啮齿类有害动物防治的制作方法

专利名称：：啮齿类有害动物防治的制作方法啮齿类有害动物防治本发明涉及新型啮齿类动物防治剂，其包含结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的抗体或其抗原结合片段，特别是结合在啮齿类动物胃肠(GI)道中表达的蛋白质的抗体或抗原结合片段，以及涉及制备此类新型啮齿类动物防治剂的方法。本发明进一步扩展至在啮齿类动物防治中使用的新型抗体和抗原结合片段，以及涉及通过使用此类抗体、抗原结合片段和新型啮齿类动物防治剂来防治啮齿类动物的方法。啮齿类动物长久以来被认为是有害动物并且引起各种问题。它们经常从预定用于人和家养动物消耗的食物中觅食，因此它们不仅对生长中的作物还对贮存的食物材料造成损害和污染(由于尿、粪便和疾病)。啮齿类动物还已知是广泛多样的疾病的携带者，所述疾病包括例如，旋毛虫病、钩端螺旋体病、霍乱、腺鼠疫、斑疹伤寒、痢疾、汉坦病毒、沙门氏菌病、巴斯德氏菌病、弓形体病和鼠咬热，其可以通过:粪便、一尿和/或唾液，和/或靠啮齿类动物为生或;靠啮齿类动物提供食物来源的昆虫等产生的灰尘)接触进行传播。此外，啮齿类动物通过咬蚀和挖洞经常造成财产、装置和设备的物理损害。因此，由于防治啮齿类动物的方法已经过数年发展，并且逸些方法一般可以分为3类i)诱捕；U)通过暴露于化学剂而杀死；和iii)绝育或降低啮齿类动物生育的能力。所有这3种方法都具有一种或多种缺陷。例如，设计为捕捉和/或杀死啮齿类动物的机械陷阱由于其性质而在其使用方面收到它们可处理的动物数量的限制，即在它们需要人类干预以重新设定之前它们每次只能处理1只动物。当考虑到啮齿类动物可以以高速率繁殖时(平均胎仔数为6-8只，并且每年产10-l2胎，一对大鼠一年可以产生多达15000个后代)，可以看出诱捕并不适合于大量的侵袭。此外，诱捕是相对劳动密集型的，需要定期的人类干预，并且这不仅导致有害动物防治的成本增加，而且还经常将被陷阱靶向的啮齿类动物吓跑。使用化学杀啮齿类剂目前是由于在城市和农业环境中的实际啮齿类动物防治程序的主要方法。一般而言，化学杀啮齿类剂在其作用方面是急性或慢性的，即在啮齿类动物已摄取有效剂量后，化学药品快速或緩慢地介导中毒。急性杀啮齿类剂包括磷化锌、磷化三锌(trizincphosphide)、红海葱(有效成分为红海葱糖苷)、(单)氟乙酸钠、氟乙酰胺、oc氯醛糖和硫酸铊。某些杀啮齿类的化学药品，例如麦角钙化固醇、溴鼠胺和氟鼠啶，可以描述为亚急性杀啮齿类剂，因为致死剂量在最初24小时内摄入，但发生重复进食并且死亡通常延迟数天，然而急性和亚急性杀啮齿类剂之间的区别不一定清晰。尽管急性杀啮齿类剂由于其非常快速地发挥作用而有利，但它们一般是非常毒的化学药品，并且存在与其使用相关的安全和环境担忧。此外，急性毒斜的存活者可能变得对斜有戒心，从而减少了这种啮齿类动物防治方法的整体功效。慢性杀啮齿类剂通过充当抗凝剂来介导其效应，其例子包括第一代抗凝剂羟基香豆素类(例如杀鼠灵、氯灭鼠灵、克鼠灵、杀鼠醚)和茚满二酮类(例如鼠完、敌鼠、氯鼠酮)；和第二代抗凝剂溴敌隆、溴鼠灵、鼠得克、氟鼠灵和噻鼠灵。第二代杀啮齿类剂的使用在最近20-30年中已是普遍的，而第一代抗凝剂的使用时间甚至更长(30-50年)。因此，啮齿类动物种群已有充足的时间来形成针对这种防治方法的抗性，并且在各种啮齿类动物种群和/或种类中已报告了针对上文提及的每一种有效成分的抗性/耐受性(参见Kerrins等人，2001，"DistributionofresistancestoanticoagulantrodenticidesinEngland,1995-98"，第149-159页，Proceedings,AdvancesinVertebratePestManagementII，SecondEuropeanVertebratePestManagementConference,Braunschweig,Germany)。第二代抗凝剂的另一个缺点源于与其广泛使用相关联的其非物种特异性作用模式。许多年来已为消灭携带抗凝剂残留的啮齿类动物的捕食性和清除性哺乳动物和鸟类的二次中毒而担心。溴鼠灵和氟鼠灵在英国已被限制于在室内使用，因为它们被认为如果在户外使用会造成其程度无法接受的高的二次中毒风险。然而，针对更广泛使用的鼠得克和溴敌隆的普遍抗性可能鼓励其使用被限制于室内的更有效抗凝剂的误用。近来，已在广泛范围的具有相当大的保护重要性的非靶标物种中观察到低水平的残留和此类残留的致死影响，所述非靶标物种例如为仓鸮、白鼬、黄鼠狼、臭鼬和红隼。已提出但仍未达到任何实际商业成功的第三种啮齿类动物防治方法依赖于降低啮齿类动物的出生率。生殖抑制剂例如避孕药和杀配子剂的使用，以及生物学和化学不育剂的使用都已被研究。然而，每种方法均具有某些缺点。例如，尽管使用化学或类固醇化合物作为抗生育剂已证明对于被俘获的动物是成功的，但它们更难以用于自由活动的有害动物种群。所述化合物是不好吃的，因而难以确保啮齿类动物获得足够剂量。杀配子剂OC氯乙醇已作为毒性不育剂上市，然而，它在不同物种中具有可变的效应并且在较高剂量上是有毒的(导致高达50%的死亡率)。最近的研究已检查作为啮齿类动物防治方法的免疫避孕(参见，例如美国专利申请号2005/0009188;Moore和Wongl997，ReproductionFertility&Development9:125-9;Smith等人，1997，Reproduction,Fertility&Development,9:85-9)。然而，当施用途径是口服时，由于口服耐受性的问题，存在与功效相关的困难，并且可能需要佐剂。因此需要克服了当前啮齿类动物防治方法所具有的某些缺点的新型啮齿类动物防治剂(即能够防治啮齿类动物种群的试剂，例如通过杀死啮齿类动物或通过调节啮齿类动物种群生育的能力)。本发明通过提供包含抗体组分的新型啮齿类动物防治剂而解决了这个需要，所述抗体组分结合在啮齿类动物中表达的蛋白质(此类蛋白质在本文中称为靶蛋白)的细胞外表位。因此，在本发明的第一个方面中，提供了包含抗体组分的啮齿类动物防治剂，所述抗体组分结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位。通过将所述啮齿类动物防治剂靶向啮齿类动物中的特定蛋白质和/或特定组织，例如，靶向在啮齿类动物肠组织/啮齿类动物GI道中表达的蛋白质，所述新型啮齿类动物防治剂与啮齿类动物肠接触的时间长度相对于非特异性啮齿类动物防治剂来说增加了，非特异性啮齿类动物防治剂仅仅通过肠而不会经特异性结合而延迟。这反过来可导致新型啮齿类动物防治剂效力的有效增加，从而使得其能够在比传统非特异性杀啮齿类剂，例如抗凝剂杀啮齿类剂更低的浓度下使用。优选地，抗体组分赋予所述新型啮齿类动物防治剂对于啮齿类动物超过非靶标动物(例如，人、鸟、伴侣动物、家畜和不是有害动物的野生动物)的选择性。这种超过非靶标物种的对于啮齿类动物组织/啮齿类动物蛋白质的选择性是进一步有利的，因为它可能减少对解毒剂的需要，并且有可能减少所述新型啮齿类动物防治剂对非靶标物种的环境影响。当抗体组分识别在啮齿类动物中执行非必需功能的靶蛋白时，所述啮齿类动物防治剂必需进一步包含毒性组分或避孕组分。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含连接至毒性组分或避孕组分的抗体组分的啮齿类动物防治剂。此类新型啮齿类动物防治剂可以是融合蛋白的形式，其中所述毒性组分或避孕组分是经由肽键直接或间接(即经由肽连接体)连接至抗体组分的蛋白质或肽部分；或者是蛋白质缀合物的形式，其中所述毒性或避孕组分是直接化学缀合至抗体组分的小分子(即非蛋白质性质的化学实体)或蛋白质或肽部分。当所述抗体组分识别在啮齿类动物中执行必需功能的靶蛋白(例如，在啮齿类动物的Gl道中执行必需功能的蛋白质)时，抗体组分作为单独的功能剂可以完成啮齿类动物防治功能。此类啮齿类动物防治抗体组分来介导其效应。因此，在一个进一步的实施方案中，本发明提供了包含抗体组分的啮齿类动物防治剂，所述抗体组分结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位，其中所述蛋白质在啮齿类动物中执行必需功能。根据本发明的这个方面的抗体组分所结合的合适耙蛋白(并且因此其将用于生产根据本发明的这个方面的抗体组分)的例子包括啮齿类动物SoxlO基因产物、啮齿类动物内皮素-B受体(EDNRB)、啮齿类动物内皮素-3配体(EDN3)、啮齿类动物CFTR(关于更多细节参见下表1和实施例)、啮齿类动物IL-2、啮齿类动物IL-IO、啮齿类动物T-细胞受体cx和/或P链、啮齿类动物的II类主要组织相容性复合物的组分。技术人员将理解，上述基因产物/蛋白质中的某些在啮齿类动物的上皮表面上不容易接近，因此在它们能够介导其活性之前需要内在化。在此类情况下，可能需要将针对上述蛋白质之一的抗体组分与增强内在化概率的另外的靶向性抗体组分相组合。因此，两种或更多种抗体组分，其中一种针对前述蛋白质之一和第二种充当导向合适的上皮靶的靶向性抗体以增强内在化，可以经由缀合或依靠下文所述的融合蛋白进行连接。术语"抗体组分"在本文中用于指抗体或其抗原结合片段，其结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位。优选地，抗体组分所结合的表位具有只在啮齿类动物蛋白质中发现的氨基酸序列，即所述抗体结合啮齿类动物特异性表位或RSE。可以用于产生在本发明的啮齿类动物防治剂中使用的抗体组分、并且本发明的啮齿类动物防治剂与之结合的啮齿类动物特异性表位(RSEs)，形成了本文描述的发明的第二个方面。结合RSEs的抗体组分#:视为本文描述的发明的第三个方面。RSE将是细胞外的以有利于抗体(或抗原结合片段)接近其结合位点。优选地，提供RSE的靶蛋白将在啮齿类动物的上皮表面中或其上表达，包括例如鼻、口、眼、胃肠道、生殖泌尿道和表皮的上皮。最优选地，所述蛋白质将在啮齿类动物的胃肠道上皮中(或其上)表达。在一个实施方案中，RSE将由连续的(即相继)的肽序列(即表位的第一个氨基酸残基将经由肽键直接连接至表位的第二个氨基酸残基，表位的第二个氨基酸残基将经由肽键直接连接至第三个氨基酸残基，等等)提供。此类连续的肽表位在本文中称为啮齿类动物特异性肽表位或RSPE。本发明的抗体组分所结合的、并因而可以用于产生本发明抗体组分(以及还有啮齿类动物防治剂)的RSPEs，可以如此来确定进行由文献和数据库信息所表明的在所需耙组织/细胞层中表达的蛋白质的比较生物信息学分析，随后进行证实性的免疫学分析。RSPEs,如RSEs—样，在自然界中只在啮齿类动物蛋白质中发现。RSPE在本文中定义为靶蛋白的寡肽片段，其中所述寡肽序列代表了细胞外连续肽表位，其与来自非靶标动物(即非啮齿类动物，例如，人)的同源蛋白质的相应线性肽序列具有60%或更低的同一性百分比。在本文中所使用的术语"寡肽片段"指靶蛋白的片段，所述片段由至少约4个和至多约50个氨基酸组成。优选地，所述寡肽片段的长度将为9-45个(包括端点)氨基酸，并且更优选地，所述寡肽片段的长度将为9-30个(包括端点)氨基酸。在具体实施方案中，所述寡肽片段长度将为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、24或44个氨基酸。优选地，RSPE和非靶蛋白之间的同一性百分比将是这样的，即使得本发明的抗体组分对RSPE具有高度特异性和亲和力，并且将不与和RSPE所来源于的蛋白质属于相同类别/家族的非啮齿类动物蛋白质交叉反应。在优选实施方案中，RSPE和非靶蛋白之间的同一性百分比，或相继)肽序列之间的同一性百分比低于或等于50%、45%、40%、35%、30%或25%。优选地，RSPEs在所有靶啮齿类动物物种中将是高度保守的，特别是在大鼠和小鼠之间是高度保守的，尤其是在黑家鼠(h〃i/s)、褐家鼠(/or^7ci/s)和小家鼠(/z^cw/i/s)/家鼠(M^^/Z/"〃CM)中的两种或更多种之间。高度保守指来自一种啮齿类动物物种的RSPE和来自另一种啮齿类动物物种的相应RSPE之间的同一性百分比#高。优选地，两种啮齿类动物RSPEs之间的同一性百分比为至少75%。更优选地，同一性百分比将大于或等于80%、85%、90%或95%、96%、97%、98%或99%。最优选地，RSPE在两种或更多种啮齿类动物物种之间将是100%相同的。尽管如上文讨论的，RSPE之间的同一性百分比优选在两种或更多种物种之间是高度保守的，但如果没有观察到所需高水平的保守性，那么可以使用来自两种或更多种啮齿类动物物种的蛋白质(同源或不同)的不同RSPEs以产生不同的抗体组分，其随后可以如下文所述组合在啮齿类动物防治剂中(例如每种抗体组分连接至毒性/避孕组分，因而所述啮齿类动物防治剂包括多种不同的抗体-毒素/避孕剂分子，或者所述啮齿类动物防治剂包括连接至两种或更多种不同抗体组分的毒性/避孕组分，所述两种或更多种抗体组分中的每一种识别来自不同啮齿类动物物种的蛋白质的RSPE)。在一个具体实施方案中，在本发明的啮齿类动物防治剂中，识别小鼠MDR1(SEQIDNO:8)的抗体组分可以与识别大鼠MDR1(SEQIDNO:9)的抗体组分相组合。本发明的抗体组分所结合的、并可以用于生产或鉴定本发明抗体组分的耙蛋白的例子在表l中给出。这个表还提供了可能来源于示例性蛋白质的具体RSPEs的例子。技术人员将理解，表l中给出的蛋白质列表或从中衍生的RSPEs列表均不是毫无遗漏的。另外合适的RSPEs可以在给定的蛋白质(它们都在GI道中表达)中鉴定，并且另外的蛋白质，例如来自其他啮齿类动物靶组织如鼻上皮、口腔上皮、表皮、生殖泌尿道上皮和眼上皮的蛋白质也可用于生产本发明的抗体組分。表1.可以被本发明抗体靶向的蛋白质的例子，以及可能来源于此类蛋白质的RSPEs的具体例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>在本发明中使用的优选靶蛋白的例子是大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0)+、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠OATP-B、大鼠ENT1、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL和大鼠SCAB。本发明的优选的RSPEs具有SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、26、27、28、29、31、32和34。在本发明中使用的特别优选的靶蛋白是大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155、大鼠CFTR、大鼠CNT2、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB和大鼠LPH。本发明的特别优选的RSPEs具有SEQIDNO:1、3、5、6、11和27、28和29。技术人员将理解，抗体识别蛋白质三级结构，并且表位可以包括分布遍及蛋白质一级氨基酸序列而同时在结构上来说彼此紧密接近的氨基酸残基。因此，在一个进一步的实施方案中，本发明的抗体组分(以及因此还有啮齿类动物防治剂)可以识别不连续的细胞外RSE。在本发明中使用的抗体可以是多克隆或单克隆的。此类抗体可以通过用如上所述的RSPE免疫接种动物，或通过用完整的啮齿类动物乾蛋白免疫接种动物来获得。本发明的多克隆抗体可以从此类经免疫接种的动物的血清中获得，参见例如实施例2。识别RSPE或啮齿类动物靶蛋白但不识别来自非靶标动物的同源蛋白质的多克隆抗体可以使用标准免疫学技术(例如通过ELISA，和/或通过针对合适的组织来源的免疫组织化学)来鉴定。在本发明中使用的单克隆抗体可以通过下列方法获得从用RSPE或啮齿类动物靶蛋白进行免疫接种的动物的脾脏中分离B-淋巴细胞，并使用此类淋巴细胞制备杂交瘤细胞系。随后在所述杂交瘤细胞系中筛选分泌识别所述RSPE或啮齿类动物靶蛋白但不识别来自非靶标动物的同源蛋白质的抗体的那些杂交瘤，参见例如实施例。在本发明中使用的优选多克隆和单克隆抗体在本文实施例中描述。在本发明中使用的抗体和抗原结合片段还可从抗体或抗原结合片段的噬菌体展示文库(首次用于实验的或免疫的)中，或从抗体或抗原结合片段的类似的酵母或细菌展示文库中，或从抗体或抗原结合片段的核糖体展示文库中分离。通常，将筛选此类展示文库以鉴定所展示出来的结合RSPEs或啮齿类动物靶蛋白的蛋白质。技术人员会非常熟悉用于筛选此类文库、在文库中鉴定结合伙伴和随后分离此类成员的方法。可以用于筛选的抗体和抗原结合片段展示文库及其构建已在本领域中描述(参见例如国际专利公开号WO01/90190和W093/19172;美国专利号5，759，808和6,517,829;由Hoogenboom1997，TrendsinBiotechnology15(2):62-70所作的综述;Dooley等人，2003MolecularImmunology40:25-33;Nutall等人，2001MolecularImmunology2001,38:313-326;和Hanes等人，1998ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA95:14130-14135)。此夕卜可以检查以这种方法鉴定的抗体或抗原结合片段以证实它们不结合来自非靶标动物的同源蛋白质。