专利名称：抑制癌细胞迁移的肽配体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有氨基酸序列的新肽结构 LGTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.1 GTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.2 TQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.3 QGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.4 GRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.5 RLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.6 LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7 CNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.8 NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9 KTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.10 TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11 SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12 EGMDGCEL SEQ.ID.NO.13 GMDGCELSEQ.ID.NO.14 MDGCEL SEQ.ID.NO.15 或其甲酰基化衍生物 在本发明一个优选实施方案中，论述了肽结构SEQ.ID.NO.9至SEQ.ID.NO.15或其甲酰基化衍生物。
尤其，本发明论述了SEQ.ID.NO.15或其甲酰基化衍生物。
本发明进一步论述了由下述序列编码的一个或多个氨基酸或其甲酰基化衍生物在生产一种药物组合物中的使用，其中该药物组合物通过抑制癌细胞的运动性发挥抗癌作用。
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL GTQGRLCNKTSEGMDGCEL TQGRLCNKTSEGMDGCEL QGRLCNKTSEGMDGCEL GRLCNKTSEGMDGCEL RLCNKTSEGMDGCEL LCNKTSEGMDGCEL CNKTSEGMDGCEL NKTSEGMDGCEL KTSEGMDGCEL TSEGMDGCEL SEGMDGCEL EGMDGCEL GMDGCEL MDGCEL 尤其氨基酸是选自下面的组中 NKTSFGMDGCEL KTSEGMDGCEL TSEGMDGCEL SEGMDGCEL EGMDGCEL GMDGCEL MDGCEL 或其甲酰基化衍生物 本发明还进一步涉及一种药物组合物，其含有一定治疗剂量的一种或多种对癌细胞运动性有抑制作用的活性肽序列，该活性肽序列选自含有下列序列的组中 LGTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.1 GTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.2 TQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.3 QGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.4 GRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.5 RLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.6 LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7 CNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.8 NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9 KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10 TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11 SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12 EGMDGCELSEQ.ID.NO.13 GMDGCEL SEQ.ID.NO.14 MDGCEL SEQ.ID.NO.15 或其甲酰基化衍生物，可选择地结合使用惰性载体或赋形剂，尤其是该活性肽是选自含有下述序列的组中 NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9 KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10 TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11 SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12 EGMDGCEL SEQ.ID.NO.13 GMDGCEL SEQ.ID.NO.14 MDGCELSEQ.ID.NO.15 或其甲酰基化衍生物，更具体的，该活性肽是 MDGCELSEQ.ID.NO.15 或其甲酰基化衍生物。
