专利名称：在PEG树脂上合成α-螺旋的肽合成法的制作方法
在PEG树脂上合成a-螺旋的肽合成法
本发明涉及在固相上合成特定类型的肽的方法，并涉及典型的肽固相偶联物。
一种作为广泛传播的人类病毒性疾病如HIV感染的抑制剂的成功的肽药物是 T-20(也称为DP-178),其为Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser陽Leu-Trp -Asn-Trp-Phe-NH2。该肽序列取自一个与HIV-1的跨膜受体蛋白gp41的氨基酸 638-673相对应的被称为'七重复(heptad repeat)'的a-螺旋状促融序列区段。
因此，充分大规模的生产是需要的，但是目前仅通过在固相上部分合成T-20区 段然后通常在液相中将区段縮合的组合方法来达成(参见W099/48513)。迄今还未证 实在固相上进行有效率的全长合成，因为这种方法产生的无用副产物通常要多于正 确产物，杂质纯化则引发更多问题并且再次降低最终产率。
Tam J.等人(Dep. Microbiology Vanderbilt University; Organic Letters, 2002， 第4 巻4167-4170)描述了 DP-178和相关的30聚体肽的制备，其目的为制备三螺旋束。
该文献中作者只提到应用通用FMOC合成法，并提供所使用的偶联剂以及树脂 切割条件。该文献中未提及所采用的树脂和/或树脂把手的种类，亦未提及所使用的 试剂的过量情况。该文献中未展示色谱图且未提出纯化细节和最终纯度。该文献未 指出关于所得到的产率的提示而全部留给读者自己思考。因为该研究仅适合于实验 室规模的实验，所以并未提出对于设计有效合成方法的显著需求。
本发明的一项目标是要设计一种改进的、有效的方法以合成这种a-螺旋蛋白，尤 其是T-20。本发明的方法解决了这项目标。
根据本发明的制备肽的方法，包括将所述肽制备成结合至固相的步骤，所述肽可 具有保护和/或未保护的氨基酸侧链，所述固相是两性PEG树脂，且其中所述的肽包 含不含脯氨酸(prolin)的螺旋形成区段，该区段由包含至少四个保护或未保护的螺旋 形成性氨基酸残基的一系列六个毗连氨基酸残基构成。
图1显示了用本发明的高产率合成方法合成的产物的HPLC色谱图和低杂质量。
PEG树脂由不同公司所提供，例如加拿大魁北克省的Matrix Innovation Inc.(品牌 名为'ChemMatrix，)或丹麦的Versamatrix A.S.。这些树脂已在例如US2003078372 Al
中被描述过，或者，对于优选类型的PEG树脂，已在WO 02/40559中被描述过。为 连接肽，这种PEG树脂可包含末端的'天然'羟甲基基团或例如从其衍生的'准天 然'氨基甲基、羧基或溴甲基或碘甲基基团，或其可用已知的固相连接的整合或接 枝接头或把手(handle)衍生，例如Wang树脂、4-羟甲基苯甲酸(后者需利用对-二甲基 氨基吡啶催化的酯化作用连接第一个氨基酸，请参考Atherton等人，1981， J. Chem. cos. Chem. Commun.，第336页起)、2-氯-三苯甲基(tritly)-氯(CTC)及相关者，优选烷 氧基化的三苯甲基卤化物树脂、Bayer的4-羧基三苯甲基接头、4-甲基苄基羟基胺 (4-methylbenzylhydrylamine)树脂，或例如如同在Fmoc化学中所使用的酰胺产生性 PAL或Rink或Sieber酰胺接头，或其中使用到Boc化学，例如Pam把手或酰胺产 生性BHA把手。
优选地，本发明所使用的PEG树脂包含含有反应性NH-基团的接头，该反应性 基团在从树脂上切割肽时会产生酸式酰胺，这发生在最初将该肽的C端氨基酸残基 的Ca-羧酸官能团偶联到此接头后，或在最初侧链固定与该肽的C端被保护之后， 于切割时从天冬氨酸或谷氨酸的"-羧酸侧链官能团产生天冬酰胺或谷氨酰胺。在本 发明的内容中，这种接头被称为酰胺产生性接头。更优选地，且尤其对于T20的合 成而言，这种酰胺产生性接头是PAL(Albericio等，1987， Int. J. Pept.Protein Research, 第30期，206-216)、 Sieber(TetrahedronLett.， 1987， 28， 2107-2110)或类似的9-氨基 -"占吨基-类型的树脂接头，或Rink酰胺(4-(2'， 4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧 基；Rink等，1987， Tetrahedron Lett.， 28，第3787页起)接头。