在本发明中使用的抗体可以是任何免疫球蛋白类别，例如它们可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。优选地，本发明的抗体是IgG抗体。本发明的抗体可以是包括重链和轻链的免疫球蛋白分子，或它们可以是单链抗体。本文所使用的术语"单链抗体"涵盖了天然存在的只由单一类型的链组成的抗体，例如骆驼科或软骨鱼纲(篁鱼)来源的抗体，其缺乏轻链，以及只由单一多肽链组成的经改造的抗体。此类经改造的抗体的例子包括例如在国际专利公开号W094/09817中所描述的单链抗体或"微型抗体"，和单链可变区片段(scFv)。本发明的抗体优选是单链抗体。在一个优选实施方案中，抗体是scFv。在另一个优选实施方案中，抗体是缺乏轻链的单链抗体，最优选骆驼科来源的抗体(例如在国际专利公开号W094/04678中所迷的)。在本发明中使用的抗原结合片段包括免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、Vh結枸域、Vt结构域、Fvs、Fabs、di-Fabs、Fab's、F(ab')2S、Vhh結枸域、IgNARV结构域和CDRs。技术人员会非常熟悉抗原结合片段例如免疫球蛋白轻链和重链、VH和、结构域、Fvs、Fabs、di-Fabs、Fab's、F(ab')2s、和CDRs，及其制备。VHH结构域是骆驼科抗体的可变结构域。VHH结构域及其分离在本领域中进行了描述，参见例如国际专利公开号W094/04678、国际专利公开号WO01/90190以及其中包含的参考文献。IgNAR抗体是来自鲨鱼的单链抗体，其与骆驼科抗体一样缺乏轻链(参见Greenberg等人，1995Nature374:168-173)。这些抗体的抗原结合区域，IgNAR可变结构域(IgNARV结构域)，已在本领域中描述，参见例如Dooley等人，2003(MolecularImmunology40:25-33)以及其中引用的参考文献。在某些实施方案中，在本发明中使用的抗体组分将是骆驼科抗体或Vhh結枸域，其识别上文所述的优选靶蛋白之一。特别地，结合SEQIDNO:1、3、5、6、11或27中任何一个的骆駝科抗体或V冊结构域是优选的，而结合SEQIDNO:5、6、11或27中任何一个的VHH结构域是特别优选的。在本发明中使用的抗体和抗原结合片段还可进行改造以增加其稳定性，例如它们可以通过二硫桥来稳定化(参见例如Reiter等人，1996，NatureBiotechnology14(10):1239-1245)。如上所述，抗体组分可以通过使用完整的啮齿类动物蛋白质或RSEs(这个术语包括RSPEs)作为抗原或用于筛选合适的抗体/抗原结合片段来获得，所述完整的啮齿类动物蛋白质或RSEs已被选择为与来自非靶标动物(即非啮齿类动物，例如，人)的同源蛋白质具有低的同一性百分比。因此减少了本发明的抗体组分与来自非靶标物种的同源蛋白质交叉反应的概率。因此，在本发明的优选实施方案中，抗体组分(以及因此还有本发明的啮齿类动物防治剂)显示出对于啮齿类动物靶蛋白上的表位而不是来自非靶标动物的同源蛋白质上的相应表位的选择性。换言之，本发明的优选抗体组分通过以比来自非靶标动物的同源蛋白质上的相应表位(或同源蛋白质)大的亲和力与RSE结合而显示出对RSE(或RSE所来源的啮齿类动物蛋白质)的选择性。非靶标动物包括人、鸟、伴侣动物、家畜和不是有害动物的野生动物。优选地，本发明的抗体組分将显示出减少的与来自人的同源蛋白质的结合，和更加优选地不结合来自人的同源蛋白质。更加优选地，本发明的抗体组分将不仅显示出减少的与来自人的同源蛋白质的结合(或不结合来自人的同源蛋白质)，而且还显示出减少的与来自至少一种其他非靶标动物的同源蛋白质的结合(或不结合来自至少一种其他非靶标动物的同源蛋白质)。为了避免疑问，就此而言，术语"结合"在本文中用于以定性或定量方式描述本发明的抗体组分与表位或蛋白质的相互作用。当定性地使用该术语时，关于结合靶蛋白、RSE或RSPE的特异性可以通过抗体组分以可替换的方式结合靶蛋白、RSE或RSPE的能力来证实，其中抗体结合的替换是由于存在针对其而产生或筛选出了所述抗体组分的抗原(在下文中称为"特异性抗原")而引起的。如果没有观察到此类靶蛋白/RSE/RSPE特异性抗体组分与非靶蛋白(或来自非靶蛋白的相应表位)的结合，或如果观察到不能通过特异性抗原进行替换的某些与非靶蛋白(或来自非靶蛋白的相应表位)的结合，那么该抗体组分将,皮认为显示出对于靶蛋白、RSE或RSPE(适当时)的选择性，因为抗体组分以比非靶蛋白或来自非靶蛋白的相应表位大的亲和力结合靶蛋白/RSE/RSPE。特异性和选择性因此可以通过合适组织样品的免疫组织化学分析和/或通过^f吏用合适样品的ELISA来测定。当定量地使用术语"结合"时，它表示抗体组分对于与其相互作用的表位或蛋白质具有至少l(T6M的亲和力。优选地，亲和力为至少10—7M，更优选10—8M,更优选1(TM，更加优选10—'。M，和最优选1011M或更大。因此，当抗体组分结合RSE或RSPE(或RSE或RSPE所来源的蛋白质)时，它将具有至少10—6M的亲和力，并且在进一步的实施方案中，它将具有至少1(TM、至少10—8M、至少10—9M和至少10—1QM的亲和力。在优选的实施方案中，抗体组分将不结合来自一种或多种非靶标物种(优选人)的同源蛋白质上的相应表位，即抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将少于10—6M，或它将显示出减少的与其的结合，即抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将比对于靶啮齿类动物蛋白质的小至少10倍。因此，在优选的实施方案中，当本发明的抗体组分对于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所来源的蛋白质)具有至少10"M的亲和力时，抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将少于10"M，并优选10—5M或更少；当本发明的抗体组分对于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所来源的蛋白质)具有至少1(T7M的亲和力时，抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将为10"M或更低；当本发明的抗体组分对于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所来源的蛋白质)具有至少10—8M的亲和力时，抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将为l(T7M或更低，和优选10-6M或更低；当本发明的抗体组分对于RSE或RSPE(或RSE或RSPE所来源的蛋白质)具有至少1(TM的亲和力时，抗体组分对于来自非靶标物种的同源蛋白质的亲和力将为10—8M或更低，和优选10—6M或更低。抗体组分对靶和非耙蛋白(以及源于其的表位)的亲和力可以使用任何合适的技术来测定；例如通过使用表面等离子共振(例如使用BIAcore"。在本发明的一个实施方案中，啮齿类动物防治剂是融合蛋白的形式，其中所述融合蛋白包含第一种蛋白质组分和第二种蛋白质组分，所述第一种蛋白质组分是如上文所述的抗体组分，和所述第二种蛋白质组分选自毒素、免疫原和激素。第一种蛋白质组分可以直接连接至第二种蛋白质组分，然而，优选地，这两种组分将经由连接体肽而间接连接。一般地，连接体肽的长度足够第一种组分和第二种组分如所需地起作用，而一种组分不会不利地影响另一种的功能(例如通过空间位阻)。适合于在本发明这个方面中使用的常用连接体肽的例子是(Gly4Ser)n连接体，其中"n"是大于或等于1的整数。通常，n大于或等于3。优选地，连接体肽的一级序列被设计成在苛刻的水解和热环境中是稳定的。这可以通过去除或突变在连接体中充当用于经由例如蛋白水解机制而加工连接体的识别位点的残基而达到。合适的连接体肽的另外例子是Gustavsson等人，2001(ProteinEngineering14:711-715);Hennecke等人，1998(ProteinEngineering11:405-410);和Huston等人，1991(MethodsinEnzymology203:46-88)描述的那些。在一个进一步的实施方案中，希望将特定的不稳定性改造到连接体肽中，从而使得在将融合蛋白递送至合适部位后实现受控制的所述两种蛋白质组分的分离/第二种蛋白质组分的释放，例如一旦融合蛋白被内在化，第二种蛋白质组分就可以在细胞内释放。所述的分离控制可以用于增强某些融合蛋白的活性。如上文提及的，在融合蛋白的一个实施方案中，第二种蛋白质组分是毒素。毒素赋予所述融合蛋白杀啮齿类活性它经由外部或内部介导的作用方式来实现针对所靶向的啮齿类动物细胞的毒性。在本发明这个方面中使用的合适毒素包括尤其是破裂膜的蛋白质、核糖基转移酶、丝氨酸蛋白酶、鸟苷酸环化酶激活物、参与ATP酶介导的离子转运的蛋白质、钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶、RNA糖苷酶和核糖核酸酶。合适的毒素的具体例子在下表2中给出。技术人员将意识到，表2中列出的某些毒素是毒素分子家族的代表，并且在这种情况下，那些成员中的任何一个都可以在本发明中使用。表2.可以在本发明融合蛋白中用作毒素的蛋白质的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>肺炎球菌溶血素胆固醇依赖性成孔溶细胞素P11990X52474链球菌溶血素0胆固醇依赖性成孔溶细胞素P21131M18638热稳定型直接溶血素(神奈川毒素)成孔溶细胞素P19249D90101钩端螺旋体溶血素成孔/破裂膜034095U89708Cry毒素，例如CrylAc成孔溶细胞素P05068M11068炭疽毒素靶细胞中激酶的蛋白水P15917/M29081/解攻击/钙调蛋白依赖P13423/M22589/性腺苦酸环化酶P40136M23179假单胞菌外毒素ANAD-依赖性ADP-核糖基转移酶P11439K01397芽孢杆菌RNA酶核糖核酸酶P00648M14442VIP3成孔溶细胞素(J45792L48811硫素细胞溶解性植物毒素P01543AF004018l型核糖体灭活蛋白，例rRNAN-糖*酶P33186L12243如白树毒蛋白P-噪呤硫素细胞溶解性植物毒素P01543AF00術8在本发明的实施方案中使用的优选毒素包括粒酶B、cyt2A、P-噤呤硫素、VIP2A、白树毒蛋白和粒溶素。特别优选的毒素选自粒酶B、cyt2A、p-嘌呤石克素、VIP2A和白树毒蛋白。如上所述的蛋白质毒素可以整体引入本发明的融合蛋白中。备选地，当此类毒素的结构域或片段赋予毒性活性时，那种结构域或片段可以月作融合蛋白中的第二种蛋白质组分。在另一个实施方案中，本发明融合蛋白中的第二种蛋白质组分是免疫原，即能够在啮齿类动物中引发免疫应答的多肽或寡肽。在一个优选实施方案中，本发明的免疫原-融合蛋白将能够充当免疫避孕剂，并且将因此通过阻止繁殖而充当啮齿类动物防治剂。因此，精子或卵子特异性抗原，例如，乳酸脱氢酶C、精子抗原PH-20(Primakoff等人，1988Nature335:543-6)、受精蛋白(PH-30)和透明带抗原是在本发明融合蛋白中用作第二种蛋白质组分的合适免疫原。在另外一个实施方案中，本发明融合蛋白中的第二种蛋白质组分是激素或蛋白质性质的激素模拟物。在这个实施方案中，第二种蛋白质组分将干扰和阻止啮齿类动物中的繁殖，并且融合蛋白因此通过阻止生育而充当啮齿类动物防治剂。可以在本发明的这个实施方案中使用的激素的例子包括促性腺激素释放激素。在进一步的实施方案中，如上所述的融合蛋白可以包含至少一种另外的蛋白质组分。这种(或这些)另外的蛋白质组分可以是如上所述的毒素、免疫原、激素或蛋白质性质的激素模拟物。因此，可以构建包含抗体组分和至少2种另外的蛋白质组分的融合蛋白，其中另外的蛋白质组分中的每一种赋予融合蛋白以啮齿类动物防治(即毒性或避孕，或两者)功能。第二种和另外的蛋白质组分可以各自具有相同或不同的啮齿类动物防治功能(即它们可以各自独立地是毒性的或避孕的)，并且当它们具有相同功能时，它们可以各自具有相同的或独立地不同的作用方式。当另外的蛋白质组分具有相同的啮齿类动物防治功能并且其中至少一种另外的蛋白质组分具有不同于第二种蛋白质组分的作用方式时，可以增强啮齿类动物防治剂的功效(相对于包含赋予啮齿类动物防治活性的单一蛋白质组分的啮齿类动物防治剂)。例如融合蛋白，其中第二种蛋白质组分是细胞破裂性毒素(例如选自产气荚膜梭菌细胞溶素0、a溶血素、鞘磷脂酶、5-溶血素、ot毒素、cyt毒素、粒溶素、蜂毒肽、穿孔素、海葵毒素、李斯特菌溶胞素、气单胞菌溶素、溶血素A、变形虫通道蛋白、ElTor溶血素、美人鱼弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、链球菌溶血素0、神奈川毒素、钩端螺旋体溶血素、cry毒素、VIP3、硫素和P-嘌呤硫素)并且另外的蛋白质组分可以是为了活性而需要在细胞内内在化的毒素(例如选自粒酶B、白喉毒素、霍乱内毒素、VIP2、附属肠毒素、大肠杆菌素E1、CTXIV、2型核糖体失活蛋白例如蓖麻毒素、炭疽毒素、假单胞菌外毒素A、芽孢杆菌RNA酶、1型核糖体失活蛋白例如白树毒蛋白)，可以是特别有效的啮齿类动物防治剂，因为由第二种蛋白质组分所赋予部来帮助另外;蛋白质组分的功能活性。在优选的实施方案中，融合蛋白将包含选自cyt2A、p-嘌呤硫素和粒溶素的至少一种毒素组分；和选自粒酶B、VIP2A和白树毒蛋白的至少一种毒素组分。本发明的融合蛋白可以如此构建，即使得第一种蛋白质组分(抗体组分)处于第二种蛋白质组分的N-末端，备选地，它们可以如此构建，即使得第二种蛋白质组分处于第一种蛋白质组分的N-末端。如前文提及的，在某些实施方案中，希望经由连接体肽间接连接所述两种蛋白质组分。因此，本发明的融合蛋白从N到C末端可以包括，经由肽键连接至连接体肽的第一种蛋白质组分，所述连接体肽接着经由肽键连接至第二种蛋白质组分，或者它们从N到C末端可以包括，经由肽键连接至连接体肽的第二种蛋白质组分，所述连接体肽接着经由肽键连接至第一种蛋白质组分。当融合蛋白包含另外的蛋白质组分时，另外的蛋白质组分可以处于第一种组分的N-末端，即另外的蛋白质组分通过其C-末端残基经由肽键直接连接至第一种蛋白质组分的N-末端残基，或经由肽连接体(或另外的蛋白质组分)间接连接至第一种蛋白质组分的N-末端残基。在一个进一步的实施方案中，另外的蛋白质组分处于第二种蛋白质组分的N-末端，即另外的蛋白质组分通过其C-末端残基经由肽键直接连接至第二种蛋白质组分的N-末端残基，或经由肽连接体(或另外的蛋白质组分)间接连接至第二种蛋白质组分的N-末端残基。在更进一步的实施方案中，另外的蛋白质组分可以i)处于第一种组分的C-末端，即另外的蛋白质组分通过其N-末端残基经由肽键直接连接至第一种蛋白质组分的C-末端残基，或经由肽连接体(或另外的蛋白质组分)间接连接至第一种蛋白质组分的C-末端残基；或ii)处于第二种蛋白质组分的C-末端，即另外的蛋白质组分通过其N-末端残基经由肽键直接连接至第二种蛋白质组分的C-末端残基，或经由肽连接体(或另外的蛋白质组分)间接连接至第二种蛋白质组分的C-末端残基。本发明的抗体组分和/或融合蛋白可以通过在任何合适的蛋白质表达系统中表达编码它们的核酸来产生。因此，在一个进一步的方面，本发明提供了编码本发明融合蛋白的核酸。编码本发明融合蛋白的核酸可以通过将编码第一种蛋白质组分的核酸按阅读框架与编码第二种蛋白质组分的核酸克隆在一起来获得。当第一种和第二种蛋白质组分经由肽连接体间接连接时，编码所述连接体的核酸将分隔融合蛋白的两种蛋白质组分，并且与它们处于阅读框架内。编码抗体组分的核酸可以使用标准分子生物学技术从表达本发明抗体的杂交瘤细胞中分离。备选地，编码抗体组分的核酸可以再次使用标准分子生物学技术从编码本发明抗体或抗原结合片段的噬菌体展示或其他文库克隆中获得。编码第二种蛋白质组分(毒性或避孕组分)的例子的核酸序列是本领域可获得的，参见，例如表2中的EMBL数据库参照符号。编码连接体肽的核酸可以从头合成，例如从编码所述连接体肽序列的寡核苷酸合成。为了使抗体组分或融合蛋白在合适的蛋白质表达系统中表达，将编码融合蛋白的核酸可操作地连接至合适的启动子，以及任选地连接至合适的转录终止子。一般而言，编码融合蛋白的核酸所可操作地连胞中表达的任何启动子。因此，如果需要在细菌细胞中表达抗体组分或融合蛋白，那么启动子将是在那种细菌细胞中可运作的。类似地，如果需要在真菌表达系统中表达抗体组分或融合蛋白，那么启动子将是在真菌细胞中可运作的，并且如果构建体被引入哺乳动物细胞培养表达系统或植物表达系统中，那么可采用相同的逻辑类推。当抗体组分或融合蛋白在植物细胞和/或植物中表达时，种子特异性启动子的使用是特别希望的。当本发明的核酸可操作地连接至合适的转录终止子区域时，所述转录终止子区域将是介导在其中待表达本发明抗体组分或融合蛋白的宿主细胞中的转录终止的转录终止子区域。适合用于这个目的的转录终止子区域在本领域中进行了描述。