2H7.vl6高至少20倍的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)，且展示出比2H7.vl6高至少25倍的补体依赖性细胞毒性。或者，包含替代S100aR的抗体可具有Fc中至少一处改善ADCC活性但降低CDC活性的氨基酸改变或替代。在这点上，抗体可至少包含Fc中的氨基酸替代K322A,且还可包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A。在优选的实施方案中，具有改良的ADCC和CDC活性的抗体还以相对于抗体2H7.vl6而言^是高至少3倍、优选至少6倍的亲和力结合人CD20,所述2H7.vl6具有分别为SEQIDNO.13和14的轻《连和重《连序列。NO.26的轻链序列和SEQIDNO.34的重链序列组成。本发明还提供了任何前述实施方案的抗体，它与细胞毒剂偶联。在一个实施方案中，所述细胞毒剂是放射性同位素或毒素。在一个实施方案中，本发明的抗体在CHO细胞中生成。本发明还提供了编码前述实施方案的抗体的分离核酸，包括表达载体。还提供了包含所述核酸而生成所述抗体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是生成抗体2H7.v511的细胞。提供了用于生成任何前述抗体的方法，包括培养前述宿主细胞并从细胞培养物中回收抗体。还提供了包含本发明的2H7抗体及载体的组合物。在一个实施方案中，所述载体是药剂学可接受载体。另一实施方案是包含hu2H7.v511的组合物，其中组合物中大约80-100%的抗体缺乏海藻糖。另一方面是制品，包括容器及装在该容器中的组合物，其中所述组合物包含任何前述实施方案的抗体。根据需要组合物的具体处理，所述制品还可包括指明该组合物用于治疗非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤或该组合物用于治疗类风湿性关节炎的包装插页。本发明的另一方面是使用前述实施方案的人源化2H7抗体在体内消减B细胞的方法。本发明还提供了治疗CD20阳性癌症的方法，包括对癌症患者施用治疗有效量的前述实施方案的人源化2H7抗体。所述CD20阳性癌症优选B细胞淋巴瘤或白血病。在具体的实施方案中，将结合hCD20的人源化2H7抗体及其功能性片段用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在具体的实施方案中，将人源化CD20结合抗体或其功能性片段，特别是v511和v114，用于治疗无痛(indolent)NHL，包括复发的无痛NHL和rituximab耐受(refractory)的无痛NHL。为了治疗这些癌症，在一个实施方案中，经静脉内输注施用所述抗体。经输注施用的剂量在每剂约12.5mg/m2至800mg/m2的范围内，通常每周一剂，共1、2、3或4剂。本发明还提供了减轻自身免疫病的方法，包括对自身免疫病患者施用治疗有效量的任一前述实施方案的人源化2H7抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是静脉内或皮下施用的。所述抗体静脉内施用的剂量在每剂10mg至500mg的范围内，在具体的实施方案中，剂量是100mg/剂。在具体的实施方案中，所述自身免疫病选自类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳(Wegener)氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关性血管炎、糖尿病、雷诺(Reynaud)氏综合征、斯耶格伦(Sjogren)氏综合征、视神经脊髓炎(NeuromyelitisOptica,NMO)和肾小球肾炎。hu2H7.v511和hu2H7.v114抗体可用于治疗或减轻自身免疫病或B细胞肿瘤的方法，其中所述抗体与第二种治疗剂以同时、序贯施用或在交替方案中联用。在一个实施方案中，所述第二种治疗剂是BAFF拮抗剂。在某些实施方案中，所述BAFF拮抗剂是结合人BR3的抗体或BR3-Fc融合蛋白。在治疗前述疾病的方法的一个优选实施方案中，受试者或患者是灵长类动物，优选人。还提供了液体配制剂，其在20mM乙酸钠，4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20,pH5.5中含有约20mg/ml人源化2H7.v511抗体，供静脉内施用。还提供了液体配制剂，其在20mM乙酸钠，240mM(8%)二水合海藻糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH5.3中含有约20mg/ml人源化2H7.vl14抗体。可用于2H7.vl6的另一液体配制剂是在20mM乙酸钠pH5.3,f/o二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20(Tween20顶)中含有约30mg/ml抗体。附图简述图1A显示了比较鼠2H7(SEQIDNO.1)、人源化2H7.vl6变体(SEQIDNO.2)和人k轻链亚类I(SEQIDNO.3)各自轻链可变区(VO氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下.'CDRl(SEQIDNO.4)、CDR2(SEQIDNO.5)和CDR3(SEQIDNO,6)。图IB显示了比较鼠2H7(SEQIDNO.7)、人源化2H7.vl6变体(SEQIDNO.8)和人重链亚类III共有序列(SEQIDNO.9)各自重链可变区(VH)氨基酸序列的序列比对。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDRl(SEQIDNO.10)、CDR2(SEQIDNO.ll)和CDR3(SEQIDNO.12)。在图IA和图IB中，如图所示，每条链中的CDR1、CDR2和CDR3围在括号中，侧翼是框架区FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗体。两行序列之间的星号指明两种序列间不同的位置。残基编号依照KabatWa/.,o/7mw丽o/og/ca//"temst,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),插入显示为a、b、c、d和e。图2A显示了比4支人源化2H7.vl6和v511轻链的蛋白质序列比对。图2B显示了比较人源化2H7.vl6和v511重链的蛋白质序列比对。图3显示了在溶解的CD20ELISA中2H7变体的相对结合。对抗体2H7.vl6(圓圏)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)进行了比较(见实施例12)。图4显示了使用WIL2-S细胞和纯化的人NK细胞测定的ADCC活性。对抗体2H7.vl6(圓圈)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)比较了它们在体外介导ADCC的能力(见实施例13)。图5显示了使用WIL2-S细胞和人补体测定的CDC活性。对抗体2H7.v16(圓圈)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)比较了它们在体外介导CDC的能力(见实施例14)。图6显示了注射抗体后的第2天2H7变体v16和v511在体内对血液(左图)和腹膜腔(右图)中B细胞的消减(见实施例15)。图7显示了注射抗体后两天2H7变体v16和v511对脾脏中B细胞的消减脾B细胞(左图)、边缘区B细胞(中图)和滤泡B细胞(右图)(见实施例15)。图8比较了在表达人CD20和人CD16的hCD20Tg+/+/mCD16-/-/hCD16Tg+A转基因小鼠中2H7.vl6和v511的体内B细胞消减(见实施例15)。图9显示了用于在CHO细胞中表达2H7.v16的载体。图10显示了用WIL2-S细胞测定的2H7.v511与其它2H7变体vl6、v31、v114、v138和v488的CDC活性的比较(见实施例14)。图11比较了用WIL2-S细胞和纯化的人NK细胞测定的抗体变体2H7.v511、v16、v31、v114、v138和v488的ADCC活性(见实施例13和图4)。图12概括了在表达人CD20和人CD16的hCD20Tg+/+/mCD16-/-/hCD16Tg+A转基因小鼠中2H7.v511和rituximab(Rituxan⑧)的体内B细胞消减分析，两种抗体的活性总结于表中(见实施例15)。图13显示了注射后第2天2H7.v511和rituximab在体内对血液(左图)和腹膜腔(右图)中B细胞的消减(见实施例15)。图14显示了注射抗体后第2天2H7.v511和rituximab对脾脏中B细胞的消减脾B细胞(左图)、边缘区B细胞(中图)和滤泡B细胞(右图)(见实施例15)。图15A、15B和15C显示了纯化自3名CLL患者的PBMC的体夕卜CDC活性比较，其中所述PBMC用2H7.vl14或RituxanTM，及人血清补体处理。图16A、16B和16C显示了来自3名CLL患者(患者与图15中的相同)的PBMC的体夕卜CDC活性比專交，其中所述PBMC用2H7.v511或RituxanTM，及人血清补体处理。优选实施方案的详述"CD20"抗原是在超过90。/。来自外周血或淋巴样器官的B细胞表面上找到的、分子量约35kD的非糖基化跨膜磷蛋白。CD20在早期前B(pre-B)细胞发育过程中表达，并保留至浆细胞分化；它在人干细胞、淋巴样祖细胞或正常浆细胞上找不到。CD20存在于正常B细胞以及恶性B细胞二者上。CD20在文献中的其它名称包括"B淋巴细胞限制分化抗原"和"Bp35"。CD20抗原记载于例如ClarkandLedbetter,爿心.C朋.52:81-149(1989)和ValentineJ肠/.C7z亂264(19):11282-11287(1989)。术语"抗体"以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性或功能。本发明的人源化CD20结合抗体的生物学活性将至少包括抗体与人CD20的结合，更优选与人和其它灵长类动物(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)CD20的结合。所述抗体将以不高于1x10—8的Kd值，优选不高于约1x10—9的Kd值结合CD20,并且能够在体内杀死或消减B细胞，优选与未用所述抗体处理的适宜阴性对照相比杀死或消减至少20%。B细胞消减可以是ADCC、CDC、凋亡或其它才几制中的一种或多种造成的。在本文疾病治疗的有些实施方案中，可能期望特定的效应器功能或机制甚于其它的，而且优选人源化2H7的某些变体以实现那些生物学功能，诸如ADCC。"抗体片段"包含全长抗体的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。"Fv"是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠结构中散发出六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出结合抗原的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区结构域(或是只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体通常以极小量存在。此类单克隆抗体通常包括这样的抗体，它包含结合靶物的多肽序列，其中靶物结合多肽序列是通过包括如下步骤的过程获得的，即从众多多肽序列中选择单一的靶物结合多肽序列。例如，所述选择过程可以是从众多克隆，诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应当理解，选定的靶物结合序列可进一步更改，例如为了提高对靶物的亲和力，为了人源化靶物结合序列，为了提高其在细胞培养物中的产量，为了降低其在体内的免疫原性，为了产生多特异性抗体，等等，而且包含更改的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体制备物的优势还在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语"单克隆"指明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括例如杂交瘤方法(例如Kohlerefa/"7Va&re256:495(1975);Harlowa/.,JwriZ)o&M.'^丄a6oratorjvMw認/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1988;Hammerlinga/.,in:Momc/owa/爿w"70(i/es7^Ce〃场Zn,(iomas1563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA方法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如ClacksonWa/.，TVa^re352:624-628(1991);Marks"a/.，/Mo/.说o/.222:581-597(1991);Sidhu&a/.，乂Mo/.338(2):299-310(2004);Lee""/，乂M/.肠/.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,户亂淑/.爿caJ.101(34):12467-12472(2004);Lee"a/.，J/mmwwo/.7WeAoA所述动物具有部分或全部的人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因(参见例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits&a/.，尸rac.A/aA爿cadSc/.90:2551(1993);Jakobovitsa/.,A^wre362:255-258(1993);Bruggemann&a/.,lfear/mmw"o.7:33(993);美国专利No.5,545,806;5,569,825;5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807;WO1997/17852;美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marksez1"/.,肠/Tec/7"0/0gy10:779-783(1992);Lonberg"a/.,A^,e368:856-859(1994);Morrison,M似368:812-813(1994);Fishwild&a/.,7Va化refi/0&c/2"0fogy14:845-851(1996);Neuberger,A^wreS/otec/zwo/ogy14:826(1996);及LonbergandHuszar,i6v./mm丽o/.13^5-93(1995)。本发明的CD20结合抗体的"功能性片段"是那些保持与衍生它们的完整全长分子以基本上相同的亲和力结合CD20并且根据体外或体内测定法诸如本文所述的那些测定法的测量显示出包括消减B细胞在内的生物学活性的片段。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变区结构域3争越的110个氨基酸。事实上，V区由15-30个氨基酸，称作框架区(FR)的相对不变异的区段及将框架区分开的每个长度为9-12个氨基酸，称作"高变区"的极度变异的较短区域构成。天然重链和轻链的可变区结构域各自包含四个FR,它们大多采取(3-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成(3-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,1991)。恒定区不直4妄参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。术语"高变区"在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中的残基31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5片反,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD，1991)和/或那些来自"高变环"的残基(例如Vl中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的残基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk,/Afo/.肌o/.196:卯1-917(1987))。在本文中提及时，"共有序列"或共有V结构域序列是衍生自已知人免疫球蛋白可变区序列氨基酸序列比较的人工序列。基于这些比较，制备编码V结构域氨基酸序列的重组核酸序列，所述V结构域氨基酸序列是衍生自人K链和人H链亚类inv结构域的共有序列。共有v序列不具有任何已知的抗体结合特异性或亲和力。"嵌合"抗体(免疫球蛋白)中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利第4,816,567号；Morrison"a/.,Ato/.Jcad5W."&481:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个子集。非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能诸如结合亲和力。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR，尽管FR可包含一处或多处改善结合亲和力的氨基酸替代。FR中这些氨基酸替代的数目通常在重链中不超过6处，在轻链中不超过3处。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones"a/.，Atowre321:522-525(1986);Riechmann"a/.,A^wre332:323-329(1988);Presta，6>/.脂.2:593-596(1992)。抗体"效应器功能"指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"或"ADCC"指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的耙细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。所述抗体"武装"(arm)纟田胞毒性细胞，而且是此类杀伤作用绝对要求的。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRin,而单核细胞表达FcyRI、Fq/RII和FcyRIII。RavetchandKinet,ylmw.細./画画/.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体夕卜ADCC测定法，诸如美国专利第5,500,362或5,821,337号或Presta美国专利第6，737，056号中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物才莫型中，诸如ClynesWa/.,iWJ5195:652-656(1998)中所披露的。若抗体是CD20结合抗体，则ADCC活性可如下所述在表达人CD20力口CD16的转基因小鼠(hCD20+/hCD16+Tg小鼠)中测试。"人效应纟田月包"指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白纟田月包。优选的是，该细胞至少表达FcYRHI并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。"Fc受体"或"FcR"描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括FcyRI、FcyRII和FcyRHI亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基S臾序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcyRIlA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FqRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Dagron,Jwm/.Aev./mmwwo/.15:203-234(1997))。FcR的综述参见RavetchandKinet,Jmw.Wev.7mmwwo/.9:457-492(1991);Capel&a/.,Immunomethods4:25-34(1994);deHaasefa/.,J.丄a6.C7/w.她t/.126:330-41(1995)。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyere/a/.，/附mw"o/.117:587(1976)和Kimefa/.,,/附m冊o/.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的动态平衡。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。在此明确收入该专利申请的内容作为参考。还可参阅Shieldsetal.，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。关于对FcRn的结合亲和力，在一个实施方案中，抗体的EC50或表观Kd(在pH6.0)是<=100nM,更优选<=10nM。至于对FcyRIII(F158;即低亲和力同种型)提高的结合亲和力，在一个实施方案中，EC50或表观Kd<=10nM,而对于FcyRin(V158;高亲和力)，EC50或表观Kd<=3nM。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参阅例如Ghetie1997,Hinton2004)以及下文所述。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体还包含IgGFc中的氨基酸更改并展示出对人FcRn提高的结合亲和力，比具有野生型IgGFc的抗体高至少60倍，至少70倍，至少80倍，更优选至少100倍，优选至少125倍，甚至更优选至少150倍至约170倍。"补体依赖性细胞毒性"或"CDC"指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如》口Gazzano-Santoroef/mmwwo/.202:163(1996)中戶斤i己载的。具有更改的Fc区氨基酸序列及提高或降低的Clq结合能力的多肽变体记载于美国专利第6,194,551Bl和WO99/51642中。在此明确收入那些专利出版物的内容作为参考。还可参阅Idusogieetal.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。纵观本说明书和权利要求书，除非另有说明，免疫球蛋白重链恒定区的残基编号方式是依照Kabatea/,,。/Pr她/m17m附w"o/。g/ca//"femst,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU索引的编号方式，在此明确收入作为参考。"依照Kabat的EU索引"指人IgGlEU抗体的残基编号方式。V区的残基依照Kabat编号方式编号，除非明确指明顺序或其它编号系统。CD20抗体的例子包括"C2B8"，现在称作"rituximab"("RITUXAN")(美国专利5,736,137);钇[90]标记的2B8鼠抗体，称作"Y2B8"或"IbritumomabTiuxetan，，(ZEVALIN),可从IDECPharmaceuticals公司购买(美国专利5,736,137;2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，编号HB11388);鼠IgG2a"B1",也称作"Tositumomab"，任选用1311标记以产生"1311-81"或"碘131tositumomab，，抗体(BEXXARtm，可从GlaxoSmithKline购买，还可参见美国专利5,595,721);鼠单克隆抗体"1F5"(Pressetal.,Blood,69(2):584-591(1987))及其变体，包括"框架修补"或人源化1F5(WO2003/002607,Leung,S.;ATCC保藏物HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗体(美国专利5,677，180);人源化2H7(WO2004/056312(Lowmanetal.)及下文所列)；HUMAX-CD20完全人的^t体(Genmab，丹麦；参见例^口GlennieandvandeWinkel,DrugDiscoveryToday8:503-510(2003);Craggetal.，Blood101:1045-1052(2003));WO04/035607(Teeling等人)中所列的人单克隆抗体；US2004/0093621(Shitaraetal.)中所述Fc区结合有复杂N-糖苷连接的糖链的抗体；诸如AME系列抗体的CD20结合分子，例如WO2004/103404中所列AME-133tm抗体(Watkinsetal.，AppliedMolecularEvolution);A20抗体或其变体，诸如嵌合的或人源化的A20抗体(分别是cA20,IMMU-106a.k.a.hA20)(US2003/0219433，US2005/0025764;Immunomedics);及单克隆抗体L27、G28-2、93-lB3、B-C1或而-B2，可从国际白细胞分类研究组(InternationalLeukocyteTypingWorkshop)获得(Valentine等人，《LeukocyteTypingIII》，McMichael编，p.440,OxfordUniversityPress,1987)。本文中优选的CD20抗体是人源化的、嵌合的、或人的CD20抗体，更优选人源化2H7抗体、rituximab、嵌合的或人源化的A20抗体(Immunomedics)、和HUMAX-CD20人CD20抗体(Genmab)。在用于本文时，"B细胞消减"指药物或抗体治疗后，与治疗前的水平相比，动物或人体中B细胞水平降低。B细胞水平可使用众所周知的测定法来测量，诸如通过获得全血细胞计数、通过对已知B细胞标志进行染色的FACS分析、及通过诸如实验性实施例中描述的方法。B细胞消减可以是部分的完全的。在一个实施方案中，表达CD20的B细胞的消减是至少25。/。。在接受B细胞消减剂的患者中，B细胞消减的持续时间通常是药物在患者体内的循环时间及B细胞恢复的时间。"月中瘤坏死因子a(TNFa)"指包含如Pennicaetal"Nature312:721(1984)或Aggarwaletal.,JBC260:2345(1985)中所述氨基酸序列的人TNFa分子。"TNFa抑制剂"在本文中是一定程度抑制TNFa的生物学功能的物质，通常通过结合TNFa并中和其活性。本文中具体考虑的TNP抑制剂的例子是Etanercept(依那西普，ENBREL)、Infliximab(英夫利昔单抗，REMICADE)和Adalimumab(阿达木单抗，HUMIRATM)。表述"对TNFa抑制剂响应不当"指因为毒性和/或功效不足而对先前或当前的TNFa抑制剂治疗响应不当。不当响应可由对治疗所讨"i仑疾病熟悉的临床医师来评估。发生"功效不足"的哺乳动物在先前或当前的TNFa抑制剂治疗后病情继续保持活跃状态。例如，患者可能在用TNFa抑制剂治疗3个月后仍具有活跃的疾病活动。术语"BAFF，、"BAFF多肽"、"TALL-l"或"TALL-1多肽"、"BLys"、"THANK"在用于本文时涵盖"天然序列BAFF多肽"和"BAFF变体"。"BAFF，是给予下文所示任一氨基酸序列所编码的那些多肽人BAFF序列(SEQIDNO:46)1mddstereqsrltsclkkreemkJkecvsilprkespsvrsskdgkl〗aatlllallscc61Uvvsfyqvaalqgdlaslraelqghhaeklpagagapkagleeapavtaglkifeppap121gegnssqnsTnkravqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsalee181icenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkicvhvfgdelsivtifrciqnmpetl241pnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkll(还可参阅US2005/0095243Al中图3的序列)及其同源物和片段和变体的名称，所述同源物和片段和变体具有天然序列BAFF的生物学活性。BAFF的生物学活性可选自促进B细胞存活，促进B细胞成熟和结合BR3。