专利名称：：弱分配层析的方法弱分配层析的方法发明领域本发明涉及从包括一种或多种混杂物的负载流体中回收纯化的产物的方法。在本发明的某些实施方式中，所述方法包括使负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1mg产物/mL介质，并在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收纯化的产物。在本发明的其他实施方式中，所述方法包括使负载在由至少0.1的分配系数限定的操作条件下通过介质。
背景技术：
：在生物技术工业中，商业规模的蛋白质纯化是开发用于治疗和诊断目的的重组蛋白的重要挑战。与收率、纯度和处理量有关的问题困扰着制造部门。随着重组蛋白技术的出现，目标蛋白质可以使用被工程化以表达编码蛋白质的基因的培养的真核或原核宿主细胞系来生产。然而，从宿主细胞培养过程产生的结果是期望的蛋白质与混杂物的混合物，所述混杂物不是来自所述蛋白质本身，例如蛋白质变体，就是来自宿主细胞，例如宿主细胞蛋白质。期望的重组蛋白质用于药物应用的用途视能够从这些混杂物可靠地回收足够水平的蛋白质而定。常规的蛋白质纯化方法被设计以根据大小、电荷、溶解度的差异和疏水性的程度从混杂物中分离目标蛋白质。这些方法包括层析方法，例如亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水性相互作用层析、固定的金属亲和层析和羟基磷灰石层析。这些方法常常采用分离介质，其被设计以选择性地吸附目标蛋白或混杂物。在结合-洗脱模式中，期望的蛋白质选择性地结合分离介质，通过不同的溶剂从介质上差别地洗脱。在流通(flow-through)模式中，混杂物特异性地结合分离介质，而目标蛋白质不结合，因而容许期望的蛋白质在"流通"中回收。用于蛋白质，例如抗体的纯化的当前方法包括两个或多个层析步骤。例如，蛋白质纯化方案中的第一步常常涉及亲和层析步骤，其利用目标蛋白质和固定的捕获试剂之间的特异性相互作用。蛋白A吸附剂对于含有Fc区域的蛋白质，例如抗体的亲和性捕获是特别有用的。然而，使用蛋白A层析用于蛋白质纯化的缺点包括蛋白A捕获试剂的漏出，导致洗脱的蛋白质产物的污染。此外，亲和性捕获不能从目标蛋白质中分离出蛋白质变体，例如蛋白质的聚集形式。研究人员已经使用了结合洗脱方法、流通方法和置换方法努力来回收没有混杂物的蛋白质，所述混杂物产自培养过程和产自纯化步骤本身里可能的前期步骤。在亲和性捕获步骤之后使用结合-洗脱步骤作为典型的第二步骤来纯化蛋白质的类型的实例包括美国专利4,983，722，描述了从混合物还原蛋白A的结合-洗脱离子交换方法；美国专利5,429,746,描述了从包括蛋白A混杂物的混合物中纯化IgG抗体的结合-洗脱疏水性相互作用层析方法；以及美国专利5,644,036，描述了获得纯化的IgG抗体制品的三步骤过程，包括蛋白A步骤、结合-洗脱离子交换步骤和尺寸排阻步骤。其他类型在亲和层析步骤之后使用流通步骤。例如，PCT公开WO04/076485描述了从通过蛋白A层析步骤纯化的抗体中除去漏出的蛋白A、随后是流通离子交换步骤的方法。PCT公开WO03/059935描述了纯化样品中的蛋白质的方法，包括使样品经历亲和层析步骤之后的流通羟基磷灰石层析步骤。其他类型使用了单精炼步骤纯化方案来避免与先前的纯化步骤相关的难题。例如，美国专利6,177,548描述了用于从生物样品除去聚集物的单步骤流通离子交换方法，其中样品的pH值被调节到低于生物样品的等电点0,2对数值(log)。美国专利5,451,662描述了单步骤结合-洗脱离子交换法，其中粗蛋白混合物的pH值被调节到要分离的蛋白质级分的等电点范围之间的点值。PCT公开WO05/044856描述了使用羟基磷灰石层析用于从抗体制品除去高分子量聚集物的单步骤置换方法。然而，就通过量、收率和产品纯度的所有要求来说，现有技术中常规的从结合-洗脱或流通方法都不能满足生物技术工业的需要。在其他的因素中，结合-洗脱方法和置换方法受到用于期望蛋白质的分离介质的容量极限的限制。另一方面，流通方法确实比结合-洗脱方法容许更高的负载挑战，但受到用于混杂物的分离介质的容量的限制。使用流通方法，不发生产物与柱的实质上的结合；任何实质上的产物结合被看作消极地影响产物回收率。仍然需要以高处理量回收纯化的蛋白质的方法，其满足为治疗和诊断应用所需的纯度和收率的要求。此外，商业性制造过程增加了可靠的、坚实的和成本有效的纯化方案的需求。发明概述本发明涉及从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，通过使负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg产物/mL介质，并在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收纯化的产物。在其他实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少5mg产物/mL介质，在另一个实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少10mg产物/mL介质。在其他实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少20、30、40、50或60mg产物/mL介质。本发明还涉及从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，通过使负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定，并在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收纯化的产物。在一个实施方式中，所述分配系数在约0.2到约20.0的范围内。在另一个实施方式中，所述分配系数在约0.2到约10.0的范围内。在另一个实施方式中，所述分配系数在约1.0到约5.0的范围内。在另一个实施方式中，所述分配系数在约0.5到约5.0的范围内。在其他的实施方式中，所述分配系数在约0.5到约1.5的范围内。本发明还涉及从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，通过使负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg产物/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定，并在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收纯化的产物。本发明还提供了在筛选步骤中鉴定操作条件，所述操作条件引起介质结合至少lmg产物/mL介质，或作为选择，由至少0.1的分配系数限定。所述筛选步骤可以采用分批结合研究或柱结合研究，例如梯度洗脱研究或等度洗脱研究。取决于媒介的选择，操作条件包括pH水平、离子强度、盐浓度、赋形剂浓度(例如，磷酸盐浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度)，和反配体水平(例如，咪唑浓度)。所述介质可以是任何类型的层析树脂或分离介质，包括带电离子交换介质，例如阴离子交换介质或阳离子交换介质，疏水性相互作用层析树脂、羟基磷灰石树脂或固定的金属亲和层析树脂。可以使用本发明回收的纯化的产物包括融合蛋白、含有Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子、白细胞介素、激素和治疗性酶。可以使用本发明除去的混杂物包括宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素、蛋白A和病毒。在一个实施方式中，所述介质除去负载流体中至少99.9%的混杂物，所述负载流体包括宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素和蛋白A。在另一个实施方式中，在纯化的产物中产物变体的浓度不超过约2%。在其他实施方式中，所述介质上的负载可以是至少500mg或至少1000mg产物/mL介质的负载挑战。在本发明的一个方面，纯化的产物从包括一种或多种混杂物的负载流体中回收，通过使所述负载流体在包括pH值水平和离子强度的操作条件下通过带电离子交换介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg产物/mL介质，或作为选择，在由至少0.1的分配系数限定的操作条件下通过带电离子交换介质。在本发明的另一个方面，纯化的产物从包括一种或多种混杂物的负载流体中回收，通过使所述负载流体在包括pH值水平、离子强度和盐浓度的操作条件下通过疏水性相互作用层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1mg产物/mL介质，或作为选择，在由至少0.1的分配系数限定的操作条件下通过疏水性相互作用层析树脂。在本发明的另一个方面，纯化的产物从包括一种或多种混杂物的负载流体中回收，通过使所述负载流体在包括pH值水平、离子强度、磷酸盐浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度、HEPES浓度和咪唑浓度的操作条件下通过羟基磷灰石层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1mg产物/mL介质，或作为选择，在由至少0.1的分配系数限定的操作条件下通过羟基磷灰石层析树脂。在本发明的又一个方面，纯化的产物从包括一种或多种混杂物的负载流体中回收，通过使所述负载流体在包括反配体水平和pH值水平的操作条件下通过固定的金属亲和层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1mg产物/mL介质，或作为选择，在由至少O.l的分配系数限定的操作条件下通过固定的金属亲和层析树脂。本发明的方法可以任选的组合一种或多种纯化步骤。可选择的步骤可以在进行本发明的方法之前或之后进行。例如，本发明的方法可以任选的与作为起始步骤的蛋白A层析步骤组合。在本发明的一个实施方式中，使用低离子强度的洗脱緩冲液从蛋白A柱上洗脱含产物流体；使用中和緩冲液调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩冲液产生所述含产物流体的不超过20mM的离子强度，产生负载流体；以及所述负载流体在本发明的操作条件下通过阴离子交换介质。在某些实施方式中，所述洗脱緩冲液包含具有6.5-10pKa的带电阳离子基团的分子。在其他实施方式中，所述洗脱緩沖液进一步包含具有2-5pKa的带电阴离子基团的分子。在某些实施方式中，所述洗脱緩沖液包含是pH在7和9之间的两性离子的分子。本发明还提供了由本发明的方法制备的纯化的产物，包括纯化的蛋白质和抗体。本发明的其他目的和益处将在随后的说明书中部分地阐述，在某种程度上根据说明书将变得更为明显，或可以从本发明的实践中习得。通过特别在附随的权利要求中指出的元素和组合的方式，将实现和达到本发明的目的和益处。需要理解的是，以上的一般性说明和随后的详细说明都仅是示范性的和说明性的，而不是对所要求权利的本发明的限制。附随的图画，合并到本说明书中并作为本说明书的一部分，与说明书一同用来解释本发明的原理。附图的简要说明附图1显示了(A)分配系数和产物吸附等温线之间的关系；以及(B)与树脂结合的产物的吸附等温线，针对三种操作模式结合-洗脱模式，弱分配模式，和流通模式。附图2显示了(A)离子交换层析中三种操作模式的分配区结合-洗脱模式、弱分配模式和流通模式；以及(B)在羟基磷灰石中三种操作模式的分配区。附图3显示了三种操作模式的示意性层析结合-洗脱模式、弱分配才莫式和流通才莫式。附图4显示了弱分配和流通层析之间的比较。附图5显示了(A)作为Kp的函数的典型的杂质去除曲线；以及(B)作为负载挑战和Kp的函数的回收率。附图6显示了弱分配层析步骤发展的典型进展，包括1)高处理量筛选来确定Kp,2)低负载挑战运行，3)高挑战容量运行，以及4)最佳的弱分配层析运行。附图7显示了Kpvs.pH和来自低浓度数据集的总氯化物浓度的等高线图，如实施例l.l所描述。附图8显示了作为分配系数、Kp的函数的蛋白A去除，如实施例1.1所描述的。对数去除值随Kp升高。流通模式由短划线的方框"FT"标出，弱分配模式由短划线的方框"WP"标出。附图9显示了logIQKpvs.pH和总氯化物浓度对数值的等高线图，如实施例2.1所描述。附图IO显示了(A)对于Mab-AAB,在离子交换层析中作为Kp的函数的宿主细胞蛋白穿透曲线；以及(B)对于Mab-AAB，在离子交换层析中作为Kp的函数的蛋白A穿透。附图ll显示了，对于Mab-MYA，在羟基磷灰石中弱分配层析的最佳的操作范围。这个实施例中的最佳Kp是1.5和20之间。附图12显示了，对于Mab-A5T4，在羟基磷灰石中弱分配层析的最佳的操作范围。这个实施例中的最佳Kp是2和20之间。附图13显示了，对于Mab-MYO,在羟基磷灰石中弱分配层析的最佳的操作范围。这个实施例中的最佳Kp是5和20之间。发明的详细说明A.限定为了更容易地理解本发明，首先限定一些术语。其他的限定在整个详细说明中阐述。术语"流通模式"是指一种产物制品分离技术，其中在制品中含有的至少一种产物预期流动通过层析树脂或介质，而至少一种可能的杂质或混杂物与层析树脂或介质结合。一般地，流通模式的产物分配系数低于O.l，结合的产物浓度是<1mg/mL。"流通模式"是等度操作。术语"结合-洗脱模式"是指一种产物制品分离技术，其中制品中含有的至少一种产物与层析树脂或介质结合。一般地，结合-洗脱模式的产物分配系数大于20，结合的产物浓度在1-20mg/mL之间。在这种模式中结合的产物在洗脱阶段期间被洗脱。术语"弱分配模式"是指一种产物制品分离技术，其中制品中含有的至少一种产物以及至少一种杂质或混杂物，都与层析树脂或介质结合。