本发明进一步涉及一种通过用药一定治疗剂量的一个或多个肽序列来抑制人体癌细胞运动性的方法，尤其是对乳腺癌患者中的癌细胞，其中，该肽序列选自含有下述序列的组中。
LGTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.1 GTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.2 TQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.3 QGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.4 GRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.5 RLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.6 LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7 CNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.8 NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9 KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10 TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11 SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12 EGMDGCELSEQ.ID.NO.13 GMDGCEL SEQ.ID.NO.14 MDGCEL SEQ.ID.NO.15 或其甲酰基化衍生物。
下文中用到了一些缩写，他们是 CM，Wnt-5a-条件培养液； DDR1，盘状结构域受体1； F-肌动蛋白，丝状肌动蛋白； Frz，Frizzled MTS，(3-(4，5-二甲基噻唑-2-烃基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H- 四唑盐，内盐； PP1，4-氨基-5-(4-甲基-苯)-7-(t-丁基)pyrozolo-D-3、4-嘧啶 结果 Wnt-5a反义HB2细胞黏附力和迁移的肽诱导作用。
表1列出从Wnt-5a序列中衍生的14个初始肽片断，并探讨了它们模拟Wnt-5a蛋白对哺乳动物细胞黏附力和运动性作用的能力。以前的研究表明只有在Wnt-5a蛋白的存在下，胶原才能诱导激活黏附受体DDR1，乳腺细胞与胶原的黏附力才最强(12)。因此，DDR1的磷酸化和黏附力可作为不同肽模拟Wnt-5a反义HB2细胞中Wnt-5a介导作用的能力筛选参数。之所以选择这些细胞是因为这些细胞中的Wnt-5a含量非常低，很容易观察这些肽对Wnt-5a的依赖作用。从有代表性的印迹(blots)和累积密度分析显示，第168、169、170和175(100μM)肽能使DDR1产生明显的磷酸化。采用高效液相色谱(HPLC)(文中没有列出相关资料)对这些肽进行初选(
图1和2)，它们的纯度约为65％。接下来测定图1中能使DDR1产生磷酸化的这四种肽(168、169、170和175)存在时和胶原I黏附的细胞比例。肽171和Wnt-5a条件培养液(CM)可分别作为阴性对照和阳性对照包括在其中。结果显示肽168对黏附力没有任何作用，反而假设的阴性对照肽却对黏附力产生明显作用(图2A)。观察到肽171存在时DDR1没有产生磷酸化(图1A)，因此猜想肽171影响黏附力的机理并不依赖于DDR1是合乎逻辑的。因为DDR1的激活不需要β1-整联蛋白(22)，而且采用抗-β1-整联蛋白抗体预孵育后，依赖Wnt-5a-的哺乳细胞的黏附力并无明显变化(12)，因此用阻断抗体-抗-β1-整联蛋白单克隆抗体将悬浮的HB2细胞在37℃条件下预处理45分钟。结果显示作为对照的肽171增强黏附力的作用很可能依赖于β1-整联蛋白(图2B)。这些作用与肽175相反(图2B)。应当指出，这些纯度为65％的肽中没有一种肽对HB2黏附力的增强作用能够与CM的增强作用匹敌(图2A)。为了明确图2中CM的作用是受到Wnt-5a的介导，我们采用Wnt-5a抗体和蛋白A对CM进行预处理，将Wnt-5a耗竭。结果显示将Wnt-5a耗竭后，CM对黏附力没有影响(图2C)。
表1 肽序列和在Wnt-5a蛋白的相应位置
A Wnt-5a序列的3个半胱氨酸被肽中的丙氨酸替代。