术语"BAFF，包括下列文献中所记载的那些多肽Shuetal"J.LeukocyteBiol.65:680(1999);GenBank登记号AF136293;WO98/18921,公开于1998年5月7日；EP869,180,公开于1998年10月7日；WO98/27114，公开于1998年6月25日；WO99/12964,公开于1999年3月18日;WO99/33980，公开于1999年7月8日；Mooreetal"Science285:260-263(1999);Schneideretal.,J.Exp.Med.189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayetal"J.Biol.Chem.274:15978-15981(1999)。术语"BAFF拮抗剂，，在用于本文时以最广义使用，包括(l)结合天然序列BAFF多肽或结合天然序列BR3多肽以部分或完全阻断BR3与BAFF多肽相互作用，及(2)部分或完全阻断、抑制或中和天然序列BAFF信号传导的任何分子。天然序列BAFF多肽信号传导促进B细胞存活和B细胞成熟等。BAFF信号传导的抑制、阻断或中和导致B细胞数目减少等。依照本发明的BAFF拮抗剂将在体外或在体内部分或完全阻断、抑制或中和BAFF多肽的一种或多种生物学活性。在一个实施方案中，生物学活性BAFF在体外或在体内加强以下任一事件或其组合B细胞存活提高，IgG和/或IgM水平提高，浆细胞数目增力口，及脾B细月包中NF-Kb2/100加工成p52NF-Kb(例如Batten,M.etal"(2000)J.Exp.Med.192:1453-1465;Mooreetal"(1999)Science285:260-263;Kayagakietal.，(2002)10:515-524)。术语"BR3"、"BR3多肽"或"BR3受体"在用于本文时涵盖"天然序列BR3多肽"和"BR3变体"(在本文中对其有进一步限定)。"BR3"是给予包含如下任一氨基酸序列的多肽及其同源物的名称。(a)人BR3序列(SEQIDNO:47)1MRRGPRSIjRGRDAPAPTPCVPAECFDliVRHCVACGLIjRTprpkpagasspaprtalqpq61ESVGAGAGEAALPLPGIiFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGD121KDAPEPIiDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATEUGSTELVTTKTAG181PEQQ(b)可变的人BR3序列(SEQIDNO:48)1MRRGPRSIjRGRDAPAPTPCVPAECFDLiVRHCVACGIjIjRTPRPKPAGAASSPAPRT虹QP61QESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDG121DKDAPEPLDKviilspgisdATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTA181GPEQQ在有些实施方案中，依照本发明的BAFF拮抗剂包括抗BAFF抗体、BAFF结合多肽(包括免疫粘附素和肽)、及结合BAFF的小分子。BAFF拮抗剂包括WO02/02641中所记载的BAFF结合抗体(例如包含表1中SEQIDNO.1-46、321-329、834-872、1563-1595、1881-1905任何氨基酸序列的抗体)。在另一实施方案中，免疫粘附素包含BAFF受体的BAFF结合区(例如BR3、BCMA或TACI的胞外结构域)。在又一实施方案中，所述免疫粘附素是BR3-Fc。结合BAFF的Fc蛋白质的其它例子可参阅WO02/66516、WO00/40716、WO01/87979、WO03/024991、WO02/16412、WO02/38766、WO02/092620、WO01/12812。制备BAFF拮抗剂的方法加载于US2005/0095243Al,同上和US2005/0163775。"分离的"抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%,最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。"分离的"核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。表述"控制序列"指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连才妻"的。例i口，若前序歹寸(presequence)或分)必前导(secretoryleader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein),则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，"可操作连接，，意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。"载体"包括穿梭载体和表达载体。典型的是，质粒构建物还将包含复制起点(例如ColEl复制起点)和选择标志(例如氨千青霉素或四环素抗性)，分别用于质粒在细菌中的复制和选择。"表达载体"指包含在细菌或真核细胞中表达抗体包括本发明的抗体片段所必需的控制序列或调控元件的载体。下文公开了合适的载体。生成人源化CD20结合抗体诸如本发明的人源化2H7抗体的细胞将包括其中已导入了编码所述抗体的核酸的细菌和真核宿主细胞。下文公开了合适的宿主细胞。术语"标记物"在用于本文时指与抗体直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是通过自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。本发明的组合物和方法本发明提供了人源化2H7抗体，它们是2H7.v16的变体。在一个具体的实施方案中，所述变体是hu2H7.v511。在全长抗体中，本发明的人源化CD20结合抗体将包含相连的人源化的V结构域和人免疫球蛋白的C结构域。在一个优选的实施方案中，H链C区来自人IgG,优选IgGl或IgG3。L链C结构域优选来自人K链。为了本文的目的，"人源化2H7"指如下完整抗体或抗体片段，其包含轻链可变区(V。序列KVEIKR(SEQIDNO:2);和重链可变区(VH)序列RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:8)。若人源化2H7抗体是完整抗体，优选的是，它包含v16轻链氨基酸序列:KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:13);和重链氨基酸序列SLSLSPGK(SEQIDNO:14)。前述人源化2H7mAb的一种变体是2H7.v31，它具有与上文SEQIDNO:13相同的L链序列及H链氨基酸序列SLSLSPGK(SEQIDNO:15)。另一种变体是2H7.v138,它具有SEQIDNO.26的重链氨基酸序列。前述人源化2H7抗体的另一种变体是这样一种抗体，它包含2H7.v511的SEQIDNO.25的VL和SEQIDNO.33的VH(见表2)。hu2H7.v511是全长IgGl。在一个实施方案中，该抗体包含2H7.v511轻链(SEQIDNO.26):PVTKSFNRGEC;和2H7.v511重寺连(SEQIDNO.34):LSLSPGK。基于v16的所有其它变体的可变区将具有v16的氨基S臾序列，除了下文表1所示氨基酸替代的位置。除非另有说明，2H7变体将具有与vl6相同的L链。人源化抗体2H7.vl6也称为rhuMAb2H7、PRO70769或Ocrelizumab。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表22H7型式VLSEQIDNO.vHSEQIDNO.完整轻链SEQIDNO.完整重链SEQIDNO.<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>歹戋基纟扁号方式依月褒Kabat"/.,Se《we"cey/附ww"o/。g/c"//"tereW，第片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md,(1991)，#i入以a、b、c、d和e表示，缺口在序列图中以破折号表示。在包含Fc区的CD20结合抗体中，Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可去除，例如，在抗体纯化期间或通过重组工程改造编码抗体多肽的核酸。因此，本发明的人源化2H7抗体组合物可包含具有K447的抗体、去除了所有K447的抗体、或者具有和不具有K447残基的抗体的混合物。IgG中的N-糖基化位点位于CH2结构域中的Asn297。本发明的人源化2H7抗体组合物包括具有Fc区的任何前述人源化2H7抗体的组合物，其中组合物中大约80-100%(优选大约90-99%)的抗体包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，附着于糖蛋白的Fc区。此类组合物在本文中证实展现出与FcyRIIIA(F158)结合方面惊人的改善，在与人IgG相互作用方面FcyRfflA(F158)不象FcYRIIIA(V158)那样有效。在正常的、健康的非洲裔美国人和高加索人中FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbecheretal"Blood94:4220(1999)。历史上，在中国仓鼠卯巢细胞(CHO)，最常用的工业用宿主之一中生成的抗体包含大约2-6%的抗体是非岩藻糖化的。然而，YB2/0和Lecl3可生成具有78-98%非岩藻糖化类型的抗体。Shinkawa"a/.,J.所o.C7zem.278(5):3466-347(2003)!艮道了YB2/0和Lecl3细胞中所生成的具有较低FUT8活性的抗体在体外显示出显著升高的ADCC活性。岩藻糖含量降低的抗体的生成还记载于例如Li"a/.,(GlycoFi)"OptimizationofhumanizedIgGsinglycoengineeredPichiapastoris",inNatureBiologyonlinepublication22Jan.2006;NiwaR.a/.,Cawcer64(6):2127-2133(2004);US2003/0157108(Presta);US6,602,684和US2003/0175884(GlycartBiotechnology);US2004/0093621,US2004/0110704,US2004/0132140(都是KyowaHakkoKogyo的)。双特异性人源化2H7抗体涵盖这样的抗体，其中抗体的一条臂至少具有本发明人源化2H7抗体H链和/或L链的抗原结合区，而另一条臂具有针对第二抗原的V区结合特异性。在具体的实施方案中，所述第二抗原选自CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活4匕配体。在某些实施方案中，本发明的人源化2H7抗体进一步包含IgGFc中的氨基酸更改，并且展现出较之具有野生型IgGFc的抗体提高的对人FcRn的结合亲和力，纟是高至少60倍、至少70倍、至少80倍，更优选至少100倍，优选至少125倍，甚至更优选至少150倍至大约170倍。抗体生产单克隆抗体可以使用最初由Kohler"Ato^e256:495(1975)记载的杂交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来生成。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Mowoc/cwa/Jw"Z)<%/Ze5v^PnVzc^/esiV"c"ce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的选择性培养基典型的将含有次黄。票呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选择的抗体生成细胞稳定的高水平的生成抗体、且对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-ll小鼠肿瘤所衍生的及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)获得的SP-2和衍生物例如X63-Ag8-653。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也有用于生成人单克隆抗体的记载(Kozbor，/mm丽o/.133:3001(1984);Brodeura/.,Mwoc/cwa/J油7o办/Vo(iMc/7'朋Tfec/w—esflwdjp—'cfl/iom1,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆4元体的结合亲和力可通过例如MunsonWJ""/.S/oc/zew.107:220(1980)中记载的Scatchard分析来测定。一旦鉴定出生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，所述克隆就可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,M9wc/o腦"油,6o(i/w尸rz'"一/es1awJ尸raWce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠中。可通过常规抗体纯化流程，诸如例如亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)、离子交换层析、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将由亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，就可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述包4舌Skerra&a/.,Cm/t.C^/m'ow/mmwwo/.5:256-262(1993)及PlUckthun，/mm丽o/.130:151-188(1992)。在另一个实施方案中，可从使用McCafferty"a/.,A^w348:552-554(1990)中记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clacksonea/.,7Vaft^e352:624-628(1991)^Marks"a/.,Mo/,fi/o/.222:581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库进行的鼠和人抗体的分离。后续出版物记载了通过链改组生成高亲和力(nM范围)的人抗体(Marks"a/.,&'o/rec/z"o/ogv10:779-783(l"2)),以及组合感染和体内重组作为构建非常大的谨菌体文库的策略(Waterhouseda/.，21:2265-2266(1993))。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可^^^4义方法。可以修饰编码抗体的DNA以生成嵌合或融合抗体多肽，例如通过用人重^4和轻^i恒定区(CH和CO序列替代同源鼠序歹'K美国专利No.4,816,567;Morrison"a/.,尸roc.A^/.爿c"c.81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列融合。可以用非免疫球蛋白多肽序列替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。乂源化拔谬本领域已经记载了用于人源化非人抗体的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作"输入"残基，它们典型的取自"输入"可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jonesaa/.,7Va&re321:522-525(1986);Reichmanna/.,TVaZwre332:323-327(1988》Verhoeyen&a/.,5*c/ewce239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类"人源化，，抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567),其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是这样的人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代。将用于构建人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链二者，在抗体意图用于人类治疗性用途时对于降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)应答非常重要。依照所谓的"最适"(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。鉴定出与啮齿类最接近的人可变区序列并接受其中的人框架区(FR)用于人源化抗体(SimsWa/.，/扁,/.151:2296(1993);Chothia"a/.,JMo/.編.196:901(1987))。另一种区。同一才匡架可用于l欠种不同的人源4匕^t体(Carter"a/.,/Voc.iV"f/.Jcad.5W.89:4285(1992);Presta"a/.,//mwimo/.151:2623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高结合亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可得到的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。可得到图解和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选择出FR残基并组合，从而实现期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质性的涉及对抗原结合的影响。人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab,它任选与一种或多种细胞毒剂偶l关以生成免疫偶4关物。或者，人源化抗体可以是全长抗体，诸如全长IgGl抗体。乂戎谬/。^,谬j^才法夢作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成这样的转基因动物(例如小鼠)，它们在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合删除导致内源性抗体生成的完全抑制。将大量人种系免疫球蛋白基因转移到此类种系突变小鼠中将导致在抗原攻击时生成人^t体。参见侈'ji口JakobovitsW尸rac.A^/1/.爿cadSc/.OS^90:2551(1993);Jakobovits&a/.，TVa/we362:255-258(1993);Bmggemanna/"肠r/m附腦o.7:33(1993);美国专利No.5,545,806,5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807;WO97/17852。或者，噬菌体展示技术(McCaffertyWa/.，7W^w348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因得到选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson,KevinS.andChiswell,DavidJ"Cwre"/Qp/m'朋/"5^w"wra/3:564-571(1993)。V基因区,殳的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson"a/.,Atow"352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离出大量不同的抗d恶唑酮抗体。可基本上遵循Marks乂7kfo/.祝o/.222:581-597(1991)或Griffith"a/.五AffiOJ12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5，573，905。如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来书亍生这些片4殳(参见例如Morimotoefa/.，Jo^7a/o/5/oc/zem/ca/5/6//z>^/ca/A/e^zocis124:107-117(1992》Brennanefa/"5b/ewce229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片^:。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter&a/.,所o/rec/z"o/ogv10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185;美国专利No.5,571,894;及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺乏恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见^""^4五wg/ween'wg,5o;re6aec^:编,swpra。抗体片l爻还可以是"线性抗体"，例如如美国专利No.5，641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将CD20结合位点与另一种蛋白质的结合位点组合在一起。或者，可将抗CD20臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)、或IgG的Fc受体(FcyR)诸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)、或NKG2D或其它NK细胞活化配体的臂组合在一起，使得细胞防御机制聚焦和定位于CD20表达细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达CD20的细胞。这些抗体拥有CD20结合臂和结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-a、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。WO96/16673记载了一种双特异性抗ErbB2/抗FcyRIII抗体，美国专利No.5,837,234披露了一种双特异性抗ErbB2/抗FcyRI抗体。WO98/02463显示了一种双特异性抗ErbB2/Fca抗体。美国专利No.5,821,337教4受了一种双特异性抗ErbB2/CD3抗体。用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein"a/.,A^we305:537-539(1983))。由于免疫^求蛋白重《连和轻《连的随4几分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成IO种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的流程纟皮露于WO93/08829及Traunecker&a/"五MB(9J10:3655-3659(1991)。依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、Ch2和Ch3区的免疫球蛋白重链恒定区进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主细胞中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供期望双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例对期望链组合的产量没有显著影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入单一表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Sureshda/.,iWe^2otfc五"zymo/ogy121:210(1986)。依照美国专利No.5,731,168中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分Ch3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性"空腔"。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或"异源偶联"抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)。可^f吏用4壬何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan"a/.,5We"ce229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')2片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab，片段转变为硫代硝基苯曱酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalabyaa/.,JExp.Met/.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种寺支术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。KostelnyWa/.，J/mm朋o/.M8(5):l547-1553(l"2)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在4H连区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger&a/"Ato/.Jc"d6W.L/SJ90:6444-6448(1993)记载的"双抗体"技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的Vh和Vl,所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的Vh和V^结构域与另一个片段上的互补Vl和Vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gmbera/.,J./mmzmo/.152:5368(1994)。设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt&J./mm画/.147:60(1991)。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的，具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，XI和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含VH-CH1-柔性接头-VH-CH卜Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本文设想的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且任选进一步包含CL结构域。:#它疯差虔#/{/,#设想了本文所述CD20结合抗体的氨基S吏序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗CD20抗体核酸或者通过肽合成来制备抗CD20抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗CD20抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的构建物具有期望特性，可进行删除、插入和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗CD20抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。可用于鉴定抗CD20抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作"丙氨酸扫描诱变"，如CunninghamandWells,6We"ce244:1081-1085(1989)中所记载的。