在弱分配模式中产物的结合是至少1mg产物/mL层析树脂或介质。一般地，弱分配模式的产物分配系数是至少0.1。"弱分配模式"是等度操作。术语"分配系数"(Kp)是指在特定的pH值和溶液组成条件下吸附到树脂上的产物浓度(Q)与溶液中的产物浓度(c)的平衡比。分配系数Kp还与如附图1所示的产物吸附等温线相关。分配系数Kp相应于极低溶液浓度下产物吸附等温线的斜率。它与最大容量相关，如下其中Qmax是用于产物的树脂的最大容量，kd是"树脂-产物"相互作用的离解常数。分配系数一般使用分批结合技术来测量，但是也可以使用其他技术，例如等度层析。术语"结合的产物"(Q)是指当在料流中平衡时与树脂结合的产物量。术语"抗体"是指任何免疫球蛋白或其片段，并且涵盖任何包含抗原结合位点的多肽。这个术语包括，但不限于，多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、人类的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、移植的和体外产生的抗体。术语"抗体，，还包括抗体片段，例如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持了抗原结合功能的其他抗体片^a。一船:地，这种片段将包含抗原结合结构域。在本发明的某些实施方式中，所述抗体是包含Ch2/Ch3区域并因而能由蛋白A层析纯化的抗体。术语"CH2/CH3区域"是指在免疫球蛋白分子Fc区域中与蛋白A相互作用的那些氨基酸残基。在某些实施方式中，(^2/(^3区域包括完整的CH2区域和随后的完整Ch3区域，在其他实施方式中，包括免疫球蛋白的Fc区。含有Ch2/Ch区域的蛋白质的实例包括抗体、免疫粘附素以及包含与CH2/CH3区域融合或缀合的目标蛋白质的融合蛋白。术语"负载"是指任何含有产物的负载材料，所述产物来源于澄清的细胞培养物或发酵条件培养基，或来自层析步骤的部分纯化的中间物。术语"负载流体，，是指含有负载材料的流体，用于在本发明的操作条件下通过介质。术语"混杂物"是指除了目标蛋白质以外、也存在于要纯化目标蛋白质的样品中的任何外源的或不需要的分子，包括生物学大分子，例如DNA、RNA或蛋白质。混杂物包括，例如，蛋白质变体，如聚集的蛋白质，高分子量种类、低分子量种类和片段，以及脱酰氨基的种类；来自分泌要纯化的蛋白质(宿主细胞蛋白质)的宿主细胞的其他蛋白质；作为用于亲和层析的吸附剂的部分、在先前的纯化步骤期间可能漏出到样品中的蛋白质，例如蛋白A;内毒素；以及病毒。术语"基本上等度的洗涤"是指就组成或pH值而言仅稍微不同于负载流体的溶液。术语"柱流出物"是指在负载循环期间、或在施加负载的期间流出介质或柱的液体。术语"负载挑战"是指按照每单位体积树脂的产物的质量单位来测量的、在层析步骤的负载循环中负载到柱上的、或在分批结合中施加到树脂上的产物的总质量。术语"对数去除值"(LRV)是指纯化步骤中负载中的混杂物质量与产物库中混杂物质量的比例的对数(底数io)。术语"等度层析"是指使用在目标时期期间不改变强度(strength)的溶剂的层析柱的操作。B.方法的i兌明本发明提供了从含有一种或多种混杂物的负载流体中回收纯化的产物的方法。本发明应用于治疗和诊断目的的蛋白质的大规模制备。1.弱分配模式申请人:令人惊讶地发现，通过按照处于常规的结合-洗脱和流通层析模式之间区域的一种层析模式操作，可以获得高度的混杂物降低以及高产物负载挑战和产物回收。申请人将这种中间的产物结合模式命名为"弱分配模式"。在弱分配模式中，含有目标产物和一种或多种混杂物的负载流体通过层析介质，产物和混杂物都与介质结合。然而，与产物相比，混杂物与介质更紧密地结合，随着负载的继续，未结合的产物通过介质，并在柱流出物中被回收。任选的，介质随后在等度条件下洗涤来从介质回收其他弱结合的产物，来自任何基本上等度洗涤的纯化产物与在负载循环期间来自柱流出物的纯化产物集中在一起。根据本发明，弱分配模式由操作条件限定，其使所述介质结合至少lmg产物/mL介质。在一个实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少5mg产物/mL介质。在另一个实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少10mg产物/mL介质。在另一个实施方式中，所述操作条件使得所述介质结合至少20mg产物/mL介质。在本发明的某些实施方式中，结合到介质是的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少10%。在某些实施方式中，结合到介质上的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少20%。在其他实施方式中，结合到介质上的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少30%。根据本发明，弱分配模式还由至少0.1的分配系数限定。在某些实施方式中，在弱分配模式下操作包括在由约0.2到约20.0的范围内的分配系数限定的条件下操作。在某些实施方式中，在弱分配模式下操作包括在由约0.2到约10.0的范围内的分配系数限定的条件下操作。在其他实施方式中，在弱分配模式下操作包括在由约1.0到约5.0的范围内的分配系数限定的条件下操作。在其他实施方式中，在弱分配模式下操作包括在由约0.5到约5.0的范围内的分配系数限定的条件下操作。在又一个实施方式中，在弱分配模式下操作包括在由约0.5到约1.5的范围内的分配系数限定的条件下操作。在本发明的至少一个实施方式中，提供了弱分配模式操作条件，其使得所述介质结合至少1到约70mg产物/mL介质，并且其由0.3到20的分配系数限定。附图1显示了结合-洗脱、流通和弱分配模式的产物吸附等温线，与结合-洗脱和流通模式相比，弱分配模式的产物结合清楚地居于中间。由于产物分配系数(Kp)的值是吸附的产物浓度与溶液中的产物浓度的比值，弱分配模式的Kp值也处于结合-洗脱和流通模式的值之间。附图2A描绘了作为离子强度的函数的结合-洗脱、弱分配和流通模式的分配区域，显示了Kimp在弱分配模式中高于流通模式中。在弱分配模式的更严格的结合条件下，可以实现比流通模式更高的产物容量，而混杂物更强烈地结合，并且高于结合-洗脱模式，而与混杂物相比产物结合非常微弱，并且不占用大部分的树脂容量。在更严格的结合条件下混杂物分配系数(Kimp)更高，与流通模式的产物库相比，在弱分配模式的产物库中产生更低浓度的残余混杂物。作为磷酸盐和NaCl浓度的函数的、羟基磷灰石中的流通、弱分配和结合-洗脱区域在附图2B中示出。表A概况了三种结合模式结合-洗脱(B-E)、弱分配(WP)和流通(FT)之间的特征差异。表AFT/WP/B-E模式的特征<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>弱分配模式也可以在它们的层析语上不同于结合-洗脱和流通模式，如附图3所示。首先，流通和弱分配模式的层析语看起来相当类似，产物在等度条件下在柱流出物和洗涤馏分中回收。然而，精细的、但重要的区别存在于层析镨中，其可以用于区分这些模式，如附图4所示。与流通模式相比，弱分配模式的起始穿透曲线中存在延迟(〉0.1柱体积或CV)。在弱分配模式中存在更慢的沖洗曲线。可以存在含有产物的小的列带(strip)峰(其相应于洗涤阶段之后仍然结合10-50%负载产物浓度的树脂)，其可以通过在负载循环期间回收柱流出物之后在等度条件下在负载之后施加1-5CV的洗涤来从树脂中回收。附图5A显示了各种水平的产物分配系数值的杂质LRV中的一般趋势。杂质LRV在相应于流通操作的Kp条件下是相对低的。在提高Kp的条件下的操作在杂质穿透之前显著地提高柱流出物级分中的LRV。如实施例所示，与相应于标准的流通条件的那些相比，更高Kp值下的操作改善了杂质LRV多达2对数值。提高Kp—般增加了与树脂结合的产物以及杂质。在较高Kp下杂质的更强结合导致杂质穿透之前柱流出物级分中更大的200680016391.X说明书第12/53页LRV。然而，在杂质穿透点处的负载挑战随着Kp提高而降低，因为产物开始与杂质竟争树脂上的结合位点，如附图5A中高Kp曲线所示意性表示的。因而，弱分配区域相应于操作范围，其为给定的分离平衡了杂质LRV的改善和柱容量需求。弱分配层析的Kp上限还取决于如附图5B所示的柱负载挑战。在流通条件的边界值处，分配系数对于产物回收率没有影响。在高Kp值处产物回收率开始降低，此时等度洗涤条件在以合理的洗涤体积数从柱上洗下结合的产物方面不是有效的。由于无效沖洗的产物损失程度对于负载挑战以及负载中杂质的性质和比例是敏感的。因而，WP区域的下限由杂质去除的需求决定，而给定的负载挑战的上限由产物回收率或容量的约束决定。在本发明的一个或多个实施方式中，最佳的弱分配条件可以使用以下的实验系列来鉴定，如附图6所示(i)进行HTS筛选(或标准的分批结合实验)来确定作为操作条件的函数的产物分配系数Kp。从这些实验鉴定相应于弱分配区域(0.1<Kp<20)的操作范围。(ii)优选的，在鉴定弱分配区域之后，可以以同用于标准流通操作类似的负载挑战(大约50mg/mL)在小规模柱上进行探测运行。根据来自这些实验的杂质去除和产物回收值可以进一步精调弱分配操作范围。(iii)更优选的，然后可以为弱分配区域内的少数Kp条件产生杂质穿透数据。根据这些结果，选择弱分配区域中的最佳分配系数，其以可接受的负载挑战提供了最高的杂质去除。(iv)然后可以在最佳Kp条件下最优选地进行弱分配层析运行，并进一步按需要来精调负载挑战和洗涤体积以获得最佳的回收和杂质去除。确定弱分配层析^骤，其以相比;示准流通或结合/洗""脱模式的柱操作相当的或更高的负载挑战提供了增强的杂质去除。以上讨论的一般性框架，如果有的话，具有细微的调整，可以用于开发离子交换、疏水性相互作用、羟基磷灰石或组合了这些相互作用中的任一或所有元素的多模式系统中的纯化步骤。2.分离技术弱分配模式可以与任何用于从混杂物分离产物的层析树脂或介质组合使用。在一个实施方式中，所述介质是带电离子交换介质。离子交换是一种根据净电荷来分离的层析形式。作为目标带电产物和平衡离子之间对离子交换介质上的带相反电荷的配体基团竟争的结果，发生分子的分离。在产物和离子交换介质之间的结合相互作用取决于产物的净电荷。净电荷取决于pH值和介质的离子强度，其影响目标产物分子的暴露表面上的氨基酸和其他成分的不同电荷性质。可以用于本发明的离子交换树脂包括阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。阴离子交换树脂可以采用取代基，例如二乙氨基乙基(DEAE)、三曱基氨基乙基(TMAE)、季氨乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子交换可以采用取代基，例如羧曱基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)和磺酸根(S)。纤维素离子交换树脂，例如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可以/人WhatmanLtd.Maidstone、Kent、U.K获4寻。基于Sephadex的禾口交联的离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-Sephadex，以及DEAE-、Q-、CM-和S-Sepharose，以及S印harose都可以从AmershamBiosciences,Piscataway,NJ获得。进一步的,DEAE和CM衍生的乙二醇-异丁烯酸酯共聚物，例如TOYOPEARLDEAE-650S或M以及TOYOPEARLCM-650S或M可以从TosoHaasCo.,Philadelphia,PA获得。在本发明的某些实施方式中，弱分配模式与疏水性相互作用层析(HIC)树脂使用用于产物纯化。HIC是根据疏水性来分离分子的技术。一般地，高盐緩沖液中的样品分子被负载到HIC树脂上。緩冲液中的盐与水分子相互作用来降低分子在溶液中的溶解，从而暴露样品分子中的疏水性区域，其因而由HIC介质吸附。分子的疏水性越高，需要越少的盐来促进结合。在产物分子和HIC介质之间的结合相互作用因而取决于一些条件，例如介质的pH值、离子强度和盐浓度。可以用于本发明的各种商业上可获得的HIC树脂包括包含连结了疏水性配体(例如，烷基或芳基基团)的基础基质(例如，交联的琼脂糖或合成的共聚材料)的树脂。实例包括PhenylSEPHAROSE6FASTFLOW(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);PhenylSEPHAROSEHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology、AB，Sweden);OctylSEPHAROSEHighPerformance(PharmaciaLKBBiotechnology、AB，Sweden);FractogelEMDPropyl或FRACTOGELEMDPhenyl(E.Merck、Germany);MACRO-PREPTMMethyl或MACRO-PREPt-ButylSupports(Bio-Rad、CA);WPHI画Propyl(C3)TM(J.T.Baker、NJ);以及TOYOPEARL醚、苯基或丁基(TosoHaas、PA)。在本发明的其他实施方式中，弱分配模式与羟基磷灰石层析使用用于产物纯化。羟基磷灰石层析是一种技术，其利用了式[Ca,。(P04)6(OH)2]的不溶的羟基化的磷酸钙作为基质和配体。功能基团由带正电的钙离子对(C-位点)和带负电的磷酸根基团的簇(P-位点)组成。产物和羟基磷灰石介质之间的结合相互作用取决于一些条件，例如介质的pH值、离子强度和赋形剂浓度，例如磷酸根浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度。