B以肽175为基础的延长序列 已经从Wnt-5a蛋白中分离出四种肽片断，它们能增强内源性Wnt-5a低表达的HB2细胞的黏附力(图2A)，下一步将对这些肽进行浓度依赖性分析，目前以较高的纯度(用高效液相色谱法测定纯度为95％)。显然，175肽在增强HB2细胞与胶原I黏附力方面能力最强(图3A-3D)。当纯度较高时，肽169的效能也会增强，但是在这种高纯度条件下，肽170和171将会失效或作用欠一致。与单独使用肽175相比，同时添加95％纯度的肽169和175并不能进一步提高HB2细胞的黏附力(文中资料未列出)。以前通过理论推测Wnt-5b分子的活性部分有20个氨基酸的长度。有趣的是，本发明中的肽175位于Wnt-5a分子相应的结构域中。因此假设肽175加上丢失的8个氨基酸构成一种新肽，这种新肽与先前研究证实的影响细胞黏附力的Wnt-5a蛋白的活性位点完全一致的话，能否增强细胞的黏附力。经过验证，显然20个氨基酸长度的肽174(表1)在增强HB2细胞与胶原I黏合力方面不如较短的肽175(图3E)。
提高HB2细胞中的Wnt-5a蛋白水平可以抑制HGF-诱导的细胞在胶原凝胶上的迁移，原因可能是与胶原的黏附力增强(10)。基于目前已经观察到的肽169和175对细胞黏附力的作用，下一步我们将研究这些肽(纯度95％)对Wnt-5a低表达的HB2细胞迁移的影响。正如方法部分所示，首先让细胞分别在含有或不含有纯度为95％的肽169或175(100μM)的条件下在改良Boyden小室迁移18h。分别加入纯化的重组Wnt-5a(0.4μg/ml)或纯度为95％(100μM)的肽171作为阳性和阴性对照。肽169和175以及重组Wnt-5a都能有效降低Wnt-5a反义HB2细胞的迁移(图3F)。作为对照的肽171对迁移没有影响(图3F)。
肽诱导对Wnt-5a缺乏的MDA-MB-468肿瘤细胞的黏附力和迁移的影响。
在乳腺癌细胞中重建Wnt-5a信号后有可能抑制细胞的转移能力，因此完成人Wnt-5a缺乏的MDA-MB-468乳腺癌细胞与胶原I之间的黏附力研究之后，我们开始研究纯肽169、175和对照肽171对它们的影响。首先分析MDA-MB-468细胞中的Wnt-5a蛋白表达水平与Wnt-5a反义和HA-Wnt-5a过表达的HB2细胞之间的关系。如图4A所示，Wnt-5a反义HB2和MDA-MB-468细胞中的Wnt-5a蛋白水平较低，而Wnt-5a转染细胞中的Wnt-5a蛋白水平很高。Wnt-5a的表达依赖于培养条件，也与分析时细胞的融合状态有关(23)。最终图4A中进行细胞分析时收集细胞的条件与后来进行的实验条件一致。即如果没有特殊说明，收集细胞之前细胞的融合率为80-90％，并且可以用无血清培养液培养16h。
当有肽169和175存在或含有Wnt-5a的CM存在时，MDA-MB-468与胶原I的黏和力明显增强，但是对照肽171却没有这个功能(图4B)。含有一个或多个游离半胱氨酸的肽，如肽175可能通过与不同蛋白/肽形成半胱氨酸-半胱氨酸相互作用发挥非特异性功能。为了研究肽175对细胞黏附力的作用是否与半胱氨酸残基有关，我们将含有半胱氨酸的肽175和与175肽结构相同但其中的半胱氨酸被丙氨酸残基代替的肽进行比较。结果发现含有丙氨酸的175在增强黏附力方面与含有半胱氨酸的175相似，而且两者之间没有统计学差异(图4C)。
一个有趣的现象是即使在没有Wnt-5a或肽存在的基础状态，MDA-MB-468细胞中也一直存在中等水平的DDR1磷酸化水平(图4D)。而且，无论是纯肽、CM，还是重组Wnt-5a都不能进一步提高MDA-MB 468细胞中的DDR1磷酸化水平(图4D)。已有的研究表明MCF-7和HB2细胞中依赖于Wnt-5a的胶原诱导的DDR1磷酸化由Src激酶介导(12)。此后，我们用10μM Src抑制剂4-氨基-5-(4-甲基-苯)-7-(t-丁酰)pyrozolo-D-3，4-嘧啶(PP1)对MDA-MB-468细胞进行处理30min。显然，这种处理消除了基本的DDR1磷酸化(图5A)。此结果与此前报道的MDA-MB-468中高Src激酶活性的结果一致(24)，此结果再次证实这种作用与血清无关，但是能被PP1消除(图5B)。已经证明这些细胞中增高的Src活性源于EGF-受体的过表达和过兴奋(25)。与此一致，即使在无血清环境下培养16h后，MDA-MB-468细胞中的EGF-受体也能充分表达，并且产生高度磷酸化(图5C)。EGF-受体的过兴奋和由此产生的Src高活性可能是MDA-MB-468细胞中DDR1持续磷酸化的原因。虽然这些发现与鉴定拟Wnt-5a肽没有直接关系，但是它们说明i/DDR1活化不是Wnt-5a影响乳腺细胞黏附力和运动性的唯一方式，ii/除Wnt-5a信号之外，可能还有其它机制通过激活Src引起胶原诱导的DDR1活化。
众所周知，迁移是癌侵袭和转移的先决条件，细胞在Boyden小室系统中的迁移增加与体内肿瘤细胞的侵袭力增加有关。因此，可以在Boyden小室中研究纯肽171(对照)、169和175对MDA-MB-468细胞运动性的影响。肽169和175都能明显降低MDA-MB-468细胞的迁移，而对照肽171对细胞没有明显作用(图6A)。如果培养孔和膜用胶原I(10μg/ml)在37℃包被1h后再进行上述实验，也能得出相同的结果(文中资料未列出)。实验中还发现用肽175处理的MDA-MB-468细胞与未处理的细胞相比，细胞中的丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)明显增高，用
488鬼笔毒环肽作为染色方法进行显色(图6B)。DDR1的活性没有增高时，增高的F-肌动蛋白可以很好的解释肽诱导的MDA-MB-468细胞黏附力增高和运动性降低，因为增高的F-肌动蛋白可以使细胞的硬度增高，从而降低细胞的运动性。
氨基酸的时序删除和甲酰化作用对175肽诱导作用于MDA-MB-468肿瘤细胞的黏附力和迁移效果的影响。