用于表达本发明抗体组分和/或融合蛋白的合适表达系统包括，微生物表达系统例如细菌系统(例如大肠杆菌(Aco//)、芽孢杆菌表达系统)，和真菌系统如酵母(例如酿酒酵母(Sacc力aro迈/cescere7/siae)、粟酒裂歹直酵母(Sc力/zc^accAaro迈/ces/70边6e)、毕赤酵母属(P/c力/a)物种、汉逊酵母属(^3/^e/zw/a)物种)和其他真菌表达系统(例如来源于曲霉属(J"e^/7"s)物种、里氏木霉(7Wc力c^/er鹏reese/)和粗糙脉孢菌(勘"rospora"as^s)的丝状真菌表达系统)；哺乳动物表达系统例如CHO细胞；和植物表达系统。在表达本发明融合蛋白中使用的优选植物和植物细胞包括小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻和粟。技术人员会熟悉在本领域中充分描述的这些表达系统。本文所述的新型啮齿类动物防治剂还可以是蛋白质缀合物的形式。因此，在一个进一步的方面，本发明提供了包含化学缀合至毒性组分或避孕组分的本文所述的本发明抗体组分的蛋白质缀合物。在一个实施方案中，毒性组分或避孕组分将是小的化学实体，而在一个进一步的实施方案中，毒性组分或避孕组分将是上文在关于本发明融合蛋白时所描述的蛋白质或肽。当毒性组分是小的化学实体时，在本发明的这个方面中使用的合适毒性化合物的例子包括秋水仙素；多柔比星；加利车霉素；非类固醇抗炎药(NSAID)类的分子；松胞菌素；抗凝剂例如溴鼠灵、鼠得克、溴敌隆、氟鼠灵、噻鼠灵、羟基香豆素类和茚满二酮类；麦角钙化固醇；溴鼠胺；氟鼠啶；磷化锌；红海葱糖普；(单)氟乙酸钠；氟乙酰胺；a氯醛糖；硫酸铊。当避孕组分是小的化学实体时，在本发明的这个方面中使用的合适的激素和激素样化合物包括例如黄体酮和雌激素(合成的和天然的)和diazacon(即，20，25-二氮杂胆固醇)。蛋白质缀合物的抗体组分可以如前文所述获得，并且可以直接化学缀合至毒性组分或避孕组分。通常，这种缀合物将涉及导致二硫键或硫醚键的异双功能试剂的使用，如本领域中所述的(参见，例如Hermanson，G.T."BioconjugateTechniques"AcademicPress,London,1996，forstandardmethodologiesrelatingtotheuseofcross-linkingreagents)。在一个进一步的实施方案中，当毒性或避孕组分是小的化学实体时，毒性化合物、激素或激素样化合物可以包入胶囊，并且胶囊可以连接至本发明的抗体或抗原结合片段。在一个具体实施方案中，胶囊可以如上文所讨论的经由化学缀合进行连接。在另一个具体实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可以经由肽键而化学缀合或融合至结合胶嚢的第二种结合性组分。例如，本发明的抗原结合片段可以用于提供双特异性或甚至多特异性结合分子中的一种特异性，其中第二种(或另外的)特异性是对于胶嚢的，并且这种第二种(或另外的特异性)由特异性地结合胶嚢的分子(例如抗原结合片段)来提供。在一个进一步的方面，将蛋白质缀合物的抗体组分化学缀合至两种或更多种毒性或避孕组分。另外的毒性或避孕组分可以是蛋白质或肽部分的形式或者是小化学实体的形式。当至少一种另外的毒性或避孕组分是蛋白质或肽部分时，所述另外的组分可以是如前文所述的毒素、免疫原、激素或蛋白质性质的激素模拟物。当至少一种另外的毒性或避孕组分是小的化学实体时，它可以是如上文所述的毒性化合物或激素或激素样化合物。在本发明这个方面的某些实施方案中，制备包含化学缀合至至少两种另外组分的、如本文所述的抗体组分的蛋白质缀合物，所述至少两种另外组分中的每一种赋予所述蛋白质缀合物以啮齿类动物防治(即毒性或避孕，或两者)功能。第二种另外组分(和另外的组分)可以(各自)具有与第一种另外组分相同或不同的啮齿类动物防治功能，并且当它(它们)具有相同功能时，它(它们)可以具有相同或不同(独立地不同)的作用方式，如上文关于本发明融合蛋白时所述的。在一个具体实施方案中，蛋白质缀合物将包含如上文所述的抗体组分，其化学缀合至第二种毒性或避孕组分中的一种或多种分子。缀合位点将取决于用于缀合反应的化学作用。当希望将两种不同的另外组分缀合至第一种(抗体)组分时，可能希望对于每种另外组分使用不同的化学缀合方法，以便确保不同的另外组分不会互相竟争缀合第一种组分上的相同位点。在本发明的更进一步的方面，提供了包含如上文所述的融合蛋白或蛋白质缀合物的啮齿类动物防治剂，其中所述融合蛋白或蛋白质缀合物包含至少两种抗体组分。在一个实施方案中，每种抗体组分结合相同的靶蛋白，从而增加啮齿类动物防治剂结合其耙组织的概率并还可能增加啮齿类动物防治剂的结合亲合力。在此类实施方案中，抗体组分可以是相同或不同的。当抗体组分不同时，这包括，结合耙蛋白中相同RSE或RSPE的不同抗体组分，或更优选地其中每种抗体组分结合相同靶蛋白内的不同RSE或RSPE的不同抗体组分。在一个进一步的实施方案中，啮齿类动物防治剂将包含结合至少两种不同靶蛋白的抗体组分。包含结合单个靶蛋白内的不同RSEs或RSPEs的抗体组分和/或包含结合不同靶蛋白的抗体组分的实施方案，在延迟针对所述啮齿类动物防治剂而出现的抗性发作中或在抵制于潜在靶位点之一上的抗性中可能特别有用。本发明的抗体、抗原结合片段、融合蛋白和蛋白质缀合物可用于防治啮齿类动物，例如它们可以在杀死啮齿类动物的方法中或在阻止啮齿类动物生育的方法中使用。因此，在一个进一步的方面，提供了包含或由本文所述的抗体、抗原结合片段、融合蛋白或蛋白质缀合物组成的啮齿类动物防治剂。其中第二种蛋白质组分是毒素或其中将抗体或抗原结合片段缀合至毒性化合物或蛋白质/肽毒素的本发明融合蛋白和蛋白质缀合物，将通过杀死啮齿类动物来达到啮齿类动物防治(即，此类融合蛋白和蛋白质缀合物在其作用方式方面是杀啮齿类的)。当抗体或抗原结合片段组分识别在啮齿类动物GI道上皮中表达的蛋白质时，融合蛋白或蛋白质缀合物将结合上皮。取决于融合蛋白/蛋白质缀合物中存在的毒素或毒性化合物的类型，毒素或毒性化合物可以破裂细胞膜。GI道上皮的完整性因此受损，并且在GI道中出现的损伤将导致啮齿类动物死亡。备选地，当毒素或毒性化合物通过细胞内作用方式介导中毒时，结合的融合蛋白或蛋白质缀合物依赖于通过内吞作用的内在化。一旦融合蛋白或蛋白质缀合物进入细胞，毒素/毒性化合物将能够介导中毒，这将最终导致啮齿类动物死亡。其中第二种蛋白质组分是免疫原的融合蛋白也需要摄入到啮齿类动物细胞中。一旦存在于啮齿类动物细胞内，就激起针对该免疫原的免疫应答。因此，当免疫原是卵子或精子特异性抗原时，这导致产生阻止繁殖发生的免疫应答。有利地，融合蛋白的抗体或抗原结合片段将增加吸收到啮齿类动物中(通过内吞作用)的免疫原的量，并且还可充当佐剂，从而增加激起合适的免疫应答的可能性。其中第二种蛋白质或缀合的组分是激素或激素样组分的本发明融合蛋白和蛋白质缀合物同样需要摄入到啮齿类动物细胞中。一旦存在于啮齿类动物细胞中，激素/激素样化合物就会干扰繁殖的激素调节，并因而通过阻止生育来防治啮齿类动物。本文描述的融合蛋白和蛋白质缀合物的抗体/抗原结合部分的啮齿类动物特异性赋予了本发明啮齿类动物防治剂几个优点。对于啮齿类动物组织的高特异性意味着，啮齿类动物防治剂特异地被靶向啮齿类动物组织，从而促进毒性/免疫原性/激素组分的摄入/活性。反过来，这种特异性靶向意味着，对于有效防治可能需要更少的啮齿类动物防治剂，在环境中存在更少的啮齿类动物防治剂，以及在环境中存在的啮齿类动物防治剂对非靶标物种不是特异性的，并因此较不可能被其吸收和对其造成损害。本发明的啮齿类动物防治剂可以配制成包括本发明融合蛋白或蛋白质缀合物作为有效成分以及至少一种添加剂、稀释剂和/或载体的组合物。合适的添加剂例如包括充当啮齿类动物引诱剂的化合物，使得所述组合物对啮齿类动物来说更可口的化合物，另外的啮齿类动物防治剂，和用于稳定或保护所述啮齿类动物防治剂的化合物。合适的引诱剂化合物包括食物材料例如小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻和粟。在本发明中使用的合适的可口性增强化合物包括增甜剂(例如乙酰舒泛钾、阿力坦、阿斯巴甜、brazzein、环己烷氨基磺酸盐、糖精、三氯蔗糖(sucralose)、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、奇异果甜蛋白、莫内甜蛋白、益寿糖(isomalt)和异麦芽酮糖(isomaltulose))、植物或动物油(例如玉米、大豆和花生油，鱼油)和干酵母。合适的稳定性增强/保护性化合物包括保护或防护啮齿类动物防治剂在被啮齿类动物摄食后免于蛋白水解或水解的那些化合物，例如anatacids，和可以在pH释放胶嚢的形成中使用的化合物。在本发明组合物中使用的合适稀释剂和载体包括在已知啮齿类动物防治剂中用作稀释剂和/或载体的那些，例如蜡，和结合剂例如纤维素醚、淀粉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、角叉菜聚糖、明胶、刺梧桐树胶、黄原胶、阿拉伯胶、槐豆胶、黄蓍胶、果胶和聚丙烯酸酯。本发明组合物可以包括除了上述添加剂、稀释剂或栽体中任何一种以外的和/或代替其的另外啮齿类动物防治剂，例如上文在本发明引言中提及的那些。特别地，本发明还包括本文描述的一种或多种新型啮齿类动物防治剂与至少一种第一代抗凝剂和/或至少一种第二代抗凝剂相組合的混合物。在本发明这个方面中使用的优选第一代抗凝剂包括羟基香豆素类和茚满二酮类，其中杀鼠灵、氯灭鼠灵、克鼠灵和杀鼠醚是特别优选的羟基香豆素，和鼠完、敌鼠和氯鼠酮是特别优选的茚满二酮。在本发明这个方面中使用的优选第二代抗凝剂包括溴敌隆、溴鼠灵、鼠得克、氟鼠灵和噻鼠灵。本发明还包括至少两种上文描述的新型啮齿类动物防治剂的混合物，以及包含此类混合物的组合物(如上文所述)。例如，当啮齿类动物防治剂是结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位的抗体组分(即抗体组分本身是功能性啮齿类动物防治剂)时，该啮齿类动物防治剂可以与一种或多种另外的啮齿类动物防治剂相组合，其中另外的啮齿类动物防治剂包含抗体组分以及一种或多种毒性或避孕组分(即一种或多种另外的啮齿类动物防治剂是本文所述的融合蛋白或蛋白质缀合物)。在进一步的实施方案中，混合物将包括如本文所述的两种或更多种融合蛋白和/或蛋白质缀合物。在一个实施方案中，在植物中生产本发明的融合蛋白，并将包含表达的融合蛋白的植物材料用作用于啮齿类动物防治的饰。根据本发明的这个方面，优选地，生产融合蛋白的植物将是能够充当啮齿类动物食物来源的植物，例如小麦、大麦、玉米、高粱、燕麦、水稻和粟都是用于表达本发明融合蛋白的合适植物。在一个实施方案中，特别优选地，融合蛋白将在植物种子中表达。以这种方式，来自表达本发明融合蛋白的植物的谷粒可以直接用作辨。如上文所提及的，本发明组合物以及包含本发明融合蛋白的植物和/或谷粒可以用作啮齿类动物防治剂。因此，在一个更进一步的方面，本发明提供了杀死啮齿类动物的方法，包括将啮齿类动物防治剂置于啮齿类动物经常出现的区域，从而使得在所述啮齿类动物防治剂被所述啮齿类动物摄食后，所述啮齿类动物被杀死。技术人员还将意识到，本发明还提供了阻止啮齿类动物生育的方法，包括将啮齿类动物防治剂置于啮齿类动物经常出现的区域，从而使得在所述啮齿类动物防治剂被所述啮齿类动物摄食后，所述啮齿类动物的生殖能力被抑制。为了测试本发明啮齿类动物防治剂的功效，可以进行各种体外和体内研究。合适的体外测试的例子是如Heylings1991(Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-293)和实施例9中所述的肠环测定法(gutloopassay)。用于体内评估本发明啮齿类动物防治剂的杀啮齿类特性的典型策略基于下列要求1)最小化测试中使用的动物数量，2)使成本下降，3)快速产生有用信息，4)不拒绝可能有希望的活性物质。最初的测试通常将在实验室中进行，因为可以小心地控制测试条件。使用级联测试程序。这个级联允许通过使用顺次决定过程来接受或拒绝活性物质。通常的测试受试者是褐家鼠和家鼠。屋顶鼠是另一种重要的测试受试者，但因为它不能作为实验室品系获得，所以它只在评估程序的较后阶段进行测试。对于抗凝剂具有抗性的啮齿类动物品系也可在实验室程序的较后阶段中使用，以便测试针对这些动物的功效。然后，可以在野外评估在实验室测试中具有活性并且显示出希望的本发明啮齿类动物防治剂。野外试验在各种自然环境中针对所有重要有害啮齿类动物物种进行。技术人员可参考容易获得的指导性文献，所述文献阐述了在实验室中(EPP0/0EPP.1999.Laboratorytestsforevaluationofthetoxicityandacceptabilityofrodenticidesandrodenticidepreparations;OEPP/EPPOPP1/113(2):89-101)和在野外(EPPO/OEPP.1999.GuidelinesfortheEfficacyEvaluationofPlantProtectionProducts:Field—testsagainstsynanthropicrodents肠颜cw/ws，Aa〃i/"or^/,,i.r"to;OEPP/EPPOPP1/114(2):102-113)的用于杀啮齿类剂的合理测试程序。还可以获得对于满足英国(Anonymous.2005.GuidelinesontheEfficacyDataRequirementsforApprovalofNon-agriculturalPesticideProductsRodenticides.HealthandSafetyExecutive,Bootle，UK.第30页)、欧盟(Anonymous.2002.TechnicalnotesforguidanceinsupportoftheAnnexVIofDirective98/8/ECoftheEuropeanParliamentandtheCouncilconcerningtheplacingofbiocidalproductsonthemarket.Coimnonprinciplesandpracticalproceduresfortheauthorisationandregistrationofproducts.EuropeanCommission,July2002.第215页)和美国的规章要求的测试程序的建议。在实验室可以遵循以便评估本发明啮齿类动物防治剂功效的典型级联测试可以包括口部插管测试、无选择饲养测试和选择祠养测试。这些测试的进一步细节在下文概述。口部插管用于确定活性物质效力的最初测试涉及使用管饲法将在惰性液体例如聚乙二醇中携带的活性物质直接递送至测试受试者的胃中。可以以这种方式递送准确的剂量，以便确定致死剂量百分位数统计学。该测试提供了关于活性物质在受试者物种的肠中存在的条件下保持活性的能力以及关于其穿过肠膜进行转移的信息。该测试还提供了关于活性物质的固有毒性的信息。无选择饲养测试事实上所有市售杀啮齿类剂产品都作为配制好的斜呈现。测试级联的下一个阶段涉及制备包含活性物质(在这种情况下是本发明的啮齿类动物防治剂)的饰。首先进行其中个别笼养的测试受试者只有给予它们的实验饵的'无选择，测试，以确定活性物质在作为可食用的辨进行递送时是否具有活性。测试斜通常可随意获得。除了如在口部插管测试中获得的信息外，无选择饲养测试提供了关于活性物质通过受试者物种的消化过程从饰中移出的能力的信息。选择饲养测试为了能够被在配制饰中的活性物质控制，啮齿类动物必须消耗足够量的斜以在可替代的天然食物存在下获取致死剂量。因此，活性物质(即本发明的啮齿类动物防治剂)的可口性是评估的重要方面。进行选择测试，其中将活性物质以计量浓度加入斜基质中。然后，向个别笼养的测试受试者提供在包含活性物质的测试斜和不含活性物质的相同饰之间的选择。进行一系列此类测试以确定被测试受试者所察觉的活性物质的浓度。通常地，此类检测通过厌恶包含活性物质的仵来证明。评估中的重要考虑是，被测试受试者所察觉和引发明显厌恶的浓度低于在测试辨中递送致死剂量所需的浓度。进一步的选择测试对在商业制剂开发中生产的实验辨来进行。这些选择测试涉及实验制剂的呈现和'挑战饮食(challengediet)，。挑战饮食如此构成，即使得它呈现为实验制剂的适度可口的可替代物。在此类测试中使用的典型'挑战饮食，是'EPA餐，。这是包含固定量的燕麦、粗碾玉米、糖和油的制剂。符合通常实践的是，其的消耗包括最少30%的组合挑战饮食的实验制剂以及由测试受试者所消耗的实验制剂将被考虑为用于野外试验的潜在候选物。实验室测试后，可以在野外环境中测试功效。啮齿类动物具有复杂和高度适应性行为，这些行为只在天然条件下才完全展现。因此，可以进行野外试验以便评估杀啮齿类的活性物质和配制的产品在野外条件下的效果。通常地，野外试验在各种天然环境下针对一系列靶物种进行，所述天然环境是在其中可能进行实际的啮齿类动物防治处理的那些环境的典型代表。野外试验可以在产品开发的早期阶段使用不希望用于商业化的实验制剂来进行，以便研究当它们以包含活性物质的典型辨进行呈递时靼啮齿类动物物种中的天然行为过程。随后，野外试验还可对商业辨产品来进行，以证实其在实际条件下的功效。本发明的各个方面和实施方案现在将通过实施例更详细地举例说明。应当理解，可进行细节修饰而不背离本发明的范围。为了避免疑问，在本申请文本中引用了书面参考文献、专利申请或专利，所述引用的完整文本引入本文作为参考。附图简述图1:重组白树毒蛋白对萤光素酶翻译的抑制。图2:抗CNT2多克隆抗体-重组白树毒蛋白缀合物对萤光素酶翻译的抑制。