这里，鉴定了一个残基或一组輩巴残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与CD20抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的抗CD20抗体变体筛选期望活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰残基的抗CD20抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗CD20抗体分子的其它插入变体包括在抗CD20抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或^是高抗体血清半衰期的多肽。另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗CD20抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在下表中显示在标题"优选替代"下。如果此类替代导致生物学活性的变化，那么可以引入表中称为"例示替代"的更实质性变化，或者如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。氨基酸替代表<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威'I"生的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代将需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的。任何不牵涉保持抗CD20抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和人CD20之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删除在抗体中找到的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物才莫块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗体中添加糖基化位点是通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个上述三肽序列而便利的完成的(用于N-连接的糖基化位点)。还可通过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。编码抗CD20抗体的氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗CD20抗体进行寡核香酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而容许在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚体抗体可具有改良的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caronetal.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992).具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可如WolffWa/.,Ca"ceri^化wc/z53:2560-2565(1993)中所记载的使用异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体介导的溶解和ADCC能力。参见Stevenson&a/"勘"-C認eri>wgDe—3:219-230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中所记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语"补;故受体结合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。^它我谬渗谬本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米"交嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术纟皮露于Wem/"gto"kP/2a，acew/C(3/5We"ces,第16版，Osol,A.编,1980。谬遂的炎#可以如实验性实施例中所述选择具有某些生物学特性的抗体。例如4吏用内源性的或在用CD20基因转染后表达CD20的细胞。例如，可将肿瘤细胞系和CD20转染细胞用多种浓度的本发明抗CD20单克隆抗体处理几天(例如2-7天)，并用结晶紫或MTT染色，或者通过一些其它比色测定法进行分析。测量增殖的另一种方法将是通过比较在存在或缺乏本发明抗CD20抗体时处理的细胞的3H-胸苷摄取。抗体处理后，收获细胞并在闪烁计数器中对掺入DNA的放射性的量定量。适宜的阳性对照包括用已知抑制选定细胞系生长的生长抑制性抗体处理该细胞系。为了选择诱导细胞死亡的抗体，可相对于对照评估通过例如碘化丙啶(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取显示的膜完整性丧失。PI摄取测定法可在缺乏补体和免疫效应细胞时进行。在单独的培养基或含有浓度为例如约10lag/ml的适宜单克隆抗体的培养基中温育表达CD20的肿瘤细胞。将细胞温育3天的时限。每次处理后，将细胞清洗并等分到35mm盖有滤网(strainer-capped)的12x75管中(每管lml,每个处理组3管)以除去细胞团块。然后向管中加入PI(10ng/ml)。可以使用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件(BectonDickinson)分析样品。可以将那些根据PI摄取的测定诱导统计学显著水平的细胞死亡的抗体选作诱导细胞死亡的抗体。为了筛选结合CD20上目的抗体所结合的表位的抗体，可进行常规交叉P且断观l)定法，诸^口爿w/7'6od/es,」丄aZonator少Afa"wa/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane,1988中所记载的。此测定法可用于测定通过本领域知道的方法进行表位作图。例如，可对抗体序列进行诱变，诸如通过丙氨酸扫描，以鉴定接触残基。首先对突变型抗体测试多克隆抗体的结合以确保正确折叠。在一种不同的方法中，可将对应于CD20不同区域的肽与测试抗体或者与测试抗体及具有已表征或已知表位的抗体一起用于竟争测定法。载体、宿主细胞和重组方法本发明还提供了编码人源化2H7变体抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞、及用于生产所述抗体的重组技术。为了重组生产抗体，分离编码抗体的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。本发明的人源化2H7抗体不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列优选是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然CD20结合抗体信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、oc因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属CC因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO90/13646中记载的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱渗gD信号。将此类前体区(precursorregion)的DNA以符合读码框的方式与编码人源化2H7抗体的DNA连接。问复翔趟^沟伴表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2)1质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。&》逸脊差^沟伴表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选4奪方案。此类显性选^^的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取编码人源化2H7抗体的核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过将所有转化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一种竟争性拮抗剂的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细月包系(例如ATCCCRL-9096)。或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中的生长来选择经编码人源化2H7抗体、野生型DHFR蛋白质、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的基因(Stinchcomb&a/.,Atoww282:39(1979))。基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了选4奪标志。Jones，85:12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带丄ew2基因的已知质粒补足丄ew2缺陷型酵母菌林(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6(im环状质粒pKDl的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。VandenBerg,S/o/Tec/"o/o"8:135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌林分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer&,6/0/7fec/2"o/ogv9:968-975(1991)。"v」y^动子沟伴表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码人源化2H7抗体的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括p/za4启动子、P-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac启动子。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码CD20结合抗体的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氬酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录人源化2H7抗体受到例如从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最优选的猿猴病毒40(SV40)基因组，从异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，及此热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱渗病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人P-干扰素cDNA还可参阅Reyes"a/.,iVa似"297:598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。W增强子无伴沟伴常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明人源化2H7抗体的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参阅Yaniv,Atowe297:17-18(1982)。可以将增强子剪接到载体中，位于CD20结合抗体编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。(vi)转录终止构件用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻i,区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码CD20结合抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参阅WO94/11026及其中披露的表达载体。"谅i勿應适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属C&c/7en'c/z/a)例如大肠埃希氏菌(￡.co//)、肠杆菌属(&7&ra/7acte。、欧文氏菌属0Erw/m'a)、克雷伯氏菌属(《/efe/e〃fl)、变形菌属(尸rafew力、沙门氏菌属(/Sa/wowe〃a)i"列^口鼠4另寒沙、门氏菌(5"a/wowe〃azyp/n'mwr/ww)、沙、雷氏菌属(Serra"o)例^口粘质沙雷氏菌(》Serra"<3marcavcam)、志贺氏菌属(57z/ge〃(2)、以及芽孢杆菌属(Sa"7//)诸如枯草芽孢杆菌wto7/力和地衣芽孢杆菌(6.//c/7em/w7w》(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属CP化w^wo"a。诸如铜绿假单胞菌OPaen^/wwa)、和链霉菌属(5^印tomyce力。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌抹诸如大肠杆菌B、大肠杆菌Xl776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。可以在细菌中生产全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时，诸如在将治疗用抗体与细胞毒剂(例如毒素)偶联及免疫偶联物自身显示出破坏肿瘤细胞方面的效力时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中的生产更快速且更低廉。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如U.S.5,648,237(Carter"/)，U.S.5,789,199(JolyWa/.)和U.S.5,840,523(SimmonsWa/.)，它们记载了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，在此收入这些专利作为参考。表达后，在可溶性级分中从大肠杆菌细胞糊分离抗体，可以通过例如根据同种型选择蛋白A或G柱进行纯化。最终的纯化可以与用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的过程类似的进行。在原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是编码CD20结合抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒^唐酵母(Sacc/zaramycascemWWae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通常可获得许多其它属、种和菌抹且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(6b/n'zosacc/z(2rawyces/om6e);克鲁维酵母属(A7t/yveramyc&s)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K/ac&)、脆壁克鲁维酵母(K/rag/fo)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(AT.6w/gan'cw)(ATCC16，045)、威克克鲁维酵母(I.w/cfera脂7)(ATCC24,178)、Iw"/"/(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.t/mw/^//aram)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(IAermoto/erara)和马克思克鲁维酵母(Imarx/awM》；亚罗酵母属(r"mw/a)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/a/似ton'力(EP183,070);41丝酵母属(C朋;瑞氏木霉(7h'c/zofiferma(EP244,234);粗糙月永孑包菌(7Vewras;oracro^a);许旺酵母属(5b/2vra朋/om^yce力，诸如许旺酵母(Sc/wa朋z.o/^yces1occ/<ietoto);和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(7Vewm^ora)、青霉属(尸em'c/〃/wm)、弯颈霉属(7b/y;oc/a力^m)、和曲霉属0^perg/〃w)宿主诸如构巢曲霉(AmV/w/ara)和黑曲霉(Am'ger)。适于表达糖基化人源化2H7抗体的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊推动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒抹和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾SpoJopfera/rag^eWfl(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纟丈伊蚊/c加(蚊子)、,繁、腹果虫黾Z>aop/z//<3me/awogaster(果虫虽)禾口家蚕Bow6ja附on'等宿主。公众可获得多种病毒抹用于转染，例如苜蓿尺蠖/^tograp/2aca/z/orm'cflNPV的L-l变体和家蚕SomxNPV的Bm-5抹，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。然而，脊推动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊推动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham"a/.，36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaubwa/"户rac.胸/.固77:4216(1980))或CHO-OP-12系;小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather,所o/.W印rad23:243-251(1980》；猴肾细胞(CV1，ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mathera/.，TV.K^cad383:44-68(1982);MRC5纟田月包；FS4细胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用于生产CD20结合抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。潜^谅i勿應可以在多种培养基中培养用于生产本发明CD20结合抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏更改的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细月包的3咅养基Hama/.，Me仇五"z.58:44(1979);Barnes&a/.,所0c/2e肌102:255(1980);美国专利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、緩冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。Carter""/.,S/o/rec/z朋/ogy10:163-167(1992)记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的流程。简单的说，在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯曱基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊融化约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，优选的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯^b基于人yl、或y4重《连的^L体(Lindmarkea/.，/7mmwwo/.Me仇62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人y3(GussWa/.，五MSO/5:1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含Ch3结构域，则可使用BakerbondABXtm樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和石克酸4妄沉淀。在任何预备性纯化步骤后，包含目的抗体和污染物的混合物可进行低pH疏水相互作用层析，使用pH大约2.5-4.5之间的洗脱緩冲液，优选在低盐浓度进行(例如大约0-0.25M盐)。抗体偶联物抗体可以与细胞毒剂诸如毒素或放射性同位素偶联。在某些实施方案中，所述毒素是力口利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物石咸类(maytansinoid)、多4i司他汀(dolastatin)、auristatinE及其类似物或书亍生物。优选的药物/毒素包括DNA损伤剂、微管聚合或解聚的抑制剂、及抗代谢物。细胞毒剂的优选类别包括例如酶抑制剂诸如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合酶抑制剂、DNA嵌入剂、DNA切割剂、拓朴异构酶抑制剂、蒽环类抗生素(anthracycline)药物家族、长春类(vinca)药物、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、细胞毒性核苷、蝶啶(pteridine)药物家族、二炔类抗生素(diynenes)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和分化诱导物。那些类别特别有用的成员包括例如曱氨喋呤(methotrexate)、曱氨蝶呤(methopterin)、二氯曱氨口菜口令(dichloromethotrexate)、5-氟尿。密口定(fluorouracil)、6-3危基口票口令(mercaptopurine)、阿4唐月包苦(cytosinearabinoside)、美法仓(melphalan)、〉各"i若生(leurosine)、洛诺西丁(leurosidine)、放线菌素(actinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxombicin)、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)多柔比星、吗啉代-多柔比星、1-(2-氯乙基)-1,2-二曱基磺酰肼(l-(2-choroehthyl)-l,2-dimethanesulfonylhydrazide)、N8-乙酰基亚津青胺(N8-acetylspermidine),氨基虫莱p令(aminopterin)、曱氨虫菜卩令(methopterin)、埃斯波霉素(esperamicin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、丝裂霉素A(mitomycinA)、放线菌素(actinomycin)、博来霉素(bleomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氛基虫莱口令(aminopterin)、J也利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)及鬼臼毒素衍生物诸如依托泊苦(etoposide)或磷酸依托泊苦、长春碱(vinblastine)、长春新械(vincristine)、长春地辛(vindesine)、泰素(taxol)、泰索帝(taxotere)、一见黄酸(retinoicacid)、丁酸(butyricacid)、N8-乙酰基亚4青胺(N8-acetylspermidine)、喜杉于石咸(camptothecin)、力口利车霉素(calicheamicin)、苔藓才中素(bryostatin)、cephalostatins、安丝菌素(ansamitocin)、actosin、美登木素生物石咸类(maytansinoid)诸如DM-1、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、N-去曱基-4,5-去环氧美登醇、C-19-脱氯美登醇、C-20-羟基美登醇、C-20-脱曱氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧曱基美登醇、C-14-羟基或乙酰氧曱基美登醇、C-15-羟基/乙酰氧基美登醇、C-15-曱氧基美登醇、C-18-N-脱曱基美登醇和4,5-脱氧美登醇；auristatin,诸如auristatinE、M、PHE禾口PE;dolostatin,诸i口dolostatinA、dolostatinB、dolostatinC、dolostatinD、dolostatinE(20-表和ll-表)、dolostatinG、dolostatinH、dolostatinI、dolostatin1、dolostatin2、dolostatin3、dolostatin4、dolostatin5、dolostatin6、dolostatin7、dolostatin8、dolostatin9、dolostatin10、deo-dolostatin10、dolostatin11、dolostatin12、dolostatin13、dolostatin14、dolostatin15、dolostatin16、dolostatin17禾口dolostatin18;cephalostatin，诸^口cephalostatin1、cephalostatin2、cephalostatin3、cephalostatin4、cephalostatin5、cephalostatin6、cephalostatin7、25'-表-cephalostatin7、20-表-cephalostatin7、cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostatin11、cephalostatin12、cephalostatin13、cephalostatin14、cephalostatin15、cephalostatin16、cephalostatin17、cephalostatin18禾口cephalostatin19。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(M，fem^化rrato)分离得到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其4汙生物和类似物披露于例如美国专利No.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533,在此明确收入其公开内容作为参考。已经将美登素和美登木素生物碱类与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其治疗用途披露于例如美国专利No.5,208,020;5,416,064及欧洲专利EP0425235Bl，在此明确收入其公开内容作为参考。Liu"a/.,Prac.Ato/.Jcad5W.93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱类的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示出抗肿瘤活性。Chari&a/.,QwcerWe化arc/252:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/wew癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.l偶联的免疫偶联物。