各种羟基磷灰石层析树脂是商业上可获得的，可以用于本发明。在本发明的进一步的实施方式中，弱分配模式与固定的金属亲和层析(IMAC)树脂使用用于产物纯化。IMAC是基于固定在树脂上的螯合的过渡金属离子与标靶的目标产物上组氨酸残基的咪唑侧链之间的相互作用。作为标靶的目标产物和IMAC树脂上金属基团的反配体之间的竟争的结果，发生了分子的分离。在产物和带有金属的IMAC介质之间结合相互作用取决于一些条件，例如介质的反配体水平，例如咪唑浓度，以及离子强度。各种IMAC树脂是商业上可获得的，可以用于本发明。3.用于纯化的产物本发明可以用于各种目标产物的大规模纯化，包括天然出现的蛋白质、融合蛋白、含有Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子、白细胞介素、激素和治疗性酶。在一个实施方式中，经历纯化的蛋白质可以包括一个或多个恒定抗体免疫球蛋白结构域。在一个实施方式中，蛋白质还可以包含单或多可变抗体免疫球蛋白结构域。在另一个实施方式中，含有Fc的蛋白质可以包含抗体。蛋白质可以来自各种来源，包括培养的重组原核或真核宿主细胞系。本发明的抗体制品可以从许多来源分离，包括但不限于，免疫动物的血清、腹腔积液、杂交或骨髓瘤上清液、来自培养表达抗体分子的重组细胞的或来自抗体生产细胞的所有细胞提取物的条件培养基。在本发明的一个实施方式中，纯化来自多种抗体生产重组细胞系的条件细胞培养基的抗体。虽然可以预期在各种的抗体产物之中存在细胞系与细胞系的一些偏差，根据在此公开的，本领域普通技术人员的能力范围内的是调整此处的发明来适合特定的抗体蛋白质和生产细胞系组合。仅为了说明的目的，本发明被用于IgG同种型的几种抗体的纯化。更具体地，本发明被用于人源化的抗A(3单克隆抗体、抗GDF8抗体和人源化的抗-IL-13单克隆抗体的纯化。4.负载条件和容量在将含有产物和混杂物的流体负载到介质上之前，可能必需的是通过找到引起介质结合至少1mg产物/mL介质的操作条件来鉴定弱分配的区域。在一个实施方式中，发现的所述操作条件使得所述介质结合至少5mg产物/mL介质。在另一个实施方式中，发现的所述操作条件使得所述介质结合至少10mg产物/mL介质。在其他实施方式中，发现的所述操作条件使得所述介质结合至少20mg产物/mL介质。做为选择，通过找到由至少O，l的分配系数限定的操作条件来鉴定弱分配区域。在某些实施方式中，发现的操作条件是由约0.2到约20.0的范围内的分配系数限定的。在其他实施方式中，发现的操作条件是由约0.2到约IO.O的范围内的分配系数限定的。在又一个实施方式中，发现的操作条件是由约1.0到约5.0的范围内、约0.5到约5.0的范围内或约0.5到约1.5的范围内的分配系数限定的。在其他实施方式中，所述弱分配区域是通过找到使得所述介质结合至少l到约70mg产物/mL介质、并且由0.3到20的分配系数所限定的操作条件来鉴定的。本领域技术人员将认识到，合适的操作条件将取决于为纯化产品所选择的介质的选择。在某些实施方式中，操作条件包括pH值水平和离子强度。在其他实施方式中，操作条件进一步包括盐浓度。在又一个实施方式中，操作条件进一步包括赋形剂水平，例如磷酸盐浓度和钙浓度。在某些实施方式中，所述操作条件包括反配体水平，例如咪唑浓度，以及pH值水平。筛选步骤可以用来鉴定弱分配模式的操作条件。这种筛选步骤可以包括分批结合研究或柱结合研究。柱结合研究可以包括梯度洗脱研究或等度洗脱研究。例如，本领域:汰术人员可以确定哪种緩沖液或盐适合于要纯化的特定蛋白质以及要鉴定的操作条件。然后，所选择的援冲液或盐的最佳浓度可以通过，例如，使选择的緩沖液或盐的梯度运动通过已经施加了包含要纯化的产物和混杂物的负载流体的柱来确定。可以收集和分析柱的流出物的级分，来确定緩冲液或盐的浓度，在该浓度下产物结合是至少1mg产物/mL介质，或作为选择，在该浓度下产物的分配系数是至少0.1。在本发明的某些实施方式中，在分批结合实验中使用三到六的相比例(液体的体积比树脂的体积)，测量1和10mg/mL负载挑战之间的分配系数。—旦确定了操作条件，可以相应地调节负载流体和/或介质的条件。例如，可以通过用溶液洗涤介质来将介质平衡，所述溶液将使得所述介质达到弱分配模式的必要操作条件。在弱分配模式的准备中，负载流体也可以是被交换成合适的緩冲液或负载緩冲液的緩冲液。负载緩沖液可以是与平衡緩沖液相同或不同的緩沖液。在一个实施方式中，负载流体的离子强度不超过100mM。在另一个实施方式中，负载流体的离子强度不超过50mM。在其他实施方式中，负载流体的离子强度不超过25mM。在又一个实施方式中，负载流体的离子强度不超过10mM。负载流体可以通过分离介质，所述分离介质被填充在床柱中、填充在含有固相基质的流化/膨胀床柱中，和/或以分批形式，其中固相基质与负载流体混合一定时间。在负载流体通过所述介质之后，任选的用一定体积的基本上等度的洗液来冲洗介质。纯化的产物可以从任何基本上等度的洗液获得，并与负载循环期间来自柱流出物的纯化的产物集中。在任选的洗涤步骤之后，介质可以任选的被脱除'并再生。这个步骤一般有规律地进行，用以最小化混杂物在固相的表面上的积累，和/或用以灭菌介质来避免微生物对产物的污染。使用弱分配模式，高负载浓度和负载体积是可能的。在一个实施方式中，负载流体中产物的浓度是至少1mg产物/mL负载流体，在另一个实施方式中，负载流体中的产物浓度是至少5mg个产物/mL负载流体，在另一个实施方式中，至少50mg产物/mL负载流体，在另一个实施方式中，至少100mg产物/mL负载流体。纯化的产物可以从至多50CV的通过介质的负载流体中回收。使用弱分配模式，高负载挑战也是可能的。在一个实施方式中，介质上的负载可以是至少10mg产物/mL介质的负载挑战。在其他实施方式中，介质上的产物负载可以是至少50mg产物/mL介质。在某些实施方式中，介质上的产物负载可以是至少100mg产物/mL介质。在其他实施方式中，介质上的负载可以是至少500mg产物/mL介质的负载挑战。在又一个实施方式中，介质上的负载可以是至少1000mg产物/mL介质的负载挑战。5.混杂物的去除弱分配模式已经显示了对于从产物制品除去所有种类的混杂物是有用的，包括宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体，包括聚集的产品和高分子量种类，内毒素、病毒、和来自先前的纯化步骤的蛋白A杂质。在本发明的一个实施方式中，在纯化的产物的存在的宿主细胞蛋白质的浓度是不超过约500ng宿主细胞蛋白质/mg产物。在其他实施方式中，宿主细胞蛋白质的浓度可以被降低到不超过250ng/mg产物，在其他实施方式中，降低到不超过IOOng/mg产物。在某些实施方式中，宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少1.0,在其他实施方式中，宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少2.0，在其他实施方式中，宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少3.0。在本发明的一个实施方式中，在纯化的产物的蛋白A的浓度是不超过约100ng蛋白A/mg产物。在某些实施方式中，蛋白A的浓度可以被降低到不超过50ng/mg产物，在其他实施方式中，降低到不超过10ng/mg产物。在某些实施方式中，蛋白A的对数去除值是至少1.0,在其他实施方式中，蛋白A的对数去除值是至少2.0，在其他实施方式中，蛋白A的对数去除值是至少3.0。在本发明另一个实施方式中，从纯化的产物中除去病毒混杂物。在某些实施方式中，病毒的对数去除值是大于1.0,在其他实施方式中，大于2.0，在其他实施方式中，大于3.0。在本发明的某些实施方式中，从純化的产物除去核酸混杂物。在某些实施方式中，在纯化的产物中存在的核酸的数量可以被降低到不超过1ng核酸/mg产物。在其他实施方式中，在纯化的产物中蛋白质变体的浓度是不超过约10%。在某些实施方式中，蛋白质变体的浓度被降低到不超过约5%,在某些实施方式中，降低到不超过2%,在某些实施方式中，降低到不超过0.5%。在弱分配模式的严格结合条件下，分离介质除去至少90%的宿主细胞蛋白质、核酸、蛋白质变体、内毒素和蛋白A混杂物。在某些实施方式中，所述介质除去至少99%的混杂物，在其他实施方式中，所述介质除去至少99.9%的混杂物。6.其他的可选4奪的步骤本发明的纯化方法可以与其他蛋白质纯化步骤组合使用。在本发明的一个实施方式中，在弱分配步骤之前的一个或多个步骤可能是期望的，以降低负载挑战。在本发明的其他实施方式中，在弱分配步骤之后的一个或多个纯化步骤可能是期望的，以除去其他的杂质或混杂物。所描述的弱分配纯化步骤可以任选的与其他纯化步骤组合，包括但不限于，蛋白A层析、亲和层析、疏水性相互作用层析、固定的金属亲和层析、尺寸排阻层析、渗滤、超滤、病毒去除过滤和/或离子交换层析。在弱分配步骤之前和/或之后的可选择的纯化步骤也可以以弱分配模式，或以其他模式，例如结合-洗脱模式或流通模式来操作。在一个实施方式中，在弱分配纯化步骤之前，收获物介质可以任选的通过蛋白A层析步骤初步纯化。例如，可以采用PROSEP-A(Millipore、U.K.),其由与受控有孔玻璃共价连结的蛋白A组成。其他有用的蛋白A制剂包括蛋白ASepharoseFASTFLOW(AmershamBiosciences,Piscataway、NI)、TOYOPEARL650M蛋白A(TosoHaasCo.、Philadelphia,PA)和MABSELECTtm柱(AmershamBiosciences、Piscataway、NJ)。7.在串联的蛋白A层析和离子交换层析中使用的两性离子緩冲液在某些实施方式中，使用低离子强度的洗脱緩冲液从蛋白A柱上洗脱含产物流体。然后使用中和緩冲液调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩冲液产生不超过20mM的离子强度的所述含产物流体。产生的负载流体然后通过在弱分配模式的条件下操作的阴离子交换介质或羟基磷灰石介质。在某些实施方式中，所述负载流体通过阴离子交换介质而不需要渗滤。在某些实施方式中，使用中和緩沖液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩沖液产生不超过40mM的离子强度的所述含产物流体。在其他实施方式中，使用中和緩沖液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩沖液产生不超过60mM的离子强度的所述含产物流体。在又一个实施方式中，使用中和緩冲液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩冲液产生不超过80mM的离子强度的所述含产物流体。可用于从蛋白A柱上的洗脱的緩沖液包括一些緩冲液，其包含具有pKa2-5的带电阴离子基团的分子。这种洗脱緩沖液可以进一步包含具有6.5-10的pKa的带电阳离子基团的分子。在一个实施方式中，所述洗脱緩沖液包含pH值在4和9之间的两性离子的分子，例如甘氨酸；1，4-哌溱二-(乙烷磺酸)；双甘氨肽；环戊烷四-1,2,3,4-羧酸；N，N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸；2-(N-吗啉代)丙烷-磺酸；N-三(羟曱基)甲基-2-氨基乙烷磺酸；N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；4-(2-羟乙基)-I-哌溱丙烷磺酸；N-三(羟曱基)曱基甘氨酸；甘氨酰胺；N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸；N-三(羟曱基)甲基-2-氨基丙烷磺酸；或N-甘氨酰-甘氨酸。使用两性离子緩沖液洗脱蛋白A柱提供了在一定程度的中和时的低离子强度益处。緩冲液的低离子强度不会不利地影响随后的离子交换柱，包括羟基磷灰石柱的操作。高水平的离子强度将降低混杂物与离子交换柱的结合，其可能降低纯化的总效率。更低离子强度的溶液对于在离子交换柱上的负载是优选的，因为离子强度可以通过添加浓缩的盐溶液来容易地提高；降低溶液的离子强度是不容易的。令人惊讶地，存在着一些緩沖液，所述緩沖液具有低pKa，其容许使用在蛋白A洗脱步骤中有用的低pH值水平，但也具有第二pKa，其容许使用在离子交换层析中有用的更高的pH值水平；如果在适合的第二pH值下使用，这些緩冲液在蛋白A步骤之后的离子交换步骤的操作期间具有极少的有效电荷。具有与优选用于蛋白A的洗脱pH值相近的pKa的两性离子緩沖液(在pH2和5之间，优选的在2.5和4.0之间)容许该緩冲液被使用来维持pH值接近緩沖液的pl并且用来洗脱柱。还具有接近随后的离子交换柱的操作的(pH5.5到11)的pKa的两性离子緩沖液将容许緩沖液将pH值控制在这个pH范围内，以及控制在蛋白A洗脱pH值范围内。使用单个化合物用于在低pH值洗脱蛋白A柱以及用于维持在离子交换层析中有用的较高pH值，简化了两个步骤的操作，并且也简化了中和之后产物库的组成。在本发明的进一步的实施方式中，具有pKal和pKa2的两性离子緩沖液可以在pKal的一个pH单位内的pH值水平下洗脱蛋白A柱。进一步的，如果蛋白A库使用两性离子緩沖液的碱性溶液中和到pKa2的一个pH单位内的第二pH值，两性离子緩沖液将能够维持该溶液的pH值。如果第二pH值低于pKa2的，緩沖液保持了两性离子性，并且为溶液的总离子强度做出极少贡献。例如，浓度x的两性离子緩冲液在pH等于pKa2将仅贡献总离子强度x/2。浓度x的两性离子緩沖液在该緩冲液pKa2以下一个pH单位将具有x的十分之一的离子强度。这种离子强度的降低对于离子交换层析的操作是非常有用的。具有对于蛋白A柱的洗脱有用的pKal以及对于离子交换层析的操作有用的pKa2的缓沖液的存在不是显而易见的，因为通常没有报道这些緩冲液的pKal。緩沖液通常在靠近pKa2的pH值水平下使用，层析领域的技术人员不知道对于蛋白A柱的洗脱是有用的。