为了鉴定仍具有黏附力和抗运动性效果的最短肽片断，我们从已经鉴定出的两个活性肽中较短的一个，即175肽的N-末端时序删除两个氨基酸。当这两个氨基酸从肽175上被删除后，肽对肿瘤细胞黏附力的作用开始逐渐消失，当仅剩下6个氨基酸时，作用完全消失(图7A)。众所周知，细菌中的N-甲酰基化肽配体可以和白细胞上的G-蛋白偶联受体结合，从而对这些细胞产生明显的激活作用。此时甲酰基可以使配体的效应增加3至4个数量级。有趣的是，这种细菌肽和Wnt-5a都可以结合G-蛋白偶联受体，而且其中的一些细菌肽和我们发现的六肽的N-末端都有甲硫氨酸残基。因此我们检测了六肽的甲酰基化变异体对细胞黏附力的作用。结果发现这种六肽N-末端甲硫氨酸的甲酰基化不仅保留，甚至可能增强了它对黏附力的影响(图7A)。对照研究发现发生甲酰基化的具有白细胞(19)激活作用的三肽fMet-Leu-Phe没有影响MDA-MB-468细胞的黏附力(对照15.3+3.6，fMet-Leu-Phe15.7±4.5；n＝6)。这表明Wnt-5a六肽序列在介导甲酰基化六肽的作用中发挥特殊作用。甲酰基化六肽和肽175对细胞黏附作用的影响还表现为两种肽在最低达10μM的浓度时也能明显抑制MDA-MB-468细胞的运动性(图7B和7C)。
为了证实甲酰基化六肽和重组Wnt-5a是乳腺细胞中Frz-5受体的真正配体，如同在滑膜细胞和恶性黑色素瘤细胞中出现的结果，我们用上文中提到的Frz-5阻断抗体和对照抗体抗Frz-2受体外功能区中的相同序列。图8A中的条带印迹表明这两种经过亲和力纯化的抗体能分别特定识别与Frz-2和Frz-5受体分子量完全匹配的蛋白条带印迹。我们还同时进行了肽阻断实验，用相应的抗体与抗原肽进行预培养(摩尔比值1∶10)。后续的Western blot分析即使在感光过度的情况下也没有发现Frz-2和Frz-5受体(图8A，条带印迹分别是2和4)。与以前在恶性黑色素瘤细胞中的实验结果一致(14)，Wnt-5a-引起的MDA-MB-468细胞迁移降低是通过Frz-5受体介导，而作为对照的抗Frz-2抗体没有这种作用(图8B)。有趣的是，甲酰基化六肽也是通过Frz-5受体的介导影响MDA-MB-468细胞的迁移(图8B)。体内抑制肿瘤细胞的迁移还要考虑到pH值，乳腺肿瘤组织块中的pH值大约是6.7。结果我们很惊奇的发现甲酰基化六肽在pH 6.7和pH7.4时抑制MDA-MB-468细胞迁移的效果相似(图8C)。
目前通过对从Wnt-5a蛋白序列衍生的不同肽进行研究，发现其中两种在抑制乳腺癌细胞运动性方面具有拟Wnt-5a作用。推测Wnt-5a可能象许多其它蛋白配体一样，通过表面至少一个暴露于溶剂的环与其受体发生作用。因为Wnt-5a的实验性三维结构未知，所以缺乏合适的模板，因此无法采用同源性模型的方法进行研究。有鉴于此，为了预测暴露于溶剂的环是由哪个Wnt-5a片断构成，我们采用PHD对其二级/溶剂可及表面进行预测。这些结果(表1所示)可以使我们将最初的研究集中在8至15个氨基酸长度的肽。
此前我们已经成功鉴定出几种肽配体，其中包括作为整联蛋白受体配体的三肽Arg-Gly-Asp和可以激活G-蛋白偶联蛋白酶活化受体1和4的两个六肽(18)。另外一个例子是可以和G-蛋白偶联凝血酶结合的七肽，只是效应为拮抗作用(30)。本研究中将肽诱导对乳腺细胞黏附力的作用作为初选标准。采用这种方法，我们鉴定出两种高纯度肽(95％)，这两种肽可以增强非癌HB2细胞和MDA-MB-468癌细胞(这种细胞系内的内源性Wnt-5a蛋白水平很低)与胶原I之间的黏附力，而且与浓度成正比。为了鉴定具有与Wnt-5a相似的抗运动性作用的最短肽片断，我们从已经鉴定出的两个活性肽中较短的一个肽的N-末端时序删除两个氨基酸(12个氨基酸长度)。结果发现辛肽仍具有增强黏附力的作用，但是六肽没有这种作用。但是，这个六肽的N-末端氨基酸是甲硫氨酸，这让我们想到细菌源性的fMet-Leu-Phe肽中N-末端甲硫氨酸的甲酰基对黏附力也具有很强的增强作用(19，31-33)。N-甲酰基化甲硫氨酸是合成所有细菌蛋白的初始氨基酸。在发生感染时，由于种种原因大量细菌会发生死亡，在这个过程中，细菌会释放一种短N-甲酰基化肽。这些肽可以和白细胞上的G-蛋白偶联甲酰基肽受体紧密结合，是很强的白细胞活化剂(31，33)。
哺乳动物细胞中Wnt-5蛋白的六肽序列Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu是独一无二的，但是这种六肽也出现在细菌中另外两种蛋白中。但是两种情况的六肽序列都没有N-末端，所以没有甲酰基化状态。因此，本文描述的N-甲酰基化六肽是一种独特的肽，既不存在于细菌中，也不存在于哺乳动物细胞。必须指出的是一种能激活白细胞的三肽N-甲酰-Met-Leu-Phe对MDA-MB-468细胞的黏附力没有影响，表明并不是任何发生甲酰基化的肽都将结合并激活这些细胞上的Frz-5受体。
前期实验证实Wnt-5a失表达能导致乳腺肿瘤细胞的黏附力降低，运动性增强。细胞迁移增强是癌症转移的根本问题所在，将这些结果结合起来考虑，我们希望研究甲酰基化六肽对乳腺肿瘤细胞运动性的影响。这些实验都在改良Boyden小室中进行，因为前期实验已经证明肿瘤细胞在这种条件下的运动活性与它们在体内的侵袭特性具有高度一致性。这也与甲酰基化六肽对MDA-MB-468细胞的作用一致-既增强细胞的黏附力，又抑制它们的迁移。据推测对黏附力和迁移的作用源于DDR1。无论是否存在肽、CM还是重组Wnt-5a，MDA-MB-468细胞都能产生持续DDR1磷酸化作用，表明Wnt-5a还可以通过其它机制影响MDA-MB-468肿瘤细胞的迁移。肽诱导引起的F-肌动蛋白明显增高伴随运动性降低，表明F-肌动蛋白引起的细胞僵硬可能是细胞具有较强黏附力和运动性减低的另一个原因。甲酰基化六肽对迁移产生作用的最低浓度是10μM，这与Andersen等的发现一致，他们发现六肽对血小板产生作用的最低浓度是10μM。