库A样品对应于来自IMAC纯化、确定包含游离抗体的合并级分。库B样品对应于来自IMAC纯化、确定包含抗体-毒素缀合物的合并级分。实施例实施例1:RSPEs的产生和制备1.1.肽的选择和合成在啮齿类动物肠上皮上存在的潜在蛋白质靶通过文献和生物信息学方法来鉴定。基于下列标准在这些蛋白质中鉴定出啮齿类动物特异性肽表位(RSPEs):在小鼠和大鼠序列之间的高序列同一性(优选80-100%的同一性)以及在啮齿类动物和人序列之间的低序列同一性(优选0-40%的同一性)，并且使用BLAST比对与其他物种没有显著命中；其亲水性特征(表面可能性(surfaceprobability)的指征)；弹性和二级结构的预测。用于预测亲水性、弹性和二级结构的算法由DNAstar和VectorNTI程序套件中的程序提供。一旦鉴定出合适的RSPE，就可以4吏用Fmoc固相合成来合成肽并纯化至约90%的纯度。已经合成了下表3中显示的肽。合适时，向所述序列加入N-末端半胱氨酸以使得能够定向缀合至载体蛋白。备选地，合适时，合成N-末端氨基酸保持未封闭的序列，以使得能够定向缀合至载体蛋白。当不需要缀合时，N-末端氨基酸通过乙酰化封闭。另外，C-末端氨基酸用酰胺基团封闭。表3.已合成的RSPEs<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>1.2.肽与BSA的缀合使用异双功能交联剂间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯将包含N-末端半胱氨酸残基的肽偶联至BSA。如Kitagowa和Aikawa.J.Biochemistry第79巻第233-236页(1976)所述，偶联经由BSA中赖氨酸残基上的伯胺和所述肽中半胱氨酸残基上的巯基。在0.2M磷酸钠(pH7.0)中制备25mg/ml的BSA(Sigma，Poole，Dorset)溶液，并在二甲基甲酰胺(Sigma)中制成25mg/ml的MBS(Perbio,Cheshire)溶液。在进行混合的情况下将30plMBS溶液逐滴加入lmlBSA溶液中，并在黑暗中于室温下孵育45分钟。随后将经活化的BSA溶液向下经过PD10凝胶过滤柱(GEHealthcare,Buckinghamshire),所述柱先前已用G.2M砩酸钠(pH7.0)平衡。包含BSA的级分通过280nm处的吸光度来鉴定，并合并在一起。将2mg肽溶解于1迈l50mM磷酸钠(pH7.5)中。将足够的经活化的BSA溶液加入肽中以达到肽BSA为30:1的摩尔比。该混合物在室温下孵育4小时，随后于41C在黑暗中在进行混合的情况下孵育过夜。将缀合的肽贮存于-20"C。使用2-步戊二醛法将在N-末端包含赖氨酸残基或伯胺的肽偶联至BSA。基于Bio-conjugateTechniques,AcademicPress1996，第583-584页中的方法来进行BSA和肽中的伯胺基团之间的偶联。在0.1M磷酸钠，0.15M氯化钠(pH6.8)中制成10mg/ml的BSA溶液。加入戊二醛(Sigma)至1.25%的最终浓度，并将混合物在进行混合的情况下在室温下孵育12小时。将经活化的BSA溶液向下经过PD10凝胶过滤柱，所述柱先前已用PBS平衡。包含BSA的级分通过280nm处的吸光度来鉴定，并合并在一起。将2mg肽溶解于1ml0.5M碳酸钠(pH9.5)中，并向肽中加入足够的经活化的BSA溶液以达到肽BSA为至少10:1的摩尔比。混合物于4匸孵育过夜。过量的反应位点通过加入40jal1M乙醇胺(Sigma)来封闭。将缀合的肽贮存于-20。C。实施例2:抗体组分的产生将如上面实施例1中所述已合成并缀合至BSA的肽用于产生结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位的抗体。2.1，兔免疫接种方案新西兰白兔用于多克隆抗体生产。对于第一剂，使用弗氏完全佐剂(Sigma)，通过皮下施用100ng蛋白质来免疫接种兔。在这之后为在第28、56和84天时的3次加强免疫接种，包括在弗氏不完全佐剂(Sigma)中的皮下施用的IOOjug蛋白质。在初次免疫接种前获取预放血获得物(Pre-bleeds)，在第三剂后10-14天获取测试放血获得物(testbleeds)，和在第四剂后10-14天获取收获放血获得物(harvestbleeds)。对于下列RSPEs中的每一种，免疫接种2只兔子并产生多克隆抗体血清SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6;SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15。对于下列RSPEs中的每一种，免疫接种1只兔子SEQIDNO:27、SEQIDNO:28;SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34。2.2.小鼠/仓鼠免疫接种方案小鼠和仓鼠用于单克隆抗体生产，对于第一剂，通过皮下施用在弗氏完全佐剂中的20pg蛋白质来进行免疫接种。在这之后为在第28和56天时皮下施用20蛋白质的2次免疫接种。在第28天时在弗氏不完全佐剂中施用剂量，和在第56天时在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中施用剂量。在第三剂后7天获取测试放血获得物。在第三剂后至少6周，小鼠通过在PBS中静脉内施用20pg蛋白质来进行加强。4天后收获脾以用于融合。小鼠已用下列RSPEs中的每一种进行免疫接种，并产生了多克隆抗体血清SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29。2.3.单克隆抗体的生产4吏用基于KohlerG.和MilsteinC.Nature256，495-497(1975)的方法产生单克隆抗体。使用由具有20号针头的注射器递送的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen,Paisley)从收获的脾脏中洗涤出淋巴细胞。NSO骨髓瘤细胞(EuropeanCollectionofCellCultures,PortonDown,Salisbury)在包含10%(v/v)胎牛血清(PAA，Yeovil，Somerset)、2mML-谷氨酰胺、1xHT补充物以及50单位/ml青霉素和50ug/ml链霉素(全都来自Invitrogen)的DMEM中，于37"€在5%C02中培养至5x105/ml的密度。将来自单个脾脏的淋巴细胞(大约2xl08)与2xl(TNS0骨髄瘤细胞混合。在2000xg下离心4分钟后，将细胞沉淀轻轻地重悬浮，并通过经过1分钟逐滴加入1ml在75mMHEPES緩沖液pH8(Roche,Lewes,EastSussex)中的50%(w/v)聚乙二醇(1500)而进行融合。在数分钟内緩慢加入补充有HI克隆补充物(Roche)的完全培养基(如上所述)，至50ml的最终体积。所得到的融合溶液在5个无菌微量滴定细胞培养板(Nunclon,Fisher,Loughborough,Leicestershire)中以100ul/孔在37t:和5%C02下培养4小时，在这之后，加入包含4。/。(v/v)lxHAT选择培养基(Invitrogen)的100ul/孔的完全培养基。融合后14天，基于EngvallE.和PerlmannP.I咖unochemistry8，871-874(1971);HarlowE.等人，Antibodies-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988，第182-183页描述的方法，特异性抗体。经由至少2轮通过有限稀释的克隆以及随后的再测定来获取所选择的杂交瘤细胞，以确保杂交瘤的克隆性(clonality)和稳定性。冷冻的杂交瘤文库在由在胎牛血清中的10%(v/v)DMSO(Sigma,Poole，Dorset)构成的冷冻培养基中以1C/分钟的冷冻速率经过80分钟来制备，随后贮存于液氮中。所选择的单克隆抗体的生产通过按比例扩大的组织培养来完成。使用来自用SEQIDNO:1、SEQIDNO:5、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6和SEQIDNO:27免疫接种的小鼠脾脏的淋巴细胞已获得了杂交瘤融合物。已分离、培养和冷冻了产生针对来自小鼠GLUT7的RSPE(SEQIDNO:11)的抗体的4个稳定的单克隆细胞系。已分离了产生针对来自大鼠CFTR的RSPE(SEQIDNO:5)的抗体的4个稳定的单克隆细胞系。已分离、培养和冷冻了产生针对来自大鼠PepTl的RSPE(SEQIDNO:1)的抗体的7个阳性单克隆细胞系。2.4.来自噬菌体展示文库的抗体组分的鉴定和分离2.4.1.首次用于实验的骆驼科VHH噬菌体展示文库的筛选如上文实施例1.2中所述，通过化学合成和随后缀合至BSA来制备RSPEs以用于篩选首次用于实验的驼羊(Wfl鹏^a则)VHHMU丝状噬菌体展示储库。噬菌体所展示的免疫结合结构域储库的筛选遵循已建立的程序，例如由McCafferty和Johnson所描述的那些("PhageDisplayofPeptidesandProteins"，第98-100页，Eds.Kay，Winter和McCafferty，1996，AcademicPress,Inc.)。RSPE::BSA缀合物通过以100jig/ml的浓度施加在50mM碳酸氢钠pH9.6緩冲液中并过夜赙育而粘附至MaxisorbImmunotubes(Nunc)的内表面。游离的RSPE::BSA缀合物通过在PBS中漂洗3次而去除，然后通过加入PBS/2%脱脂牛奶蛋白(PBSM)并于37X:孵育2小时来封闭表面。在免疫管(immunotube)用所需RSPE敏化后，通过加入在4mlPBSM中的1012-1013噬菌体并在室温下孵育2小时来进行"淘选"。这个步骤后，抽吸出管内容物并使用PBS/0.1%TweenM将管洗涤20次，随后使用PBS再洗涤20次。随后通过加入1ml100mM甘氨酸pH3.0并经过10分钟来洗脱免疫管所结合的噬菌体(代表大多数RSPE::BSA-特弄性Vhh結合物)。将溶液转移至包含0.5ml1MTris-HClpH7.4的新试管中以进行中和。然后，将洗脱的噬菌体用于通过混合并于37匸孵育30分钟来感染对数期TGI大肠杆菌细胞，随后涂布在"x24cm2xTY/2。/。葡萄糖/100jig/ml氨千青霉素平板(NuncBioAssayDish)上，其随后于371C孵育过夜。第二天，刮板以取出包含对RSPE::BSA缀合物具有结合特异性的序列的细胞(其代表了富集的、增加的噬菌粒克隆群体)。为了进一步筛选/选择来自该群体的展示出对于RSPE的高亲和力的克隆，通过加入辅助噬菌体例如M13-K07或VCS-M13来"营救"噬菌体颗粒。简言之，将来自最后一个步骤的细胞接种到在250ml锥形烧瓶中的50ml2xYT/2%葡萄糖/100pg/ml氨爷青霉素中，并于30r孵育直至0D6。。为约0.5。然后，加入辅助噬菌体以提供1:1的辅助噬菌体与细菌比率，通常为2xl01。pfu/50ml，随后于37。C孵育l小时。接下来，细胞通过在3000g下离心IO分钟来沉淀，弃去上清液，将细胞沉淀重悬浮并用于接种在2升烧瓶中的新鲜培养基500ml2xYT/100pg/ml氨苄青霉素/50yg/ml卡那霉素(无葡萄糖)。这种培养物于30TC伴随剧烈振荡来孵育过夜，随后通过于4TC加入100ml20%PEG/2.5MNaCl30分钟来收获噬菌体-VHH颗粒。然后，通过在4000g下离心10分钟来收集沉淀的噬菌体，并重悬浮于5mlPBS中，准备用于下一轮筛选。选择过程的效率可以通过减少在每轮淘选中用于敏化免疫管的RSPE::BSA缀合物的量来改进。另外，选择过程可以调整至包括偏向选择显示出某些物理化学特征例如蛋白水解稳定性的噬菌体-VHH颗粒的步骤。例如，已知M13噬菌体颗粒对由某些蛋白水解酶例如胰蛋白酶和糜蛋白酶所进行的蛋白水解有抗性(Schwind等人，1992，Eur.J.Biochem.210:431-436)，并且这个特性可以在噬菌体展示中用于选择结构上稳定的变体(Kristensen和Winter,1998，Folding&Design,3:321-328)。为了选择显示出所需的对于RSPE的亲和力和选择性的单个颗粒，挑选在2xTY/2o/。葡萄糖/100pg/ml氨千青霉素板上的独特克隆(从在淘选步骤后被洗脱的噬菌体感染的TG1大肠杆菌的系列稀释样品中获得)，并排列在每孔包含150]ul2xTY/2y。葡萄糖/100pg/ml氨苄青霉素的96孔培养区块中，并且伴随振荡于30t:进行孵育直至0D6。。达到约0.5。然后，将辅助噬菌体加入每个孔中以提供1:1的辅助噬菌体细菌比率，随后伴随振荡于37X:再孵育1小时。然后，在通过以3000g离心来沉淀细胞后去除培养基，并用1.5ml2xYT/100jig/ml氨苄青霉素/50jug/ml卡那霉素(无葡萄糖)替换，并且伴随剧烈振荡于30X:继续孵育过夜。然后通过使用20%PEG/2.5MNaCl于41C下30分钟而从每个孔中收获噬菌体颗粒，随后在4000g下离心并重悬浮于PBS中。这些克隆噬菌体样品用于ELISA中以使用抗噬菌体抗体-HRP复合物来测定对于固定的RSPE的相对结合亲和力，或者备选地，通过用所述噬菌体感染非琥珀阻抑子大肠杆菌宿主(例如菌株HB2151)来表达可溶性VHH。然后，使用IPTG诱导使得能够进行可溶性的、分泌的V冊的96孔培养和表达，并且将粗培养基(包含可溶性VHH)或IMAC-纯化的VHH(借助于完整的六组氨酸标签)用于ELISA中以测定与固定的RSPE的结合。在这种情况下，合适的检测抗体是9E10-HRP(RocheMolecularBiochemicals),其检测在可溶性VHH蛋白上存在的c-Myc标签。最初，作为针对如上所述的首次用于实验的骆驼科噬菌体展示文库的RSPE::BSA缀合物来筛选下列RSPEs;具有SEQIDNO5的RSPE，具有SEQIDNO6的RSPE，具有SEQIDNO11的RSPE和具有SEQIDN027的RSPE。随后，将从这种筛选中鉴定出的V冊克隆用于生产本文所述的融合蛋白和抗体缀合物。2.5.重组抗体结合结构域的克隆和表达为了举例说明形成单链抗体(更特别地scFv)的过程，将来自杂交瘤HB-8766(美国典型培养物保藏中心；Rettig等人，1989，US4851332)的SV63小鼠单克隆抗体(MAb)(识别来自由某些结肠直肠胂瘤表达的人碱性磷酸酶的细胞表面表位)用作模型细胞表面抗原结合蛋白质。为了从这种IgGlMAb衍生scFv分子，用在文献(例如Dubel等人1994，JournalofImmunologicalMethods175:89-95;McCafferty和Johnson"PhageDisplayofPeptidesandProteins"，第95页，Eds.Kay，Winter和McCafferty,1996，AcademicPress,Inc.)中所述的啮齿类动物Fv和恒定结构域特异性引物组，采用RT-PCR从所述杂交瘤中克隆出Fv序列，釆用了在文献中说明的对于个别引物的修饰。在这个实施例中使用的引物序列在下表4中给出。表4.在从杂交瘤ATCCHB-8766中克隆SV63scFvs之中使用的引物引物序列5'至3'SEQIDRoPro-9AGGTSCAGCTGCAGSAGTCWGGSEQIDNO:37RoPro-28CCAGGGGCCAGTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTSEQIDNO:38RoPro-6GAGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGACCTAGCCTGGTGSEQIDNO:39RoPro-25TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCSEQIDNO:40RoPro-3GGTGATATCGTKCTCACYCARTCTCCAGCAATSEQIDNO:41RoPro-4GGGAAGATGGATCCAGTTGGTGCAGCATCAGCSEQIDNO:42scFvoligo1AGCCCGCCATGGCCGATATCGTTCTCACTCAATCSEQIDNO-43scFvoligo2CGCCAGAGCCACCGCCACCGCTACCGCCACCGCCCTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCSEQIDNO:44scFvoligo3AGCGGTGGCGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGTAGCGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGSEQIDNO:45scFvoligo4CTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCSEQIDNO-46scFvoligo5AGCCCGCCATGGCCGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGSEQIDNO:47scFvoligo6CGCCAGAACCACCTCCGCCGCTTCCGCCACCGCCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCSEQIDNO:48scFvoligo7AGCGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGAAGCGATATCGTTCTCACTCAATCTCSEQIDNO:49scFvoligo8GTATGAATTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCCTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCSEQIDNO:502.5.1.