这种PEG树脂也可能为一种经混合的聚醚-聚酯或聚醚-聚酰胺树脂，例如在 Kempe等人，J. Am. Chem. Soc.， 1996年，第118期，第7083页和在US5，910，554 中描述的树脂。
优选地，该PEG树脂是一种基本纯的PEG树脂，其不含最后进一步取代的聚苯 乙烯部分作为规定的结构元件，且更优选地，也不含任何内酯或酰胺官能团而只有 聚醚官能团。应注意，在较后的定义中，直接或经由把手将树脂连接到肽的末端酯 或酰胺键由于不是内部结构交联特征，因而不会在此方面影响'纯的PEG'的定义。
PEG树脂提供最佳化学稳定性和良好的相容性且在一般Fmoc合成期间很容易用 标准溶剂处理。根据本发明，其容许以罕见的产率和纯度合成例如T-20。
螺旋形成区段包含如以上所定义之螺旋形成性氨基酸残基；在本说明书中以其意 义而言，螺旋形成性残基是那些一起成为强螺旋形成者的残基，即根据Ch0U和 Fasman， Ann. Rev. Biochem.， 47， 258(1978)的螺旋倾向注解与预测图谱被标注为Ha-或ha-型氨基酸的残基。这种强螺旋形成者仅有>1的实验测定的螺旋倾向，说明这 种强螺旋形成性氨基酸残基以大于平均的机率出现在X-射线蛋白质结构的a螺旋 中。对于天然的20种氨基酸中的每一种而言，实验数字倾向值可在上述Chou的文 献中的表中找到。因此，强螺旋形成者为Ala、 Gln、 Glu、 Ile、 Leu、 Lys、 Met、 Phe、 Trp和Val。相反，His、 Arg和Asp则以约1的统计概率(意味着倾向性)出现在a螺 旋中，而Asn则被发现事实上对于螺旋的形成具有负面影响，即仅有0.67的倾向。 为了预测螺旋状或螺旋形成性肽区段，Chou等人在1978年定义出较为简单但可靠 的预测演算法在六个毗连氨基酸残基中， 一簇四个强螺旋形成性氨基酸残基将成 为螺旋的核心，例外为两个His和/或Asp组成一个强螺旋形成性残基。对这种螺旋 区段的每一重叠四肽区段计算平均螺旋倾向，这种螺旋可接着被预测会往两个方向 延伸，直到末端四肽区段的平均倾向低于1.00为止。脯氨酸是螺旋破坏者并且只能 出现在螺旋的末端。优选地，由此预测的螺旋形成区段的平均螺旋倾向大于根据 Chou(同上)的类似可预测平均P-片层倾向值。虽然在肽合成领域中经常认为，通过 链内结合而导致相邻肽链聚集的P -片层结构可能对合成期间的偶联反应和合成之后 的去保护反应造成负面影响，但链内螺旋形成尚未被认为是线性固相合成的可能障 碍。偶联反应、所采用的偶联剂和从树脂切割/侧链去保护按照标准固相合成法进行， 采用例如Boc化学或优选Fmoc化学。注意，应在合成期间通过例如茚三酮检验控制 每一个偶联步骤之后的偶联效率，并且应在继续进一步的去保护和偶联循环之前重 复偶联效率异常低的个别的偶联；尤其是在重要的偶联步骤之后，在下一合成循环 之前可对仍然未反应的Na官能团优先加帽。在树脂上合成之后，尤其是在T-20的情形中，可进行通常使用乙酸酐的N-端乙 酰化或类似的修饰作用。在进行常规的从PEG树脂一步整体切割和去保护(其中不对 侧链使用特殊的正交保护基)之后，将该肽收获并且分离，或用惯用方法予以进一步 处理。优选地，待合成的肽是T20。然而其他含有螺旋形成区段的肽也可由本方法获得。 除了 T-20以外，具有这种螺旋形成区段的类似肽的更多例子是与所述具有15-40个
氨基酸残基且与T-20有至少10个氨基酸残基重叠的gp41七重复结构域重叠或相关
但不完全相同的肽。
优选地，除了需要包含螺旋肽区段，包含前述指明的螺旋肽区段的待合成肽的总
长至少是15个氨基酸，更优选其为至少24个氨基酸，最优选其为至少30个氨基酸。
优选地，待合成的肽是具有以下序列的胸腺素011:
l-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala陽Glu-Asn-28