这项发现的临床意义显而易见。乳腺肿瘤细胞中如果缺乏内源性Wnt-5a蛋白表达，组织学分类就比较高，患者的无瘤生存率就会缩短(9)，说明必须要在这些细胞中重建Wnt-5a信号，以延缓或抑制远处转移的发生。而且，重建Wnt-5a信号对其它肿瘤也有治疗作用，因为Wnt-5a对甲状腺癌具有肿瘤抑制活性，Wnt-5a失表达还与神经系统肿瘤的高发有关。
由于无效血管化和乳酸产生增多，肿瘤团块中的细胞外pH要低于正常组织。但是，据报道人乳腺肿瘤中Na+-H+交换器亚型1参与调节胞外和胞内的pH值。因此抑制肿瘤转移的物质在肿瘤组织的低pH值环境中也要有效，这一点很重要。研究表明体内肿瘤团块中的pH约为6.75。有趣的是，目前资料显示甲酰基化六肽在低pH值(6.7)和正常pH(7.4)值环境中对MDA-MB-468乳腺肿瘤细胞的运动性都有抑制作用。
总之我们已经以Wnt-5a配体为基础，构建了一种新型甲酰-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu肽配体，在内源性Wnt-5a蛋白低表达的人乳腺肿瘤细胞中模拟完整Wnt-5a分子的作用，与Frz-5受体结合并抑制人乳腺肿瘤细胞的运动性。这种肽配体可以作为未来研制新型抗肿瘤转移治疗药物的模型，为内源性Wnt-5a蛋白低表达的乳腺癌患者(约占50％)提供新的治疗手段。
方法 细胞培养 HB2乳腺上皮细胞系，MTSV-1.7细胞系的亚克隆，来源于J.Taylor-Papadimitriou博士的实验室(11)。HB2细胞在DMEM培养液中培养，其中含有10％的胎牛血清、5U/ml青霉素、0.5U/ml链霉素、2mM谷氨酰胺、10μg/ml牛胰岛素和5μg/ml氢化可的松。人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-468在DMEM培养液中培养，其中含有10％的胎牛血清、5U/ml青霉素、0.5U/ml链霉素和2mM谷氨酰胺。pH实验在MEM培养液中进行，其中含有10mM Tris、0.5％的牛血清白蛋白(BSA)、5U/ml青霉素、0.5U/ml链霉素和2mM谷氨酰胺。pH 7.4的培养液中还含有4mM碳酸氢钠而pH 6.7的培养液中没有。所有的细胞都在含有95％空气和5％CO2的37℃培养箱中培养。
化学试剂 抗体和化学试剂的来源抗肌动蛋白单克隆抗体C4(加利福尼亚州Irvine MP生物医学公司)、抗β1整联蛋白单克隆抗体P5D2(加利福尼亚州Temecula Chemicon公司)、来源于大鼠尾的I型胶原和抗EGF受体抗体(活化型)(加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司)、抗EGF受体抗体(所有类型)和抗磷酸酪氨酸单克隆抗体4G10(纽约普莱西德湖城Upstate生物技术公司)、PP1(宾夕法尼亚州PlymouthMeeting Biomol公司)、重组小鼠Wnt-5a(英国阿宾登R&D系统)、抗Src抗体(加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz公司)、抗Src[pY418](加利福尼亚州CamarilloBiosource公司)和SDS-PAGE试剂(加利福尼亚州Hercules BioRad实验室)。
肽的合成 大多数从Wnt-5a分子衍生出的各种不同的肽片断都是由Eurogentec(比利时Seraing)合成。但是从12个氨基酸长度的175肽衍生的更短的肽和甲酰基化肽是由Pepscan系统(荷兰Lelystad)合成。其它试剂从Sigma Aldrich公司获得(密苏里州圣路易斯市)。
受体阻断抗体 先前报道与人Frz-5受体外功能区中第198-217位氨基酸序列相同的肽CPILKESHPLYNKVRTGQVPN用于生产Frz-5受体的阻断抗体(13)。与人Frz-2受体外功能区中第202-220位氨基酸序列相同的肽CPRVLKVPSYLSYKFLGERD用于生产抗Frz-2抗体，作为对照。这些肽(斜体字母表示Frz-5和Frz-2序列，加入半胱氨酸用于产生和纯化抗体)和兔抗Frz-5、抗Frz-2抗血清产品都由AgriSera(瑞典Vannas；Umea动物伦理委员会批准，批准号A69-04)生产。在实验室中分别将不同的肽抗原与Sulfolink Sepharose耦合，将各自的抗血清洗脱下来，进行亲和力纯化。