杂交瘤RNA的分离和cDM的合成离心杂交瘤细胞(107)并重悬浮于lmlTrizorM和200|u1氯仿中。将样品在室温下剧烈混合15分钟，随后在12000g和4T下离心15分钟。移去水层并加入等量的异丙醇。样品在12，000rp迈和4匸下离心15分钟以沉淀RNA,其在70%乙醇中洗涤并随后重悬浮于不含RNA酶的水中。通过在包含5n1RNA、0.1U不含RNA酶的DNA酶I(Ambion)和1URNasin的10jj1反应体系中用不含RNA酶的DNA酶进行处理而从RNA中去除痕量的基因组DNA。将混合物置于371c下30分钟，随后于80匸孵育5分钟。然后，在制造商的标准条件(1.5nlRNA，50nl总反应体积，oligo-dT引物)下，将经DNA酶I处理的RNA用于Accuscript(Stratagene)反应中以产生第一条链cDNA。2.5.2.SV63Vh区的分萬和克隆使用1ju1来源于SV63RNA的经oligo-dT引发的第一条链cDNA作为模板以及寡核苷酸RoPro-9(SEQIDNO:37)和RoPro-28(SEQIDNO:38)来进行PCR。采用RocheGC-RICHPCRSystem,其中以在25p1反应体积中0.5M的浓度使用GC-RICH解析緩冲液(resolutionbuffer)。在StratageneRobocycler中使用下列循环条件进行反应循环l-5循环6-35最后延伸94X:30秒94"C30秒30秒60X:30秒72°C60秒72*C60秒72X:300秒从这个反应中，PCR产物的产量非常低。因此，进行第二次PCR以进一步扩增所产生的分子。使用来自上述反应的2ju1PCR产物作为模板，使用下列寡核苷酸引物对来建立2个反应URoPro-6(SEQIDNO39，特异性低于RoPro-9(SEQDINO37)和RoPro-25(SEQIDNO:40,3'嵌套的);和ii)RoPro-9(SEQ:IDNO37)和RoPro-28(SEQIDNO:38)。如上所述进行PCR。当上述反应的样品在1%琼脂糖/TBE凝胶上电泳并用溴化乙锭染色时，2个PCRs包含大约400bp的DM片段。使用GenecleanSpin试剂盒来分离和纯化由上述反应2产生的PCR产物，并克隆到pCRTOPOBluntII(Invitrogen)中。8个TOPO克隆通过DM测序进行充分表征，这些克隆中的一个具有通过UniProt/IPI数据库的BLASTP分析所测定的典型(但独特的)Vh序列的特征。2.5.3.SV63Vl区的分萬和克隆使用2jn1来源于SV63RNA的经oligo-dT引发的第一条链cDNA作为模板以及寡核苷酸RoPro-3(SEQIDNO:41)和RoPro-4(SEQIDNO:42)来进行PCR。在50ja1反应体积中l吏用StratagenePfuUltraDNA聚合酶，并且反应在MJResearchDyad热循环仪中4吏用下列循环条件来进行95*C，1分钟，随后[95X:，1分钟；52X:，1分钟；68<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>，3分钟]40个循环，随后为68C，IO分钟的最后延伸。上述反应的样品在1%琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴化乙锭染色，观察到大约350bp的片段。使用QiaQuick(Qiagen)凝胶洗脱来分离和纯化这个PCR产物，并克隆到pCRT0P0BluntII(Invitrogen)中。5个T0P0克隆通过DNA测序进行充分表征，这些克隆中的4个是(但独特的)Vl序列的特征。所述5个克隆中的1个包含与M0PC21k轻链可变序列(Swissprot:P01634)相同的序列，从在杂交瘤制备中所使用的骨髓瘤融合伙伴扩增出的无关序列。2.5.4.将Vh和W序列装配到scFv构建体中PCR-重叠延伸(也称为"剪接-重叠延伸，，；SOE)用于制备2个方向的SV63scFv:(i)VH-[Gly4Ser]3连接体-VL，和(ii)VL-[Gly4Ser]3連接体-Vh),每个在大肠杆菌表达载体pDGF(来源于NEB载体pMALc-2,pDGF包括pMALc-2的所有特征，除了编码麦芽糖结合蛋白的序列外，其已被切除)和pIMS147(Hayhurst和Harris,1999,ProteinExpressionandPurification15:336-343)中包含N-末端PelB前导序列以及C-末端FLAG和六组氨酸标签。下表5说明了所使用的寡核苦酸引物及其目的。表5.用于将Vh和Vl序列装配到scFv构建体中的引物引物目的SEQIDNO:scFvoligo1SV63scFVVL::VH方向PelB:Vl正向引物43scFvoligo2SV63scFvVL::VH方向Vl:GlySer反向引物44scFvoligo3SV63scFvVL::VH方向GlySer:Vh正向引物45scFVoligo4SV63scFvVL::VH方向Vh:FLAG:His反向引物46scFvoligo5SV63scFvVH::VLscFvoligo6SV63scFvVH::VLscFvoligo7SV63scFvVH::VLscFvoligo8SV63scFvVH::VL方向PelB:Vh正向引物47方向Vh:GlySer反向引物48方向GlySer:VI正向引物49方向VI:FLAG:His反向引物50为了制各Vl-[Gly4Ser〗3連接体-VhscFv序列,以2个步骤进行PCR。第一个步骤由2个反应组成，使用i)scFvoligo's1和2(分别为SEQIDNO:43和44)和作为模板的pCRTOPOBluntllSV63W克隆，以扩增构建体的5'—半；ii)scFvoligo、3和4(分别为SEQIDNO:45和46)和作为才莫板的pCRTOPOBluntllSV63Vh克隆，以扩增构建体的3'—半。第二个步骤使用S0E以通过下列方法来连接来自(i)和(ii)的2个片段退火其互补的3'和5'末端(分别地)，并通过加入聚合酶而延伸成全长产物，随后使用scFvoligo'sl和4(分别为SEQIDNO:43和46)进行扩增。Vf[Gly4Ser]3连接体-、scFv序列以类似方法制备。第一个步骤由2个反应组成，使用i)scFvoligo's5和6(分别为SEQIDNO:47和48)和作为模板的pCRTOPOBluntllSV63Vh克隆，以扩增构建体的5'—半；ii)scFvolig(Zs7和8(分别为SEQIDNO:49和50)和作为模板的pCRTOPOBluntllSV63Vl克隆，以扩增构建体的3'一半。第二个步骤使用S0E以通过下列方法来连接来自(i)和(ii)的2个片段退火其互补的3'和5'末端(分别地)，并通过加入聚合酶而延伸成全长产物，随后使用scFvoligo's5和8(分别为SEQIDNO:47和50)进行扩增。使用RocheGCRICH试剂盒和制造商的条件，用在25pl反应体积中0.5M浓度的GC-RICH解析緩冲液来进行第一个步骤反应。在StratageneRobocycler中使用下列循环条件进行反应循环l-2循环3-27最后延伸94°C30秒94X:30秒54*C30秒65t:30秒60秒72匸60秒300秒上述反应的样品在1%琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴化乙锭染色，这些揭示出已产生了所有4个预期的DNA片段。第二个步骤SOE反应通过下列方式来进行使用制造商的条件，用在25p1体积中0.5M浓度的GC-RICH解析緩沖液，在RocheGCRICH试剂盒反应中以大约相等的量混合合适的片段。使用下面的2步循环条件来进行反应循环l-2941C30秒65。C30秒72°C60秒这个反应充当用于产生全长融合物的引物延伸。然后加入寡核苷酸引物以使用下列循环条件来PCR扩增全长分子。循环3-15最后延伸94。C30秒30秒72"C60秒72匸300秒当上述SOE反应的样品在1%琼脂糖/TBE凝胶上进行分析并用溴化乙锭染色时，2个反应均显示出包含大约750bp(预期大小)的DNA片段。使用GenecleanSpin试剂盒分离并纯化SOE产物，并克隆到pCRT0P0BluntII(Invitrogen)中。对于每种S0E产物(VH->VL和V「>VH)，T0P0克隆通过DNA测序来进行充分表征。然后，通过使用i^/el和fcoRI从pCRTOPOBluntil中切出scFv序列，并随后连接到类似制备的pDGF载体主链DNA中来制备pDGF表达构建体(pDGF-SV63-VHVL和pDGF-SV63-VLVH)。还通过使用和fcoRI从pCRTOPOBluntII中切出scFv序列，并随后连接到类似制备的pIMS147载体主链DM中来产生pIMS147表达构建体(pIMS-SV63-VHVL和pIMS-SV63-VLVH)。根据制造商的说明书将连接反应产物转化到大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中，并鉴定转化体。通过DNA序列分析来鉴定正确的pIMS147-SV63scFv和pDGF-SV63scFv克隆，以证实阅读框的保留和序列的精确度。2.5.5.重组scFv蛋白质在大肠杆菌中的表达根据Charlton("AntibodyEngineering:methods&protocols"第245-254页，Ed.B.K.C.Lo，HumanaPress,2004)所描述的指南，就可溶性scFv蛋白质的表达来测试pIMSSV63-scFv大肠杆菌TOP10克隆。简言之，将所选择的克隆的过夜培养物用于接种在2.5L烧瓶中的500ml2TY(amp/glu)(1升中含16g细菌用蛋白胨/5g酵母提取物/5gNaCl/2%(w/v)葡萄糖，pH7.5，+lOOjug/ml氨苄青霉素)，其随后在37C和250rpffl下孵育直至0D,达到约0.8。在这个点上，通过在3000g下离心来收获细胞，并转移至在2.5L烧瓶中的500ml新鲜2TY(amp/sue)(1升中含16g细菌用蛋白胨/5g酵母提取物/5gNaCl/0.4M蔗糖，pH7.5，+lOOyg/ml氨苄青霉素)之中。随后在30X:和250rpm下开始孵育1小时，然后加入IPTG至1mM的最终浓度。然后再孵育16小时，在这个点上收获细胞和培养基，并使用SDS-PAGE和蛋白质印迹程序就重组scFv的存在进行分析。其中与BMPOD生色底物溶液(Roche)相组合地使用抗FLAGMhHRP抗体(Sigma)的蛋白质分析表明，对于两个方向的scFv，在可溶性细胞裂解物和培养基样品中均存在重组蛋白质的良好表达水平(具有大约30kDa的预期大小分子量)。使用IMAC柱色镨法来纯化重组scFv蛋白质，并在使用Caco2Bbel细胞(CRL-2102,美国典型培养物保藏中心)的免疫细胞化学测定法中通过与亲本SV63MAb竟争结合抗原来测试功能性。观察两个方向的scFv以抑制亲本SV63MAb与细胞表面的结合，这表明在经改造的scFv中保留了抗原结合表面。实施例3:抗体纯化3.1.肽亲和柱的制备为了从多克隆血清中纯化出肽特异性抗体，制备肽亲和柱。取决于肽的N-末端残基，使用用于柱制备的两种方法中的一种。这些使用SulfoLink或AminoLink偶联凝胶作为亲和基质。SulfoLink偶联凝胶(Perbio)允许含巯基的肽共价固定至琼脂糖凝胶支持物以在亲和纯化程序中使用。使用由制造商提供的和下文概述的方案将RSPEs偶联至这种凝胶。10mlSulfoLink凝胶浆(5ml凝胶床体积)平衡至室温。将凝胶浆倾入柱中，并用20ml偶联緩冲液(50mMTris，5mMEDTApH8.5)(Sigma)平衡。将1mg合成肽溶解于5ml偶联緩冲液中并加入柱中。密封柱，并在室温下伴随颠倒混合来孵育15分钟，随后允许凝胶稳定30分钟。排出过量緩冲液，然后用15ml偶联緩冲液洗涤柱。用5ml在偶联緩冲液中的50mML-半胱氨酸盐酸盐(Sigma)封闭非特异性结合位点。如上所述，密封柱并在进行混合或不进行混合的情况下进行孵育。柱用30mlIM氯化钠(Sigma)洗涤，并通过施加10ml包含0.05%叠氮化钠(Sigma)的除气PBSpH7.2进行制备以用于jj^存。偶联的柱贮存于4r。AminoLink偶联凝胶(Perbio)允许肽经由伯胺共价固定至琼脂糖凝胶支持物以在亲和纯化程序中使用。使用由制造商提供的和下文概述的方案将RSPEs偶联至这种凝胶。10mlAminoLink凝胶浆(5ml凝胶床体积)平衡至室温。将凝胶浆倾入柱中，并用20ml偶联緩冲液(0.1M磷酸钠，pH7.5，0.05%叠氮化钠)平衡。将lmg合成肽溶解于5ml偶联緩沖液中。随后向肽溶液中加入250pi在0.01M氢氧化钠(Sigma)中制成的1M氰基硼氢化钠，将溶液倾入柱中。密封柱，并在室温下伴随颠倒混合来孵育6小时。让柱站立，并随后去除上清液。加入5ml1MTris-HClpH7.4(Sigma)和250pi在0.01M氢氧化钠中制成的1M氰基硼氢化钠。密封柱，并在室温下伴随颠倒混合来孵育30分钟。柱用30ml1M氯化钠洗涤，并通过施加10ml包含0.05%叠氮化钠的除气PBS进行制备以用于贮存。偶联的柱贮存于4x:。3.2.从多克隆血清中纯化肽特异性抗体多克隆兔血清在2500xg下离心IO分钟，使用0.45微米膜过滤，并随后用PBS进行1:1稀释。让肽亲和柱达到室温，并随后用4柱体积的PBS平衡。将制得的血清溶液加入柱，将流出液再施加至柱上。柱用6柱体积的PBS洗涤。通过将O.1M甘氨酸-HC1pH3.0(Sigma)施加至柱并在包含O.1ml1MTris-HClpH8.0的管中收集1ml级分来洗脱肽特异性抗体。随后通过在280nm处的吸光度来鉴定包含蛋白质的级分，并将它们合并在一起。使用具有10,000分子量截止值的Slide-a-Lyser盒(Perbio)将纯化的抗体透析到PBS中，并贮存于-20X:。同时，柱用3柱体积的0.1M甘氨酸-HClpH2.5，随后为8柱体积的PBS来再生。3.3.单克隆抗体的纯化使用HiTrapG蛋白HP1ml柱(GEHealthcare)通过G蛋白亲和色镨法从培养物上清液中纯化出单克隆IgG。将培养物上清液在2500xg下离心IO分钟，并在使用前用0.45微米膜过滤。最大流速自始至终为1ml/分钟。柱用10柱体积的PBSpH7平衡，并加载样品。柱用IO柱体积的PBS洗涤。通过将0.1M甘氨酸-HClpH3.0(Sigma)施加至柱上并在包舍O.1ml1MTris-HClpH8.O的管中收集lml级分来洗脱抗体。随后通过在280nm处的吸光度来鉴定包含蛋白质的级分，并将它们合并在一起。使用具有io，ooo分子量截止值的Slide-a-Lyser盒(Perbio)将纯化的抗体透析到PBS中，并贮存于-20匸。同时，柱用IO柱体积的0.1M甘氨酸pH2.5再生，用10柱体积的PBS洗涤，并于4X:贮存在20%乙醇中。实施例4:抗体表征4.1.通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)来滴定抗-肽抗体基于EngvallE.和PerlmannP.Immunochemistry8，871-874(1971);HarlowE.等人，Antibodies-ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988，笫182-183页描述的方法，通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定从用肽缀合物免疫接种的兔、小鼠或仓鼠获得的血清以测定抗体应答的相对量级。在35mM碳酸氢钠，15mM碳酸钠(pH9.5)中2pg/ml的肽溶液以lOOju1/孔加入96孔微量滴定板中，并于4T孵育至少4小时。板随后用PBS，0.05%Tween20(PBST)(Sigma)洗涤3次。剩余的结合位点用200ul/孔的包含1%脱脂奶粉Marvel，PremierFoods,StAlbans)的PBS在室温下封闭30分钟。如上洗涤后，以100jil/孔向板中加入PBST。将最初的血清稀释物加入在第1列中的一式两份孔中，并随后跨越板的孔进行两倍稀释，留下第12列中的孔只包含PBST。板在室温下孵育2小时。进一步如上洗涤后，板在室温下与在PBST中稀释至1/10，000的合适的经缀合的抗-物种抗体一起孵育1小时。