进一步的，虽然这些緩沖液用于蛋白A层析柱洗脱的实用性没有被普遍认识到，但是同样没有认识到的是，这些两性离子緩沖液将具有作为用于蛋白A柱之后的离子交换柱緩沖液的其他实用性，因为它们为中和的蛋白A库贡献了较少的离子强度。C.实施例以下实施例仅为了说明性的目的来提供。实施例提供了使用三种不同单克隆抗体的三种层析模式(阴离子交换、疏水性相互作用和羟基磷灰石)。描述了四个独立的实验系列，各自代表了不同的层析模式和要纯化的单克隆抗体的配对。首先呈现了初步筛选研究，其确定了在各种溶液条件下的分配系数和/或与树脂结合的产物浓度，因而确定了弱分配(WP)和流通(FT)模式的操作区域。然后使用关于产物回收率和混杂物去除的数据概述了几项柱研究。产物回收率对于WP柱运行是非常好的，与相应的FT研究中的相比混杂物水平更低。与FT研究相比，对树脂使用了更高的负载挑战来进行WP运行。使用蛋白A酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量测试样品中的蛋白A残留物的水平。使用分析性尺寸排阻层析(SEC)分析来测量高分子量聚集物的数量。使用HCPELISA来测量宿主细胞蛋白质(HCP)的水平。所有的筛选和柱研究在室温下进行。系列1-使用TMAE-HiCap(M)的阴离子交换和Mab-AAB实施例1.1高处理量筛选来确定WP和FT条件进行高处理量筛选(HTS)来鉴定使用TMAE-HiCap(M)介质对于Mab-AAB的弱分配和流通条件。这种筛选改变氯化钠的浓度和pH值来确定它们对MAB-AAB的结合程度的影响以及步骤相关的混杂物(蛋白A和HCP)对TMAE介质的影响。50jaL的TMAEHiCap介质添加到96孔滤板的每个孔中。在由50mM甘氨酸和变动数量的Tris緩冲液(取决于中和到表1.1.1中指定的pH值所需的数量)和氯化钠(在表l丄2中指定)制成的溶液中平衡每个孔。pH值范围从7.6到9.0，氯化钠范围从OmM到80mM。用于每一排的緩冲溶液在自动化的移液系统(Tecan100RST)上稀释。緩沖液的])&备溶液由用HC1酸化到pH值3.0的500mM甘氨酸制成，随后用2MTris碱中和到表1.1.1中指定的pH值水平这种滴定产生了取决于緩沖液的pH值的Tris水平。在贮备缓沖液浓度的1到10倍稀释度下测量緩沖液pH值，其相应于由自动化移液系统产生的稀释度。作为甘氨酸酸化到pH3.0的结果，緩沖液为最终溶液贡献了约10mM的离子强度。将两个负载挑战做到树脂上5mg/mL来测量分配系数，K,122mg/mL来测量树脂除去混杂物和结合的产物的容量，Q，使用与柱负载浓度近似相等的浓度的蛋白质溶液平衡。表1.1.1:每个孔中的緩沖液类型和pH值目标<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>强度与TMAE介质结合的区域。这些区域在附图7中更清楚地示出。MAB-AAB与TMAE介质结合的强度可以通过改变进入到流通(K<0.1)、弱分配(0.1<K<20)和结合区(K>20)的pH值和氯化物浓度条件来操纵。将来自每个区域的所有孔的负载阶段的上清液进行采样并进行蛋白A分析。这些样品的分析结果在表1.1.4中概述。存在着一个pH值和导电率区域，在此TMAE层析步骤提供了非常显著的蛋白A去除以及对于树脂的有限蛋白质损失。发现这个区域与分配系数值Kp紧密相关，而不是任何特定的pH值或氯化物浓度(参见附图8)。表1.1.4来自HTS筛选的MAB-AAB结合数据的蛋白A对数去除值(LRV)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实验1.2流通条件下的柱运行以流通(FT)模式进行以下实验，其中Mab-AAB仅非常微弱地与柱相互作用。使用110mg/ml和200mg/ml树月旨的负载挑战进行两个运行。对于在系列1实验中描述的所有TMAE(HiCapM)阴离子交换层析运行，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。操作流速-150-300cm/hr平衡液l-50mMTris、2.0MNaCl、pH7,5(5倍柱体积)平衡液2-如指定的，大约等于负载pH值和氯化物含量负载后洗涤液-如指定的，大约相当于负载pH值和氯化物含量脱除緩冲液-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱体积)Mabselect蛋白A层析使用连接到MilliporeK画prime400层析系统的MabSelect柱(2,389mL)在中试规模纯化含有单克隆抗体的培养物。用5倍柱体积的50mMTris/150mMNaCl，pH7.5以300cm/hr的流速平衡Mabselect蛋白A柱。然后以大约40mg产物/ml树脂的负载来负载柱。之后是1MNaCl、50mMTris，pH7.5中的5CV洗液，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的洗涤。然后使用50mM甘氨酸、75mMNaCl，pH3.0来洗脱柱。使用2MTrispH8=5将产物库中和到pH7.6。中和的峰具有大约90mM的氯化物浓度。TMAEHiCap(M)层析中和的蛋白A库进一步在具有平tf、负载和pH7.5、50mMTris和75mM氯化钠的洗涤溶液的TMAE步骤上纯化。使用5倍柱体积的洗液。用于这两项研究的柱尺寸和负载挑战是运行l:7.0cm直径x20.6cm床高度(体积-793mL),负载浓度11.9mg/mL，运行2:7.0cm直径x13cm床高度(体积-500mL),负载浓度17.6mg/mL。这些负载条件处于流通(FT)区域中(表1.2.1)。分批结合研究被用于测量分配系数(Kp)，通过使用UV吸光度通过柱列带中的蛋白质测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的等度洗脱，测定结合的产物的这种方法一般低估了在负载期间结合的产物数量。测量负载和产物库中蛋白A、HCP和HMW的水平，计算去除的程度。结果在表1.2.1中示出。存在着不良的蛋白A和HMW去除，和HCP水平的中度降低。表1.2.1流通条4:i二下HCP、蛋白A和HMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>*混杂物水平是38.5ppmProA和51,943ppmHCP(运行1)8.8ppmProA和25,398ppmHCP(运行2)。实施例1.3在弱分配条件下的柱运行(高产物挑战)TMAE(HiCapM)阴离子交换层析基本上如实施例1.2中描述的进行几个MabselectProteinA运行来产生用于这些运行的负载材料。来自蛋白A步骤的部分纯化的抗体库进一步在TMAE柱上纯化。TMAE柱上的负载是处于50mMTris，pH8.2中。柱直径是0.5cm，床高度是10cm床高度(体积-2.0mL)。以27.7mg/mL的负载浓度将柱挑战到500mg/mL树脂的负载。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5的5倍柱体积的溶液平衡柱，随后是包含50mMTris、pH8.2溶液的另一个平衡步骤。然后用来自上述步骤的中和的蛋白A峰将柱负载到500mg产物/mL树脂，从负载循环期间的柱流出物以及一定柱体积的洗涤级分中回收产物。这些负载条件处于弱分配区域内。分批结合研究被用于测量分配系数(Kp)，产物在高蛋白浓度下结合。在pH8.2处，12mM的近似的氯化物含量，分配系数Kp估计是1.9(根据对来自HTS筛选的数据集的内插值)。在代表大约250、375和500mg/ml树脂的负载挑战的负载阶段期间，在三个级分中测量HCP和蛋白A水平。实验1.3的结果在表1.3.1中示出。这些结果表明，在弱分配模式中可以实现非常高的产物挑战，而没有混杂物的穿透。实现了HCP和蛋白A的极好的降低，以及HMW含量的50%降低。与表1.2.1中的流通模式的操作结果相比，在弱分配模式中混杂物的去除好得多。表1.3.1:500mg/mLTMAE负载挑战的HCP、ProteinA和HMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*负载中的混杂物是25,398ppm的HCP、99.5ppm的蛋白A和2.3%HMW。实施例1.4在弱分配条件下的柱运行(健全性(robustness)研究)为了进一步确认在弱分配区域内TMAE柱的性能，设计了改变负载中的pH值和NaCl浓度来测试过程健全性的几个运行试验。在250mg/mL树脂的负载挑战下进行所有运行试验。基本上如实施例1.2中描述的进行几个Mabselect蛋白A运行试一验来产生用于这些运行试验的负载材料。在这些运行试验中改变的唯一因素是蛋白A洗脱中的氯化钠浓度，其被改变来匹配特定实验的TMAE负载中的NaCl浓度。用平衡液2緩沖液平衡柱，并用具有与负载大致相同的pH值和氯化钠含量的洗涤緩冲液洗涤。这些负载条件处于弱分配区域内。分批结合研究被用于测量分配系数(Kp)。通过表1.4.1所列的分配系数来对运行试验分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物，范围7.8-25.3mg/mL。这些实验的蛋白A、HCP和HMW结果也在表1.4.1中呈现。发现在覆盖13.5-38.8mM总氯化物和pH值7.8-8.4的操作范围中，所有混杂物的去除是健全的。表1.4.1:对于弱分配模式中HCP、ProteinA和HMW去除的过程健全性研究<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*混杂物水平是38.5ppmProA和51,943ppmHCP(运行1),8.8ppmProA和25,398ppmHCP(运行2)。+包括来自NaCl、緩沖液和滴定剂的Cl离子贡献总结根据这项研究，可以看出蛋白A去除(LRV)随着Kp强烈地变化，而HCPLRV在0，26或以上的所有Kp值下是极好的，但在Kp=0.17时大大降低(在流通条件下)。甚至在降低的负载挑战之下，与弱分配条件相比，流通条件的宿主细胞蛋白质去除要低超过一个对数。对于树脂和单克隆抗体的这种组合，这些弱分配条件的结合的产物范围从7.8-25mg/mL。分配系数在0.41<Kp<5.4之间似乎是最佳的。看起来实施例1.2的条件Kp=0.17和1.4-3.3mg/mL的结合产物处不是最佳的。系列2-使用TMAE-HiCapM的阴离子交换和Mab-IMA实施例2.1高处理量筛选来确定WP和FT条件进行高处理量筛选(HTS)来鉴定使用TMAE-HiCap(M)介质对于Mab-IMA的弱分配和流通条件。这种筛选改变氯化钠的浓度和pH值来确定它们对Mab-IMA的结合程度的影响以及步骤相关的混杂物(蛋白A和HCP)对TMAE介质的影响。将100"L的TMAEHiCap介质添加到96孔滤板的每个孔中。在由不远离緩冲液pKa超过1个pH值单位的25mM緩沖液(表2.1.1)和合适水平的氯化钠(表2丄2)组成的溶液中平衡每个孔。pH值浓度范围从7.00到8.75，氯化钠浓度范围从lmM到190mM。使用12MHCl将所有緩沖液滴定到目标pH值。作为不同的緩沖液种类需要不同水平的滴定剂的结果，取决于对孔使用的緩沖液，氯化物浓度在孔与孔之间是不同的。滴定緩冲液到目标pH值所需的Cl-的数量使用Henderson-Hasselbach方程式来计算，并增加到由NaCl和负载材料中的数量所贡献的总C1-中。在该实验中为每个孔计算的Cl-水平在表2丄3中列出。表2,1.1:每个孔中的緩H<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>溶液100|aL树脂)在表2.1.1和2.1.2描述的NaCI和pH值条件下平衡每个孔。将平板摇动20分钟，容许达到平衡。然后通过离心所述滤板来除去溶液。这个平衡循环重复三次。在第二阶段，每个孔中的树脂在合适的NaCl浓度和pH值下以3:1的体积比(300juL溶液100nL树脂)用浓缩的MAb-IMA溶液挑战到3mg/mL树脂。具有300ppm蛋白A的、在lmMMes、15mMNaCl、pH6.5中30mg/mL的Mab-IMA溶液被用作贝i备溶液。负载的板摇动20分钟，容许树脂和溶液平衡。通过离心从滤板除去上清液，并收集到收集板中。每个孔中的上清液中的蛋白质浓度通过A280nm处的吸光度来测定。蛋白A和/或HCP水平中的任何下降表明有助于纯化的条件。在第三阶段，通过添加在表2.1.2中列出的指定的NaCl和pH值条件的溶液来洗涤树脂。在摇动20分钟后除去上清液。在第四阶段，添加2MNaCl来除去结合到树脂上的剩余蛋白质。使用从阶段3&4洗脱的质量以及阶段2的产物浓度，为每个孔计算分配系数，在表2丄4中示出。作为pH值和氯化物的函数的分配系数的对数的等高线图在附图9中示出。表2.1.4MAB-IMA的96孑LHTS筛选的分配系数(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>如表2丄4中所示，Kp值可以用于描述MAB-IMA以不同强度与TMAE介质结合的区域。这些区域在附图9中更清楚地示出。MAB-IMA与TMAE介质结合的强度可以通过改变进入流通(Kp<0.1)、弱分配(0,l<Kp<20)和结合区(Kp>20)的pH值和氯化物浓度条件来操纵。来自每个区域的几个孔的负载阶段的上清液进行采样并进行蛋白A分析。负载具有300ppm的蛋白A。这些样品的分析结果在表2.1.5中概述。存在着一个pH值和导电率区域，在此TMAE层析步骤提供了非常显著的蛋白A去除以及对于树脂的有限蛋白质损失。发现这个区域与分配系数值Kp紧密相关，而不是任何特定的pH值或氯化物浓度。表2.1.5来自HTS筛选的蛋白A残留水平和MAB-IMA结合数据<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>预测的Kp值来自与HTS筛选的响应表面拟合，和基于此回归模型的Kp的随后预测。