本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱类偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235Bl及ChariWa/.,Ca"ceri^earc/z52:127-131(1992)中所披露的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所4皮露的，优选二硫化物和硫醚基团。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡。定基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N—马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯曱酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson"J173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡咬基硫代)戊酸酯(8),由此提供二硫键连接。根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟曱基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的CD20结合抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都是美国Cyanamid公司的)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于Y」、a2'、a、N-乙酰基,1、PSAG和0、(Hinman&7eearc/253:3336-3342(1993);Lode"a/.，Ca"cerWe化arc/z58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA,它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。放射^/^位素为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗CD20抗体。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc"""或I123,或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、缺-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、锰或铁。可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc"m或I123、Re186、Re哪和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker""/，&oc/zem.祝o//i^.Commw",80:49-57(1978))可用于4参入石典-123。M9woc/o憩/v4w"6o(i/es1/mm朋osc/油'gra//z乂Chatal,CRCPress,1989详细记载了其它方法。可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥询酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基曱基)环己烷-l-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitettae/1a/.,Sc/e"ce238:1098(1987)中所记载的来制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸苯甲基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苦酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的"可切割接头"。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二曱基接头、或含二硫化物接头(Chariefa/.,C朋cerie化wr/52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。治疗用途本发明的人源化2H7CD20结合抗体可用于治疗许多恶性和非恶性疾病包括CD20阳性癌症诸如B细胞淋巴瘤和白血病，及自身免疫病。骨髓中的干细胞(B细胞前体)缺乏CD20抗原，使得健康B细胞能在处理后再生并在数月内回到正常水平。hu2H7.v511是将用于本文中的治疗方法的优选抗体。CD20阳性癌症指这样的癌症，其中在细胞表面上表达CD20的细胞异常增殖。CD20阳性B细胞肿瘤包括CD20阳性何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL);慢性淋巴细胞性白血病CCLL);毛细胞性白血病。术语"非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤"或"NHL"在用于本文时指何杰金氏淋巴瘤以外的淋巴系统癌症。通常可通过何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述细胞将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。非何杰金氏淋巴瘤在该术语用于本文时所涵盖的例子包括本领域技术人员(例如肺瘤学家或病理学家)依照本领域已知的分类表将鉴定为此类的任何淋巴瘤，诸如Co/orq/"C7/m'ca///ewato/ogy,第3版，VictorA.Hoffbrand和JohnE.Pettit编,HarcourtPublishersLtd.,2000中i己载的RevisedEuropean-AmericanLymphoma(REAL)scheme(欧美淋巴瘤修正表)。具体参见图11.57、11.58和11.59中的表。更具体例子包括但不限于复发性或顽固性NHL、前线(frontline)低级NHL、阶段III/IVNHL、化疗耐受性NHL、前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或前淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞性淋巴瘤、免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、边缘区B细月包淋巴瘤、月年边缘区淋巴瘤、节夕卜边缘区(extranodalmarginalzone)-MALT淋巴瘤、节边缘区(nodalmarginalzone)淋巴瘤、毛细胞性白血病、浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤、低级/滤泡淋巴瘤、中级/滤泡NHL、套细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤(滤泡的)、中级弥漫性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤、攻击性(agressive)NHL(包括攻击性前线NHL和攻击性复发性NHL)、自体干细胞移植后复发性或顽固性NHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、高级成免疫细胞NHL、高级成淋巴细胞NHL、高级小无核裂细胞NHL、贮积病(bulkydisease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前体(外周)大粒状淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿病和/或塞扎里(Sezary)综合征、皮肤淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。在具体的实施方案中，将人源化CD20结合抗体及其功能性片段用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴细胞为主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，包括这些疾患的复发。无痛淋巴瘤是一种生长緩慢的、不能治愈的疾病，其中患者在多次病情消退和复发后平均存活6至10年。在一个实施方案中，将人源化CD20结合抗体或其功能性片段用于治疗无痛NHL,包括复发性无痛NHL和Rituximab耐受性无痛NHL。复发性无痛NHL患者可以是先前接受过一个疗矛呈的Rituximab且响应6个月以上的Rituximab响应者。本发明的人源化2H7抗体或其功能性片段可作为单一药剂治疗(单一疗法)用于例如复发性或顽固性低级或滤泡性CD20阳性B细胞NHL,或者可以与其它药物联合成多药物方案施用于患者。本发明的人源化2H7抗体或其功能性片段可用作第一线疗法。本发明还设想了将这些抗体用于治疗对使用以下任一药物的治疗没有响应或响应不足或在用这些药物治疗后复发的CD20阳性B细胞肺瘤患者rituximab(Genentech);ocrelizumab(Genentech,Inc.);ibritumomabtiuxetan(Zevalin,BiogenIdee);tosit腿omab(Bexxar,GlaxoSmithKline);HuMAX-CD20TM(GenMab);IMMU-106(—种人源化抗CD20,也称作hA20或90Y-hLL2,Immunomedics);AME-133(AppliedMolecularEvolution/EliLilly);gentuzumabozogamicin(MylotargTM,—种人源^匕抗CD33抗体，Wyeth/PDL);alemtuzumab(Campath,—种抗CD52抗体，ScheringPlough/Genzyme);epratuzumab(IMMU-103TM,—种人源化抗CD22抗体，Immunomedics)。本发明进一步提供了用本发明的人源化2H7抗体治疗CLL患者的方法，所述患者包括使用氟达拉滨的疗法失败了的患者，在具体的实施方案中用2H7.v511和2H7.vl14进4亍治疗。"自身免疫病"在本文中指因个体自身组织引起的和针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或者由此产生的疾患。自身免炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、感染性关节炎、莱姆(Lyme)关节炎、增生性关节炎、银屑病性关节炎、脊推关节炎和幼发型类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性进行性关节炎(arthritischronicaprogrediente),变形性关节炎，慢性原发性多关节炎，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病诸如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指曱银屑病，特应性包括特应性疾病诸如干草热和乔布氏(Job)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎和特应性皮炎，x连锁的高IgM综合征，荨麻渗诸如慢性变应性荨麻渗和慢性特发性荨麻渗包括慢性自身免疫性荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化诸如系统性硬化、多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发性消退性(relapsingremitting)MS(RRMS)、进行性系统性硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、播散性硬化(sclerosisdisseminata)和共济失调性(ataxic)石更化，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩氏(Crohn)病，自身免疫介导的胃肠病，结肠炎诸如溃疡性结肠炎(colitisulcerosa),微观(microscopic)结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎，和自身免疫性炎性肠病)，坏疽性脓皮症，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，巩膜外层炎，呼吸窘迫综合征包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS),脑膜炎，整个或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液学病症，类风湿性脊推炎，突发性听觉丧失，IgE介导的疾病诸如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen)脑炎和边缘系和/或脑干脑炎，葡萄膜炎诸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球肾炎诸如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急进性GN，变应性疾患和应答，变应性反应，湿渗包括变应性或特应性湿渗，哞喘诸如支气管嗜喘(asthmabronchiale)和自身免疫性孝喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾患，针对外来抗原诸如妊娠期间胎儿A-B-O血型的免疫反应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼裔(SLE)(systemiclupuserythematodes)诸如皮肤SLE、亚急性皮肤红斑《良裔、新生儿狼疮综合征(NLE)、播散性红斑狼疮、狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、狼疮脱发)，幼发型(I型)糖尿病包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、成人期发作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特发性尿崩症，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏感性有关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳氏(Wegener)肉芽月中病,粒纟田月包击夹乏,血管炎病包4舌血管炎(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu))动脉炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)，微观(microscopic)多动脉炎，CNS血管炎，坏死性、皮肤性或超每文感性血管炎，系统性坏死性血管炎，和ANCA相关血管炎诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)),颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，库姆斯(Coombs)阳性贫血，戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA),恶性贫血(anemiapemiciosa)，阿狄森氏(Addison)病，单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子vin缺乏，血友病A,自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，涉及白细月包渗出的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征诸如那些败血症、外伤或出血继发的，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet或Behcet)病，卡斯尔曼氏(Castleman)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)综合征，雷诺氏(Reynaud)综合征，斯耶格伦氏(Sjogren)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，类天疱瘙诸如大疱性类天疱痴和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮和红斑性天疱疮)，自身免疫性多内分泌病，莱特氏(Reiter)病或综合征，免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，视神经脊髓炎，多神经病，慢性神经病诸如IgM多神经病或IgM介导的神经病，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、输血后紫癜(PTP)、肝素诱发的血小板减少症、和自身免疫或免疫介导的血小板减少症诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP,睾丸和卯巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性曱状腺功能减退症，曱状旁腺功能减退，自身免疫性内分泌病包括曱状腺炎诸如自身免疫性曱状腺炎、桥本氏(Hashimoto)病、慢性曱状腺炎(桥本氏(Hashimoto)曱状&泉炎)或亚急性曱状腺炎，自身免疫性曱状腺病，特发性曱状腺功能减退症，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性综合征诸如自身免疫性多腺体综合征(或多腺性内分泌病综合征)，瘤外综合征包括神经学瘤外综合征诸如兰伯特一尹顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征或伊顿-兰伯特(Lambert-Eaton)综合征，僵体或僵人综合征，脑脊髓炎诸如变应性脑脊髓炎(encephalomyelitisallergica)和实验性变应性脑脊髓炎(EAE),重症肌无力诸如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，视性眼阵挛或视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏(Sheehan)综合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、类狼疮肝炎、巨细胞性肝炎、慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP,格-巴二氏(Guilkin-Bar^)综合征，贝格尔氏(Berger)病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，原发性胆汁性肝硬化，肺硬变，自身免疫性肠病综合征，乳糜泻，腹部疾病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化(ALS)(卢格里克氏(LouGehrig)病)，冠状动脉病，自身免疫性耳病诸如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听觉丧失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS),多软骨炎诸如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巩膜炎，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如良性单克隆丙种球蛋白病和性质未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS))，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、失聪、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病学病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病诸如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，糖尿病肾病，德雷斯勒氏(Dressler)综合征，斑秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏(Raynaud)现象、食道运动功能障碍、指端硬化和毛细管扩张)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性结締组织病，恰加斯氏(Chagas)病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏切开术后综合征，柯兴氏(Cushing)综合征，养鸟者肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞性血管炎，阿尔波特氏(Alport)综合征，肺泡炎诸如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis),血吸虫病，虫回虫病，曲霉病，Sampter氏综合征，卡普兰氏(Caplan)综合征，登革，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，间质性肺纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，嚢性纤维化，目艮内炎，持久隆起性红斑(erythemaelevatumetdiutinum),月台儿成红细月包增多症，嗜曙红细胞性筋膜炎(faciitis)、舒尔曼氏(Shulman)综合征，费尔提氏(Felty)综合征，flariasis,睫状体炎诸如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch氏睫状体炎，亨诺-许兰二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏(Alzheimer)病，细小病毒感染，风瘆病毒感染，种痘后综合征，先天性风渗感染，爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)综合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，链球菌后肾炎，闭塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans),甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，内分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾炎综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血-再灌注损伤，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道疾病，珪沉着病，口痴，口掩性口炎，动脉硬化性病症，无精子发生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren)挛缩，晶体过敏性目艮内炎(endophthalmiaphacoanaphylactica),变应性小肠炎(enteritisallergica),麻风节结性红斑，特发性面瘫，l曼性疲乏综合征，风湿热(febrisrheumatica),口合-里二氏(Hamman-Rich)病，感觉神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)，寸生A泉功能减退，局卩艮'l"生回肠炎(ileitisregionalis)，白细月包减少症，传染性单核细胞增多症，横贯性(traverse)脊髓炎，原发性特发性粘液水月中，肾病，交感性目艮炎(ophthalmiasymphatica),肉芽月中性睾丸炎(orchitisgranulomatosa)，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮症，查尔万氏(Quervain)甲状腺炎，获得性脾萎缩，由于抗精虫抗体的不育症，非恶性胸腺瘤，白癜风，SCID和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒相关疾病，获得性免疫缺陷综合征(AIDS),寄生虫病诸如利什曼虫病，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的疾患，白细胞粘附缺陷，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性有关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病，混合性结締组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌衰竭，周围神经病，自身免疫性多腺性综合征I型，成人期发作的特发性曱状旁腺功能减退(AOIH),全秃，扩张型心肌病，获得性大疱性表皮松解(epidermolisisbullosaacquisita，EBA),血色素沉着，心月几炎，肾病综合4正，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦炎，上颌窦炎或蝶窦炎，嗜曙红细胞相关病症诸如嗜曙红细胞增多症、肺嗜曙红细胞增多性浸润、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler)综合征、慢性嗜曙红细胞性肺炎、热带肺嗜曙红细胞增多、支气管肺曲霉病、曲霉胂、或含有嗜曙红细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊推关节炎病，多内分泌自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性粘膜皮肤假丝酵母病，布鲁顿氏(Bruton)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，威斯科特-奥尔德里齐(Wiskott-Aldrich)综合征，共济失调性毛细管扩张，与以下各项有关的自身免疫性病症胶原病、风湿病、神经病学疾病、'淋巴结炎、在夬血再灌注紊^L、血压应答降寸氐(reductioninbloodpressureresponse)、血管功能障碍、毛细管扩张(antgiectasis)、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、脑缺血和伴随血管化的疾病，变应性超敏感性病症，肾小球肾炎病，再灌注损伤，心肌或其它组织的再灌注损伤，具有急性炎性成分的皮肤病，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼和眶炎性病症，粒细胞输血相关综合征，细胞因子诱发的中毒，急性重度炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，肺硬变，糖尿病性视网膜病，糖尿病性大动脉病症，动脉内增生，消化性溃疡，心瓣炎，和子宫内膜异位症。在具体的实施方案中，将人源化2H7抗体及其功能性片段用于治疗类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎、韦格纳氏(Wegener)病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化包括复发緩和性MS、4艮屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、ANCA相关血管炎、糖尿病、雷诺氏(Reynaud)综合征、斯耶格伦氏(Sjogren)综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾d、球肾炎。"处理"或"治疗"或"减轻"指治疗性处理，其中目标是若不能治愈则减緩(减轻)所针对的病理学疾患或病症或者预防疾患的复发。如果在依照本发明的方法接受治疗量的本发明人源化CD20结合抗体后，患者在特定疾病的一项或多项体征和症状中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者成功"治疗，，了自身免疫病或CD20阳性B细胞恶性肿瘤。