免疫沉淀作用和Western blot测定 采用Western blot分析评估HB2和MDA-MB-468细胞中的Wnt-5a、EGF受体、Src和Frz-2及5的蛋白表达。结果表明这批MDA-MB-468细胞中的Wnt-5a表达水平低。如上所述，已经在实验室生产出Wnt-5a抗体(9，10)。将细胞裂解并在2×Laemmli缓冲液中煮沸。对每个样品的蛋白进行定量并调整，确保每个泳道内的上样量相等，然后加入50mM DTT，进行SDS凝胶电泳分离前先将细胞溶解产物煮沸10min。然后将蛋白转移到PVDF膜上。用3％牛血清白蛋白或5％的脱脂奶粉将膜封闭45min，一抗孵育1h(Wnt-5a为1∶2,000，活化EGF受体、总EGF受体、肌动蛋白、活化Src和总Src为1∶1,000，Frz-2和Frz-5为1∶5,000)，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1h。用增强化学发光试剂盒(瑞典Uppsala Amersham生物制剂公司)检测抗体抗原复合物。如果需要再标记，就用Chemicon国际公司(加利福尼亚州Temecula)的Reblot Strong溶液将膜剥离下来。
对前述方法稍作改动分析DDR1的磷酸化状态(12)，无血清培养16h后，用乙二胺四乙酸(Versene)将细胞消化下来，然后在37℃与胶原I黏附60(MDA-MB-468)或90min(HB2)。用溶解缓冲液(50mM Tris pH 7.4、1％Triton-X、5mM EDTA、5mM EGTA、50mM NaCl、10μg/ml抑肽酶、2.5mM苄脒、1mMpefabloc、1μg/ml亮肽素和1mM Na3VO4)溶解黏附和非黏附细胞终止实验。用抗DDR1兔多克隆抗体sc-532(加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz生物公司)按照1∶10,000稀释进行免疫印迹测定。抗体可以识别DDR1b/c，这一点非常重要，因为胶原只诱导乳腺上皮细胞中DDR1的b或c亚型发生磷酸化(10)。
黏附力分析 按照前述方法进行黏附力分析(12)。主要过程是细胞进行无血清培养16h，然后用乙二胺四乙酸消化为单细胞，在37℃与胶原I黏附60(MDA-MB-468)或90min(HB2)。用PBS洗去非黏附细胞。用(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑盐孵育黏附细胞，用内盐(MTS)(威斯康星麦迪逊Promega公司)进行染料还原法分析，用BMG实验室技术公司的Fluostar全自动定量绘图酶标仪(德国Offenberg公司)在490nm测定吸光率。每一步实验都扣除塑料培养皿中黏附的细胞数后，将六个孔的黏附力结果进行平均，得出一个结果。黏附力分析中作为对照的CM来源于Wnt-5a过表达的融合HB2细胞(实验时使用Wnt-5a反义HB2细胞)或采用Wnt-5a过表达载体稳定转染得到的Wnt-5a过表达MCF-7细胞(实验时使用MDA-MB-468细胞)。收集的CM通常在3天内使用。
CM的控制 为了控制CM的特异性，将其在37℃下与Wnt-5a或对照抗体一起孵育45min。然后加入10μl Protein A琼脂糖30min，采用离心法将Protein A结合的抗体收集完毕之后，剩余的上清用于实验。
细胞迁移分析 在改良Boyden小室中进行细胞迁移分析(厚度为10μm，孔径为8.0μm)，两个小室(
；马萨诸塞州剑桥Costar公司)之间用聚碳酸酯膜分开。和其它同类实验一样，将胶原I用0.25％的醋酸稀释为10μg/ml，加入上层小室在37℃将膜包被1h，然后用PBS漂洗三次。每一步实验开始时都首先用乙二胺四乙酸在37℃消化10-20min，将细胞消化下来进行洗涤，并在加入0.5％牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液中重悬浮成单细胞悬液。然后取0.2ml细胞悬液(含有25,000MDA-MB-468或50,000HB2细胞)与特定激动剂一起加入Transwell的上层小室。下层小室中加入0.6ml含有牛血清白蛋白和1ng/ml化学引诱物IGF-I的无血清DMEM培养液。每次单独的实验中都会去除一些培养孔中的IGF-I作为对照。允许细胞在37℃，湿化气体中含有95％空气和5％CO2的条件下在Boyden小室迁移18h。最后用棉签将膜上表面没有迁移的细胞去除，结束实验。用20％甲醇/80％水将甲紫稀释为0.5％后将穿过膜迁移到下表面的细胞染色20min。将膜清洗之后，在倒置显微镜下计算每个膜上和孔内的着色细胞数目。每个单独实验的结果代表三个独立培养孔的中位数。
萤光显微镜检查 用乙二胺四乙酸在37℃孵育10min，将MDA-MB-468细胞从组织培养皿上消化下来，洗涤，在含有0.5％牛血清白蛋白的无血清DMEM培养液中重悬浮成单细胞悬液，培养液中含有或不含肽175(100μM)，铺在细胞培养皿中的盖玻片上，盖玻片事先用10Dg/ml胶原I包被。18h后，用4％多聚甲醛在4℃将细胞固定10min，实验终止。然后将细胞在0.5％Trition X-100中孵育5min进行透明，在含有0.3％Triton X-100的3％牛血清白蛋白中孵育45min进行封闭。细胞染色在暗室进行，用含有1％牛血清白蛋白稀释度为1∶500的
488鬼笔毒环肽(phalloidin)(俄勒冈州Eugene Molecular Probes公司)将细胞孵育40min。然后充分洗涤细胞，最后用Dako Cytomation荧光封固剂进行封固。用Nikon Eclipse 800显微镜在60x油镜下观察标本并进行拍照。
药品配方 当作为药物时，此发明的化合物通常以药物组合物的形式给药。这些化合物具有多种给药方式，包括口服和直肠给药。这些化合物作为口服药物组合物很有效。这些药物组合物的生产方式采用的是常见的制药工艺，其中含有至少一种活性化合物。