实施例2.2使用TMAE-HiCapM和Mab-IMA在FT条件下的柱运行以流通(FT)模式进行以下实验，其中Mab-IMA仅非常微弱地与柱相互作用。进行四个运行，产物挑战109-275mg/ml树脂。TMAE(HiCapM)阴离子交换层析对于在实验2系列中描述的所有TMAE(HiCapM)阴离子交换层析步骤，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。操作流速-150-300cm/hr平衡液1-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5或8.0(5倍柱体积)平衡液2-75mMNaCl、50mMTris、pH7.5(运行3和4含有50mM甘氨酸)负载后洗涤液-75mMNaCl、50mMTris、pH7.5(运行3和4含有50mM甘氨酸)脱除緩沖液-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5或8.0(5倍柱体积)基本上如实施例1.2中描述的进行几个MabselectProteinA运行来产生用于这些运行的负载材料。来自先前描述的蛋白A步骤的部分纯化的抗体库以流通(FT)模式在阴离子交换步骤中进一步纯化。柱直径范围1.0-3.2cm，柱高度是7.2-8.5cm。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5的5倍柱体积的溶液平衡柱，随后是包含50mMTris、pH7.5溶液的另一个平衡步骤。然后用所述部分纯化的蛋白A峰将柱负载到109mg/mL和275mg/mL之间，从负载循环期间的柱流出物以及洗涤级分的一定柱体积中回收产物。这些负载条件处于流通(FT)区域中。实施例2.1中描述的高处理量筛选估计了在这些pH值和氯化物浓度条件下分配系数(Kp)的值。通过表2.2.1所列的分配系数对运行试验分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的等度洗脱，测定结合的产物的这种方法一般低估了结合产物总量。这些实验的蛋白A、HCP,HMW去除结果也在表2.2.1中呈现。存在着相对不良和可变的HCP去除，没有蛋白A和产物变体(HMW和LMW种类)的去除。表2.2.1:在FT模式中HCP、蛋白A和HMW和LMW的去除<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>ND=没有测定实验2.3-对于Mab-IMA在弱分配条件下的柱运行以下柱实验在由HTS筛选(实验2.1)鉴定的条件下在弱分配模式中进行。对来自部分地纯化的蛋白A库的TMAE柱进行七个运行。TMAEHiCap(M)层析谱来自基本上与先前描述的相同的蛋白A步骤运行的部分纯化的抗体在如下所述的pH值和氯化物含量的弱分配(WP)条件下在TMAE步骤上被进一步纯化。柱直径范围0.5到3.2cm，柱高度是9.4-9.5cm。用含有50mMTris、2MNaCl、pH7.5或8.0的5倍柱体积的溶液平衡柱，随后是包含50mM甘氨酸、50mMTris、pH7.5或8.0溶液的另一个平衡步骤。然后用所述部分纯化的蛋白A峰将柱负载到124mg/mL和303mg/mL之间，从负载循环期间的柱流出物以及洗涤级分的一定柱体积中回收产物。这个实验的结果在表2.3.1中示出。这些负载条件处于弱分配(WP)区域中。实施例2.1中描述的高处理量筛选提供了对分配系数(Kp)的值的估计。通过表2.3.1所列的分配系数来对运行试验分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的等度洗脱，测定结合的产物的这种方法一般低估了结合的产物总量。这些实验的蛋白A、HCP、HMW和LMW去除结果也在表2.2.1中呈现。存在着一致的和很高的HCP去除，极好的蛋白A去除，以及产物变体的有价值的降低(HMW和LMW种类)。表2.2.1和2.3.1中呈现的数据的比较证实了，在流通模式(《0.3的Kp值)的条件下HCP、蛋白A、HMW和LMW的去除与在弱分配条件(X).3的Kp值)实现的相比要低得多，即使在负载挑战超过300mg/mL时。表2.3.1:弱分配条件下HCP、蛋白A、HMW和LMW的去除ND=没有测定<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>NO:没有测定表2.4.2:在弱分配条件下生产规模运行的性能<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>承TMAE峰库中的HCP和蛋白A水平低于定量的极限。总结HTS鉴定了WP和FT操作的条件。FT模式仅提供了HCP和LMW种类中的中度的降低，在蛋白A残余或HMW种类中没有降低。WP模式的操作改进了所有混杂物的去除而没有牺牲产物收率。加工步骤被扩大到中试工厂，三个运行一致性地操作，对于HCP和蛋白A具有非常高的LRV,以及在HMW和LMW种类中良好的降低。系列3-使用TMAE-HiCapM的阴离子交换和Mab-AAB实施例3.1-高处理量筛选来确定WP和FT条件使用如实验l.l中描述的步骤来进行实验3.1。实验3.2-在相应于变动的分配系数的条件下的柱容量运行在相应于由HTS筛选(实验3.1)鉴定的一系列分配系数的条件下进行五个层析实验。TMAE柱被负载到非常高的负载挑战(>1000g/L)来特别地强调在弱分配条件下AEX步骤的优越性能。使用以下条件用于在系列3中进行的AEX运行(除了在单独的实验描述中注明的)。捧作流速-l50-300cm/hr平衡液1-50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱体积)平衡液2-如指定的，大约相当于负载pH值和氯化物含量负载后洗涤液-如指定的，大约相当于负载pH值和氯化物含量脱除緩冲液50mMTris、2.0MNaCl、pH7.5(5倍柱体积)使用5倍柱体积的平衡緩沖液1和随后5倍柱体积的平衡液2步骤来平衡柱。然后用调节到适合的平衡液2緩沖液的蛋白A峰库(是指系列1，实验1.1)将柱负载到940和2144mg产物/ml树脂之间。收集柱流出物级分，随后分析HCP和残余的蛋白A水平。这些实验中使用的负载条件相应于逐渐地提高的分配系数，其跨越了流通和弱分配(WP)区域。实施例3.1中描述的高处理量筛选提供了对分配系数(Kp)的值的估计。这个实施例中结合的产物的值根据在列带中洗脱的产物来计算。这些实验的结果在表3.2.1和附图IOA和10B中示出。表3.2.1-在WP模式下非常高的负载挑战试验结果的概述<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*基于质量平衡计算。相应于KpO.l的运行的结合的产物的值接近零，如典型的流通操作所预期的。在弱分配区域中进行的实验的结合的产物值在所有情况下>12.0mg/ml。实际上，相应于Kp7的运行的结合的产物结合高达71mg/ml。然而，在所有情况下，在组合的负载洗脱液和洗涤级分中的产物回收率是>93%。作为负载挑战的函数的HCP和蛋白A去除在附图IOA和IOB中示出。如较早讨论的，HCP去除随着条件从流通移动到弱分配而显著提高。流通条件下的操作提供了大约1.5对数值的HCP清除，而当在弱分配区域中在Kp7下操作时在负载挑战<450mg/ml树脂时HCP对数去除值高达3.8对数值。在弱分配区域中的Kp0.8时，高达1000mg/ml树脂的负载挑战获得了2.8对数值的HCP清除，在弱分配区域中在Kp2.7时，高达800mg/ml树脂的负载挑战获得了〉3对数值的HCP清除。与HCP中的情况一样，当我们从流通条件移动到弱分配条件时，蛋白A去除显著地提高。附图IOA和10B中示出的结果也强调了该事实，将操作的Kp从流通提高到弱分配区域时，在杂质的穿透之前提高了所获得的HCP和蛋白A对数清除值，并提高了相应于穿透点的负载挑战。在杂质的穿透之前，Kp的进一步增加提高了HCP和蛋白ALRV。然而，由于结合的产物现在与杂质竟争结合位点，穿透点在相对较低的负载挑战时出现。尽管如此，在此呈现的运行的柱容量即使对于高Kp运行也是非常高的。总结在这个实施例中，显示的是，通过在弱分配条件下和在超过1000mg/ml树脂的负载挑战下操作AEX步骤，可以显著地改善蛋白A和HCP去除。这个实施例突出了弱分配层析和在结合条件下的标准操作之间的一个根本差异。弱分配条件仅将产物结合的极限推高到杂质清除或被显著改善的点，而产物回收率和负载挑战保持很高。相应于结合条件的Kp值在AEX中是〉20;在这些条件下，产物和杂质之间的竟争效应非常强，导致与弱分配层析相比降低的容量。系歹'J4-使用PhenylToyopearl的疏水性相互作用和Mab-AAB实验4.1-确定WP和FT条件的分批结合研究进行分批结合研究来鉴定使用来自TosohBiosciences的PhenylToy叩earl介质对于Mab-AAB的弱分配和流通条件。调节产物与树脂的相互作用的强度的盐是Na2S04，其从0.20变动到0.90M。溶液被緩沖控制在pH7.5。使用45um过滤板来孵育树脂和液体，并通过离心倾析出上清液。使用不同浓度的Na2S04(0.2M到0.9M)来制作八个Tris/Na2S04緩沖液。通过蛋白A层析部分纯化的Mab-AAB稀释到Tris/Na2S04溶液中到0.87mg/ml的终浓度。使用300juL的緩沖液平衡50Ml的树脂，然后对于每个Tris/Na2S04条件倾析出上清液；重复这个平衡三次。在平衡之后，在相同的盐浓度和pH值下将倾析的树脂与产物混合，并柔和摇动地孵育30分钟。所有条件的负载挑战是5.2mg产物/ml树脂。然后将UV平板堆叠在滤板的底部来在离心时收集上清液。随后，将300lal50mMTris、pH7.5緩冲液施加到树脂上来脱除结合的产物。在20分钟的孵育之后，通过离心在独立的UV平板中收集列带。每个级分中的产物浓度通过UV吸光度和这种MAB的消光系数来测量。调节计算用于29lal(在通过独立的实验集确定)体积的阶段-阶段继续试验(carryover)。在每种盐条件下重复实验四次，报告平均的分配系数。表4.2.1概述了这个实验的分配系数。Na2S04的最高浓度引起了强的产物结合，而在0.40-0.55M的范围内的盐浓度代表了弱分配条件。实验4.2-在弱分配、流通和结合条件下的柱运行(高产物挑战研究)在流通、弱分配和强结合条件下进行柱运行。对于在系列4实验中描述的所有PhenylToyopearl疏水性相互作用层析运行，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。柱尺寸直径0.5cm,床高度9.5-10.5cm平衡液-50mMTris、pH7.5，[Na2S04]大约等于负载负载-如以下指定的[Na2S04]洗涤-[Na2S04]等于负载(除以下注明的之外)脱除-50mMTris、pH7.5使用两种不同的负载i)来自与之前描述的那些基本上相同蛋白A步骤运行的部分纯化的抗体库，或ii)来自FT模式操作的更纯的TMAEQSepharoseFF产物库。实验4.2.1使用蛋白A峰库作为负载的柱运行进行在此讨论的实验来强调弱分配条件下HIC的优越性能。在变动的盐浓度下进行柱运行来覆盖相应于流通、弱分配和强结合条件的一系列分配系数。实验4.1中描述的分批结合筛选提供了对分配系数(Kp)的值的估计。用5倍体积的含有50mMTris、pH7.5和指定浓度的适合的[Na2S04]的溶液来平衡柱子。蛋白A峰首先浓缩10倍，随后在合适的盐浓度中稀释到14.77mg/ml。在负载材料的宿主细胞蛋白质(HCP)和残余的蛋白A水平分别是30911ppm和17.1ppm。所有的柱运行在100mg/ml树脂的负载挑战下进行。在负载循环级分期间在柱流出物中收集产物。在产物流通之后，将与负载相同盐浓度的十倍柱体积的洗涤緩沖液施加到柱上，随后是含有50mMTris、pH7.5的五倍体积的脱除緩冲液。负载洗脱液和洗涤样品中的HCP和蛋白A含量随后通过ELISA来分析。在负载洗脱液和洗涤级分中的组合的混杂物水平在表4.2.1中报告。运行通过分配系数来分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的逐渐脱附，测定结合的产物的这种方法一般低估了在负载期间结合的产物数量。表4.2.1:在流通、弱分配和强结合条件下的混杂物去除<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>(分配系数Kp说明来自50微升树脂和300微升溶液的相体积比6。)根据表4.2.1中呈现的数据明显的是，当我们从流通条件移动到弱分配条件时，对于杂质降低，HIC步骤的性能显著地改善了，而产物回收率是相当的。在操作盐浓度中的进一步提高产生了相应于强结合条件的分配系数。根据表4.2.1中呈现的数据再一次清楚的是，当我们从弱分配移动到强结合条件时，对于杂质降低以及产物回收率，HIC步骤性能都恶化了。因而这种分离的最佳的操作范围相应于弱分配层析的。在弱分配条件下，HIC步骤提供了HCP的1个对数的降低和蛋白A的3.4倍的降低。在这个实施例中，在弱分配条件下的结合的产物水平在2.8-5mg/ml树脂之间。实验4，2.2-使用Q-Sepharose峰库作为负载的柱运行在这些实验集里使用QSepharoseFF峰库来突出以下事实，在最佳的弱分配层析条件下的HIC步骤的性能可以用更清洁的进料来进一步改善。在这种情况下的负载材料含有2880ppm的HCP，通过在Q-SepharoseFF柱上纯化蛋白A峰库来产生。进行两个实验来比较对于混杂物去除的柱性能，一个在弱分配条件下，另一个在典型的流通条件下。Q-Sepharose峰在550mMNa2S04中稀释到3.27mg/ml,并负载到柱上到100mg/ml树脂的负载挑战用于在弱分配条件下操作。随后用含有与负载相同盐浓度的IOCV的緩冲液洗涤柱，用6CV的50mMTris緩冲液、pH7.5来脱除。