其中的个别氨基酸链是未保护的，或如本领域的常识当给定的个别氨基酸残基需 要时予以适当保护(请参考例如Bodansky，如下)。更优选地，这种肽在一个紧接于 线性合成、但在从树脂上切下之前的步骤中经N-端乙酰化。亦被用作药物的天然胸 腺法新(tymalfasin)即被N-端乙酰化。
应注意，本发明的发明人已发现主要是胸腺法新肽的C-端部分(大约是残基19-28) 因链删除作用而导致大部分的杂质并因此造成在线性相合成期间产生的终产物产率 的损失。该肽的此部分已经被发现极度难以合成。
反之亦然，在线性合成期间，使用这种如W6hr等人(W池r等人，J. Am. Chem. Soc.， 118， 9218)所述的n恶唑烷二肽亦可行。
实施例
T-20的固相合成
一般方法。ChemMatrix树脂购自Matrix Innovation(加拿大，魁北克省)，HCTU 购自Luxembourg Industries Ltd.(以色列，Tel Aviv)，保护的Fmoc-氨基酸衍生物和Rink 把手购自IRIS Biotech(德国，Marktredwitz)。
手动固相合成是在装配有聚乙烯多孔盘的聚丙烯针筒(IO毫升)中进行的。利用抽 吸法移除溶剂和可溶性试齐!」。用哌啶-DMF(2:8，v/v)(1 X2分钟，2X 10分钟)进行Fmoc 基团的移除。在去保护与偶联之间进行洗涤，再用DMF(5X0.5分钟)和CH2C12(5X 0.5分钟)且每次使用10毫升溶剂/克树脂进行去保护的步骤。肽合成的转型和洗涤是 在25t:进行的。
自动固相合成是在ABI 433A肽合成仪中使用FastMoc程序以0.10毫摩尔树脂进 行的。
Fwoc游移,。用22%的哌啶DMF溶液进行Fmoc的移除2+7.6分钟。用DCM(六
次，历时0.5分钟)和DMF(四次)洗涤树脂。^^貌。在一个卡匣中，将Fmoc-氨基酸(0.9毫摩尔，IO当量)溶于DMF，并在卡 匣中加入0.9毫摩尔溶于DMF的0.45M HCTU。然后加入溶于NMP的2M DIEA 1 毫升，并将该溶液转移至反应容器中。偶联进行30分钟，而用DMF洗涤树脂(六次)。HPLC反相柱Symmetry C184， 6X 150mm， 5微米(柱A)购自Waters(爱尔兰)。 分析型HPLC是在包含两个溶剂输送泵(Waters 1525)、自动进样器(Waters 717自动取 样器)、双波长检测器(Waters 2487)和系统控制器(Breeze V3.20)的Waters仪器上进行 的。在220nm进行UV检测，在15分钟内完成从30%到70%的CH3CN(+0.036%TFA) 到H2O(+0.045。/oTFA)的线性梯度。在PerSeptive Biosystems Voyager DE RP中用ACH基质(ACH matrix)进行肽样品 的MALDI-TOF和ES-MS分析。图1显示了在a)HPLC色谱图和b， c)MS质谱中的 产物纯度和产率。在HPLC分析中纯产物(RT7，078)相对于杂质的产率是50%。实施例1Ac-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser誦Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-GIu-Gln-GlU"Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(T陽20)步骤1F附o c-Z /w A:- C7z ef MflZr^c-银潔将ChemMatrix-树脂(O.l毫摩尔，0.45毫摩尔/克)置入聚丙烯针筒中。用CH2C12(3 X0.5分钟)、DMF(3X0.5分钟)和DMF(5X0.5分钟)对树脂进行洗涤/处理。接着， 加入溶于DMF(l毫升)中的Fmoc-Rink把手(3当量)和D正A(6当量)，然后加入溶于 DMF(5毫升)中的PyBOP(3当量)和HOAt(3当量)。将混合物机械搅拌2小时并用 DMF(3X0.5分钟)洗涤树脂，茚三酮试验的结果为阴性。步骤267 67<師￡/)-/^"-1^"-67<鋪">1^-勿(^^-丄>^0^-7>/^紐>庙-&,^-将Fmoc基团移除并接着将Fmoc-aa-OH加到上述ABI自动合成仪443A中的肽 基-树脂中(步骤1)。
步骤3
&，">(7/",-颠,-(7/",-(7/",-(7/一,如^￡^-颠,-(7/"(0,-