本发明还包括药物组合物，包括文中提到的一种或多种作为活性成分的化合物与药物可接受载体结合使用。在生产本发明的组合物时，活性成分通常与一种赋形剂混合，用赋形剂稀释或作为载体封闭活性成分，包装形式可以是胶囊、囊剂、纸质或其它包装。赋形剂作为稀释剂时，可以是固体、半固体或液体原料，它们都可以作为活性成分的载体。因此，这些组合物可以具有多种形式，包括片剂、丸剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬液、乳剂、溶剂、糖浆剂、软或硬的明胶胶囊、栓剂和包装粉。
进行一种药品配方生产时，在与其它成分进行混合之前，可能需要将活性成分碾磨成合适大小的颗粒。如果活性化合物很难溶解，就将其碾磨成小于200目的颗粒。如果活性化合物易溶于水，只需通过碾磨使其可以在药物中均匀混合即可，如大约40目的颗粒。
合适的赋形剂包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。药品配方中还可以含有润滑剂，如滑石、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化和悬浮剂；防腐剂如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂和调味剂。采用一些熟知的制药工艺后，还可以将本发明中的组合物制备成不同的配方，使活性成分在进入人体后可以迅速释放、持续释放或缓慢释放。
组合物优选制备成单元剂型。“单元剂型”指的是适合为人类或其他哺乳动物制备单一剂型的物理上分离的单元，每个单元含有预先经过计算可以产生预期治疗效果的活性成分含量，还包括适量的药物赋形剂。优选的，上述配方(1)中的化合物含量不超过药物组合物质量的20％，更优选不超过15％，其它部分由没有药物活性的惰性载体补充。
活性化合物在各种剂型内都有效，通常使用量以达到药效为准。例如，当口服给药时，每种剂型中活性成分的含量范围是1mg至1000mg左右，优选为2mg至500mg左右，更优选为5mg至100mg左右，更加优选的是5mg至60mg左右。但是，应当认识到实际服用的剂量是由医生决定的，参考有关环境，包括治疗条件、选择的用药途径、服用的实际化合物及其相对活性、患者个体的年龄、体重和对药物的响以及患者的症状的严重程度及类似的其他因素。原则上来说，药物应当与食物一起服用，然后再服用一定的剂量，确保能充分抑制脂类。但是从营养的角度出发，机体需要摄入一定量的脂类，这势必会影响体内药物的吸收。本发明的化合物在小肠内开始发挥药效，因此不会产生其他的作用，但是不排除化合物的代谢产物可能产生的作用。
制备固体组合物如片剂时，要将主要的活性成分与药物赋形剂混合在一起形成固体预配方组合物，其含有本发明化合物的均质混合物。当提到这些预配方组合物是均质的时，意味着活性成分均匀分散在组合物中，从而组合物可以很容易地被再分为效能相同的单元剂型如片剂、丸剂和胶囊。然后将这种固体预配方组合物再分为上述形式的单元剂型，内含本发明的活性成分。
可以将本发明的片剂、丸剂或粒剂进行包膜，或者以其他形式混合，制成可以延长药物作用时间的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含一个内剂量和一个外剂量成分，后者作为前者的外膜。两种成分之间可以用肠衣隔开，用于抵抗在胃中产生的分解，这样内部成分就可以完整的进入十二指肠或缓慢释放。许多材料都可以作为这种肠衣或外膜，这些材料包括大量聚合酸和聚合酸与诸如虫胶、十六醇和醋酸纤维素之类形成的混合物。
可以用缓释膜作为本发明的片剂、丸剂或粒剂的外膜，以便在胰腺进行释放，在那里胰腺脂肪酶释放到肠里。这种缓释膜可以减少活性成分在胃中的损失，而在小肠上部完全释放。
例如，可以用压制或塑型的方法制备片剂。可以在合适的机器上将本发明松散类型的组合物如粉末或颗粒压制成片剂，可选择与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂或分散剂进行混合。可以在合适的机器上将用惰性液态稀释剂湿润的粉状化合物的混合物用模具制成模印片剂。
在优选的实施方案中，至少一种药物可接受的赋形剂是粘合剂、充填剂或它们的混合物。合适的赋形剂包括润滑剂、崩解剂和它们的混合物。优选的赋形剂包括但不限于乳糖、交联羧甲纤维素、微晶纤维素、预凝胶化的淀粉和硬脂酸镁。
适合于制备本发明的药物组合物剂型配方的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其它淀粉、明胶、天然或合成树脂例如阿拉伯胶、褐藻酸钠、褐藻酸、其它褐藻酸盐、黄芪胶粉、瓜尔胶(guar gum)、纤维素及其衍生物(如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预凝胶化淀粉、羟丙基甲基纤维素(如2208、2906、2910)、微晶纤维素以及它们的混合物。
合适的微晶纤维素类型包括如出售的AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103和AVICEL-PH-105(由宾夕法尼亚州Marcus Hook镇FMC公司美国Viscose分部提供)材料。特别合适的粘合剂是微晶纤维素和如FMC公司出售的AVICEL RC-581羧甲基纤维素钠形成的混合物。
适合与本发明化合物制备的剂型一起使用的充填剂包括但不限于滑石粉、碳酸钙(如粒剂或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露醇、水杨酸、山梨糖醇、淀粉、预凝胶化的淀粉以及它们的混合物。