在流通条件下进行第二实一睑。将负载在200Na2SO4中调节到3.03mg/ml，并负载到柱上到90mg/ml树脂的负载挑战。然后用含有与负载相同盐浓度的6CV的緩冲液洗涤柱，随后用6CV的50mMTrislC冲液、pH7.5来脱除。在两个运4亍中，收集流通和洗涤级分用于回收率和混杂物分析。这些运行的结果在表4.2.2中报告。表4.2.2:HIC弱分配结果与流通结果的比较<table>complextableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在弱分配条件下的产物回收率数值与流通操作是相当的，也独立于这些实验中使用的进料。与流通操作相比，该步骤对于HCP去除的性能在弱分配条件下显著更高。两种进料的HIC步骤的HCPLRV在流通条件下是相当的(约0.4-0,5LRV)。然而，在弱分配条件下进行的实验的HCPLRV值从使用蛋白A负载材料的1LRV提高到使用通过蛋白A和QSepharosePF柱纯化的负载材料的大于2LRV。总结层析的另一种模式(HIC)显示了在弱分配模式中成功地运作。对于产物回收率和HCP/蛋白A去除，显示了在弱分配条件下的HIC步骤的性能优于流通条件以及更紧密的结合条件下的操作。100mg/ml树脂的高负载挑战容量在弱分配条件成功地进行，其中〉3mg/mL的产物结合到树脂(即使负载浓度是3.27mg/mL)。相应于最佳弱分配条件的分配系数似乎稍微高于阴离子交换层析的分配系数。系列5-使用陶瓷的I型羟基磷灰石的羟基磷灰石和Mab-MYA实施例5.1-高处理量筛选来确定WP和FT条件进行高处理量筛选(HTS)来鉴定使用陶瓷羟基磷灰石介质对于Mab-MYA的弱分配和流通条件。这个筛选改变氯化钠和磷酸钠的浓度来确定它们对MAB-MYA与羟基磷灰石介质的结合程度的影响。将50juL陶瓷羟基磷灰石介质添加到96孔滤板的30个孔中。在由含100mM精氨酸、pH7.2的100mMHEPES緩冲液中适合的氯化钠和磷酸钠浓度组成的溶液中平衡每个孔。溶液中两种盐的浓度在表5丄1和5.1.2中示出。每种条件进行两次。这些孔的每一个中的MAB-MYA负载挑战是5.0mg/mL树脂。表5.1.1:每个孔中的氯化钠水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>表5.1.2:每个孔中的磷酸钠水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>在HTS实验的第一个阶段，以6:1的相体积比(300ML溶液50jaL树脂)在表5.1.1和5.1.2中描述的氯化钠和磷酸钠条件下平衡每个孔。将平板摇动20分钟，容许达到平衡。然后通过离心所述滤板来除去溶液。这个平衡循环重复三次。在第二阶段，每个孔中的树脂在合适的氯化钠和磷酸钠浓度下以6:1的体积比(300juL溶液50juL树脂)用浓缩的MAb-MYA溶液挑战到适合的蛋白质负载挑战。使用50mMNaCl、100mMHEPES、100mM精氨酸、pH7.2中的7.0mg/mLMAB-MYA溶液作为贝i备溶液。负载的板摇动20分钟，容许树脂和溶液平衡。通过离心从滤板除去上清液，并收集到收集板中。每个孔中的上清液中的蛋白质浓度通过A280nm处的吸光度来测定。在第三阶段，通过添加在表5.1.1和5.1.2中列出的指定的氯化钠和磷酸钠条件的溶液来洗涤树脂。在摇动20分钟后除去上清液。在第四阶段，添加由100mM磷酸钠、1MNaCl组成pH7.2的緩冲液来除去与树脂结合的残留蛋白质。使用从阶段4洗脱的质量以及阶段2的产物浓度，为每个孔计算分配系数，在表5.1.3中示出。表5,1.3:MAB-MYO的96孑LHTS筛选的分配系数(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>如表5丄3中所示，Kp值可以用于描述MAB-MYA以不同强度与羟基磷灰石介质结合的区域。MAB-MYA与陶瓷羟基磷灰石介质结合的强度可以通过改变进入流通(K《0.1)、弱分配(0,KK〈20)和结合区(K>20)的氯化物和磷酸盐浓度的条件来操纵。实验5.2-在WP条件下的柱运行具体地进行在此讨论的实验来强调弱分配条件下cHA步骤的优越性能。因而在相应于由HTS筛选(实验5.1)鉴定的一系列分配系数的条件下进行实验。进行十二个运行，产物负载挑战为100mg/ml树月旨。Mabselect蛋白A层析使用MabSelect柱纯化含有单克隆抗体的培养物。用5倍柱体积的50mMTris/150mMNaCl,pH7.5以300cm/hr的流速平4軒Mabselect蛋白A柱。然后以大约40mg产物/ml树脂的负载来负载该柱。之后是1M精氨酸、50mMTris，pH7.5中的10CV洗液，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的5CV洗液。然后使用100mM精氨酸、50mMNaCl，pH3.0来洗脱柱。使用2MHEPESpH8.0将产物库中和到pH7.2。陶瓷羟基磷灰石层析来自蛋白A步骤的部分纯化的抗体库进一步在羟基磷灰石上纯化。柱直径是0,5cm,柱高度是10cm。对于在实验5系列中描述的所有羟基磷灰石层析步骤，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸钠、l.OMNaCl、pH6.8(3倍柱体积)平衡液25-30mM磷酸钠、50-760mMNaCl、100mMArg、100mMHEPESpH7.2(5倍柱体积)洗涤5-30mM磷酸钠50-760mMNaCl、100mMArg、100mMHEPESpH7.2(5-10倍柱体积)使用5倍柱体积的平衡緩沖液1和随后另一个平衡液2步骤来平衡柱。然后用来自上述步骤的蛋白A峰(调节到合适的平衡液2緩冲液)将柱负载到100mg产物/mL树脂，从负载循环期间的柱流出物以及一定柱体积的洗涤级分中回收产物。这些实验的结果在表5.2.1和附图11中示出。这些负载条件处于流通、弱分配(WP)和结合区域中。实施例5.1中描述的高处理量筛选估计了在这些氯化物和磷酸盐浓度条件下分配系数(Kp)和结合的产物(mg/mL树脂)的值。结合的产物根据柱运行的产物穿透体积来测定。这些实验的HCP和蛋白A结果在表5.2.1和附图11中示出。表5.2.1:在流通、弱分配和结合条件下的HCP和蛋白A去除<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>根据表5.2.1和附图11中呈现的数据明显的是，当我们从流通条件移动到弱分配条件时，对于杂质降低，cHA步骤的性能显著地改善了，而产物回收率是相当的。在相应于分配系数进一步提高的条件下的操作(即，在结合区域操作)对于杂质去除没有提供额外的益处。然而，在强结合条件下在该步骤上产物回收率开始降低。因而这种分离的最佳的操作范围相应于弱分配层析的操作范围。在这些条件下，在100mg产物/ml树脂的负载挑战下获得了〉2对数的蛋白A降低和〉1.2对数的宿主细胞蛋白质降低。在这个实施例中，在弱分配条件下的结合的产物水平在3.0-10.2mg/ml树脂之间。总结层析的第三种模式(羟基磷灰石)显示了在弱分配模式中成功地运作。蛋白A和HCP比产物抗体更紧密地结合陶资的树脂，在WP条件下强烈地保留。在WP区域中更高的Kp值有时在10和20之间，其仍然提供了良好的产物回收率(>90%)。更低的Kp水平得到了相应更高的回收率。在这个实施例中，显示的是，柱步骤的性能可以主要通过选择用于运行柱的分配系数来优化。羟基磷灰石中的分配系数是pH值、盐(类型和浓度)、磷酸盐和緩冲液成分的复杂的函数。一般地所有这些变量对于柱步骤的性能有影响。在此呈现的方法提供了改变任一种这些变量对柱性能的影响的关联的简单方法。与以前所做的相比，在这个实施例中呈现的统一的"分配系数"方法打开了在这种层析模式中以更广的操作空间来操作的可能性。最佳性能的弱分配条件可以使用如上所述的HTS方法容易地鉴定。系列6-使用陶瓷的I型羟基磷灰石的羟基磷灰石和Mab-A5T实施例6.1-高处理量筛选来确定WP和FT条件进行高处理量筛选(HTS)来鉴定使用陶f:羟基磷灰石介质对于Mab-A5T的弱分配和流通条件。这个筛选改变pH值、氯化钠和磷酸钠的浓度来确定它们对MAB-A5T与羟基磷灰石介质的结合程度的影响。将50iuL陶资羟基磷灰石介质添加到96孔滤板的30个孔中。在由含50mM精氨酸、pH7.0或pH8.0的50mMHEPES緩沖液中适合的氯化钠和磷酸钠浓度组成的溶液中平tf每个孔。溶液中两种盐的浓度在表6.1.1和6.1.2中示出。1-3栏中所示的条件在pH7.0下进行，4-6栏在pH8.0下进行。这些孔的每一个中的MAB-A5T负载挑战是5.0mg/mL树月旨。表6.1.1:每个孔中的氯化钠水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表6.1.2:每个孔中的磷酸钠水平(mM)<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>在HTS实验的第一个阶段，以6:1的相体积比(300|uL溶液50laL树月旨)在表6.1.1和6.1.2中描述的氯化钠、磷酸钠和pH值条件下平衡每个孔。将平板摇动20分钟，容许达到平衡。然后通过离心所述滤板来除去溶液。这个平衡循环重复三次。在第二阶段，每个孔中的树脂在合适的pH值和氯化钠和磷酸钠浓度下以6:1的体积比(300mL溶液50jaL树脂)用浓缩的MAb-A5T溶液挑战到适合的蛋白质负载挑战。lmMHEPES、100mMNaCl、pH7.0中的6.9mg/mlMab-A5T溶液用作贝i备溶液。负载的板摇动20分钟，容许树脂和溶液平衡。通过离心从滤板除去上清液，并收集到收集板中。每个孔中的上清液中的蛋白质浓度通过A280nm处的吸光度来测定。在第三阶段，通过添加在表6.1.1和6.1.2中列出的指定的氯化钠、磷酸钠和pH值条件的溶液来洗涤树脂。在摇动20分钟后除去上清液。在第四阶段，添加包含100mM磷酸钠、1MNaCl的pH7.2的緩沖液来除去与树脂结合的残留蛋白质。使用从阶段4洗脱的质量以及阶段2的产物浓度，为每个孔计算分配系数，在表6.1.3中示出。表6丄3:MAB-A5T的HTS筛选的分配系数(Kp)<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>如表6丄3中所示，Kp值可以用于鉴定MAB-A5T以不同强度与羟基磷灰石介质结合的区域。MAB-A5T与陶瓷羟基磷灰石介质结合的强度可以通过改变进入到流通、弱分配和结合区的NaCl、磷酸盐和pH值的条件来操纵。实验6.2-在WP条件下的柱运行进行实验来强调弱分配条件下cHA步骤的优越性能。因而在相应于由HTS筛选(实验6.1)鉴定的一系列分配系数的条件下进行实验。进行八个运行，产物负载挑战110mg/ml树脂。Mabselect蛋白A层析使用MabSelect柱纯化含有单克隆抗体的培养物。用5倍柱体积的50mMTris/150mMNaCl，pH7.5以300cm/hr的流速平衡-Mabselect蛋白A柱。然后以大约40mg产物/ml树脂的负载挑战负载柱。之后是lMNaCl、50mMTris,pH7.5中的5CV洗涤，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5的洗液的5CV洗涤。然后4吏用100mM精氨酸、50mMNaCl，pH3.0来洗脱柱。使用2MHEPESpH8.0将产物库中和到pH7.2。陶瓷羟基磷灰石层析来自蛋白A步骤的部分纯化的抗体库进一步在羟基磷灰石上纯化。柱直径是0.5cm,柱高度是10cm。对于在实验6系列中描述的所有羟基磷灰石层析步骤，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸钠、l.OMNaCl、pH6.8(3倍柱体积)平衡液22-32mM磷酸钠、50-400mMNaCl、5mM咪哇、50mM甘氨酸、10mMHEPES、pH7.0(5倍柱体积)洗液与平tf液2相同使用5倍柱体积的平衡緩沖液1和随后另一个平衡液2步骤来平衡柱。然后用来自上述步骤的蛋白A峰(调节到合适的平衡液2緩冲液)将柱负载到110mg产物/mL树脂，从负载循环期间的柱流出物以及一定柱体积的洗涤级分中回收产物。这些实验的结果在表6.2.1和附图12中示出。表6.2.1:在cHA树脂上MAB-A5T的分配系数和相应的操作范<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>这些实验中操作条件相应于流通、弱分配(WP)区域和结合区域。试验6.1中描述的HTS实验估计了在这些pH值、氯化物和磷酸盐浓度条件下分配系数(Kp)的值。表6.2.1中的运行通过分配系数来分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的逐渐脱附，测定结合的产物的这种方法一般低估了在负载期间结合的产物量。这些实验产生的HCP和产物相关的HMW去除以及产物回收率在附图12中示出。根据附图12中呈现的数据明显的是，当我们从流通条件移动到弱分配条件时，对于HCP和HMW降低，cHA步骤的性能显著地改善了，而产物回收率维持在〉80%。在相应于分配系数进一步提高的条件下的操作(即，在结合区域操作)对于杂质去除没有提供额外的益处。然而，在强结合条件下在该步骤上产物回收率开始降低。因而这种分离的最佳的操作范围相应于弱分配层析的范围。在这些条件下，在110mg产物/ml树脂的负载挑战下获得了产物相关的HMW物质的4倍降低和HCP的〉1.4的对数降低。在这个实施例中，在弱分配条件下的结合的产物水平在1.6-6.7mg/ml树脂之间。总结在弱分配层析下操作的羟基磷灰石中呈现的第二实施例显示了，提供了对于HCP和HMW降低以及产物回收率(〉80%)的改善的性能。在早先的实施例中，步骤的性能可以主要通过选择用于运行柱的分配系数来优化。