丄￡"-7>; ^<^>力5"(7>/>7>/7(^^-尸/^-7\ -^/"/^(:/"附^^^^-^^應
用Ac2O-D正A-DMF(10:5:85)的DMF(5毫升)溶液进行15分钟最终的乙酰化，同 时不时手动搅拌，其中茚三酮试验的结果为阴性。
步骤4
将肽-树脂悬浮于TFA-iPr3SiH-H20(95:2.5:2.5)并将该混合物搅拌2小时。然后，
加入乙醚/己烷使肽沉淀，离心后移除溶剂，再加入乙醚/己垸并在离心后将其移除。 重复这种操作数次。最后加入H20(5毫升)并冻干。
EI-MS，计算值4489。实测值m/z[M+2H产/2 2248
权利要求
1.一种制备肽的方法，其特征在于，所述肽被制备成结合至固相，所述肽可具有单独保护和/或未保护的氨基酸侧链，所述固相是两性PEG树脂，且其中所述的肽包含不含脯氨酸的螺旋形成区段，该区段由包含至少四个保护或未保护的螺旋形成性氨基酸残基的一系列六个毗连氨基酸残基构成。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述PEG树脂的装载容量至少为0.5毫摩尔/克。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，其为Fmoc合成。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螺旋形成区段的长度至少为10 个、更优选至少为12个残基。
5. 如上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽经官能性接头或把 手连接至所述固相。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述接头是酰胺产生性接头，优选是 Sieber或Rink酰胺接头。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEG树脂是氨基-烷基-官能化 PEG树脂，所述肽结合其氨基官能团而形成Ca末端肽基羧酰胺。
8. 如权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述树脂是PEG树脂，其中所 述树脂不是聚苯乙烯-PEG混合物或共聚物或嵌段共聚物，优选该树脂是基本纯的 PEG树脂。
9. 如权利要求1所述的肽-PEG树脂偶联物。
10. 如权利要求9所述的肽-PEG树脂偶联物，其特征在于，所述肽部分所具有氨 基酸序列Rl陽Tyr隱Thr陽Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile曙Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln陽Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe， 其 中，R1是H、乙酰基或可移除的保护基，最优选R1是乙酰基，且其中的各氨基酸 残基可进一步包含侧链保护基。
11. 如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述肽具有氨基酸序列 Rl-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu -Gln-Glu隱Leu-Leu-Glu-Leu隱Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp陽Asn-Trp-Phe，其中，Rl是H、 乙酰基或可移除的保护基，且其中进一步地，所述肽从树脂上被切割下并去保护。
12.如权利要求ll所述的方法，其特征在于，所述切割是一步切割和去保护。
全文摘要
本发明揭示了一种固相肽合成的新方法。该方法对于对形成α-螺旋二级结构元件具有强烈倾向的肽或肽区段尤其有用。
文档编号C07K1/04GK101155824SQ200680011260
公开日2008年4月2日 申请日期2006年4月10日 优先权日2005年4月8日
发明者法娜贾希雅-玛汀, 裘迪特图拉-普切, 费纳杜阿贝利希欧, 路易斯贾威尔库兹 申请人:隆萨股份公司