例如，对于癌症，显著的癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；肿瘤转移受到抑制(即一定程度的减緩，优选停止)；肿瘤生长受到一定程度的抑制；消退期延长；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。疾病的体征或症状的减轻还可以由患者感受到。治疗可实现完全响应，定义为癌症的所有体征消失，或者部分响应，其中肿瘤体积缩小，优选超过50%,更优选75%。若患者的病情得到稳定，也认为患者得到治疗。在一项标准中，本发明的h2H7抗体实现〉95。/。的外周血B细胞消减且B细胞回到基线的25%。在优选的实施方案中，用本发明抗体进行的治疗有效导致癌症患者的癌症在治疗后4个月没有发展，优选治疗后6个月，更优选l年，甚至更优选2年或更多年。用于评估疾病的成功治疗和改善的这些参数易于通过本领域胜任的内科医师所熟悉的常M^流程来测量。"治疗有效量"指抗体和药物有效"治疗"受试者中的疾病或病症的量。就癌症而言，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减緩，优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减緩和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。参见前述"治疗"的定义。就自身免疫病而言，治疗有效量的抗体或其它药物有效减轻疾病的体征禾口症状。用于评估瘤的治疗功效或成果的参数将是在相应疾病方面胜任的内科医师所知道的。通常，胜任的内科医师将期待特定疾病的体征和症状的减轻。参数可包括到病情稳定、消退时间、疾病发展的中值时间。以下参考文献记载了淋巴瘤和CLL、它们的诊断、治疗和用于测量治疗功效的标准医学流程CanellosGP，Lister,TA,SklarJL，TTzeZ^mp/owos，W.B.SaundersCompany,Philadelphia,1998;vanBesienKandCabanillas,F,Chap.70,pp1293-1338，in://emao/ogy,6as7,c尸r/"c^/eaJ/Vac/7.ce,第3片反,Hoffmana/.(编),ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000;及Rai,KandPatel,D,C7^o"/cZ3;mp/zoc3^/c丄eMA:e/w/a,Chap.72，pp1350-1362,in://emato/ogy,Sos7'c尸n'"一/es尸r"cdce,第3版，Hoffmana/.(编),ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000。用于评估自身免疫病或自身免疫相关疾病的治疗功效或成果的参数将是在相应疾病方面胜任的内科医师所知道的。通常，胜任的内科医师会期待特定疾病的体征和症状的减轻。举例如下。在一个实施方案中，将人源化2H7抗体和具体的hu2H7.v511及其功能性片段用于治疗类风湿性关节炎。RA是影响超过两百万美国人且阻碍受害者日常活动的虚弱性自身免疫病。当身体的自身免疫系统不当攻击关节组织并引起破坏健康组织的慢性炎症和关节内损伤时发生RA。症状包括关节发炎、肿胀、僵硬和疼痛。另外，由于RA是系统性疾病，它可能对其它组织诸如肺、眼和骨髓有影响。还不知道有治愈的。治疗包括多种类固醇和非类固醇抗炎药、免疫抑制剂、减轻疾病的抗风湿药(DMARD)和生物制剂。然而，许多患者继续对治疗响应不足。抗体可用作早期RA(即未用过曱氨喋呤(MTX))患者中的一线疗法，作为单一疗法，或者联合或在例如MTX或环磷酰胺之后。或者，抗体可作为二线疗法用于治疗DMARD和/或MTX耐受性患者，作为单一疗法或者4关合例如MTX。人源化CD20结合抗体可用于预防和控制关节损伤，延迟结构损伤，减轻与RA中的炎症有关的疼痛，且通常减轻中度至重度RA中的体征和症状。RA患者可在用治疗RA所用的其它药物(参见下文的联合疗法)治疗之前、之后或者与它们一起用人源化CD20抗体治疗。在一个实施方案中，用本发明的人源化CD20结合抗体治疗先前减轻疾病的抗风湿药失败了和/或对单独的曱氨喋呤响应不足的患者。在这种治疗的一个实施方案中，患者在17天治疗方案中接受单独的人源化CD20结合抗体(第1天和第15天静脉内输注lg);CD20结合抗体+环磷酰胺(第3天和第17天静脉内输注750mg);或者CD20结合抗体+曱氨喋呤。因为身体在RA期间产生肺瘤坏死因子oc(TNFa)，所以TNFa抑制剂已用于治疗该疾病。然而，TNFa抑制剂诸如依那西普(Etanercept,ENBREL)、英夫利昔单抗(Infliximab,REMICADE)和阿达木单抗(Adalimumab,HUMIRATM)可产生消极的副作用，诸如感染、心力衰竭和脱髓鞘。因此，在一个实施方案中，人源化CD20结合抗体或其生物学功能片段可作为例如一线疗法用于治疗RA患者以降低使用TNFa抑制剂药物产生这些消极副作用的风险，或者用于治疗认为倾向于发生中毒例如心脏中毒的患者。人源化CD20结合抗体或其生物学功能片段还可用于治疗以下RA患者的方法已用TNFa抑制剂治疗但没有响应的，对TNFa抑制剂响应不足的(TNF-IR患者)，或者在响应一段时间后病情复发的，或者确定为不太可能响应TNFa抑制剂疗法的RA患者。在一个实施方案中，在用TNFa抑制剂治疗前先用低剂量诸如低于1OOmg治疗TNF-IR。评估RA中的治疗功效的一种方法以美国风湿病学学会(AmericanCollegeofRheumatology,ACR)的标准为基础，它测量触痛和肿胀关节的改善百分比等。与无抗体处理(例如处理前的基线)或安慰剂处理相比，RA患者可评分为例如ACR20(20%改善)。评估抗体治疗功效的其它方式包括X射线评分诸如用于对结构损伤诸如骨侵蚀和关节腔变窄评分的SharpX射线评分。还可基于治疗期间或之后各时期的健康评估问巻(HealthAssessmentQuestionnaire,HAQ)得分、AIMS得分、SF-36对患者评估失能的预防或改善。ACR20标准可包括触痛(疼痛)关节数和胂胀关节数二者的20%改善+如下5项额外测量中至少3项的20%改善1.依据直观类比标度的患者疼痛评价(VAS)，2.疾病活性的患者整体评价(VAS),3.疾病活性的医师整体评1介(VAS),4.由健康评估问巻测量的患者自我评价失能，和5.急性期反应物，CRP或ESR。ACR50和70定义类似。优选的是，对患者施用一定量的本发明CD20结合抗体，其足以实现至少ACR20的得分，优选至少ACR30，更优选至少ACR50，甚至更优选至少ACR70,最优选至少ACR75和更高。银屑病关节炎具有唯一的和独特的放射线照相特征。对于银屑病关节炎，也可通过Sharp得分来评估关节侵蚀和关节空间变窄。本发明的人源化本发明的另一个方面是通过对患有SLE或狼疮肾炎的患者施用治疗有效量的本发明人源化CD20结合抗体来治疗病症的方法。SLEDAI得分提供了疾病活性的翁^直量化。SLEDAI是已知与疾病活性有关的24项临床和实验室参数的加权指数，数值范围0-103。参见BryanGescuk&JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus",in:Ciwe"f(9//m'ow/"i^ewmato/o^2002，14:515-521。其它评分方法包括BILAG评分。认为针对双链DNA的抗体引起肾发红(renalflares)和狼疮的其它表现。可对接受抗体治疗的患者监测到达肾发红的时间(timetorenalflare)，这定义为血清月几酸酐、尿液蛋白质或尿液中血的显著的、可重现的升高。或者/另外，可对患者监测抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平。SLE的治疗包括高剂量的皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。在此，狼疮的成功治疗将减轻发红(flare)，即降低严重性和/或减少到下一次发红(flare)的时间。脊推关节病是一组关节病症，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏(Crohn)病。治疗成果可通过经过验证的患者和医师整体评估测量工具来测定。至于血管炎，大约75%的系统性血管炎病患者具有抗嗜中性粒细胞胞质抗体并分属于影响小的/中等大小血管的三种疾患之一韦格纳氏肉芽肿(Wegener'sgranulomatosus，WG)、孩i观多血管炎(microscopicpolyangiitis,MPA)和丘施二氏综合征(ChurgStrausssyndrome,CSS),统称ANCA相关血管炎(AAV)。银屑病的治疗功效通过监测疾病的临床体征和症状较之基线状况的变化来评估，包括医师整体评价(PGA)变化和银屑病面积和严重性指数(PASI)得分、银屑病症状评价(PSA)。可在整个治疗期间在用于指示特定时间点经受的发痒程度的直观类比标度上定期测量用本发明的人源化CD20结合抗体诸如hu2H7.v511治疗的银屑病患者。患者可能在他们首次输注治疗用抗体时经受输注反应或输注相关症状。这些症状的严重程度有所不同且通常可通过医学干预逆转。这些症状包括但不局限于流感样发热、寒战/僵直、恶心、荨麻渗、头痛、支气管痉挛、血管性水肿。对于本发明的疾病治疗方法而言期望输注反应降至最低。为了减轻或最小化此类不利事件，患者可接受初始适应或耐受剂量的抗体，随后才是治疗有效剂量。适应剂量(conditioningdose)将低于治疗有效剂量以使患者适应而耐受更高剂量。^/量發一多根据待治疗的适应症和本领域熟练内科医师所熟悉的与剂量给药有关的因素，将以有效治疗该适应症同时毒性和副作用降至最^^的剂量施用本发明的抗体。理想的剂量可能取决于疾病和疾病的严重程度、疾病的阶段、期望的B细胞调控水平，及本领域熟练内科医师所熟悉的其它因素。对于自身免疫病的治疗，可能希望根据疾病和/或个体患者中疾患的严重程度通过调整人源化2H7抗体的剂量来调控B细胞消减的程度。B细胞消减可以而非必须是完全的。或者，在最初的治疗中可能期望全部B细胞消减，但在后续治疗中可调整剂量以达到只有部分消减。在一个实施方案中，B细胞消减是至少20%,即与治疗前的基线水平相比保留80%或更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方案中，B细胞消减是25%、30%、40%、50%、60%、70%或更多。优选的是，B细胞消减足以阻止疾病的发展，更优选减轻处于治疗中的具体疾病的体征和症状，甚至更优选治愈疾病。Genentech和BiogenIdec的临床调查评估了使用多剂范围从低达10mg至高达lg—剂的抗CD20(hu2H7.v16和Rituximab)治疗自身免疫病的治疗效力(见关于Rituximab研究的背景部分；及WO04/056312,实施例16)。一般而言，在这些临床调查中施用两剂抗体，间隔约两周。临床调查中所研究的治疗方案的例子包括人源化CD20抗体2H7.vl6用于类风湿性关节炎时为2xl0mg(即2剂，每剂10mg;对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量10.1mg/m2)、2x50mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量55mg/m2)、2x200mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量220mg/m2)、2x500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量550mg/m2)、和2xl000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量1100mg/m2);而Rituxan为2x500mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量550mg/m2)、2xl000mg(对于体重70kg、身高67英寸的患者，总剂量1100mg/m2)。在每个这些剂量，在施用第一剂抗体后观察到实质性的循环中B淋巴细胞消减。目前，还探索了通过1次或2次静脉内输注施用的1Omg至2000mg的剂量范围。在自身免疫病患者中治疗自身免疫病和消减B细胞的本发明方法中，在一个实施方案中，以范围为O.lmg至1000mg的1剂平剂量施用人源化2H7.v511抗体。我们发现在低于300mg,甚至10mg的平剂量实现了实质性B细胞消减。如此，在本发明的B细月包消减和治疗方法中，在不同的实施方案中，以O.l、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200或250mg的剂量施用hu2H7.v511抗体。如果目标是部分或短期B细胞消减，那么可以使用较低剂量，例如20mg、10mg或更低。对于CD20阳性癌症的治疗，可能希望将作为本发明抗CD20抗体靶物的B细胞的消减最大化。如此，对于CD20阳性B细胞胂瘤的治疗，希望B细胞消减至少足以阻止疾病的发展，这可以由本领域熟练内科医师来评估，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌性细胞类型的增殖、转移、具体癌症的其它体征和症状。优选的是，B细胞消减足以在至少2个月的时间里阻止疾病的发展，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6个月或更多个月。在甚至更优选的实施方案中，B细胞消减足以将消退时间延长至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选的实施方案中，B细胞消减足以治愈疾病。在优选的实施方案中，癌症患者中的B细胞消减是治疗前基线水平的至少约75%且更优选80%、85%、90%、95%、99%和甚至100%。hu2H7抗体包括vl6和v511用于治疗NHL的临床试验的剂量用药方案和剂量的例子记载于下文实验性实施例18-20。以mg/剂计的剂量50、75、100、125、150、200、250、300、350mg/剂也可用于B细胞恶性肿瘤诸如NHL的维持疗法。给药频率可随若千因素变化。一般而言，通常将对患者施用至少2剂人源化2H7CD20结合抗体，在不同的实施方案中可接受2-4剂、2-8剂、2-10剂。通常，在一个月内施用2剂，一般间隔l、2或3周。在针对肿瘤学的一种治疗方案中，设想了8次静脉内输注200mg/m2至750mg/m2之间的剂量。在针对RA的一种剂量给药方案中，每6个月对患者施用2次各500mg人源化抗体诸如vl6、vll4或v511。针对RA的另一种剂量给药方案是每9个月2次各1000mg。针对RA的第三种剂量给药方案是每6个月2次各10mgvl6、v114或v511。根据疾病改善的水平或复发，可在整个患病期间施用更多剂或者作为疾病的维持疗法。一种或多种现行疗法无效、耐受不良或禁忌的自身免疫病或B细胞恶性肿瘤患者可以用任何本发明剂量给药方案来治疗。例如，本发明设想了将本发明的治疗方法用于对肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂疗法或对减轻疾病的抗风湿药(DMARD)疗法响应不足的RA患者。"长期"施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长一段时间。"间歇"施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。人源化2H7抗体依照已知方法施用于人类患者，诸如通过静脉内施用，例如推注或通过连续灌注一^a时间，通过皮下、月几肉内、腹膜内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内或吸入路径，通常通过静脉内或皮下施用。通常，对于肿瘤学适应症，人源化2H7抗体配制剂通过静脉内路径诸如输注来施用。在一个实施方案中，人源化2H7抗体以0.9%氯化钠溶液作为输注媒介通过静脉内输注来施用。在类风湿性关节炎的I/II期临床试验中，抗体配制剂通过静脉内输注来施用(见实施例20)。在另一个实施方案中，人源化2H7抗体具体通过皮下注射来施用。在治疗上述B细胞肿瘤时，患者可以用本发明的人源化2H7抗体与一种或多种治疗剂诸如化疗剂联合的多药物方案来治疗。人源化2H7抗体可以与化疗剂同时、序贯或交替施用，或者在其它疗法无响应后施用。用于淋巴瘤治疗的标准化疗可包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑(melphalan)、和米托蒽醌(mitoxantrone)+美法仑。CHOP是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的最常用化疗方案之一。以下是用于CHOP方案的药物环磷酰胺(商标Cytoxan,neosar);阿霉素(多柔比星/羟基多柔比星)；长春新碱(Oncovin);和泼尼松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在具体的实施方案中，CD20结合抗体与一种或多种以下化疗剂联合施用于有所需要的患者多柔比星、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松龙。在一个具体的实施方案中，用本发明的人源化2H7抗体与CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新;咸和泼尼4公龙)疗法联合来治疗淋巴瘤(诸如非何杰金氏淋巴瘤)患者。在另一个实施方案中，癌症患者可以用本发明的人源化2H7CD20结合抗体联合CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼+〉龙)化疗来治疗。在一个具体的实施方案中，CD20阳性NHL患者施用人源化2H7.v511或v114联合CVP，例如每三周一次进行8个循环。在治疗CLL的一个具体实施方案中，hu2H7.v511抗体与利用氟达拉滨(fludarabine)和环磷酰胺(cytoxan)之一或二者的化疗联合施用。"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);石黄酉臾》克基酉旨类(alkylsulfonates),i者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)禾口。底泊舒凡(piposulfan);氮丙。定类(aziridines)，^者3口苯佐替〉泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)禾口乌5离替;泉(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemdamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙才掌石克"f戈石舞酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);TLK286(TELCYTA);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布4立4也辛(bullatacin)禾口布^立j也辛酉同(bullatacinone));S-9匿四氢大麻酚(tetrahydrocannabino1)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);p-4i帕酉昆(lapachone);^立帕醇(lapachol);一火7K仙素类(colchicines);白桦月旨酸(betulinicacid);喜冲对石咸(camptothecin)(包i舌合成类似、物4乇泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树石威、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树石成)；苫藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(pod叩hyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隐'蓬素类(cryptophycins)(净+另ll是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海纟帛抑素(spongistatin);氮芥类(nitrogenmustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、茶氮芥(chlornaphazine)、月旦石寿醜胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酉臾氧氮齐(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾酉孚(phenesterine)、泼尼莫司〉'丁(prednimustine)、曲碌胺(trofosfamide)、尿嘧口足氮芥(uracilmustard);亚竭脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司^丁(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(mnimustine);二騰酉史盐类(bisphosphonates)，i者i口氣騰酉炱盐(clodronate);it生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素yll和加利车霉素coll(参见例如Agnew,C/zem.￡d33:183-186(1994))和蒽环类抗生素(anthracyclines)诸如annamycin、AD32、alcarubicin、柔红霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-l、表柔比星(epirubicin)、GPX-IOO、伊达比星(idarubicin)、KRN5500、美诺立尔(menogaril)、dynemicin包4舌dynemicinA、^矣其斤;皮霉素(esperamicin)、壽斤制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氛茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氛酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、;改线菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗淋代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂质体和脱氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噤吟霉素(puromycin)、三4失阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、《连黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);叶酸类似、物，i者如二曱叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate);噪呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基。票呤(mercaptopurine)、辟b咪噤呤(thiamiprine)和石克鸟噤呤(thioguanine);嘧"定类似物，^"如安西4也滨(ancitabine)、阿4L月包苦(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苦(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿芬(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苦(floxuridine);雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他力#酮(dromostanolonepropionate)、表石危名食醇(epitiostanol)、美雄坑(mepitiostane)和睾内酉旨(testolactone);抗肾上&泉类，i者如氨鲁米特(aminoglutethimide)、4U乇坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，如亚叶酸(folinicacid)(leucovorin);醋葡醛内酯(aceglatone);抗叶酸抗瘤剂，诸如ALIMTA、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氢叶酸还原酶抑制剂诸如曱氨喋呤(methotrexate),抗代谢物类，诸如5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)及其前药诸如UFT、S-l和卡培他滨(capecitabine),及胸苷酸合酶抑制剂和甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶抑制剂诸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEX,TDX);二氢嘧啶脱氢酶抑制剂诸如恩尿嘧啶(eniluracil);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氛基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地石夕,酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine);J也口丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptiniumacetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸4家；羟脲(hydroxyurea);香恭多斗唐(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物石威类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫派达醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);处柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);才艮審素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺》炎4者(spirogermanium);纟田交《连孑包菌酮酸(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；单端孑包菌素类(trichothecenes)(尤其是T画2毒素、祝孑包菌素(verrucarin)A、^f干孑包菌素(roridin)A禾口虫它4亍菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);达卡巴口秦(dacarbazine);甘露莫司';丁(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛酉享(mitolactol);口底泊；臭》克(pipobroman);gacytosine;阿斗唐月包香(arabinoside)("Ara-C");环磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids)和紫杉烷类(taxanes),例如TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANEtm不含克列莫佛(Cremophor),清蛋白改造的纳米颗粒剂型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(docetaxel)(Rh6ne陽PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芬(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR);6-碌b鸟噤呤(thioguanine);巯基噤呤(mercaptopurine);柏(platinum);铂类似物或基于铂的类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)禾口卡4白(carboplatin);长春石威(vinblastine)(VELBAN);依^乇泊苦(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);长春花生物碱类(vincaalkaloid);长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE);能灭瘤(novantrone);依达曲沙(edatrexate);道诺霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸(retinoid)，诸如一见黄酸(retinoicacid);任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新石威和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唾(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嗜啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及粘附细胞增殖的信号途经中的基因表达的，诸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R);疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓朴异构酶1抑制剂；ABARELIXrmRH;及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。