兔血清样品与山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(Sigma)一起孵育；仓鼠血清与兔抗叙利亚仓鼠IgG-HRP缀合物(Stratec，Soham,Cambridgeshire)—起孵育；并且小鼠血清样品将与兔抗小鼠IgG-HRP缀合物(Sigma)和山羊抗小鼠IgGFc片段-HRP缀合物(Sigma)一起孵育。通过在10ml的24mM柠檬酸、60mM磷酸钠pH5.0中稀释包含1mg3，3'，5，5'四甲基联苯胺二盐酸盐(Sigma)的一个药片并加入2pi30%过氧化氢溶液(Sigma)来制备底物溶液。进一步洗涤后，将新鲜底物溶液以lOO]u1/孔加入板中，并将板置于黑暗中和室温下30分钟。所得到的颜色形成通过加入50ju1/孔的3M硫酸来中止。随后使用微量滴定板阅读器在450nm处读取板的光密度。4.2.EILSA结果4.2.1.来自兔的多克隆抗血清如上文实施例4.1中所述，通过肽EILSA来测定在第3剂后从用来自下列靶蛋白的RSPEs免疫接种的兔(参见上文实施例2.1)中获取的血清大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155(PVR-脊髓灰质炎病毒受体；Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠0ATP-B、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL和大鼠SCAB。来自每只兔的测试和免疫前血清通过针对它们的免疫接种肽(immunisingpeptide)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。结果概述于下表6中。表6.ELISA结果，显示出已产生了针对指定RSPEs的兔多克隆抗体来源蛋白质免疫接种RSPE~~50%结合滴度(稀释倍数)<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>测试18，000来自每一种测试放血获得物的血清如实施例3.2中所述进行亲和纯化，并随后如先前所述通过ELISA进行测试。结果在下表7中给出。表7.关于从兔测试血清获得的经亲和纯化的抗体的ELISA结果<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>用来自大鼠CNT2核苷转运蛋白的RSPE免疫接种的兔的收获放血获得物也进行亲和纯化，并通过ELISA进行测试。来自兔l的收获放血获得物以0.86mg/ml的浓度在36.5ml中洗脱，并测得50%结合滴度为1/47,000。来自兔2的收获放血获得物以0.57mg/ml的浓度在27.5ml中洗脱，并测得50%结合滴度为1/44，000。使用A蛋白柱(Amersham)进一步纯化来自兔1的经亲和纯化的多克隆抗体，逆着磷酸盐緩冲盐水(PBS)进行透析，并通过ELISA进行测试。这产生13ml的经进一步纯化的针对CNT2来源的RSPE(SEQIDNO:6)的多克隆IgG，其具有1.97mg/ml的浓度和1/90，000的50%结合滴度。4.2.2.来自小鼠的多克隆抗血清如上文实施例4.1中所述，通过肽EILSA来测定在第3剂后从用来自下列靶蛋白的RSPEs免疫接种的小鼠(参见上文实施例2.2)中获取的血清大鼠寡肽转运蛋白PepTl、大鼠CD155(PVR-脊髓灰质炎病毒受体；Tage4)、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GCC、大鼠PLB和大鼠LPH。来自每只小鼠的测试血清通过针对它们的免疫接种肽的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。结果概述于下表8中。表8.ELISA结果，显示出已产生了针对指定RSPEs的小鼠多克隆抗体来源蛋白质免疫接种RSPE小鼠血清样品50%结合滴度(稀释倍数)大鼠寡肽转运蛋白PepTlSEQIDNO:11>100,000270，000370，0004〉100，000大鼠寡肽转运蛋白PepTlSEQIDNO:21-210，00034一大鼠CD155(PVR，Tage4)SEQIDNO:313，000262，000341，0004—大鼠GTR2(GLUT2)葡萄糖SEQIDNO:412,000转运蛋白22,0003-4一67,00077,00084,000<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>4.2.3.针对来自大鼠寡肽转运蛋白PepTl的RSPE的单克隆抗体来自7种阳性单克隆细胞系(其产生针对具有SEQIDNO1的RSPE的抗体(参见上文实施例2.3))中每一种的40ml培养物上清液如实施例3.2中所述进行亲和纯化，并随后如上文实施例4.1中所述通过ELISA进行测试。纯化的单克隆抗体通过针对免疫接种肽(SEQIDNO:1)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。结果概括于下表9中。表9.来自杂交瘤细胞系的经亲和纯化的培养物上清液的ELISA结果，所述杂交瘤细胞系从用来自大鼠寡肽转运蛋白PepTl的RSPE免疫接种的小鼠产生_杂交瘤细胞系洗脱体积(ml)浓度(mg/ml)50%结合滴度_(稀释倍数)1645.142.002^El300，0001644.112.04041.112,5001645.451.20920.1-1647.372.24531.292,0001646.461.14420.08-1647.449.04720.09-1646.240.20620.1-杂交瘤细胞系1645.142，002、1644.112.040和1647.372，245清楚地产生了单克隆抗体，其识别具有来源于大鼠PepTl的SEQIDNO1序列的RSPE。4,2.4.针对来自小鼠GLUT7转运蛋白的RSPE的单克隆抗体来自4种阳性单克隆细胞系(其产生针对具有SEQIDNO11的RSPE的抗体(参见上文实施例2.3))中每一种的40ml培养物上清液如实施例3.2中所述进行亲和纯化，并随后如上文实施例4.1中所述通过ELISA进行测试。纯化的单克隆抗体通过针对免疫接种肽(SEQIDNO:11)的滴定来进行测定。免疫应答通过计算50%结合滴度值(减少最大信号至50%所需的稀释度)来评估。关于4种抗-GLUT7单克隆抗体中的2种的结果概括于下表10中。表10.来自杂交瘤细胞系的经亲和纯化的培养物上清液的ELISA结果，所述杂交瘤细胞系从用来自小鼠GLUT7转运蛋白的RSPE免疫接种的小鼠产生<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>4.3.啮齿类动物肠组织切片的免疫组织化学将大鼠肠组织速冻在液氮中，并贮存于-80'C直至使用。所有组织于-20匸在恒冷切片机上进行切片，并将组织置于带正电荷的载玻片上，在水冷的丙酮中固定IO分钟并让其风干。载玻片贮存于-20"C并在切片的l个月内使用。在开始免疫组织化学之前，让所有载玻片升热直至室温。随后将它们加栽到Sequenza上，用于执行手动IHC。所有载玻片通过在室温下施加过氧化物酶封闭物(在DakoEnvision试剂盒中提供)6分钟来封闭内源性过氧化物酶。随后，载玻片在具有吐温20(0.1%)的TRIS-緩冲盐水(10mM)(TBST)中洗涤5分钟。非特异性蛋白质通过在室温下加入5%牛奶蛋白质(Marvel)30分钟来封闭。栽玻片在TBST中洗涤5分钟。施加一抗(在含1%Marver的TBST中制成，以表中所示的稀释度)，并将载玻片在室温下孵育1小时。随后将载玻片在TBST中洗涤(2x5分钟)。施加Envision⑧兔聚合物，并在载玻片上于室温下孵育30分钟。在TBST中洗涤载玻片(2x5分钟)。在室温下施加DAB5分钟。在经蒸馏的H20中洗涤载玻片，通过分级乙醇和二曱苯进行脱水，并随后置于DPX中。表11.针对特定RSPE产生的兔多克隆抗体的免疫组织化学数据的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>9小鼠MDR1多药抗性转运蛋白1:1:10-200无染色无染色10大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶1:1:10-200无染色无染色11小鼠GLUT7葡萄糖1:25-1:50十二指肠腺上隐窝上皮细胞隐窝上皮细隐窝上皮细胞用过量肽成转运蛋白200有染色染色胞染色染色功地阻断了染色12小鼠GLUT7/大鼠GTR5(GLUT5)葡萄糖转运蛋白1:1:10-200无染色无染色15大鼠OATP-B(SLC2U9)有机阴离子转运多肽1:1:10-200可能的隐窝上皮染色27大鼠GCC(鸟苷酸环1:25-1:25隐窝上皮细胞隐窝上皮细胞隐窝上皮细隐窝上皮细胞用过量肽成化酶)1:200和绒毛上皮细胞染色和绒毛上皮细胞染色胞和绒毛上皮细胞染色和绒毛上皮细胞染色功地阻断了染色28大鼠PLB(磷脂酶1:25-1:50绒毛和隐窝上绒毛和隐窝上绒毛和隐窝绒毛和隐窝上用过量肽没1:200皮细胞染色皮细胞染色上皮细胞染色皮细胞染色有成功阻断染色-提示看到了非特异性染色29大鼠LPH(乳糖酶-1:25-1:25可能的隐窝和可能的隐窝和无染色无染色用过量肽成根皮苷水解酶)1:200绒毛上皮细胞染色绒毛上皮细胞染色功地阻断了在十二指肠和空肠中的染色31大鼠AMPN(氨肽酶1:1:25-200无染色无染色无染色无染色200680013523.3ss士-遂「、&溜步被54/71到<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>使用封闭肽(blockingpeptide)来评估特异性染色。在产生最佳染色的稀释度上的一抗与10倍过量的肽一起于室温下在含1%Marvel的TBS中孵育2小时，然后施加于载玻片上，其余方案如上所述。结果概述于上表11中。实施例5:重组蛋白质毒素的产生5.1.重组白树毒蛋白的产生编码具有251个氨基酸的白树毒蛋白的基因(参见Nolan等人，1993，Gene134:223-227)连同/e/5前导序列和C-末端六组氨酸标签一起对于大肠杆菌表达进行密码子优化，并在处于混合"c启动子控制下的条件下克隆到到大肠杆菌表达载体(pDGF-来源于NEB载体pMALc-2，pDGF包括pMALc-2的所有特征，除了编码麦芽糖结合蛋白的序列外，其已被切除)中。将重组载体转化到大肠杆菌菌抹TOP10中。通过在LB培养基中培养转化的TOP10细胞并于28X:用1mMIPTG诱导20小时来获得白树毒蛋白的表达。在收获大肠杆菌细胞后，使用弗氏细胞压碎器(ConstantSystems;在20，000psi下破裂)在lxPBS/30mM咪唑中破裂细胞。将可溶性提取物施加于GraviTrap柱(GEHealthcare)上，并在用15mllxPBS/30mM咪喳洗涤后，在lxPBS/500mM咪唑中洗脱白树毒蛋白。作为第二个纯化步骤，洗脱物经脱盐而进入20mM磷酸钠緩沖液(pH8.0)中，并施加于ResourceS阳离子交换柱上，进行0-lM盐梯度洗脱。为确定重组白树毒蛋白是否具有活性(有功能的)，将纯化的白树毒蛋白在蛋白质翻译抑制测定法(TNTT7快速的偶联式转录/翻译系统，Promega)中进行测试，其中使用T7萤光素酶DNA作为底物。作为阳性对照，使用环己酰亚胺。这证实，纯化的重组白树毒蛋白抑制了T7萤光素酶DNA的翻译。5.2.重组VIP2A的产生编码具有464个氨基酸的VIP2A蛋白(参见US5，849，870)的基因连同C-末端六组氨酸标签一起对于大肠杆菌表达进行密码子优化，并克隆到pET24a表达栽体(Novagen)中。将重组载体转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。通过在LB培养基中培养转化的BL21(DE3)细胞并于用1mMIPTG诱导20小时来获得VIP2A的表达。在收获后，如上文实施例5.1中所述使用弗氏细胞压碎器来破裂细胞。将可溶性提取物施加于HisTrapHP柱(GEHealthcare)上，并在用5柱体积的PBS/20mM咪唑洗涤后，用高达50QmM咪唑的梯度来洗脱VIP2A蛋白。可溶性提取物和来自纯化过程的样品的SDS-PAGE分析揭示出条带，该条带在对于重组生产的具有组氨酸标签的VIP2A的预期大小处。5.3.用于产生重组粒酶B的表达构建体人工合成编码具有228个氨基酸的、成熟的、来自大鼠的粒酶B的基因(关于序列信息参见Genbank登录号M34097)(DNA片段050031)，并克隆到pCR-Script中从而得到质粒p050031。采取巢式PCR方法将粒酶B编码序列导入表达载体pET32a(+)(Novagen)中。使用引物RoPro070petEK/rGrzBFl(SEQIDNO:51)和RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)从p050031中PCR扩增出成熟的粒酶B编码序列，以导入与在pET32a(+)中的融合标签之中存在的肠激酶位点同源的5'尾部。所得到的PCR产物用作巢式PCR的第二部分的模板，所述巢式PCR的第二部分使用引物RoPro076petEK/rGrzBF2(SEQIDNO:53)和RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)来进4亍以导入5'位点。最终的PCR产物用Kpnl/Notl进行消化，并连接到经类似消化的pET32a(+)中，从而得到表达载体pET32a(+)::rGrzB。这导致来自宿主载体的N-末端表达标签和重组粒酶B编码序列之间的整齐融合，从而允许在表达后通过用肠激酶进行处理来激活重組粒酶B。最终的表达载体pET32a(+)::rGrzB可以转化到任何合适的大肠杆菌表达宿主(例如RosettaGami(DE3))中。在构建pET32a(+)::rGrzB中使用的引物序列如下(所有引物序列以5'到给出)RoPro070petEK/rGrzBFl(SEQIDNO:51)GGTACCGACGACGACGACAAGATCATCGGTGGTCACGAAGCTAAGCCAC;RoPro067rGrzBR(SEQIDNO:52)AGCTGGCGGCCGCCTAGGAC;RoPro076petEK/rGrzBF2(SEQIDNO:53)AGATCTGGGTACCGACGACGACGAC。实施例6:抗体组分与毒素的缀合6.1.商购可得的白树毒蛋白与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合被选择用于执行这个操作的策略为用交联剂SPDP(N-琥珀酰亚氨基-3-[2-吡咬基二硫基]丙酸酯；PierceChemicalCo.)来激活抗体，所述交联剂SPDP将与硫醇化的毒素形成二硫键。所使用的方法来自Hermanson1996"BioconjugateTechniques"(AcademicPress第509页)，其说明，该缀合不会干扰毒素白树毒蛋白的活性(30kDa)。使用5:1和10:1的白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的摩尔比以获得最有效的反应混合物。6.1.1.CNT2多克隆抗体的SPDP处理4吏用centricon旋转浓缩器以10kDa的截止值来浓缩经A蛋白纯化的兔l多克隆IgG(参见实施例4.2.1，亲和纯化来自兔l的收获放血获得物，并随后使用A蛋白柱进行纯化)的lml等分试样。将所得到的160ul制成在PBS10mMEDTApH8中的10mg/ml溶液。将6ulSPDP(在DMF中，3mg/ml)加入200ul抗体溶液中，并在室温下孵育30分钟。将反应混合物施加至用PBS+10mMEDTApH8平衡的PD10脱盐柱上。收集所有3.5ml样品体积，并4吏用centricon浓缩器进行浓缩，从而获得最终浓度为3.6mg/ml的经SPDP处理的抗-CNT2抗体。6.1.2.白树毒蛋白的石克醇化作为从多花白树(Ce/o/7/"迈/Z7i7/"77or咖)的种子中纯化出的5mg冻干蛋白质样品从AczonSpA获得白树毒蛋白。最初将样品以5mg/ml的浓度溶解于PBS中。将300ul的这种溶液在centricon浓缩器中进行浓缩，并使体积减少至55ul。随后将这在50mM三乙醇胺，10mMEDTApH8中进行稀释以得到10mg/ml的白树毒蛋白溶液。溶解2-Immunothiolane以得到在蒸馏水中的20mg/ml溶液。将10.5ul的2-Immunothiolane溶液加入150ul白树毒蛋白溶液中，并将混合物在冰上孵育1小时。将活化的白树毒蛋白施加于用PBS+10mMEDTApH8平衡的PD10脱盐柱上。收集所有3.5ml样品体积，并在centricon浓缩器中进行浓缩，从而获得最终浓度为3mg/ml的硫醇化的白树毒蛋白。6.1.3.抗-CNT2多克隆抗体与白树毒蛋白的缀合为了获得5:1的白树毒蛋白与抗-CNT2抗体的摩尔比，需要0.5mg石充醇化的白树毒蛋白与0.5mg抗-CNT2抗体反应。因此，将138ul经SPDP处理的抗-CNT2抗体加入167ul石克醇化白树毒蛋白中。反应还在白树毒蛋白与抗-CNT2抗体的摩尔比为10:1的情况下进行(将在333ul中的1mg硫醇化白树毒蛋白加入至在138ul中的0.5mg经SPDP处理的抗-CNT2抗体中)。