在此呈现的方法提供了将改变几种变量(pH值、盐、磷酸盐、咪唑、甘氨酸、HEPES,等等)中的任一种对柱性能的影响相关联的简单方法。最佳性能的弱分配条件可以使用在这个实施例中描述的HTS方法鉴定。与以前所估文的相比，在此呈现的方法打开了在这种层析模式中以更广的操作空间来操作的可能性。这个实施例中最佳的WP区域相应于2和20之间的分配系数。系列7-使用I型陶瓷羟基磷灰石的羟基磷灰石和Mab-MYO实施例7.1-高处理量筛选来确定FT、WP和强结合条件进行高处理量筛选(HTS)来鉴定使用陶瓷羟基磷灰石介质对于Mab-MYO的流通、弱分配和结合条件。这个筛选改变pH、精氨酸/甘氨酸、HEPES、磷酸钠和氯化钠的浓度来确定它们对MAB-MYO与羟基磷灰石介质的结合程度的影响。这个实施例中使用的HTS步骤与在系列5和系列6中描述的那些类似，在此不再讨论。来自与HTS数据拟合的响应曲面的预测的Kp值被用于挑选柱实验的具体条件。实验7.2-在WP条件下的柱运行在相应于由HTS试验鉴定的一系列分配系数的条件下进步骤对于HCP和产物相关的HMW种类的去除的优越性能。使用55mg/ml树脂的产物负载挑战来进行四个运行。这些实验中使用的负载挑战对于弱分配层析是低的，但对于流通操作是典型的。在这些实验中不进行尝试来优化弱分配层析的负载挑战。来自蛋白A步骤的部分纯化的抗体库被用于这些实验中。柱直径是0.5cm，柱高度是10cm。对于在实验7系列中描述的所有羟基磷灰石层析步骤，使用以下条件(除了在单独的实验说明中注明的之外)。操作流速-150-240cm/hr平衡液1300mM磷酸钠、l.OMNaCl、pH6.8(2-5倍柱体积)平衡液2l-8mM磷酸钠、50-1750mMNaCl、12-50mMArg、20-50mMHEPESpH7.0(5倍柱体积)洗涤与平4軒液2相同使用2-5倍柱体积的平衡緩冲液1和随后5倍柱体积的平衡液2来平衡柱。然后用蛋白A峰(调节到合适的平衡液2緩冲液)将柱负载到55mg产物/mL树脂，从负载循环期间的柱流出物以及一定柱体积的洗涤级分中回收产物。这些实验的结果在表7.2.1和附图13中示出。表7.2.1:在cHA树脂上MAB-MYO的分配系数和相应的操作模式<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>*最佳的Kp条件，参见附图13这些实验中的操作条件相应于流通、弱分配(WP)区域和结合区域。实施例7.1中描述的HTS实验估计了在这些pH值、氯化物，磷酸盐、甘氨酸/精氨酸和HEPES浓度下分配系数(Kp)的值。表7.2.1中的运行通过分配系数来分级。通过使用UV吸光度测量柱列带中的蛋白质来测定结合的产物。由于在洗涤期间产物的逐渐脱附，测定结合的产物的这种方法一般低估了在负载期间结合的产物量。这些实验产生的产物相关的高分子量(HMW)去除和产物回收率也在附图13中示出。根据附图13中呈现的数据明显的是，当我们从流通条件移动到弱分配条件时，对于HMW降低，cHA步骤的性能显著地改善了，而产物回收率>80%。在相应于分配系数进一步提高的条件下的操作(即，在结合区域操作)对于杂质去除没有提供额外的益处。然而，在强结合条件下在该步骤上产物回收率开始降低。因而这种分离的最佳的操作范围相应于弱分配层析的范围。在这些条件下，获得了20倍的产物相关的HMW种类的降低。在这个实施例中，在弱分配条件下的结合的产物水平在5.1-9.5mg/ml树脂之间。总结在弱分配层析下操作的羟基磷灰石中呈现的第二实施例显示提供了关于HMW降低方面的改善性能，具有良好的产物回收率(>80%)。产物相关的HMW种类和HMW种类与产物抗体相比更紧密地结合陶瓷树脂，在WP条件下强烈地保留。这个实施例中的WP区域相应于8和20之间的分配系数。在这个实施例中，再一次显示的是，柱步骤的性能可以主要通过选择用于运行柱的分配系数来优化。在此呈现的方法提供了改变几种变量(pH值、盐、磷酸盐、精氨酸、HEPES,等等)中的任一种对柱性能产生的影响相关联的简单方法。最佳性能的弱分配条件可以使用在这个实施例中描述的HTS方法鉴定。与以前所做的相比，在此呈现的方法打开了在这种层析模式中以更广的操作空间来操作的可能性。在此还值得注意的是，弱分配层析的原理在不由电荷相互作用单独驱动的系统中也能工作。在本申请中描述的一般方法可以成功地应用于复杂的系统，例如HIC以及羟基磷灰石。例如，除了操作pH值以外，其他几种变量例如NaCl、磷酸盐、精氨酸/甘氨酸、緩沖液种类以及树脂的类型都可以影响羟基磷灰石中的步骤性能。尽管如此，人们可以通过进行使用单独的目标产物的简单分批结合实验来容易地鉴定WP窗口。系列8-用于蛋白A洗脱的两性离子緩沖液和随后的离子交换步骤使用MabSelect树脂纯化含有单克隆抗体的培养物。用5倍柱体积的50mMTris/150mMNaCl,pH7.5平衡Mabselect蛋白A柱。然后以大约40mg产物/ml树脂的负载负载柱。之后是lMNaCl、50mMTris,pH7.5中的5CV洗涤，以及含有10mMTris、75mMNaClpH7.5洗液的5CV洗涤。然后使用30mMHEPES、pH3.1洗脱柱。产物库使用1MHEPESpH8.0中和到pH7.2，产生55mM的总HEPES浓度。在pH7.2，HEPES对緩冲液贡献了17mM的离子强度。在此引用的所有参考文献在此为了所有目的通过将它们完全引用来合并在此，其程度与具体的或单独的指示为了所有目的通过引用合并在此的出版物和专利或专利申请与在说明书中含有的公开内容抵触时，本说明书意图是优于和/或高于任何这样的对立材料。在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、反应条件等的数字，都被理解为是在所有情况下用术语"约"所修饰的。因此，除非另有相反的陈述，在说明书和附随的权利要求中列出的数字参数是近似值，可以依据试图通过本发明获得的期望的性质而改变。至少，而不是作为将等效原则的应用限定到权利要求的范围的尝,[^212]S:进^t对本发明:许多修't^口变化而不背离它的精神和范围，这对于本领域的技术人员是显而易见的。在此描述的具体实施方式仅通过举例来提供，无论如何不意味着是限制性的。意图是，说明书和实施例被认为仅是示范性的，本发明的真实范围和精神由以下的权利要求指明。权利要求1.一种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1mg产物/mL介质；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。2.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。3.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg产物/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。4.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定。5.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述操作条件包括pH值水平和离子强度。6.权利要求5的方法，其中所述操作条件进一步包括盐浓度。7.权利要求5的方法，其中所述操作条件进一步包括赋形剂浓度。8.权利要求7的方法，其中所述操作条件进一步包括磷酸盐浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度。9.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述操作条件包括反配体水平和pH值水平。10.权利要求9的方法，其中所述操作条件进一步包括咪唑浓度。11.权利要求4的方法，其中所述筛选步骤使用分批结合研究。12.权利要求4的方法，其中所述筛选步骤使用柱结合研究。13.权利要求12的方法，其中所述柱结合研究是梯度洗脱研究。14.权利要求12的方法，其中所述柱结合研究是等度洗脱研究。15.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少5mg产物/mL介质。16.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少10mg产物/mL介质。17.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少20mg产物/mL介质。18.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少30mg产物/mL介质。19.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少40mg产物/mL介质。20.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少50mg产物/mL介质。21.权利要求l的方法，其中所述操作条件使得所述介质结合至少60mg产物/mL介质。22.权利要求2的方法，其中所述分配系数的值在约0.2到约20.0的范围内。23.权利要求2的方法，其中所述分配系数的值在约0.2到约10.0的范围内。24.权利要求2的方法，其中所述分配系数的值在约1.0到约5.0的范围内。25.权利要求2的方法，其中所述分配系数的值在约0.5到约5.0的范围内。26.权利要求2的方法，其中所述分配系数的值在约0.5到约1.5的范围内。27.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述产物是选自由融合蛋白、含Fc的蛋白、免疫缀合物、细胞因子、白细胞介素、激素和治疗性酶构成的组的蛋白质。28.权利要求23的方法，其中所述含Fc的蛋白是抗体。29.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述介质是带电的离子交换介质。30.权利要求29的方法，其中所述带电的离子交换介质是阴离子交换树脂。31.权利要求29的方法，其中所述带电的离子交换介质是阳离子交换树脂。32.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述介质是疏水性相互作用层析树脂。33.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述介质是羟基磷灰石树脂。34.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述介质是固定的金属亲和层析树脂。35.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述一种或多种混杂物选自由宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素和蛋白A构成的组。36.权利要求35的方法，其中所述混杂物进一步包括病毒。37.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约100ng宿主细胞蛋白质/mg产物的宿主细胞蛋白38.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约250ng宿主细胞蛋白质/mg产物的宿主细胞蛋白39.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约500ng宿主细胞蛋白质/mg产物的宿主细胞蛋白质。40.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约100ng蛋白A/mg产物的蛋白A。41.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约50ng蛋白A/mg产物的蛋白A。42.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约10ng蛋白A/mg产物的蛋白A。43.权利要求35的方法，其中所述混杂物包括具有在纯化的产物中浓度不超过约1ng核酸/mg产物的核酸。44.权利要求35的方法，其中在纯化的产物中产物变体的浓度是不超过约0.5%。45.权利要求35的方法，其中在纯化的产物中产物变体的浓度是不超过约2%。46.权利要求35的方法，其中在纯化的产物中产物变体的浓度是不超过约5%。47.权利要求35的方法，其中在纯化的产物中产物变体的浓度是不超过约10%。48.权利要求36的方法，其中所述病毒的对数去除值是大于1.0。49.权利要求36的方法，其中所述病毒的对数去除值是大于2.0。50.权利要求36的方法，其中所述病毒的对数去除值是大于3.0。51.权利要求35的方法，其中所述宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少1.0。52.权利要求35的方法，其中所述宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少2.0。53.权利要求35的方法，其中所述宿主细胞蛋白质的对数去除值是至少3.0。54.权利要求35的方法，其中所述蛋白A的对数去除值是至少1.0。55.权利要求35的方法，其中所述蛋白A的对数去除值是至少2.0。56.权利要求35的方法，其中所述蛋白A的对数去除值是至少3.0。57.权利要求1-3的任一项的方法，其中使用低离子强度的洗脱緩沖液从蛋白A柱上洗脱含产物流体；所述含产物流体的pH值和导电率使用中和緩沖液来调节，所述中和緩沖液产生不超过20mM的所述含产物流体的离子强度，产生负载流体；并且其中这种负载流体通过离子交换介质。58.权利要求57的方法，其中所述负载流体通过阴离子交换介质而不需要渗滤。59.权利要求57的方法，其中使用中和緩沖液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和li冲液产生不超过40mM的所述含产物流体的离子强度。