此外，hu2H7抗体及其功能性片段可以与抗肿瘤血管发生剂诸如血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂联合用于治疗表达CD20的B细胞肿瘤(例如NHL)。"抗血管发生剂"或"血管发生抑制剂，，指或直接或间接的抑制血管发生(angiogenesis,vasculogenesis)、或不想要的血管通透'1"生的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体发信号的小分子(例如PTK787/ZK2284,SU6668)。"VEGF拮抗剂"指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性，包括其与一种或多种VEGF受体结合的分子。在一个实施方案中，患有此类B细胞肺瘤的患者用2H7.v511或2H7.vll4联合Avastin(bevacizumab;Genentech)进4亍治疗。4元VEGF4元体"贝4戈单抗，，(bevacizumab,BV)，又称为"rhuMAbVEGF"或"Avastin⑧"，是依照Presta"a/"C""ceriw.57:4593-4599(1997)产生的重组人源化抗VEGF单克隆抗体。hu2H7抗体及其功能性片段，在特定实施方案中是2H7.v511和2H7.vl14,也可与TNF细胞因子家族的成员诸如Apo-2配体(Apo2L)又称为TRAIL耳关合用于治疗表达CD20的B细胞肺瘤的方法。全长天然序列人Apo-2配体是长度为281个氨基酸的，肿瘤坏死因子细胞因子家族的II型跨膜蛋白质。可溶形式的Apo-2配体，诸如包含胞外结构域(ECD)或其部分的那些，已发现在哺乳动物癌细胞中具有多种活性，包括凋亡活性。Apo2L/TRAIL(记载于WO97/01633和WO97/25428)是作为ECD的片^殳的可溶性人蛋白质，包含全长Apo-2L蛋白质的氨基酸114-281。在治疗上文所述自身免疫病或自身免疫相关疾患时，患者可以用一种或多种hu2H7抗体诸如hu2H7.v511联合第二种治疗剂诸如免疫抑制剂，诸如以多药物方案进行治疗。hu2H7抗体可以与免疫抑制剂同时、序贯或交替施用，或者在其它疗法无响应后施用。免疫抑制剂可以以与本领域所列相同或较低的剂量施用。优选的辅助免疫抑制剂取决于许多因素，包括所治疗病症的类型以及患者的病史。"免疫抑制剂"在本文中用于辅助疗法时指作用为抑制或掩盖患者的免疫系统的物质。此类药剂将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括类固醇，诸如糖皮质类固醇，例如泼尼;^(prednisone)、曱泼尼龙(methylprednisolone)和J也塞米^"(dexamethasone);2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧咬(参见美国专利No.4,665,077);碌b口坐噤口令(azathioprine)(或环石舞酰胺(cyclophosphamide),长口果只十碌^坐噤口令有不良反应的话)；溴隐亭(bromocryptine);戊二醛(它掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素，、-(3或-a抗体；抗肿瘤坏死因子-a抗体；抗肿瘤坏死因子-p抗体；抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛(pan)T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(WO90/08187，公布于90年7月26日)；链激酶；TGF-卩；链道酶；来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T细胞受体(美国专利No.5,114,721);T细胞受体片段(Offner5We"ce251:430-432(1991);WO90/11294;WO91/01133);及T细胞受体抗体(EP340,109),诸如T10B9。对于类风湿性关节炎的治疗，患者可以用CD20结合抗体(诸如rituximab或ocrelizumab或其变体)耳关合一种或多种以下药物进行治疗DMARD(减轻疾病的抗风湿药)(例如曱氨喋呤)、NSAI或NSAID(非类固醇抗炎药)、免疫抑制剂(例如碌^唑嘌呤(azathioprine);霉酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil,CellCept;Roche))、镇痛药、糖皮质类固醇、环磷酰胺、HUMIRA(阿达木单抗，adalimumab;AbbottLaboratories)、ARAVA(来氟米特，leflunomide)、REMICADE(英夫利昔单抗，infliximab;CentocorInc.,Malvern,Pa)、ENBREL(依那西普，etanercept;Immunex,WA)、ACTEMRA(tocilizumab;Roche,Switzerland),COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARD是羟氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮石黄。比口定(sulfasalazine)、曱氨口莱"^(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔单抗(infliximab)、石克唑噤呤(azathioprine)、D-青霉胺、金(Gold)(口服)、金(GoW)(肌肉内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素(cyclosporine)、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿达木单抗(Adalimumab)是结合TNFa的人单克隆抗体。英夫利昔单抗(Infliximab)是结合TNFa的嵌合小鼠-人单克隆抗体。它是治疗RA和克罗恩氏病的免疫抑制性药物，处方药。已经将英夫利昔单抗与致死性反应联系起来，诸如心力衰竭和感染，包括结核病，以及导致MS的脱髓鞘。Actemra(tocilizumab)是人源化抗人白介素-6(IL-6)受体。依那西普(Etanercept)是"免疫粘附素"融合蛋白，由人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分与人IgGl的Fc部分相连而组成。依那西普(ENBREL⑧)是在美国批准用于活动性RA疗法的可注射药物。依那西普结合TNFa并承担从关节和血液中除去大部分TNFa,由此阻止TNFa促进炎症和类风湿性关节炎的其它症状的作用。已经将该药与负面副作用联系起来，包括严重的感染和脓毒症、神经系统病症诸如多发性硬化(MS)。参见i"列i口www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel—embrel.html。只十于RA的常夫见治疗，参见例如"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis",JW/zn'toi/ewma^ym46(2):328-346(February,2002)。在一个具体的实施方案中，用本发明的hu2H7CD20抗体耳关合曱氨喋呤(MTX)来治疗RA患者。MTX的例示剂量是大约7.5-25mg/kg/周。MTX可通过口服和皮下施用。在一个实施例中，患者还接受伴随的MTX(10-25mg/周，口服或肠胃外)，以及组成如下的皮质类固醇方案曱泼尼龙，100mg，静脉内，输注CD20抗体前30分钟及泼尼松，60mg，口服，第2-7天；30mg，口服，第8-14天；回到基线剂量，到第16天。患者还可以接受叶酸(5mg/周)，或是作为单剂或是作为分开的日剂量。患者任选在整个治疗期间继续接受任何背景皮质类固醇(10mg/天泼尼松或等效物)。对于强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克罗恩氏病的治疗，可以用本发明的CD20结合抗体联合例如Remicade(英夫利昔单抗infliximab;CentocorInc.,Malvern,Pa)、ENBREL(依那西普etanercept;Immunex,WA)来治疗患者。SLE的治疗包括CD20抗体与高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)的联合。患有SLE、AAV和NMO的患者可以用本发明的2H7抗体耳关合任何以下药物进行治疗皮质类固醇、NSAID、镇痛药、COX-2抑制剂、糖皮质类固醇、常规DMARD(例如曱氨喋呤、柳氮磺吡啶、羟氯喹、来氟米特)、生物的DMARDi!4口^tBlys(例j口belimumab)、4元IL6R例力口tocilizumab、CTLA4-Ig(abatacept)、抗CD22例如依帕珠单抗(epratuzumab)、免疫抑制剂(例如硫唑。票呤；霉酚酸吗乙酯(CdlCept⑧；Roche))、及细胞毒剂(例如环磷酰胺)。对于银屑病的治疗，患者可施用人源化2H7抗体联合局部治疗，诸如局部类固醇、蒽啉(anthralin)、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)和他扎罗汀(tazarotene),或者联合曱氨喋呤、类视黄酸、环孢霉素、PUVA和UVB疗法。在一个实施方案中，序贯或同时用人源化2H7抗体和环孢霉素治疗银屑病患者。本发明的hu2H7抗体，特别是hu2H7.v511和hu2H7.vl14可联合BAFF拮抗剂同时、序贯或在交替的方案中用于治疗自身免疫病或B细胞肿瘤。BAFF和BAFF拮抗剂定义如上。在一个实施方案中，BAFF拮抗剂是结合人BR3的抗体，该抗体优选是人源化的、人的或嵌合的。在另一个实施方案中，BAFF拮抗剂是BR3-Fc融合蛋白。抗CD20抗体与BAFF拮抗剂在消减B细胞方面的协同作用已有报道(参见例如WO05/000351，s甲ra;Gong"a/"乂/画画/.174:817-826(2005))。为了将毒性降至最低，可以以轮回的、序贯的、联合的或间歇的治疗方案施行传统的系统性疗法，或者是hu2H7CD20结合抗体组合物釆用当前剂量的较低剂量联合方案。药用配制剂依照本发明使用的hu2H7CD20结合抗体的治疗用配制剂通过将具有期望纯度的抗体与任选的药剂学学可接受的载体、赋形剂或稳定剂CRem/"gto"'si^armace幼'ca/5We"ce，第16版，Osol,A.编(1980))混合，以冻千配制剂或水溶液的形式制备。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基千基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；对羟基苯曱酸烷基酯，诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约IO个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。例示性的hu2H7抗体配制剂记载于WO98/56418中，在此明确收入作为参考。另一种配制剂是液态多剂配制剂，包含40mg/mLhu2H7抗体，25mM乙酸盐，150mM海藻糖，0.9%苯曱醇，0.02%聚山梨醇酉旨20pH5.0，最小保存期是在2-8。C保存两年。另一种感兴趣的抗CD20抗体配制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用无菌水pH6.5中包含10mg/mL抗体。还有一种含水药用配制剂包含10-30mM乙酸钠，大约pH4.8至大约pH5.5优选pH5.5,作为表面活性剂的大约0.01-0.1%v/v量的聚山梨醇酯，大约2-10。/。w/v量的海藻糖,和作为防腐剂的苯曱醇(U.S.6,171,586)。适于皮下施用的冻干配制剂记载于WO97/04801。此类冻干配制剂可用合适的溶剂重建至高蛋白质浓度，重建的配制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。在一个具体的实施方案中，人源化2H7.vl6的一种静脉内配制剂是20mM乙酸钠，4%二水合海藻糖，0.02。/。聚山犁醇酯20(Tween20)pH5.3中的30mg/ml抗体。该静脉内配制剂可施用于肿瘤学适应症诸如NHL以及用于类风湿性关节炎。人源化2H7.v511变体的一种配制剂是10mM硫酸组氨酸，60mg/ml蔗糖(6%),0.2mg/ml聚山犁醇酯20(0.02%)，和注射用无菌水pH5.8中的15-30mg/ml抗体，优选20mg/mL抗体。在另一个实施方案中，2H7变体，具体是2H7.v511的配制剂是20mg/ml2H7，20mM乙酸钠，4%二水合海藻糖，0.02%聚山犁醇酯20pH5.5,供静脉内施用。该配制剂可用于单一静脉内输注。2H7.vl14的一种配制剂是20mM乙酸钠，240mM(8%)二水合海藻糖，0.02%聚山犁醇酯20pH5.3中的15-25mg/ml抗体，优选20mg/ml。本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能希望进一步提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的免疫抑制剂，诸如环孢霉素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常是以与本文所述相同的剂量，以本文所述施用路径而使用的，或是迄今所采用的剂量的大约1-99%。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酉旨)微胶嚢)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Wew/"gto"k户/2(armacew"ca/iSc/ec&,第16片反,Osol,A.纟扁(1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酉旨(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞;沐构成的可注射孩i球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。制品和试剂盒本发明的另一个实施方案是包含可用于治疗自身免疫病和相关疾患和CD20阳性癌症诸如非何杰金氏淋巴瘤的物质的制品。所述制品包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是静脉内溶液袋或带有皮下注射针可刺穿的塞子的药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是hu2H7抗体，例如本发明的hu2H7.v511。所述标签或包装插页指明该组合物用于治疗所述具体疾患。所述标签或包装插页进一步包含关于对患者施用所述抗体组合物的说明书。包装插页指通常包括在治疗用产品商品化包装中的说明书，它包含有关此类治疗用产品使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌和/或警告信息。在一个实施方案中，包装插页指明该组合物用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。另外，所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受緩冲液，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐緩沖盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括其它緩冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。还提供了可用于各种目的的试剂盒，例如用于B细胞杀伤测定法，用作凋亡测定法的阳性对照，用于从细胞中纯化或免疫沉淀CD20。为了分离和纯化CD20,所述试剂盒可包含与珠子(例如sepharose珠子)偶联的hu2H7.v511抗体。可提供包含用于CD20体外检测和定量的抗体，例如在ELISA或Western印迹中进行的。与制品一样，所述试剂盒包括容器及容器上或与容器相关的标签或包装插页。所述容器装有包含至少一种本发明抗CD20抗体的组合物。可包括装有例如稀释剂和緩沖液、对照抗体的别的容器。所述标签或包装插页可提供该组合物的描述以及意图体外或诊断使用的说明书。实验性实施例小鼠人CD20(hCD20)+小鼠的产生是通过使用掺入了hCD20基因座的细菌人工染色体(BAC)实现的。将阳性BAC克隆注入衍生自FVB小鼠的胚泡以产生表达hCD20的转基因(Tg)建立者品系。参阅Gongetal.(2005)J.Immunol.174:817-826中有关hCD20Tg+小鼠的产生和表征的详细描述。hCD20Tg+小鼠随后与hCD16Tg+mCD16^交配以产生hCD20Tg+mCD16一hCD16Tg+小鼠，用于下文所述的研究。抗体用于FACS分析的所有抗体均购自BDPharMingen。设备/软件FACS分析使用FACScan或FACSCalibur机器并利用购自BectonDickinson的CellQuest软件进行。单细胞悬浮液的制备用装有EDTA的管子自眼眶收集50^1小鼠血液，随后用ACK溶胞緩沖液(购自Biosource)溶解红细胞。将它们去除后，用毛玻璃载玻片(frostedglassslide)将小鼠脾脏颗粒化成单细胞悬浮液。然后洗涤细胞沉淀物，重悬并过滤。用5ml冷的PBS清洗每只小鼠的腹腔。用5ml注射器回收灌洗液随后离心。然后洗涤来自小鼠血液、脾脏和腹膜的白细胞并计数，然后染色供FACS分析。FACS染色将大约lxl(^个细胞在100(11磷酸盐緩沖盐水+1%清蛋白(Sigma)中针对各种细胞表明标记物(参见FACS分析中的定义)进行染色。在冰上放置30分钟后，将已染色细胞洗涤并重悬，然后进行FACS分析。FACS分析FACS分析是使用FACScan或FACSCalibur及CellQuest软件进行的。血液B细胞限定为CD21+CD23+;腹膜B细胞限定为CD19+;脾脏B细胞限定为B220+;MZ(边缘区)B细胞限定为CD21*CD23及FO(滤泡)B细月包限定为CD21+CD23*。统计数据表述为平均值±标准误差(11=5)。统计学分析采用双轨不成对T检验(two-tailunpairedTtest)来进行。实施例1:2H7抗CD20鼠单克隆抗体的人源化鼠抗人CD20抗体2H7(在本文中也称为m2H7，m指小鼠)的人源化是以一系列定点诱变步骤而进行的。鼠2H7抗体可变区序列及具有小鼠V区和人C区的嵌合2H7已有记载，参见例如美国专利5，846，818和6,204,023。通过比较鼠2H7可变域的氨基酸序列(披露于U.S.5，846，818)与已知抗体的序歹寸(Kabatetal.,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,Ed.5.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991》鉴定了2H7的CDR残基。基于序列高变性(Kabatetal.,同上文)P艮定了轻链和重链的CDR区并分别如图1A和图1B所示。利用合成的寡核苦酸(表1)，通过定点诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492(1985))将所有6个鼠2H7CDR区导入质粒pVX4(参见WO04/056342的图2，在此完整收入该PCT出版物作为参考)中所包含的、与共有序列vj、VHm(VtK亚型i，VH亚型ni)相对应的完整人Fab框架。噬菌粒pVX4用于"i秀变及在大肠杆菌中表达F(ab)s。以噬菌粒pb0720,pB0475(Cunninghametal.，Science243:1330-1336(1989))的一种衍生物为基础，pVX4包含编码人源化共有K亚型I轻链(VLKl-CO和人源化共有亚型III重链(VHlII-CHl)抗IFN-a(干扰素a)抗体的DNA片段。pVX4还具有碱性磷酸酶启动子和Shine-Dalgamo序列，二者均衍生自先前记载的另一种基于pUC119的质粒pAK2(Carteretal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992))。在编码F(ab)轻链和重链的DNA之间引入唯一的Spel限制性位点。抗IFN-a重链和轻链二者的前23个氨基酸是5m分泌信号序列(Changetal.,Gene55:189-196(1987》。为了构建CDR交换型式的2H7(2H7.v2)，用含脱氧尿苷的pVX4模板进行定点诱变；抗IFN-a的所有6个CDR均变成鼠2H7CDR。所得分子称为人源化2H7型式2(2H7.v2)或者2H7的"CDR交换型式"；它具有图1A和IB所示的m2H7CDR残基及共有人FR残基。将人源化2H7.v2用于进一步的人源化。表3显示了用于创建H和L链中每一个鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苦酸序列。例如，CDR-H1寡核苷酸用于重建m2H7H链CDR1。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分别指H链CDR1、CDR2和CDR3;同样的，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3指各个L链CDR。CDR-H2中的替代是用两种寡核苷酸CDR-H2A和CDR-H2B以两步进行的。表3:用于将鼠2H7CDR通过CDR交换掺入pVX4中的人框架的寡核苷酸序列。由每个寡核苷酸改变的残基以下划线标示。替代寡核苷酸序列CDR画HlCTACACCTTCACGAGCTATAACATGCACTGGGTCCG(SEQIDNO.35)CDR-H2AGATTAATCCTGACAACGGCGACACGAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGCCG(SEOIDNO,36)CDR-H2BGACAC(SEQIDNO.37)CDR-H3ATTATTGTGCTCGAGTGGTCTACTATAGCAACAGCTACTGGTACTTCGACGTCTGGGGTCAA<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>为了与人源化构建体比较，通过定点诱变(Kunkel,同上文)构建了表达嵌合2H7Fab(包含鼠V^和Vh結枸域及人Cl和Ch1结构域)的质粒，其中利用合成的寡核苷酸将鼠框架残基引入2H7.v2。所得质粒构建体用于表达称为2H7.v6.8的嵌合Fab,如WO04/056342中图3所示。Fab的每一条所编码的链具有上文关于pVX4所描述的23个氨基酸的分泌信号序列。根据鼠2H7框架残基与人VKI、VHIII共有框架(图1A和IB)及先前的人源化抗体(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289(1992))的比较，通过定点诱变将若干框架突变引入2H7.v2Fab构建体。这些突变导致在可能影响CDR构象或抗原接触的位点某些人共有框架残基改变成在鼠2H7框架中找到的那些残基。型式3包含VH(R71V,N73K),型式4包含VH(R71V),型式5包含VH(R71V,N73K)和Vl(L46P)，而型式6包含VH(R71V，N73K)和VL(L46P,L47W)。m2H7抗体的人源化和嵌合Fab型式如下在大肠杆菌中表达并纯化。将质粒转化入大肠才干菌菌才朱XL-lBlue(Stratagene,SanDiego,CA),用于制备双链和单链DNA。对于每种变体，轻链和重链二者都用双脱氧核苷酸法(Sequenase，U.S.BiochemicalCorp.)进行完整测序。将质4立转化入大肠杆菌菌抹16C9,MM294的一种衍生林，铺于含5吗/ml羧苄青霉素的LB平板上，挑选单菌落用于蛋白质表达。将单菌落在5mlLB-100(ig/ml羧苄青霉素中于37。C培养5-8小时。将5ml培养物加入500mlAP5-100|jg/ml羧苄青霉素并使其在4L带挡板摇瓶中于37。C生长16小时。AP5培养基的组成为1.5g葡萄糖，11.0HycaseSF，0.6g酵母提取物(经检定的)，0.19g无水MgS。4,1.07gNH4C1,3.73gKC1,1.2gNaCl,120ml1M三乙醇胺，pH7.4,加水至1L，然后通过0.1|amSealkeen滤器无菌过滤。通过在1L离心瓶(Nalgene)中以3000xg离心来收获细胞并除去上清液。冷冻1小时后，^!夺沉淀物重悬于25ml冷的lOmMMES-10mMEDTA,pH5.0(緩沖液A)。加入250)al0.1MPMSF(Sigma)以抑制蛋白水解，并加入3.5ml储液10mg/ml鸡卵清溶菌酶(Sigma)以帮助细菌细胞壁溶解。冰上温和摇动1小时后，将样品以40,000xg离心15分钟。用緩冲液A将上清液调至50ml并加到以緩冲液A平衡的2mlDEAE柱上。然后将流出液加到以緩冲液A平tf的蛋白G-SepharoseCL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml床体积)上。用10ml纟爰冲液A清洗柱子并用1.25mllMTris,pH8.0中的3ml0.3M甘氨酸，pH3.0洗脱。然后用Centricon-30(Amicon)将F(ab)緩冲液交换到PBS中并浓缩至终体积0.5ml。所有F(ab)s进行SDS-PAGE以确定纯度，并通过电喷射质i普证实各个变体的分子量。在基于细胞的ELISA结合测定法(下文有描述)中，Fab,包括嵌合2H7Fab对CD20的结合是难以4全测的。因此，将2H7Fab型式重建成全长IgGl抗体，供测定和进一步的诱变。通过将嵌合2H7(v6.8)Fab以及人源化Fab型式2至6的VL和VH结构域亚克隆入先前记载的用于哺乳动物细胞表达的pRK载体(Gormanetal.，DNAProt.Eng.Tech.2:3-10(1990))，构建了用于表达全长IgG的质粒。简而言之，用￡coiV和消化每种Fab构建体以切出VL片段，将其克隆入用于表达完整轻链(VrCL结构域)的质粒pDRl(WO04/056312的图4)的￡co^V/i5//I位点。此外，用PvwII和jpal消化每种Fab构建体以切出VH片段，将其克隆入用于表达完整重链(VH-CHl-铰链-CH2-CH3结构域)的质粒pDR2(WO04/056312的图5)的尸vwll"/al位点。对于每种IgG变体，通过将轻链表达质粒和重链表达质粒共转染入腺病毒转化的人胚胎肾细胞系293(Grahametal.,J.Gen.Virol.36:59-74,(1977》进行了瞬时转染。简而言之，在转染前一天分配293细胞，并铺于含血清的培养基中。次日，加入制备成磷酸4丐沉淀的双链DNA,然后力口入pAdVAntageDNA(Promega，Madison,WI),细胞于37。C保温过夜。在无血清培养基中培养细胞并在4天后收获。用蛋白A-SepharoseCL-4B从培养物上清液中纯化抗体，然后緩沖液交换到10mM琥珀酸钠，140mMNaCl，pH6.0中，并用Centricon-10(Amicon)浓缩。通过定量氨基酸分析测定蛋白质浓度。为了测量与CD20抗原的相对结合亲和力，开发了基于细胞的ELISA测定法。将人B淋巴母细胞样WIL2-S细胞(ATCCCRL8885,美国典型培养物保藏中心AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD)在补充有2mML-谷氨酰胺，20mMHEPES,pH7.2和10%热灭活胎牛血清的RPMI1640中在潮湿的5%C02培养箱中进行培养。用含1%FBS的PBS(测定緩冲液)清洗细胞并以250-300,000个细胞/孔接种于96孔圆底板(Nunc,Roskilde,Denmark)中。将在测定缓沖液中两倍连续稀释的标准品(15.6-1000ng/ml2H7v6.8嵌合IgG)和三倍连续稀释的样品(2.7-2000ng/ml)加到板上。将板埋于冰中放置45分钟。为了去除未结合的抗体，将0.1mL测定緩冲液加到孔中。将板离心并去除上清液。用0.2mL测定緩沖液再清洗细胞两次。