每个反应体系在氮气下密封，并于4"C赙育20小时。这个时间后，任何未反应的巯基残基通过加入碘乙酰胺至2mM的最终浓度来进行封闭。6.1.4.缀合物的分析每个反应混合物通过MALDI-TOF质镨法、SDS-PAGE和ELISA来进行分析。从反应混合物的SDS-PAGE分离和质谱法获得的数据(未显示)揭示出每个缀合反应都是成功的，并且鉴定出了1、2和3分子的白树毒蛋白缀合至单个抗体分子的种类。尽管质语法数据揭示了某些未缀合抗体的存在，其量不足以在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上被观察到。看起来，在2种反应比例之间在缀合效率方面没有差异。如先前所述对每个反应混合物进行ELISA测定法，以便评估抗体的结合活性是否受到缀合反应的影响。获得的数据概括于下表12中。表12.关于白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的缀合的ELISA数据<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>可以看出，结合受到添加SPDP多聚连接体(polylinker)和缀合至白树毒蛋白这两者的影响。然而，缀合的抗体反应混合物仍显示出显著的结合。这可以归因于在反应混合物中的缀合和未缀合的抗体。因为未缀合抗体的量很低，所以假定，所观察到的结合的良好比例可能归因于缀合的抗体。6.2.重组白树毒蛋白与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合采用与上文实施例6.1中所概述的相同的策略以便将如上文实施例5中所述而生产的重组白树毒蛋白缀合至多克隆抗大鼠CNT2抗体。使用5:1的白树毒蛋白与抗-CNT2多克隆抗体的摩尔比以获得最有效的反应混合物。6.2.1.抗-CNT2多克隆抗体的SPDP处理作为在PBS/10mMEDTApH8中的10mg/ml溶液将3.75mg经A蛋白纯化的兔1多克隆抗体与11.25ulSPDP(在DMF中，3mg/ml)混合，并在室温下孵育30分钟。反应混合物经过用PBS/10mMEDTApH8预平衡的Zeba(PierceChemicalCo.)脱盐柱。6.2.2.重组白树毒蛋白的^t醇化将3.75mg重组白树毒蛋白在50mM三乙醇胺，10mMEDTApH8中制成10mg/ml。将2-Iminothiolane(Traut's试剂；Sigma-Aldrich)在除气并氮起泡的去离子H20中溶解至20mg/ml，将26.25ul的这种溶液加入白树毒蛋白溶液中，并在氮气氛中在冰上孵育1小时。硫醇化的白树毒蛋白经过用PBS/10mMEDTApH8预平衡的Zeba(PierceChemicalCo.)脱盐柱。6.2.3.抗-CNT2多克隆抗体与重组白树毒蛋白的缀合将SPDP-反应的抗体溶液与硫醇化的重组白树毒蛋白溶液相混合，产生等量的每种蛋白质组成成分，提供了5:1的重组白树毒蛋白与抗体的摩尔比。反应体系在氮气下密封，并于4X:孵育20小时。这个时间后，通过加入硪乙酰胺至2mM的最终浓度来封闭任何未反应的巯基，随后为在室温下最少孵育1小时。6.2.4.缀合物与未缀合的重组白树毒蛋白的分离将使用PBS的凝胶过滤用于分离未缀合的白树毒蛋白分子与缀合物。使用AktaFPLC设备(Amersham-Pharmacia)，将10/300Superdex200柱(Amersham-Pharmacia)在PBS中平衡，进行3个柱体积(CVs)。通过在PC上运行的Unicorn软件(Amersham-Pha簡cia)来控制色镨法，所述软件注入样品并随后维持O.5ml/分钟的流速，在洗脱O.1CVs后将0.5ml级分收集到96孔区块中。让洗脱进行1.4CVs。如制造商所述在非还原性SDS-PAGE凝胶(在MOPS緩冲液中的4-12%双-三NuPage;Invitrogen)上分析所选择的级分。如制造商所述，使用SimplyBlue考马斯染料(Invitrogen)来染色凝胶。合并被确定包含缀合物的级分，并用于下一个纯化步骤。合的抗-CNT2抗体的分离在重组白树毒蛋白分子上存在六组氨酸C-末端尾部允许应用固定的金属螯合亲和色谱法(IMAC)作为在缀合物纯化中的第二个色谱步骤。在未缀合的抗体上缺乏六组氨酸基序(凝胶过滤后仍存在于缀合物级分中)允许从包含六组氨酸的缀合物中去除游离抗体。因此，将在上文6.2.4中获得的合并的级分经过HisTrapHPlml镍-亲和柱(通过5CVsPBS/15mM咪峻预平衡；AmershamBiosciences)，所述柱连接至受在PC上运行的Unicorn软件(AmershamBiosciences)控制的AktaFPLC装置。使用PBS/15mM咪唑作为加载/洗涤緩沖液，经过5CVs来进行柱的加栽和洗涤。包含六组氨酸的蛋白质的洗脱通过应用15mM-500mM咪唑(在PBS中)的梯度经过20CVs来完成。级分以O.5ml体积收集在96孔区块中。如制造商所述在非还原性SDS-PAGE凝胶(在MOPS緩沖液中的4-12%双-三NuPage;Invitrogen)上分析所选择的级分。如制造商所述，使用SimplyBlueTM考马斯染料(Invitrogen)来染色凝胶。凝胶揭示出，通过IMAC步骤基本上将缀合物纯化为不含游离抗体。合并包含缀合物的级分，并使用具有10kD分子量截止值的VivaSpin20ml旋转浓缩器进4亍脱盐而进入PBS中。6.2.6.缀合物的分析MALDI-T0F质谱法用于分析相对于未缀合的抗-CNT2抗体来说合并的缀合物样品的组成。获得的质语(未显示)表明了在合并的缀合物级分(库B)中存在1:1、1:2和1:3比率的抗体白树毒蛋白缀合物种类。没有观察到带单电荷的未缀合的抗体种类，然而鉴定出在光i瞽上的峰，其与带双电荷的未缀合的抗体种类有关。因此，尽管大多数未缀合的抗体被从缀合的抗体中纯化出去(如IMAC纯化过程的SDS-PAGE分析所表明的)，但可以推断在合并的纯化样品中残留非常少量的未缀合的抗体。通过ELISA(以确定缀合物对抗体结合的影响)和通过体外翻译抑制测定法(以确定白树毒蛋白的功能活性是否已受到缀合的影响)来评估在经IMAC纯化的合并样品中缀合物的功能活性。ELISA(数据未显示)揭示出与关于缀合至商业供应的白树毒蛋白(上文实施例6.1.4)时所观察到的那些类似的结果抗体结合受到添加SPDP多聚连接体和缀合至重组白树毒蛋白这两者的影响，但缀合的抗体反应混合物仍显示出显著的与大鼠CNT2RSPE的结合。尽管质i普分析表明，即使在IMAC纯化后仍存在某些未缀合的抗体残留，但由于IMAC纯化，在经IMAC纯化的样品中未缀合抗体的量将少于在天然白树毒蛋白/抗-CNT2抗体的缀合反应混合物中的量。因此，观察到的抗体结合可以归因为主要是由于抗CNT2抗体-重组白树毒蛋白缀合物。如制造商所述，使用TNT快速的偶联式转录/翻译系统(Promega)来测定在来自IMAC纯化的合并的包含缀合物的样品中缀合至抗-CNT2抗体的重组白树毒蛋白的核糖体抑制能力的保留。图2显示了结果。通过在经IMAC纯化的合并样品(库B)中的缀合物所显示的翻译抑制等同于最初的重组白树毒蛋白(rGelonin)。因此，在缀合后保留了核糖体抑制能力。6.3.商购可得的P-噪呤硫素与多克隆抗大鼠CNT2抗体的缀合选择用于这种缀合的策略采用具有大的间隔臂的TFCS交联剂(Pierce)，以便使得尽可能多地暴露于相对较小的(5kDa)P-嘌呤硫素分子。TFCS在一个末端上具有NHS酯基团，其结合抗体上的胺基团，并且在另一个末端上具有受保护的胺基团，通过将pH升高至8可将其暴露以用于与经适当处理的P-嘌呤硫素反应。p-嘌呤硫素上的羧基与EDC反应以形成不稳定的胺反应中间物，其随后与sulfo-NHS反应以提供更稳定的鍵合。随后将经EDC/sulfo-NHS处理的p-嘌呤硫素结合至TFCS连接体的胺末端。6.3.1.CNT2多克隆抗体的TFCS处理使用centricon旋转浓缩器以10kDa的截止值来浓缩经A蛋白纯化的兔1多克隆IgG(参见实施例4.2.1，亲和纯化来自兔1的收获放血获得物，并随后使用A蛋白柱进行纯化)的lml等分试样。所得到的样品容量为在O.1M磷酸钠緩冲液，0.15MNaClpH7.2中高达5mg/ml。每500ji1抗体加入15ulTFCS(在DMF中，3mg/ml)，并在室温下孵育l小时。将反应混合物施加至用0.1M磷酸盐緩冲液pH8平衡的PD10脱盐柱上。收集所有3.5ml样品体积，并使用centricon浓缩器进行浓缩，从而获得最终浓度为10mg/ml的经TFCS处理的抗-CNT2抗体。6.3.2.P-嘌呤硫素的EDC和sulfo-NHS处理将来自小麦胚乳的冻干P-嘌呤硫素(Takara)溶解在0.1M磷酸钠緩冲液，0.15MNaClpH7.2中至10mg/ml的最终浓度。加入EDC以得到2mM的最终浓度，同时sulfo-NHS至5mM的最终浓度，并且使混合物在室温下反应15分钟。通过加入2-巯基乙醇至20mM的最终浓度来中止反应。将活化的嘌呤硫素施加至用O.IM磷酸钠緩沖液，0.15MNaClpH7.2平衡的聚丙烯酰胺脱盐柱(大小排阻极限为1,800Da;Pierce)上。收集级分并在0D280nm处检测毒素的存在。6.3.3.抗-CNT2多克隆抗体与活化的P-噪呤硫素的缀合混合经TFCS处理的抗体和经EDC/sulfo-冊S处理的p-嘌呤石充素以得到30:1的p-噤呤硫素抗-CNT2抗体的摩尔比，并让其于4X3反应过夜。随后通过加入羟胺至10mM的最终浓度来中止反应。然后将反应混合物施加至大小排阻色镨法柱上，以分离游离的P-嘌呤硫素与抗体-p-嘌呤硫素缀合物。合并包含缀合物的级分。6.3.4.缀合物的分析MALDI-TOF质谱法用于分析相对于未缀合的抗-CNT2抗体来说合并的缀合物样品的组成。获得的质镨(未显示)表明在合并的缀合物级分中存在1:1、1:2和1:3比率的抗体P-嘌呤硫素缀合物种类。还观察到一些带单电荷的未缀合的抗体种类。如先前所述，通过ELISA评估在合并的样品中缀合物的功能活性。关于缀合物的50%结合滴度经计算为0.067jig/ml，而关于未缀合的抗-CNT2抗体为0.041jag/ml。表13.使用抗-CNT2::P-嘌呤硫素缀合物的大鼠胃肠组织免疫组织化学分析稀释存在染色时的大鼠十^"指大鼠空肠大鼠回大鼠结肠用封闭肽度范缀合物的稀释肠肠进行阻断围度1:251:25和1:50粘膜肌层染未测试未测试粘膜肌层染未测试—色以及械毛色以及绒毛1:50和隐窝上皮和隐窝上皮细胞染色细胞染色抗-CNT2::0-嘌呤硫素缀合物的样品用于进行啮齿类动物胃肠组织的免疫组织化学分析(关于方法参见实施例4.2)。结果概括于上表13中。实施例7:融合蛋白表达栽体的构建在识别细胞表面抗原的scFv和3种不同的蛋白质毒素即白树毒蛋白、粒酶B和cyt2A之间构建融合蛋白表达载体。在这个例示中所使用的scFvs是上文实施例2.5中所述的SV63scFvs。自始至终遵循用于质粒制备、限制性内切酶消化、连接、大肠杆菌转化等的标准分子生物学技术。7.1.白树毒蛋白-scFv融合构建体人工合成编码具有251个氨基酸的白树毒蛋白的基因(参见Nolan等人，同上)，5'序列设计为允许按阅读框融合至来自SV63抗体的VH(产生人工基因054014)或VL(产生人工基因054013)编码序列，并亚克隆到pCR-Script中以得到2个构建体，p054013和p054014。质粒p054013用S/7el和消化，纯化产生的编码白树毒蛋白的片段并连接到经类似消化的pDGF-SV63-VHVL中，从而得到载体pDGF-SV63-VHVLrGel。这形成了在SV63scFv的N-末端与重组白树毒蛋白之间的经由单个Gly4Ser连接体的框内融合。因此，在pDGF-SV63-VHVLrGel中的表达盒在5'到3'方向上包括下列组分"c启动子、；e^前导序列、SV63VH编码序列、[Gly4Ser]3连接体、SV63、编码序列、Gly4Ser连接体、重组白树毒蛋白编码序列。SV63VH编码序列、[Gly4Ser]3连接体、SV63VL编码序列、Gly4Ser连接体和重组白树毒蛋白编码序列可以容易地切割出为/fcoRI片段，并在需要时连接到备选的表达/克隆载体例如pIMS147或pET32a中。质粒p054014用BseRI和Notl消化，纯化产生的编码白树毒蛋白的片段并连接到经类似消化的pDGF-SV63-VLVH中，以得到载体pDGF-SV63-VHVLrGel。这形成了在scFv的N-末端与重组白树毒蛋白之间的经由单个Gly4Ser连接体的框内融合。因此，在pDGF-SV63-VHVLrGel中的表达盒在5'到3'方向上包括下列组分启动子、/7eM前导序列、SV63Vt编码序列、[Gly4Ser]3连接体、SV63VH编码序列、Gly4Ser连接体、重组白树毒蛋白编码序列。SV63VL编码序列、[Gl^Ser]3连接体、SV63VH编码序列、Gly4Ser连接体和重组白树毒蛋白编码序列可以容易地切割出为iVcol/A"RI片段，并在需要时连接到备选的表达/克隆栽体例如pIMS147或pET32a中。7.2.粒酶B-scFv融合构建体制备两种构建体，各携带N-末端融合至SV63scFv的粒酶B:pET32a::rGrzB::SV63VHVL和pET32a::rGrzB::SV63VLVH。使用pET32a(+)::rGrzB(上文实施例5.3)作为模板并结合引物重叠延伸法来构建质粒pET32a::rGrzB::SV63VHVL，以经由单个Gly4Ser连接体在VJl方向上(N到C-末端)将成熟的粒酶B编码序列融合至SV63scFv。(i)通过使用pET32a(+)::rGrzB作为PCR模板，并使用pETF(SEQIDNO:54)和RoPro071G4S/rGrzBRl(SEQIDNO:55)引物，而向成熟的粒酶B编码序列添加编码单个Gly4Ser连接体的3'末端序列。(ii)通过使用pDGF-SV63-VHVL作为PCR模板，并使用RoPro074rGrzB/G4S/VHVLF(SEQIDNO:56)和RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)引物，而向SV63VHVL编码序列添加编码单个Gly^Ser连接体和部分粒酶B编码序列的5'末端序列。纯化来自上文(i)和(ii)的产物并以等摩尔量混合，然后进行无引物延伸，并随后使用pETF(SEQIDN0:54)和RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)进行PCR以扩增出全长融合产物，其通过使用独特Sful和Notl位点而克隆到pET32a(+)中。还使用pET32a(+)::rGrzB(上文实施例5.3)作为模板并结合引物重叠延伸法来构建质粒pET32a::rGrzB::SV63VLVH，以经由单个Gly4Ser连接体在VJh方向上(N到C-末端)将成熟的粒酶B编码序列融合至SV63scFv。(i)如上文(i)中所描述的，向粒酶B编码序列添加编码单个Glyjer连接体的3'末端序列。(ii)通过使用pDGF-SV63-VLVH作为PCR模板，并使用RoPro072rGrzB/G4S/VLVHF(SEQIDNO:58)和RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)引物，而向SV63VLVH编码序列添加编码单个Gly4Ser连接体和部分粒酶B编码序列的5'末端序列。纯化来自上文(i)和(ii)的产物并以等摩尔量混合，然后进行无引物延伸，并随后使用pETF(SEQIDN0:54)和RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)进行PCR以扩增出全长融合产物，其随后通过使用独特和7VWI位点而克隆到pET32a(+)中。在粒酶B-scFv融合构建体的构建中所使用的引物序列如上文实施例5.3中和如下所述(所有引物以5'至3'给出)pETF(SEQIDNO:54)TCGGTGATGTCGGCGATATAG;RoPro071G4S/rGrzBRl(SEQIDNO:55)ACTACCTCCGCCACCGGACTTCTTCATAGTTTTCTTGATCCAGG;RoPro074rGrzB/G4S/VHVLF(SEQIDNO:56)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGAGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCTGG;RoPro075pET/VHVLR(SEQIDNO:57)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTACTTGATCTCCAGTTTGGTGCCTCCACCGAACG;RoPro072rGrzB/G4S/VLVHF(SEQIDNO:58)GAAGAAGTCCGGTGGCGGAGGTAGTGATATCGTTCTCACTCAATCTCCAGCAATC;RoPro073VLVH/pETR(SEQIDNO:59)TGCTCGAGTGCGGCCGCTTATTATGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCTTGGCC。7.3.Cyt2A-scFv融合构建体为了形成SV63scFv和Cyt2A序列的框内融合，遵循Gurkan和Ellar(2003ProteinExpr.Purif.29(1):103-16)的实例。人工合成编码Cyt2Aal(EMBL:BTCYTBG)的前237个氨基酸的基因以包含3'序列，所述3'序列被设计为形成14个氨基酸的Xpress表位(Invitrogen)的框内C-末端添加。这种人工合成的Cyt2A-Xpress表位序列称为051072，并亚克隆到pCRScript中从而得到p051072。在2个步骤中改变质粒pDGF-SV63-VHVL(参见实施例2.5)。首先，设计并产生人工合成的序列(称为p054247)，其将会通过包含SV63VL序列的3'末端序列的一部分、(Gly,Ser)3连接体和成熟Cyt2Aal蛋白的5'末端序列的一部分而形成连接片段(如Gurkan和Ellar所述，同上)。使用S/;el(5')和fcoRI(3')从p054247中切割出这个片段，并连接到经类似制备的pDGF-SV63-VHVL(参见实施例2.5)中。然后，所得到的质粒通过用S/"I和化/bHI切割并导入来自p051072的大约520bp^Y/I/^/dHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端加上Xpress表位)来进一步修饰。所得到的质粒(pDGF-SV63-VHVL::Cyt2A)包括SV63VHVLscFv经由柔性连接体与活性(成熟)形式的Cyt2Aal(氨基酸37-237)以及随后的Xpress表位的完全框内融合。类似地，质粒pDGF-SV63-VLVH在2步过程中进行修饰以导入Cyt2Aal序列。首先，设计并产生人工合成的序列(称为p054248)，其将会通过包含SV63VH序列的3'末端序列的一部分、(Gly4Ser)3连接体和成熟Cyt2Aal蛋白的5'末端序列的一部分而形成连接片段(如Gurkan和Ellar所述，同上)。将该人工序列亚克隆到pCRScript中从而得到质粒p05428。然后，使用^eRI(5')和化oRI(3')从p054248中切割出这个片段，并连接到经类似制备的pDGF-SV63-VLVH中。然后，所得到的质粒通过用5TwI和A/z/HI切割并导入来自p051072的大约520bp^wI/A/bHI片段(代表成熟的Cyt2Aal序列的3'末端加上Xpress表位)来进一步修饰。所得到的质粒(pDGF-SV63-VLVH::Cyt2A)包括SV63VLVHscFv经由柔性连接体与活性(成熟)形式的Cyt2Aal(氨基酸37-237)以及随后的Xpress表位的完全框内融合。实施例8:融合蛋白的表达将携带SV63scFv-白树毒蛋白融合基因的载体(参见上文实施例7.1)转化到大肠杆菌T0P1Q细胞中。如下来进行中试表达研究在2xYT/2%葡萄糖培养基中生长经转化的细胞，然后在补充有1mMIPTG的2xYT培养基中在20"C或15"C下诱导16小时。收获少量样品(10ml)并离心，并且将每个细胞沉淀重悬浮于1ml裂解緩冲液(PBS)中。样品进行超声处理，在13，OOOrpm和室温下再离心5分钟，并倾去上清液(可溶性级分)。将沉淀(不溶性级分)重悬浮于lml裂解緩冲液中。通过使用针对六组氨酸标签的抗体的蛋白质印迹法来分析可溶性和不溶性级分。分析揭示出，由所述两种表达载体均产生了scFv-白树毒蛋白融合蛋白(即其中scFv在VhVl方向，和其中scFv在VlVh方向)。然而，scFv的V^h方向得到较高产量的可溶性蛋白质。进行更大规模的培养和诱导，并通过在Gravitrap柱上进行纯化而从可溶性级分中进一步纯化出scFv-白树毒蛋白融合蛋白。实施例9:蛋白质缀合物和融合蛋白的体外测试本发明的蛋白质缀合物和融合蛋白导致上胃肠道损伤的能力通过测量粘膜对非可吸收性标记甘露醇的渗透性来评估，其中使用分离的大鼠十二指肠区段。使用先前公开的方法(Heylings，1991，Toxicol.Appl.Pharmacol.107:482-493)的修饰，<吏体外分离的组织暴露于这些啮齿类动物防治剂。简言之，在人道终止生命后立即从成年雄性AlderleyPark品系大鼠(Ap:AkfSD)中取出10cm胃肠道区段(胃的紧远端)。将组织置于含氧的TC199培养基中，并使用TC199培养基从远离胃的最远端小心地清洗出肠中的任何食物残渣。制备2个十二指肠区段，每个长度为2.5cm，近侧区段(紧在胃之后)和远侧区段(紧在胆管入口之后)。通过结扎拉紧而将所述区段小心附着至连接到贮液器的2个玻璃管的开放末端。这允许用分开的溶液来浸浴所分离的粘膜的腔(粘膜)侧和血液侧(浆膜)表面。每个粘膜室中玻璃棒末端之间的间隙为12mm。设备的图解表示类似于在来自Heylings1991(同上)的图1的上面部分中显示的那种。将附着有粘膜的室用含氧的T199培养基漂洗几次以去除在组织的腔侧上的过量粘液。腔(粘膜)侧装满包含20mg甘露醇/ml的4mlTC199培养基(TC199-M),并检查粘膜是否渗漏。将粘膜室浸入装满40mlTC199培养基(浆膜侧溶液)的外部杯状玻璃容器中，所述玻璃容器充入95%02:5%C02气体。安放好所述室以避免所述两种浸浴溶液之间的流体静力压梯度。所述两种溶液通过连接至外部泵的水套而维持在37±o.ix:。IO分钟的预孵育期后，取出粘膜室并用T199培养基冲洗以去除任何粘液累积物，最后将腔侧装满包含浓度为5x105dpm/ml的"C-甘露醇(胃肠道吸收很差的非电解质)的4mlTC199-M，并放回玻璃室。为了测量所分离的十二指肠粘膜对甘露醇的渗透性，在将其加入粘膜侧后，在10、20、30、60、120、180和240分钟时获取一式两份的150]Lil浆膜侧溶液等分试样。吸收的甘露醇的量通过液体闪烁计数来测定。作为阳性对照，将已知为胃肠道的局部刺激剂的百草枯(40mg百草枯离子/ml)在孵育开始后30分钟加入粘膜室中，以便证实该模型能够检测粘膜损伤。在孵育开始后30分钟时通过向粘膜室直接加入少量啮齿类动物防治剂(融合蛋白或蛋白质缀合物，参见例如上文实施例6-8)来加入其，并监控甘露醇吸收的时间过程特性。将这与平行进行的大鼠十二指肠近侧和远侧区段的同期阴性对照进行比较。上文描述的方法使用十二指肠组织，然而，胃肠道的其他区域可以代替并使用如上所述的相同程序进行测试。实施例10:蛋白质缀合物和融合蛋白的体内测试10.1.通过在小鼠中的口部管饲法来测试功效小鼠(总共18只，每组9只)通过管饲法用i)蛋白质缀合物或融合蛋白(特别参见上文实施例6-8;组1的小鼠)或ii)惰性媒介物(例如聚乙二醇；组2的小鼠)经口服给药。动物在给药后24、48和72小时被终止生命，在研究中自始至终定期进行临床观察。终止生命后，将十二指肠、空肠、回肠和结肠组织在福尔马林緩沖盐水中固定，进行加工，并包埋到蜡中和使用H&E进行染色以用于病理学评估。融合蛋白/蛋白质缀合物以下列测试浓度进行使用(以mg化合物/kg体重给出):8mg/kg、5mg/kg和3mg/kg。权利要求1.啮齿类动物防治剂，其包含结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位的抗体组分。2.根据权利要求1的啮齿类动物防治剂，其中所述啮齿类动物防治剂杀死啮齿类动物或阻止啮齿类动物生育。3.根据权利要求1或权利要求2的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分连接至毒性组分或避孕组分。4.根据权利要求3的啮齿类动物防治剂，其包含融合蛋白，所述融合蛋白包含第一种蛋白质组分和第二种蛋白质组分，所述第一种蛋白质组分是抗体组分，和所述第二种蛋白质组分选自毒素、免疫原和激素。5.根据权利要求4的啮齿类动物防治剂，其中所述第一种和第二种蛋白质组分经由肽连接体互相连接。6.根据权利要求5的啮齿类动物防治剂，其中所述肽连接体包含甘氨酸和丝氨酸残基。7.根据权利要求6的啮齿类动物防治剂，其中所述肽连接体包含至少3个(GIy4Ser)基序。8.根据权利要求3的啮齿类动物防治剂，其包含蛋白质缀合物，所述蛋白质缀合物包含化学缀合至毒性组分或避孕组分的根据权利要求1的抗体组分。9.根据权利要求3-8中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述毒性组分是蛋白质毒素。10.根据权利要求9的啮齿类动物防治剂，其中所述毒素是a)选自组1中所列出的蛋白质的全长蛋白质，其中组1由破裂膜的蛋白质、核糖基转移酶、丝氨酸蛋白酶、鸟苷酸环化酶激活物、参与ATP酶介导的离子转运的蛋白质、钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶和核糖核酸酶组成，或是b)选自组1的蛋白质的毒性结构域。11.根据权利要求9的啮齿类动物防治剂，其中所述毒素是a)全长RNA糖苷酶，或是b)RNA糖苷酶的毒性结构域。12.根据权利要求10的啮齿类动物防治剂，其中所述毒素是a)全长P-嘌呤硫素或选自组2中所列出的蛋白质的全长蛋白质，其中组2由产气荚膜梭菌细胞溶素0、ot-溶血素、鞘磷脂酶、5-溶血素、粒酶B、oc毒素、Cyt毒素、白喉毒素、粒溶素、蜂毒肽、穿孔素、霍乱肠毒素、热稳定肠毒素、海葵毒素、李斯特菌溶胞素、VIP2、附属肠毒素、气单胞菌溶素、BinA、BinB、大肠杆菌素El、溶血素A、CTXIV、蓖麻毒素、变形虫通道蛋白、ElTor溶血素、美人鱼弧菌溶血素、肺炎球菌溶血素、链球菌溶血素0、神奈川毒素、钩端螺旋体溶血素、Cry毒素、炭疽毒素、假单胞菌外毒素A、芽孢杆菌RNA酶和VIP3,或是b)b-噤呤硫素的毒性结构域或选自组2的蛋白质的毒性结构域。13.根据权利要求11的啮齿类动物防治剂，其中所述毒素是白树毒蛋白。14，根据权利要求3-8中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述避孕组分是能够引发针对卵子或精子特异性抗原的应答的免疫原。15.根据权利要求3-8中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述避孕组分是生殖激素。16.根据权利要求15的啮齿类动物防治剂，其中所述生殖激素是促性腺激素释放激素。17.根据权利要求8的啮齿类动物防治剂，其中所述毒性组分是选自下列的毒性化合物秋水仙素；多柔比星；加利车霉素；非类固醇抗炎药(NSAID)化合物；松胞菌素；抗凝剂；麦角钙化固醇；溴鼠胺；氟鼠啶；磷化锌；红海葱糖苷；(单)氟乙酸钠；氟乙酰胺；ot氯醛糖；硫酸铊。18.根据权利要求17的啮齿类动物防治剂，其中所述抗凝剂选自溴鼠灵、鼠得克、溴敌隆、氟鼠灵、噻鼠灵、羟基香豆素类和茚满二酮类。19.根据权利要求8的啮齿类动物防治剂，其中所述避孕组分是激素或激素样化合物。20.根据权利要求19的啮齿类动物防治剂，其中所述激素样化合物是diazacon。21.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分所结合的蛋白质是在啮齿类动物胃肠上皮中表达的蛋白质。22.根据权利要求21的啮齿类动物防治剂，其中所述蛋白质选自大鼠PEPTl、大鼠CD155、大鼠GTR2、大鼠CFTR、大鼠CNT2、大鼠CATB(0+)、大鼠MDR1、小鼠MDR1、大鼠蔗糖酶-异麦芽糖酶、小鼠GLUT7、大鼠GTR5、大鼠Npt2A、大鼠0AT-B、大鼠ASBT、大鼠CAT1、大鼠0ATP3、大鼠ABCG8、大鼠GTR8、大鼠MRP1、大鼠CNT1、大鼠UT-B、大鼠DRA1、小鼠ENT1和大鼠ENT1。23.根据权利要求21的啮齿类动物防治剂，其中所述蛋白质选自大鼠CATB(0+)、大鼠GCC、大鼠PLB、大鼠LPH、小鼠LPH、大鼠AMPN、大鼠MCDL、大鼠SCAB、大鼠KCV2。24.根据权利要求22的啮齿类动物防治剂，其中所述细胞外表位由选自SEQIDNO:1-26的氨基酸序列提供。25.根据权利要求24的啮齿类动物防治剂，其中所述细胞外表位由选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5的氨基酸序列提供。26.根据权利要求23的啮齿类动物防治剂，其中所述细胞外表位由选自SEQIDNO:27-36的氨基酸序列提供。27.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分是抗体或其抗原结合片段。28.根据权利要求27的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体是多克隆的。29.根据权利要求27的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体是单克隆的。30.根据权利要求27-29中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体是a)包括轻链和重链的免疫球蛋白，或b)单链抗体。31.根据权利要求30的啮齿类动物防治剂，其中所述单链抗体是scF"v。32.根据权利要求30的啮齿类动物防治剂，其中所述单链抗体缺乏轻链。33.根据权利要求32的啮齿类动物防治剂，其中所述单链抗体来源于骆驼科或软骨鱼纲。34.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分选自免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、Vh結枸域、Vl結枸域、Fv、Fab、di-Fab、Fab'、F(ab02、VHH结构域、IgNARV结构域和CDR。35.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分是经二硫键稳定的。36.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分与啮齿类动物蛋白质结合的亲和力大于与来自至少一种非靶标动物的同源蛋白质结合的亲和力。37.根据权利要求36的啮齿类动物防治剂，其中所述非靶标动物选自人、鸟、伴侣动物、家畜和不是有害动物的野生动物。38.根据权利要求37的啮齿类动物防治剂，其中所述非靶标动物是人。39.根据权利要求36-38中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述抗体组分显示出与啮齿类动物蛋白质的细胞外表位的可替换的结合，但不显示出与下列物质的可替换的结合i)来自非靶标动物的同源蛋白质，或；ii)来自非靶标动物的同源蛋白质的相应表位。40.根据权利要求39的啮齿类动物防治剂，其中所述啮齿类动物蛋白质的细胞外表位由在权利要求48中所定义的啮齿类动物特异性肽表位所代表。41.根据权利要求1-3中任一项的啮齿类动物防治剂，其中所述在啮齿类动物中表达的蛋白质是必需蛋白质。42.根据权利要求41的啮齿类动物防治剂，其中所述必需蛋白质在啮齿类动物的胃肠上皮中表达。43.啮齿类动物防治剂，其包含连接至蛋白质毒素的抗体组分，其中所述抗体组分结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的细胞外表位，和其中所述抗体组分与所述啮齿类动物蛋白质的细胞外表位的结合亲和力大于所述抗体组分与来自非靶标动物的同源蛋白质的结合亲和力。44.根据前述权利要求中任一项的啮齿类动物防治剂，其以进一步包括至少一种添加剂的组合物形式。45.根据权利要求44的啮齿类动物防治剂，其中至少一种添加剂是选自下列的啮齿类动物防治剂根据权利要求1-44中任一项的啮齿类动物防治剂、第一代抗凝剂和第二代抗凝剂。46.根据权利要求44或45的啮齿类动物防治剂，其中至少一种添加剂具有使得所述组合物对于啮齿类动物来说可口的功能。47，杀死啮齿类动物的方法，其包括将根据权利要求l-3中任一项的啮齿类动物防治剂置于啮齿类动物经常出现的区域，从而使得在所述啮齿类动物防治剂被所述啮齿类动物摄食后，所述啮齿类动物被杀死。48.阻止啮齿类动物生育的方法，其包括将根据权利要求l-3中任一项的啮齿类动物防治剂置于啮齿类动物经常出现的区域，从而使得在所述啮齿类动物防治剂被所述啮齿类动物摄食后，所述啮齿类动物的生殖能力被抑制。49.啮齿类动物特异性肽表位(RSPE),其由在啮齿类动物中表达的蛋白质的寡肽片段组成，其中所述寡肽片段序列代表细胞外连续肽表位，所述细胞外连续肽表位与来自非靶标动物的同源蛋白质的相应线性肽序列具有60%或更低的同一性百分比。50.抗体或其抗原结合片段，其结合权利要求48的RSPE。51.根据权利要求50的抗体或其抗原结合片段在制备根据权利要求1-46中任一项的啮齿类动物防治剂中的用途。全文摘要本发明涉及新型啮齿类动物防治剂，其包含结合在啮齿类动物中表达的蛋白质的抗体或其抗原结合片段，特别是结合在啮齿类动物胃肠(GI)道中表达的蛋白质的抗体或抗原结合片段，以及涉及制备此类新型啮齿类动物防治剂的方法。本发明进一步扩展至在啮齿类动物防治中使用的新型抗体和抗原结合片段，以及涉及通过使用此类抗体、抗原结合片段和新型啮齿类动物防治剂来防治啮齿类动物的方法。文档编号C07K16/46GK101163720SQ200680013523公开日2008年4月16日申请日期2006年2月17日优先权日2005年3月11日发明者A·J·丁斯莫尔,C·J·A·萨德勒,F·G·P·厄尔利,J·L·文森特,P·J·凯利申请人:辛根塔有限公司