60.权利要求57的方法，其中使用中和緩冲液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩冲液产生不超过60mM的所述含产物流体的离子强度。61.权利要求57的方法，其中使用中和緩冲液来调节含产物流体的pH值和导电率，所述中和緩沖液产生不超过80mM的所述含产物流体的离子强度。62.权利要求57的方法，其中所述洗脱緩沖液包含具有pKa2-5的带电阴离子基团的分子。63.权利要求62的方法，其中所述洗脱緩冲液进一步包含具有pKa6.5-10的带电阳离子基团的分子。64.权利要求57的方法，其中所述洗脱緩沖液包含pH在4和9之间的两性离子的分子。65.权利要求64的方法，其中所述两性离子选自由甘氨酸；1,4-哌。秦二-(乙烷磺酸)；双甘氨肽；环戊烷四-1,2,3，4-羧酸；N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸；2-(N-吗啉代)丙烷-磺酸；N-三(羟曱基)曱基-2-氨基乙烷磺酸；N-2-羟基乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸；4-(2-羟乙基)-I-哌。秦丙烷磺酸；N-三(羟甲基)曱基甘氨酸；甘氨酰胺；N,N-二(2-羟乙基)甘氨酸；N-三(羟曱基)曱基-2-氨基丙烷磺酸；和N-甘氨酰-甘氨酸构成的组。66.权利要求65的方法，其中所述两性离子包括甘氨酸。67.权利要求57的方法，其中所述负载流体的离子强度是不超过100mM。68.权利要求57的方法，其中所述负载流体的离子强度是不超过50mM。69.权利要求57的方法，其中所述负载流体的离子强度是不超过25mM。70.权利要求57的方法，其中所述负载流体的离子强度是不超过10mM。71.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述介质除去选自由宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素和蛋白A构成的组的混杂物的至少90%。72.权利要求71的方法，其中所述介质除去选自由宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素和蛋白A构成的组的混杂物的至少99%。73.权利要求72的方法，其中所述介质除去选自由宿主细胞蛋白质、核酸、产物变体、内毒素和蛋白A构成的组的混杂物的至少99.9%。74.权利要求1-3的任一项的方法，其中结合到所述介质的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少10%。75.权利要求74的方法，其中结合到所述介质的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少20%。76.权利要求75的方法，其中结合到所述介质的总产物质量是负载到介质上的总产物质量的至少30%。77.权利要求1-3的任一项的方法，其中所述产物在所述介质上的负载是至少10mg产物/mL介质。78.权利要求77的方法，其中所述产物在所述介质上的负载是至少50mg产物/mL介质。79.权利要求78的方法，其中所述产物在所述介质上的负载是至少100mg产物/mL介质。80.权利要求79的方法，其中所述产物在所述介质上的负载是至少500mg产物/mL介质。81.权利要求80的方法，其中所述产物在所述介质上的负载是至少1000mg产物/mL介质。82.权利要求1-3的任一项的方法，其中在所述负载流体中的产物浓度是至少1mg产物/mL负载流体。83.权利要求82的方法，其中在所述负载流体中的产物浓度是至少5mg产物/mL负载流体。84.权利要求83的方法，其中在所述负载流体中的产物浓度是至少10mg产物/mL负载流体。85.权利要求84的方法，其中在所述负载流体中的产物浓度是至少50mg产物/mL负载流体。86.权利要求85的方法，其中在所述负载流体中的产物浓度是至少100mg产物/mL负载流体。87.由权利要求1的方法制备的纯化的产物。88.由权利要求2的方法制备的纯化的产物。89.由权利要求3的方法制备的纯化的产物。90.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg蛋白质/mL介质；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。91.一种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。92.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg蛋白质/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。93.由权利要求90的方法制备的纯化的蛋白质。94.由权利要求91的方法制备的纯化的蛋白质。95.由权利要求92的方法制备的纯化的蛋白质。96.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg抗体/mL介质；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。97.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。98.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。99.由权利要求96的方法制备的纯化的抗体。100.由权利要求97的方法制备的纯化的抗体。101.由权利要求98的方法制备的纯化的抗体。102.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg产物/mL介质；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。103.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。104.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的产物的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg产物/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的产物。105.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg蛋白质/mL介质；其中所述操作条件在篩选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。106.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。107.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的蛋白质的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg蛋白质/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的蛋白质。108.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg抗体/mL介质；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。109.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。110.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件在筛选步骤中鉴定；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。111.一种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过带电的离子交换介质，所述操作条件使得所述介质结合至少lmg抗体/mL介质；其中所述操作条件包括pH值水平和离子强度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。112.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过带电的离子交换介质，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平和离子强度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。113.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过带电的离子交换介质，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平和离子强度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。114.一种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过疏水性相互作用层析树脂，所述操作条件使得所述树脂结合至少lmg抗体/mL树脂；其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度、和盐浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。115.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过疏水性相互作用层析树脂，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度和盐浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。116.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过疏水性相互作用层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度和盐浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。117.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过羟基磷灰石层析树脂，所述操作条件使得所述树脂结合至少lmg抗体/mL树脂，其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度、磷酸盐浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。118.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过羟基磷灰石层析树脂，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度、磷酸盐浓度、钙浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。119.一种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过羟基磷灰石层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件包括pH值水平、离子强度、磷酸盐浓度、钩浓度、精氨酸浓度、甘氨酸浓度和HEPES浓度；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。120.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过固定的金属亲和层析树脂，所述操作条件使得所述树脂结合至少lmg抗体/mL树脂；其中所述操作条件包括反配体水平和pH值水平；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。121.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过固定的金属亲和层析树脂，所述操作条件由至少0.1的分配系数限定；其中所述操作条件包括反配体水平和pH^直水平；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。122.—种从包括一种或多种混杂物的负载流体回收纯化的抗体的方法，包括步骤使所述负载流体在操作条件下通过固定的金属亲和层析树脂，所述操作条件使得所述介质结合至少1到约70mg抗体/mL介质并且由0.3到20的分配系数限定；其中所述操作条件包括反配体水平和pH值水平；和在负载循环和任何基本上等度的洗涤期间在柱流出物中回收所述纯化的抗体。全文摘要本发明涉及使用弱分配层析从含有一种或多种混杂物的负载流体中纯化产物的方法。进一步的，本发明涉及由操作条件限定的弱分配层析的方法，所述操作条件使得介质结合至少1mg产物/ml介质，或作为选择，由至少0.1的分配系数限定。文档编号C07K1/00GK101175765SQ200680016391公开日2008年5月7日申请日期2006年3月10日优先权日2005年3月11日发明者B·D·凯利,J·E·布思,J·科夫曼,M·B·斯威策,P·布朗,R·戈达瓦蒂,S·孙,S·文努姆,T·于,T·艾斯克拉申请人:惠氏公司