通过将过氧化物酶偶if关的山羊#元人Fc4元体(JacksonImmunoResearch,^VestGrove,PA)力口到斗反上来斗企测与板结合的抗体。保温45分钟后，如前所述清洗细胞。将TMB底物(3，3',5，5'-四曱基耳关苯胺；Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)力口到板上。通过加入1M磷酸来终止反应。用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)拟合滴定曲线。测定标准品在滴定曲线中点处的吸光度(mid-OD)及其对应的浓度。然后测定每种变体在此mid-OD处的浓度，并将标准品的浓度除以每个变体的浓度。因此该数值是各个变体相对于标准品的结合比率。实验之间相对亲和力(等效浓度)的标准偏差通常是+/-10%。如表4中所示，CDR交换变体(v.2)的CD20结合与嵌合2H7(v.6.8)相比有极大降低。然而，型式3至6显示出结合有所改善。为了测定将结合亲和力恢复成嵌合2H7的结合亲和力可能需要的最小突变数目，通过定点诱变构建了另外的突变和突变的组合，产生如表5所示的变体7至17。具体而言，这些包括VH突变A49G、F67A、I69L、N73K和L78A;及VL突变M4L、M33I和F71Y。型式16和17显示出最好的相对结合亲和力，在嵌合型式的亲和力的2倍之内，二者之间无显著差异(s.d.=+/-10%)。为了使突变数目降至最低，因此选择只有4个人框架残基突变成鼠框架残基的型式16(表5)作为人源化形式供另外的表征。表4:用基于细胞的ELISA比较人源化2H7IgG变体与嵌合2H7对CD20的相对结合亲和力。相对结合表示为嵌合2H7浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此比率<1表示所述变体的亲和力较弱。相对亲和力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变域中的框架替代是相对于CDR交换型式的，依照Kabat编号系统(Kabatetal.，同上文)。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表5:用于构建人源化2H7型式16(2H7.vl6)中的突变VH(A49G,R71V,N73K)和KL46P)的寡核苷酸序列。加下划线的密码子编码指示的氨基酸替代。对于VH(R71V,N73K)和VL(L46P),寡聚物显示为有义链，因为这些是用于Fab模板上的诱变的，而对于VH(A49G),寡聚物显示为反义链，因为这是与pRK(IgG重链)模板一起使用的。型式16的蛋白质序列见上文"组合物"部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>实施例2:2H7CDR区内的另外的突变还对通过丙氨酸扫描鉴定为重要的CDR位置测试了另外的残基替代及替代组合。若干组合变体，特别是v.96表现出比v.l6结合更紧密。表6:用基于细胞的ELISA(WIL2-S细胞)测量人源化2H7.vl6的CDR区中突变和非丙氨酸替代组合的影响。与CD20的相对结合表示为2H7.vl6亲本浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此比率<1表示所述变体的亲和力较弱；比率>1表示所述变体的亲和力较高。相对亲和力测定的标准偏差平均为+/-10%。可变域中的框架替代是相对于2H7.vl6的，依照Kabat编号系统(Kabatetal.，同上文)。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>实施例3:具有增强的效应器功能的人源化2H7变体因为2H7可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)二者介导B细胞的溶解，我们试图生成具有改良的CDC和ADCC活性的人源化2H7.vl6的变体。已经记载了为了通过增强与补体组分Clq的结合来改善CDC而进行的其它抗体Fc区内某些残基的突变(Idusogieetal.,J.Immunol.166:2571-2575(2001))。还已经记载了为了通过增强IgG与活化性Fq受体结合并削弱IgG与抑制性Fcy受体结合来改善ADCC的突变(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001》Prestaetal"Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002))。具体而言，如文献所述(Idusogieetal.，同上文(2001);Shieldsetal.,同上文)已经鉴定了用于改善CDC和ADCC活性的三处突变S298A/E333A/K334A(在本文中又称为三联丙氨酸突变体或变体；Fc区内的编号依照EU编号系统；Kabatetal.,同上文)。为了增强2H7的CDC和ADCC活性，构建了2H7Fc的三联丙氨酸突变体。生成了抗HER2抗体4d5的人源化变体，它具有突变S298A/E333A/K334A并称为4D5Fcl10(即抗p185HER2IgGl(S298A/E333A/K334A);Shieldsetal.,同上文)。用^pal和历>76/111消化编码抗体4D5Fc110的质粒p4D5Fcl10(Shieldsetal.,同上文)，将Fc片段(包含突变S298A/E333A/K334A)连入2H7重链载体pDR2-vl6的^al/历"c/in位点，生成pDR2-v31。型式31完整H链的氨基酸序列见上文组合物部分。L链与v16的相同。尽管IgGl抗体Fc区的恒定域在给定物种内相对保守，然而仍然存在等位基因变异(见综述LefrancandLefranc,in:ThehumanIgGsubclasses:molecularanalysisofstructure,fbnction,andregulation,pp.43-78,F.Shakib(ed.),PergammonPress,Oxford(1990》。表7:Fc区内的替代对CD20结合的影响。以框架替代的基于细胞(WIL2-S)的测定法测量对CD20的相对结合。Fc突变(*)以EU编号方式表示(Kabat,同上文)而且是相对于2H7.vl6亲本的。v.31Fc区中的三个丙氨酸变化的组合记载为"FcllO"。IgG变体显示了相对于2H7.vl6背景的突变。相对结合表示为2H7.v6.8嵌合体浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此比率<1表明所述变体的亲和力较弱。相对亲和力测定的标准偏差平均为+/-10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>实施例4:具有增强的稳定性的人源化2H7变体为了开发成治疗用蛋白质，希望选择在合适的配制緩冲液中对于氧化、脱酰胺或可能影响产品质量的其它过程保持稳定的变体。在2H7.vl6中，鉴定出若干残基可能是不稳定性的来源VL(M32)和VH(M34,N100)。因此，在这些位点引入突变，与vl6进行比较。表8:在基于细胞(WIL2-S)的测定中，为提高稳定性和/或效应器功能而设计的2H7变体对CD20的相对结合。IgG变体显示出相对于2H7.vl6背景的突变。相对结合表示为2H7.v6.8嵌合体浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此比率<1表示所述变体的亲和力较弱。相对亲和力测定的标准偏差平均为+/-10%。可变域的框架替代是相对于2H7.vl6的，依照Kabat编号系统，而Fc突变(*)以EU编号系统(Kabatetal.，同上)指示。(**)以2H7.vl6作为标准参比物对变体进行测量；相对数值以所述嵌合体的数值标准化。基于先前所才艮道的突变(Idusogieetal.(2000);Idusogieetal.(2001);Shieldsetal.(2001))，将另外的Fc突变与提高稳定性或亲和力的突变组合以改变或增强效应器功能。这些改变包括如上所述的S298、E333A、K334A;降低CDC活性的K322A;降低ADCC活性的D265A;提高CDC活性的K326A或K326W;及用于测试Fc区内同种异型变化的影响的E356D/M358L。这些突变均未引起CD20结合亲和力的显著差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>(**)以2HTvl6作为参比物测量的变体；相对结合值对嵌合体的数值标准化。为了测试稳定性突变对蛋白质降解速率的影响，将2H7.vl6和2H7.v73以12-14mg/mL配制于10mM组氨酸，6%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯20,pH5.8中并于40°C保温16天。然后测定保温后的样品，通过离子交换层析测定变体的电荷变化，通过大小排阻层析测定聚集和断裂变化，以及通过基于细胞(WIL2-S)的测定法测定相对结合变化。结果显示2H7v.73与2H7v.16相比在加速稳定性条件下通过离子交换层析测定的主峰级分丟失方面具有更高的稳定性。在聚集、断裂或结合亲和力方面没有观察到显著差异。实施例5:补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法基本上如文献所述(Idusogieetal"J.Immunol.164:4178-4184(2000);Idusogieetal.，J.Immunol.166:2571-2575(2001))，对2H7IgG变体测定它们介导WIL2-S细胞，一种表达CD20的淋巴母细胞样B细胞系的补体依赖性溶解的能力。将抗体自O.lmg/mL的储液进行1:3连续稀释。将每个稀释度的0.05mL等分试样加入装有0.05mL正常人补体溶液(Quidel，SanDiego,CA)的96孔组织培养板。向此混合物中加入0.05mL体积的50,000个WIL2-S细胞。于37。C保温2小时后，加入0.05mLAlamarblue溶液(AccumedInternational,Westlake,OH),继续于37。C另外保温18小时。然后拿走平板的封盖，将它们在轨道摇床上于室温摇动15分钟。用530nm激发滤光器和590nm发射滤光器读取相对荧光单位(RFU)。对于每种抗体用KaleidaGraph软件将RFU拟合成浓度的函数，由此计算EC50。结果(表9)显示出人源化2H7抗体的CDC有惊人的改善，其中v.73具有与Rituxan⑧相似的相对效力，v.75的效力比Rituxan⑧高3倍，而v.16的效力比Rit画n⑧弱3倍。表9:2H7抗体与Rituxan的CDC活性比较。数字>1表明CDC活性弱于Rituxan,而数字<1表明活性强于Rituxan。抗体由稳定的CHO细胞系生成，除了那些以(*)指示的是瞬时生成的之外。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>实施例6:抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)测定法基本上如文献所述(Shieldsetal.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)),利用乳酸脱氢酶(LDH)读数，对2H7IgG变体测定它们介导WIL2-S细胞，一种表达CD20的淋巴母细胞样B细胞系的天然杀手细胞(NK细胞)溶解的能力。从用100mLPBS(磷酸盐緩冲盐水)稀释的100mL肝素化血液制备NK细月包，所述血液获自对于FcyRin，又称为CD16(Koeneetal.,Blood90:1109-1114(1997))已鉴定同种型的正常人供体。在此实验中，NK细胞来自CD16杂合(F158/V158)的人供体。将稀释的血液加到15mL淋巴细胞分离培养基(ICNBiochemical,Aurora,Ohio)上成层，并以2000RPM离心20分钟。将两层之间界面的白细胞分装入4个干净的50mL管，管中装有含15%胎牛血清的RPMI培养基。将管子以1400RPM离心5分钟后丟弃上清液。将沉淀物重悬于MACS緩冲液(0.5%BSA,2mMEDTA)，依照制造商的方案(MiltenyiBiotech)用珠子(NKCellIsolationKit,130-046-502)纯化NK细胞。NK细胞在MACS緩沖液中稀释至2xl()6个细胞/mL。将在测定培养基(F12/DMEM50:50无甘氨酸，lmMHEPES緩沖液pH7.2,青霉素/链霉素(100单位/mL;Gibco),谷氨酰胺，和1%热灭活胎牛血清)中连续稀释的抗体(0.05mL)加入96孔圆底组织培养板。将WIL2-S细胞在测定緩冲液中稀释至浓度4x10VmL。在96孔板中将WIL2-S细胞(0.05mL每孑L)与稀释抗体混合并于室温保温30分钟以使抗体结合CD20(调理作用)(opsonization)。通过向每个孔中加入O.lmLNK细胞起始ADCC反应。在对照孔中，加入2%TritonX-IOO。然后将平板于37。C保温4小时。用细胞毒性(LDH)检测试剂盒(Kit弁1644793,RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana.)依照制造商的说明书测量释放的LDH水平。向每个孔中加入0.1mLLDH显影剂，随后混合10秒。然后用铝箔覆盖平板并于室温黑暗中放置15分钟。然后读取4卯nm的光密度并通过除以对照孔中测得的总LDH而用于计算溶解百分比。将溶解情况作为抗体浓度的函数作图，用4参数曲线拟合(KaleidaGraph)来测定EC50浓度。结果显示出人源化2H7抗体在ADCC中有活性，其中v.31和v.75的相对效力比Rituxan高20倍，v.16的效力比Rituxan高5倍，而v.73的效力比Rituxan高几乎44咅。表10:以n次实验为基础，比较了2H7抗体与2H7.vl6对WIL2-S纟田月包的ADCC活性(数值>1表示效力弱于2H7.vl6低，数值<1表示效力强于2H7.vl6)。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>进行另外的ADCC测定以比较2H7变体组合与Rituxan。这些测定的结果表明2H7.vl14和2H7.vl15的ADCC效力比Rituxan⑧提高大于10倍(表11)。表11:以n次实验为基础，比较了2H7抗体与Rituxan⑧对WIL2-S纟田月包的ADCC活性(数值>1表示效力弱于Rituxan,数值<1表示效力强于Rituxan)。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>实施例7:FcRn结合测定法将Fc中具有氨基酸改变的可溶性Fc变体(例如N434W,N434Y，N434F,N434A,N434H,N434A+E380A+T307A)表达，纯化，并在BIAcore结合测定法中测定它们对人、猕猴、大鼠和小鼠FcRn的亲和力。还通过大小排阻层析分析Fc变体以测定它们的聚集趋势。为了表达变体Fc片段，用突变型pW0437噬菌粒转化34B8大肠杆菌细胞，在无磷酸盐培养基中于30。C培养24小时以诱导Fc基因的表达，然后收获细胞。将细胞浆冷冻过夜，然后在10mMTris,lmMEDTA中通过渗压震扰(osmoticshock)来溶解。将溶解液通过离心而澄清并加到蛋白A柱上。用PBS洗柱，用蛋白A柠檬酸盐洗脱緩冲液(0.1M柠檬酸盐，pH3.0)洗脱可溶性Fc,并用TrispH7.5中和。用AmiconCentriprep浓缩可溶性Fc。来自人、猕猴、大鼠或小鼠的FcRn通过NHS化学法以不同密度(100-3000RU)固定在BiacoreCM5芯片上。将Fc变体在pH6.0的PBS中从10pM连续稀释至lnM，随时间监测结合。对于亲本无4交链Fc(即野生型)，huFcRn几乎立即达到平衡结合，表明它具有非常快的结合和解离速率，平衡分析测定的Kd大约为700nM。对于N434W变体，结合速率显著减慢，解离速率极其慢。通过以较慢流速较长时间注入N434W，平衡分析是有可能的，且Kd大约是4nM。变体N434W、N434F、N434A和三联突变体N434A+E380A+T307A在pH6.0时亲和力相对于野生型Fc分别明显增加大约170倍、大约9倍、大约2.7倍和大约14倍。相反，在pH7.4,N434变体对huFcRn的亲和力实在太低以至于不能在此测定法中测量。N434W对猕猴FcRn的结合相对于野生型的改善不是如此显著，比对大鼠FcRn的结合只显示出高大约10倍，而对小鼠FcRn的结合则实际上与野生型的一样。因此通过此突变获得的改善是对人FcRn特异的。用生物素化FcRn在ELISA中分析2H7.vl38的人IgGl变体对人FcRn的pH依赖性结合。将MaxiSorp96孔孩i孔4反(Nunc,Roskilde,Denmark)用100^1/孔配制于50mM碳酸盐緩沖液pH9.6中的2|ig/mlNeutrAvidin(Pierce,Rockford，IL)于4°C包被过夜。用含0.05%聚山梨醇酯的PBS(洗涤緩冲液)pH7.4洗涤，并用含0.5%BSA的PBSpH7.4以150jil/孔进行封闭。于室温保温1小时后，用洗涤緩冲液pH7.4洗涤平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics，Cleveland,OH)将人FcRn生物素化。将生物素化的FcRn以2(xg/ml，100pl/孔加到平板上,其配制于含0.5%BSA,0.05%聚山犁醇酯20的PBS(样品緩冲液)pH7.4中。将平板保温1小时并用洗涤緩沖液pH6.0洗涤。将在样品緩沖液pH6.0中7次两倍连续稀释的IgG抗体(3.1-200ng/ml)加至平板上。保温2小时后，用洗涤緩沖液pH6.0洗涤平板。通过力口入100jil/孑L酉己制于样品緩冲液pH6.0中的过氧化物酶标记的山羊F(ab，)2抗人IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)来4全测所结合的IgG。保温1小时后，用洗涤緩冲液pH6.0洗涤平板，加入100)!l/孔底物3，3',5,5'-四曱基联苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)。通过加入100(!l/孑L1M磷酸来终止反应。在multiskanAscentreader(ThermoLabsystems，Helsinki,Finland)上读取450nm处的吸光度。计算标准曲线中点处的吸光度(mid-OD)。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)从滴定曲线测定标准品和样品在此mid-OD处的相应浓度。通过用标准品的mid-OD浓度除以样品的来计算相对活性。为了评估所结合IgG与FcRn在pH6.0或pH7.4的解离，类似的进行所述测定，只是在样品保温步骤后及在洗涤平板时加入100(!l/孔样品緩沖液pH6.0或7.4。将平板保温45分钟并洗涤。然后继续如上所述进行测定。实施例8:具有FcRn突变的人源化抗CD20IgGl变体的表征还对通过噬菌体展示鉴定的人Fc突变测试了它们在完整抗体2H7.vl38的背景中的效果。2H7.vl38是人源化的抗CD20抗体，其中Fc通过以下突变进行了修饰以提高ADCC和CDC活性S298A、K326A、E333A、K334A。向此背景中引入位置N434的突变，如前所述通过瞬时转染293细胞制备IgG(表12)。在每种情况中，根据如上所述的大小排阻层析，纯化的IgG变体显示出具有低水平的蛋白质聚集。表12:人源化抗CD20抗体2H7.vl38的变体2H7变体FcRn突变<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>用生物素化的FcRn在ELISA中分析2H7.v138的人IgGl变体对人FcRn的pH依赖性结合。将MaxiSorp96孔微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)用100jil/孔配制于50mM碳酸盐緩沖液pH9.6中的2吗/mlNeutrAvidin(Pierce,Rockford,IL)于4°C包被过夜。用含0.05%聚山梨醇酯的PBS(洗涤緩沖液)pH7.4洗涤，并用含0.5%BSA的PBSpH7.4以150^1/孔进行封闭。于室温保温1小时后，用洗涤緩冲液pH7.4洗涤平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics,Cleveland,OH)将人FcRn生物素化。将生物素化的FcRn以2|ig/ml,100)!l/孔加到平板上，其配制于含0.5%BSA,0.05%聚山犁醇酯20的PBS(样品緩沖液)pH7.4中。将平板保温1小时并用洗涤緩沖液pH6.0洗涤。将在样品緩沖液pH6.0中7次两倍连续稀释的IgG抗体(3.1-200ng/ml)加至平板上。保温2小时后，用洗涤緩冲液pH6.0洗涤平板。通过加入100^1/孔配制于样品緩冲液pH6.0中的过氧化物酶标记的山羊F(ab，)2抗人IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch,WestGrove，PA)来4全测所结合的IgG。保温1小时后，用洗涤緩冲液pH6.0洗涤平板，加入100nl/孔底物3,3',5,5'-四曱基联苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)。通过加入100jil/孔1M磷酸来终止反应。在multiskanAscentreader(ThermoLabsystems,Helsinki,Finland)上读取450nm处的吸光度。计算标准曲线中点处的吸光度(mid-OD)。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)从滴定曲线测定标准品和才羊品在此mid-OD处的相应浓度。通过用标准品的mid-OD浓度除以样品的来计算相对活性。为了评估所结合IgG与FcRn在pH6.0或pH7.4的解离，类似的进^t所述测定，只是在样品保温步骤后及在洗涤平板时加入100lal/孔样品緩冲液pH6.0或7.4。将平板保温45分钟并洗涤。然后继续如上所述进行测定。结果表明相对结合亲和力类似于对Fc变体所观察到的。在pH6.0，相对结合亲和力是v477>v478=v479〉v364>v138。在pH7.4，相对结合亲和力一致的弱于在pH6.0时的相对结合亲和力，具有相同的相对结合v477>v478=v479>v364>vl38。这些Fc突变可广泛应用于人IgG抗体。实施例9:2H7变体在初步研究中在猕猴中的体内效果在正常雄性猕猴(iWacaca/oyc/cw/an》中测试通过瞬时转染CHO细胞生成的2H7变体以评估它们的体内活性。其它抗CD20抗体，诸如C2B8(Rituxan⑧)证实了在正常灵长类动物中消减B细胞的能力(Reffetal.，Blood83:435-445(1994》。在一项研究中，比较了人源化的2H7变体。在平行研究中，也在猕猴中测试了Rituxan⑧。5个剂量给药组，每组使用4只猴子(1)媒介，(2)0.05mg/kghu2H7.v16,(3)10mg/kghu2H7.v16，(4)0.05mg/kghu2H7.v31，和(5)10mg/kghu2H7.v31。抗体以静脉内施用，浓度为0、0.2或20mg/mL，总共两剂，一剂在研究的第l天，另一剂在第8天。剂量给药的首日指定为第1天，而前一天指定为第-l天；回收(每组两只动物)的首日指定为第11天。在第-19、-12、1天(剂量给药前)和第一剂后6、24和72小时收集血液样品。在第8天(剂量用药前)、第10天(处死每组两只动物前)、及第36和67天(对于回收动物)采集另外的样品。通过对CD3VCD40+细胞计数的FACS方法来测定外周B细胞浓度。猴样品中总淋巴细胞的CD3-CD40+B细胞的百分比通过以下门控策略获得。在前向散射/侧向散射的散点图上标记淋巴细胞群，限定为区域1(R1)。利用Rl中的事件，展示CD40和CD3标志物的荧光强度点图。用焚光标记的同种型对照来测定CD40和CD3阳性的各自截留点。结果表明2H7.vl6和2H7.v31二者都能够在10mg/kg剂量产生完全的外周B细胞消减，以及在0.05mg/kg剂量产生部分的外周B细胞消减。两种抗体在剂量给药后的前72小时期间测量到的B细胞消减的时间进程和程度相似。随后的回收动物分析表明与服用2H7.vl6的动物相比，用2H7.v31处理的动物显示出B细胞消减延长。具体而言，对于用10mg/kg2H7.vl6处理的回收动物，B细胞在第IO天和第36天采样之间的有些时间显示出实质性的B细胞恢复。然而，对于用10mg/kg2H7.v31处理的回收动物，B细胞直到第36天和第67天之间的有些时间才显示出恢复。这说明与2H7.vl6相比，2H7.v31的完全消减持续时间更长，大约为1个月。在低或高剂量的猴子研究中没有观察到毒性，而且总体病理学(grosspathology)是正常的。在其它研究中，在这些猴子中遵循间隔两周静脉内施用两剂，直到所评估的最高剂量(100mg/kgx2=1200mg/m2x2)，v16都得到很好的耐受。猕猴中2H7.vl6较之于Rituxan⑧的数据表明，CDC活性下降5倍对效力没有不利的影响。具有强ADCC活性但CDC活性降低的抗体在首次输注方面可能比具有更高CDC活性的抗体具有更有利的安全性特征。实施例10:肿瘤生长的体内抑制在Balb/c棵(无胸腺)小鼠中评估rhuMAb2H7.vl6抑制Raji人B细胞，一种淋巴瘤细胞系(ATCCCCL86)生长的能力。Raji细胞表达CD20，而且拒报道在棵鼠中生长，产生转移性疾病；肿瘤生长受到Rituxan⑧的抑制(Clynesetal.,NatureMedicine6:443-446(2000))。将56只8-10周龄Balb/c棵鼠分成7组(A-G),每组由8只小鼠组成。在第O天，每只小鼠在侧面接受皮下注射5x1(^个RajiB淋巴瘤细胞。从第0天开始，每只小鼠接受100uL阴性对照溶液(PBS;磷酸盐緩沖盐水)、Rituxan⑧或2H7.vl6。剂量由体重决定，而且药物经尾静脉以静脉内递送。A组小鼠接受PBS。B-D组分别接受5.0mg/kg、0.5mg/kg和0.05mg/kgRituxan。E-G组小鼠分别才妄受5.0mg/kg、0.5mg/kg和0.05mg/kg2H7.vl6。每周重复注射，共6周。在治疗期间以一周为间隔对每只小鼠检查注射部位可触知肺瘤的存在情况，如果存在就测量并记录肺瘤的体积。在第8周(在没有处理的两周间隔后)进行最后的检查。此研究的结果显示rhuMAb2H7.vl6和Rituxan⑧二者都有效抑制棵鼠中皮下Raji细胞肺瘤生长。从第4周开始在PBS对照组中观察到肿瘤生长。然而，在研究的8周持续时间在用5mg/kg或0.5mg/kgRituxan⑧或2H7.vl6处理的组中没有观察到肺瘤生长。在低剂量0.05mg/kg处理组中，在2H7组的一只动物和Rituxan组的一只动物中观察到肿瘤。实施例11:rhuMAb2H7(2H7.vl6)在中度至重度类风湿性关节炎中的I/II期研究《的此项研究的主要目的是评估在中度至重度类风湿性关节炎(RA)患者中逐步增大rhuMAb2H7静脉内(IV)剂量的安全性和耐受性。这是在中度至重度RA受试者中联合MTX逐步增大rhuMAb2H7(PRO70769)剂量的安全性研究，是随机的、以安慰剂为对照的、多中心的、盲试I/II期的、调查人员和受试者盲试的。此研究由剂量逐步增大阶段和募集更多数目受试者的第二阶段组成。主办者对于治疗安排仍然知情(unblinded)。募集患有中度至重度RA、1-5种减轻疾病的抗风湿药或生物制剂失败了、目前对MTX治疗具有不满意的临床应答的受试者。要求受试者在进入研究之前每周接受10-25mg范围内的MTX至少12周，并且在接受他们的初始剂量研究药物(PRO70769或安慰剂)之前MTX的剂量稳定至少4周。受试者还可接受稳定剂量的口服皮质类固醇(高达每天10mg，或强的松等效物)和稳定剂量的非类固醇抗炎药(NSAID)。受试者在第1天和第15天依照如下剂量逐步增大计划接受两次静脉内输注指定剂量的PRO70769或安慰剂等同物。依照特定的标准、经内部安全性数据检查委员会检查安全性数据并评估每组中治疗的最后一名受试者第二次输注后72小时的急性毒性后进行剂量逐步增大。如果剂量水平在剂量逐步增大阶段证实是可耐受的，在剂量逐步增大阶段后，在以下每个剂量水平随机追加40名受试者(32名接受活性剂，8名接受安慰剂)2x50mg、2x200mg、2x500mg和2x1000mg。研究中募集大约205名受试者。获取并记录B细胞计数。在6个月的功效评估后，在48周跟踪期中用流式细胞术评估B细胞计数。B细胞消减不会认为是剂量限制性毒性(DLC),而是PR070769处理的预期药效结果。在子研究中，在各个时间点从受试者获取用于血清和RNA分析的血液以及尿样。这些样品可用于鉴定可能预示中度至重度RA受试者对PR070769治疗的响应的生物标志物。研《义、理各组受试者在第1天和第15天依照以下逐步增大计划接受两次静脉内输注指定剂量的PRO70769或安慰剂同等物-10mgPRO70769或安慰剂同等物4名受试者接受活性剂，1名对照-50mgPRO70769或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-20011^11070769或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-50011^尺070769或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-1000mgPRO70769或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照^效PRO70769的功效通过ACR响应来测量。通过治疗组总结获得ACR20、ACR50和ACR70响应的受试者的百分率，并且产生每组的95%置信区间。通过治疗和访问总结这些响应的组成及其距基线的变化。实施例12根据对2H7.v16晶体结构的检查联合丙氨酸扫描数据，看起来包括NIOO(VH)和邻近残基的CDR-H3区可能涉及抗原结合。我们因此聚焦于N100(Vh)，在2H7.vl6的背景中生成了许多氨基酸替代。结果(表13)表明Tyr或Trp替代相对于v16改善了结合情况。表13:为增强对CD20的结合亲和力而设计的2H7变体的相对结合，以基于细胞(WIL2-S)的测定法用转染的293细胞中产生的IgG变体测定。指出了IgG变体相对于2H7.vl6背景的突变(Kabat编号)。相对结合表示为2H7.vl6浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此，比率>1表明所述变体与型式16相比对CD20的结合亲和力提高了。<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>为了测定通过S100a(VH)处的替代是否能获得另外的亲和力提高，在此位置进行了许多突变，在此案中是以2H7.v472(表13)为背景的。基于细胞的结合比较的结果(表14)表明2H7.v511对细胞上CD20的结合有大于3倍的提高。通过定点诱变构建了2H7.v511重链的基因，其中使用编码2H7.vl38重链的质粒ssDNA作为模板，及命名为CA1568的5'-磷酸化脱氧寡核苷酸5'-CCAGACGTCGAAGTACCAGTAGCGGTA^￡1GTATACGACGCG-3'(SEQIDNO.45)。标下划线的核苷酸对应于反义DNA链中编码CDR-H3变化N100Y、S100aR的密码子。2H7.v511的轻链与2H7.vl38的相同，使用相同的质粒来表达所述轻链。hu2H7变体诸如v138和v511可以在CHO细胞中表达，使用图9所示用于表达2H7.v16的载体。表14:为增强对CD20的结合亲和力而设计的2H7变体的相对结合，以基于细胞(WIL2-S)的测定法用转染的293细胞中产生的IgG变体测定。指出了IgG变体相对于2H7.vl6背景在CDR位点处的突变(Kabat编号)。此外，与2H7.vl6相比，所有变体均包含Fc变化S298A、K326A、E333A和K334A(EU编号)。相对结合表示为2H7.vl6浓度相对于等效结合所需变体浓度的比率；因此，比率>1表明该变体与型式16相比对CD20的结合亲和力提高了。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>因为这些变体还包含Fc改变，我们另外测量了竟争性Scatchard测定法中的结合情况以测定表观平衡解离常数(Kd)。对于结合WIL2s-S细胞的人源化抗CD20单克隆抗体，用放射性标记的抗体2H7.v511和2H7.vl38IgG测定平衡解离常数(Kd)。抗CD20单克隆抗体在CHO细胞中生成。所有稀释均在结合测定緩冲液(含0.5%牛血清清蛋白，25mMHEPESpH7.2和0.01%叠氮化钠的DMEM培养基)中进行。将浓度为O.lnM的125I-2H7.v511和125I-2H7.vl38(用乳过氧化物酶石典化)的等分试样(0.05mL)分配入V底96孔微量滴定板的孔。加入未标记抗体的连续稀释液(0.05mL)并混合。向每个孔中加入0.05mL体积的30,000个WIL2-S细胞。密封平板并于室温放置24小时，然后以2，500RPM离心15分钟。然后吸出上清液，并将细胞沉淀物清洗和离心。再次吸出上清液，将沉淀物溶于INNaOH并转移至管中供伽马计数。将凄t据用于Scatchard分析(MunsonandRodbard,Anal.Biochem.107:220-239(1980))，其中使用Ligand程序(McPherson,Comput.ProgramsBiomed.17:107-114(1983》。下表15所示结果表明抗CD20单克隆抗体2H7.v511和2H7.vl38以高亲和力结合WIL2-S细胞上表达的CD20，而且2H7.v511的结合亲和力比2H7.vl6高2.2倍至7.3倍。用已标记125I-2H7.v511和^I-2H7.vl38得到的数值间的差异可能反映了2H7.v511的CDR-H3中新的Tyr碘化导致的抗原结合的扰动。因此看起来有可能125I-2H7.vl38的结果更准确的反映了相对结合亲和力。表15:来自Scatchard分析的抗CD20人源化单克隆抗体的平衡结合亲和力(+/-拟合的标准误差)。竟争抗体标记抗体表观Kd(nM)相对亲和力<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>作为2H7变体结合亲和力的补充比较，用溶解的CD20进行ELISA。为了进行比较，构建了CDR区与2H7.vl6相同且Fc区与2H7.v511相同的另一变体2H7.v588。用溶于PBS的2.5|ig/ml可溶性CD20(Genentech;如前所述制备)将NUNCMaxisorpTM平板于4°C包被过夜，然后用0.5%BSA于室温封闭1小时。将在0.5%BSA中连续稀释的样品在平板上保温2小时。洗涤后，用HRP偶联的抗人Fab抗体(山羊抗人Ig,Fab'2-HRP偶联物，来自NB)检测所结合的抗体，其中以3,3',5，5'-四曱基联苯胺(KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg，MD)作为底物。读取450nm的吸光度。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph;SynergySoftware,Reading,PA)拟合滴定曲线。计算与标准品滴定曲线中点吸光度对应的抗体变体的浓度。结果(图3)显示2H7.v588和2H7.vl6具有相似的结合亲和力；然而，在此测定法中2H7.v511表现出对可溶性CD20的结合提高了大约90倍。实施例13:ADCC活性如前所述用WIL2-S细胞和从正常人供体纯化的NK细胞评估ADCC活性，图4的效应器:靶物的比率是大约4，而图11测定法的比率是5:1。图4和图11所示结果表明与2H7.vl6和其它2H7变体相比，2H7.v511的ADCC效力和最大活性提高了。2H7.v588显示出与2H7.v511相似的效力和最大活性(图4)，表明进一步的CD20亲和力改善可能不会显著提高ADCC活性。实施例14:CDC活性还如上所述用WIL2-S细胞和人补体评估了CDC活性。图5所示结果表明与2H7.v588相比，2H7.v511的CDC效力提高了，与2H7.vl6相比，2H7.v511的效力大大提高了。正如用先前所述变体观察到的，提高CD20亲和力看起来增强了体外CDC活性。在比较2H7.v511与其它2H7变体的分开的CDC测定中，v511也展示出高于v31、v488和v114的CDC活性，如图10所示。图10中的CDC测定法基本上如上所述以96微孔板格式进行，修改如下。将50(iL自300-1000nM开始的连续稀释的2H7.v511(及实施例15图12中总结的实验中的Rituxan)与50jiL正常B细胞(lxl06/ml,每孔50,000个细胞)或50(iLWIL2-S细胞(30,000个)连同50|iL1:4稀释的正常人血清补体(Quidel)—起保温。用负选4奪(Rosettesep,StemCellTechnologies)和Ficoll画PaquePlus(AmershamBiosciences)梯度分离从力口有肝素抽耳又的全血中分离正常B细胞。于37。C保温2小时后，加入50|iLAlamarBlue(BiosourceInternational)并于37°C再保温18小时。将平板轻轻摇动15分钟，然后在焚光平板读数器(激发535，发射595)上读数以测定相对荧光单位(RFU)。将观察到的RFU值相对于mAb浓度在KaleidaGraph中作图，并用4参数拟合画出曲纟戋。实施例15:体内B细胞消减在B细胞消减的转基因小鼠模型中比较2H7.v511与2H7.vl6的体内活性。给转基因小鼠(hCD20Tg倍mCD16;hCD16TgW-)，每组5只，每只小鼠静脉内注射125吗或12.5吗(相当于5和0.5mg/kg)抗体。图6、7、13和14中每个的hlgGl(空心条)是同种型对照抗体。第2天，通过FACS分析对血液和选定组织区室中的B细胞数进行计数。结果(图6)显示2H7.v511在低剂量和高剂量都比2H7.vl6更有效的消减血液和腹腔中的B细胞。在脾中(图7),2H7.v511在低剂量显示出微弱至显著更多的消减，但此差异在高剂量没有观察到。图8显示了实验的示意图并总结了vl6和v511之间的CD20结合和Fc功能的水平。还在小鼠模型中比较了2Hlv511与rituximab(Rituxan⑧)的B细胞消减情况；实验概述于图12。如图13所示，2H7.v511在低剂量和高剂量都显示出比rituximab更高的血液和腹腔B细胞消减。图14显示了脾中的B细胞消减情况。在0.5mg/kg(图中的12.5(ig)的低剂量，用v511比用rituximab更有效的消减总的和滤泡脾B细胞；然而，v511表现出在介导边缘区B细胞消减方面与rituximab相比效率相似或稍低。还基本上如上文实施例9所述在猕猴中研究了2H7.v511的体内效果。实施例16:肿瘤生长的体内抑制依照上文实施例10所述流程在Balb/c棵(无胸腺)鼠中评估了2H7.v511抑制Raji人B细胞，一种淋巴瘤细胞系(ATCCCCL86)生长的能力。实施例17:FcRn结合对药动学影响的体内试验为了测定提高FcRn结合对这些Fc变体抗体体内药动学的影响，给猕猴(Macaca/oyc/cM/an》或其它灵长类物种静脉内注射每种抗体变体，随时间推移收集血样以监测抗体的清除。在一个或多个剂量水平注射数只动物。在一个实验中，在时间零点和第1天单剂静脉内注射l-20mg/kg。在剂量给药前和剂量给药后6小时、24小时和72小时收集血液(血清)样品。在第8天、第10天、第30天和第60天收集另外的样品。用ELISA测定血清样品中的抗体浓度。用标准药理学技术(ShargelandYu,AppliedPharmaceuticsandPharmacokinetics,Fourthedition,pp.67-98,AppletonandLange,Stamford,CT(1999))对血清中抗体浓度的时间依赖性降低建模。使用二室模型(two-compartmentmodel)来说明抗体在组织间的最初分布(a阶段)，随后是终止或消除阶段((3阶段)。如此计算的消除半衰期(tv/)揭示了FcRn结合提高的效果，因为FcRn起到了维持循环中的IgG的作用。实施例18:对来自CLL患者的细胞的ADCC、CDC活性在此项研究中，测试了抗体2H7.v511和v114对来自CLL患者的B细胞的补体活性。PBMC分离自三名CD20阳性的CLL患者(在CLL患者中，在PBMC级分中找到的大多数细胞是B细胞)。在96孔微孔板格式中，将来自每名患者的50,000个PBMC与50pl自lOOOnM开始并1:3倍连续稀释的抗体的滴定mAb(vl14、v511或Rituxan)混合。每个孔接受50(il已经1:4稀释的正常人血清补体。将混合物于37。C保温2小时，然后加入50)il代谢染料指示剂AlamarBlue(细胞溶解的指示剂)并继续于37°C保温过夜(约16小时)。将96孔板于室温摇动1分钟并在荧光平板读数器上于535nm/590nm读数。相对荧光单位相对于抗体浓度作图，得到EC50。从比较v114与Rituxan的CDC活性的图15和比较v511与Rituxan的图16显示的结果可见，v511和vll4二者对所有3名患者的效力大致相当，但显著优于Rituxan禾口vl6。在分开的研究中，比较了2H7.v511与Rituxan在体外测定法中对MEC1B-CLL细胞系(Stacchini,Aetal.(1999)LeukemiaRes.23:127-136)和来自B-CLL(B细胞相关CLL)患者的B细胞的ADCC效力。实'验如下进行。依照制造商(RosetteSep,StemCellTechnologies)推荐的方案用负选择从lOOmL正常人全血中分离NK细胞。全血供体在NK细胞上CD16的表型表达方面有所变化。等位基因差异发生于第158位，包括缬氨酸-缬氨酸、缬氨酸-苯丙氨酸和苯丙氨酸-苯丙氨酸表型。典型的是，用缬氨酸-苯丙氨酸表型进行测定。如下在圓底96孔微孔板中进行测定。将50^L自10-100nM开始连续稀释的mAb与50(iL靶细胞一起保温。靶细胞包括B-CLLMEC1细月包系(10,000个每50jiL)及来自B-CLL患者的PBMC(30,000个每50jiL)。PBMC用标准Ficoll-PaquePlus梯度分离从CLL供体的全血分离。与连续稀释的抗体于室温保温30分钟后，加入50(iLNK细胞(50,000个)并继续于37°C保温4小时。将平板以1500rpm离心10分钟并除去lOOuL细胞培养基。通过测量由溶解的细胞所释;故的乳酸脱氢酶的量(LDH试剂盒，Roche)来测定细胞溶解水平。测定相对于mAb浓度的溶解百分率并用4参数曲线拟合在KaleidaGraph中作图。报告使用MEC1细胞系得到的1(35()值。用点至点的线图绘制CLLPBMC数据并报告在30、5和0.8nM的杀伤百分率。结果显示在所有三名患者的样品中2H7.v511的ADCC活性均高于Rituxan。在30nM、5nM和0.8nM抗体时，2H7.v511较之Rituxan的提高分别是2.8倍、6.2倍和5.4倍。NK细胞是VF表型的。在介导MEC1细胞的细胞溶解方面，2H7.v511的ADCC活性也高于Rituxan。2H7.v511的活性比Rituxan高大于13倍，2H7.v511的ICso是0.95pM而Rituxan的是0.012nM。NK细胞是VV表型的。结论总之，与2H7.vl6相比，2H7.v511和v114显示出升高的CD20结合亲和力、升高的CDC活性、升高的ADCC活性和升高的对于B细胞体内消减的体内#丈力。实施例19依照下表所示的研究设计用2H7.v511和vll4在猕猴中进行研究以评估安全性、在灵长类动物中的PK及体内正常B细胞消减。所述动物在每个剂量水平接受4次每周一次的剂量用药。对2.5或50mg/kgx4剂量给药的动物进行的分析显示v511和v114都消减外周B细胞。在用v511进行的初步研究中，在50mg/kg时外周B细胞迅速且完全消减。才艮据尸检发现，组织B细胞在此剂量也有显著消减。<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>实施例20:NHL的I/II期临床研究下表显示了关于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的一项I/II期临床研究设计，其中在一项研究中使用抗体hu2H7.v16而在平行研究中使用hu2H7.v511。抗体经静脉内输注来施用。此剂量给药方案也可用于上文所述本发明的其它hu2H7变体。非何杰金氏淋巴瘤的2H7I/II期研究-剂量/输注速率<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>实施例21:NHL的I期临床研究2下表显示了关于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一项I期临床研究设计，其中在一项研究中使用抗体hu2H7.v16而在平行研究中使用hu2H7.v511。抗体经静脉内输注来施用。此剂量给药方案也可用于上文所述本发明的其它hu2H7变体。每剂相隔3周给药，总共8剂。3组(10名患者/组)q3wksx8<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>实施例22:NHL的I/II期剂量逐步增大分组下表显示了关于使用抗体hu2H7.v511治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一项I/II期临床研究设计。患者每周一次用药，共4周。通过例如CT扫描看肺瘤收缩来测量功效。(每组3-6名患者)<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>页实施例23:NHL的I/II期剂量逐步增大分组下表显示了关于使用抗体hu2H7.v511治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一项MI期临床研究设计。患者每周一次用药，共4周。通过例如CT扫描看肿瘤收缩来测量功效。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>实施例24:2H7.v511在中度至重度类风湿性关节炎中的I/II期研究^f兌^理的沒f各组受试者按照如下逐步增大计划在第1天和第15天以指定剂量接受两次静脉内输注hu2H7.v511或安慰剂同等物-10mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-50mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-100mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-200mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-300mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照-500mghu2H7.v511或安慰剂同等物8名受试者接受活性剂，2名对照《放2H7.v511的功效通过ACR响应来测量。通过治疗组总结获得ACR20、ACR50和ACR70响应的受试者的百分率，并且产生每组的95%置信区间。参考文献本申请中引用的参考文献，包括专利、已公布的申请及其它出版物，均在此收入作为参考。除非另有说明，本发明的实行中将采用分子生物学等的常规技术，这些均在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有完整的阐述。参阅例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(J,Sambrooketal"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y"1989》CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubeletal"eds.，1987updated);^E^ew"'a/iVfo/ecw/ar(T.Browned"IRLPress1991);GeneExpressionTechnology(Goeddeled.,AcademicPress1991);MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGsnes(A.Bothwelletal.eds.,BartlettPubl.1990》GeneTransferandExpression(M.Kriegler,StocktonPress1990);RecombinantDNAMethodologyII(R.Wuetal.eds"AcademicPress1995);PCR:APracticalApproach(M.McPhersonetal.,IRLPressatOxfordUniversityPress1991);OligonucleotideSynthesis(M.Gaited"1984);CellCultureforBiochemists(R.Adamsed"ElsevierSciencePublishers1990);GeneTransferVectorsforMammalianCells(丄Miller&M.Caloseds"1987);MammalianCellBiotechnology(M.Butlered"1991);AnimalCellCulture(J.Pollardetal.eds"HumanaPress1990);CultureofAnimalCells,2ndEd.(R.Freshneyetal.eds.,AlanR.Liss1987);FlowCytometryandSorting(M.Melamedetal.eds.,Wiley-Liss1990);丛书MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.,WirthM.andHauserH.(1993);ImmunochemistryinPractice'3rdedition,A.Johnstone&R.Thorpe,BlackwellScience,Cambridge,MA，1996;TechniquesinImmunocytochemistry(G.Bullock&P.Petruszeds"AcademicPress1982,1983,1985,1989);HandbookofExperimentalImmunology(D.Weir&C.Blackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmunology(J.Coliganetal.eds.1991);Immunoassay(E.RDiamandis&T.K.Christopoulos,eds.，AcademicPress,Inc.,1996);Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress,NewYork;EdHarlowandDavidLane,AntibodiesAlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988;AntibodyEngineering,2ndedition(C.Borrebaeck,ed.,OxfordUniversityPress,1995);丛书AnnualReviewofImmunology;及丛书AdvancesinImmunology。权利要求1.结合人CD20的人源化2H7抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQIDNO.25的轻链可变区(VL)序列和SEQIDNO.8的重链可变区(VH)序列，但VH-CDR2中有氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代。2.权利要求1的抗体，其中N100用Y替代。3.权利要求1的抗体，其中N100用W替代。4.权利要求1的抗体，还包含VH-CDR3中的替代S1OOaR。5.权利要求4的抗体，还包含IgGFc区中至少一处改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代。6.权利要求5的抗体，包含IgGlFc且该IgGlFc包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、K326A。7.权利要求4的抗体，还包含Fc区中至少一处改善ADCC活性但降低CDC活性的氨基酸替代。8.权利要求7的抗体，至少包含氨基酸替代K322A。9.权利要求8的抗体，还包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A。10.权利要求6的抗体，包含SEQIDN0.26的轻链序列和SEQIDNO.34的重链序列。11.权利要求4的抗体，它以相对于抗体2H7.vl6而言提高至少3倍的亲和力结合人CD20。12.权利要求4的抗体，它以相对于抗体2H7.vl6而言才是高至少6倍的亲和力结合人CD20。13.权利要求6的抗体，它展示出比2H7.vl6高至少20倍的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。14.权利要求6的抗体，它展示出比2H7.vl6高至少25倍的补体依赖性细胞毒性。15.权利要求l-14任一项的抗体，它与细胞毒剂偶联。16.权利要求15的抗体，其中所述细胞毒剂是放射性同位素或毒素。17.权利要求l-14任一项的抗体，所述抗体在CHO细胞中生成。18.编码权利要求1的抗体的分离的核酸。19.编码权利要求1或权利要求10的抗体的表达载体。20.包含权利要求18的核酸的宿主细胞。21.权利要求20的宿主细胞，它生成权利要求1-14任一项的抗体。22.权利要求20的宿主细胞，它生成抗体且该抗体包含SEQIDNO.26的轻链序列和SEQIDNO.34的重《连序列。23.权利要求22的宿主细胞，它是CHO细胞。24.生成权利要求l-14任一项的抗体的方法，包括培养权利要求21的宿主细月包并从细胞培养物中回收抗体。25.包含权利要求1的抗体及载体的组合物。26.权利要求25的组合物，包含权利要求10的抗体及药学可接受载体。27.制品，包括容器及装在该容器中的组合物，其中所述组合物包含权利要求l-17任一项的抗体。28.权利要求27的制品，还包括指明该组合物用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的包装插页，其中所述抗体包含SEQIDNO.26的轻链序列和SEQIDNO.34的重《连序列。29.权利要求27的制品，还包括指明该组合物用于治疗类风湿性关节炎的包装插页。30.治疗CD20阳性癌症的方法，包括给癌症患者施用治疗有效量的权利要求1-17任一项的人源化2H7抗体。31.权利要求30的方法，其中所述CD20阳性癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。32.权利要求31的方法，其中所述CD20阳性癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。33.权利要求32的方法，其中所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或SIX。34.权利要求32或权利要求33的方法，其中所述抗体包含SEQIDNO.26的轻链氨基酸序列和SEQIDNO.34的重链氨基酸序列。35.权利要求31的方法，其中所述抗体经静脉内输注施用。36.权利要求35的方法，其中所述抗体以每剂约100mg/m2至375mg/m2范围内的剂量施用。37.权利要求36的方法，其中所述抗体以每剂375mg/m2的剂量施用至少4剂。38.权利要求30的方法，还包括对患者施用至少一种化疗剂。39.权利要求38的方法，其中所述癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)且所述化疗剂选自多柔比星、环磷酰胺、长春新^4和泼尼+>龙。40.减轻自身免疫病的方法，包括对自身免疫病患者施用治疗有效量的权利要求1-14任一项的人源化2H7抗体。41.权利要求40的方法，其中所述抗体包含SEQIDNO.26的轻链氨基酸序列和SEQIDNO.34的重链氨基酸序列。42.权利要求41的方法，其中所述自身免疫病选自类风湿性关节炎和幼年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮性肾炎、韦格纳氏病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化、银屑病、IgA肾病、IgM多神经病、重症月几无力、ANCA相关性血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征、视神经脊髓炎(NMO)和肾小球肾炎。43.权利要求42的方法，44.^又利要求43的方法，45.权利要求44的方法，46.权利要求45的方法，47.权利要求43的方法，48.权利要求43的方法量l争月永内施用。49.权利要求48的方法，50.权利要求40的方法，51.;f又利要求50的方法，52.权利要求51的方法融合蛋白。53.^又利要求30的方法，54.液体配制剂，其在20mM乙酸钠pH5.5，4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20中含有约20mg/ml人源化2H7.v511抗体，供静脉内施用。55.液体配制剂，其在20mM乙酸钠pH5.3,240mM(8%)二水合海藻糖,其中所述自身免疫病是类风湿性关节炎。还包括对患者施用第二种治疗剂。其中所述第二种治疗剂是免疫抑制剂。其中所述免疫抑制剂是曱氨蝶呤。其中所述抗体静脉内或皮下施用。其中所述抗体以每剂10mg至500mg范围内的剂其中所述抗体以100mg/剂的剂量施用。还包括对患者施用第二种治疗剂。其中所述第二种治疗剂是BAFF拮抗剂。其中所述BAFF拮抗剂是抗BR3抗体或BR3-Fc还包括给患者施用VEGF拮抗剂。0.02o/0聚山梨醇酯20中含有约20mg/ml人源化2H7.vl14抗体。56.液体配制剂，其在20mM乙酸钠pH5.3,4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20中含有约30mg/ml人源化2H7.vl6抗体，供静脉内施用。全文摘要本发明提供了改良的人源化CD20结合抗体，用于治疗B细胞恶性肿瘤和自身免疫病。文档编号C07K16/28GK101151278SQ200680010720公开日2008年3月26日申请日期2006年2月6日优先权日2005年2月7日发明者亨利·B·洛曼,卡梅利亚·W·亚当斯,杰拉尔德·R·纳卡穆拉申请人:健泰科生物技术公司