一般来说，本发明的固体剂型总质量的约50-99％都是粘合剂和/或充填剂。
崩解剂的作用是当片剂暴露于液体环境中时使之分解。崩解剂过多将会使瓶中的药片发生分解，因为空气中含有水分；崩解剂过少有可能无法使药片充分分解，从而导致本发明的化合物的释放速率和程度发生改变。因此，制备本发明的固体剂型应当使用合适剂量的崩解剂，既不能多，也不能少，以免影响药物的释放。崩解剂的使用量取决于制剂的类型和给药的方式，这对于本领域熟练技术人员是很容易辨别的。一般来说，崩解剂占药物组合物总质量的约0.5％至15％，优选约1％至5％。
适合于生产固体剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、褐藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉羟乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其它淀粉、预凝胶化的淀粉、粘土、其它藻胶、其它纤维素、树胶以及它们的混合物。
适合与固体剂型一起使用的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其它乙二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油、(如花生油、棉子油、葵花子油、麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。其它润滑剂还包括如硅酸盐硅胶(AEROSIL 200，由马里兰州巴尔地摩W.R.Grace公司生产)、合成二氧化硅的凝结气溶胶(销售商德克萨斯州Plano Degussa公司)、CAB-O-SIL(由麻塞诸塞州波士顿Cabot公司销售的一种高热所产生的二氧化硅产品)以及它们的混合物。润滑剂可选择性的添加，通常润滑剂的量要小于药物组合物总质量的1％。
优选的，每种固体剂型含有约5mg至3000mg本发明的化合物。优选的，每种固体剂型含有约5mg、约25mg、约100mg、约200mg、约250mg或约500mg本发明的化合物。适于口服给药的固体剂型优选含有约5mg至约200mg本发明的化合物。
用本发明具有新颖性的组合物生产的可用于口服的液体剂型包括水制溶液、合适的果味糖浆、药水、含有食用油如玉米油、棉籽油、麻油、椰子油或花生油的果味乳剂、还有酏剂及其他相似的药物载体。
而且，包含一种或多种本发明化合物的药物组合物还可以与其它合适的药物联合给药，如治疗胃肠道疾病的药物。当需要联合用药治疗时，包含本发明化合物的药物组合物和第二种药物可以同时给药、先后给药或分别给药。要确保联合治疗所使用的每种成分的药量都足以能达到预期的治疗目的。例如，第二种药物要使用能使体内症状减轻足够的药量。
优选的，每一剂量中含有约1mg至约1000mg的本发明化合物，更优选含有约2mg至约500mg的本发明化合物，更为优选的是含有约5mg至约100mg的本发明化合物，进一步优选的是含有约5mg至约60mg的本发明化合物。同样，使用的药物剂量取决于患者(年龄、体重等)和疾病的严重程度(轻度、中度、重度)。最后，也可以制备含有两种活性成分的药物组合物以同时给药。
当消化引起体内分泌脂肪酶一辅脂肪酶，而且十二指肠下部对它们具有良好抑制作用时，这些药物可以和食物一起服用。
实施例 下述制剂和实施例可以使本领域熟练的技术人员更清楚的理解和实施本发明。这些实施例不应该被认为是对本发明保护范围的限制，它们仅起到解释说明和代表性的作用。
配方实施例 实施例1 制备含有下述成分的明胶硬胶囊 质量 成分(mg/粒) 活性成分30.0 淀粉305.0 硬脂酸镁5.0 上述成分以340mg的量混合并填充于明胶硬胶囊中。
实施例2 制备含有下述成分的片剂 质量 成分(mg/片) 活性成分25.0 纤维素，微晶的 200.0 二氧化硅胶体10.0 硬脂酸 5.0 这些成分混合并被压制成片，每片质量为240mg。
实施例3 片剂，每片含有30mg活性成分，制备方法如下 质量 成分(mg/片) 活性成分30.0mg 淀粉45.0mg 微晶纤维素 35.0mg 聚乙烯吡咯烷酮 4.0mg (用无菌水配制成 10％浓度) 羧甲基淀粉钠4.5mg 硬脂酸镁0.5mg 滑石1.0mg 总计120.0mg 将活性成分、淀粉和纤维素通过美国产20目滤网并充分混合。然后将混合粉末与聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)溶液混合，用美国产16目滤网进行过滤。将产生的粒料在50℃至60℃条件下烘干后通过美国产16目滤网。然后将事先用美国产30目滤网过滤后的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石加入粒料中，混匀后在压片机上压制成每片120mg的片剂。
实施例4 胶囊，每粒含有40mg药剂，制备方法如下 质量 成分(mg/粒) 活性成分40.0mg 淀粉109.0mg 硬脂酸镁1.0mg 总计150.0mg 将活性成分、淀粉和硬脂酸镁混匀并通过美国产20目滤网进行过滤，以150mg的量填充于明胶硬胶囊中 实施例5 栓剂，每剂含25mg活性成分 成分量 活性成分25mg 饱和脂肪酸甘油酯加至2000mg 将活性成分通过美国产60目滤网进行过滤并悬浮于饱和脂肪酸甘油酯中，饱和脂肪酸甘油酯事先在最低所需温度下进行熔化。然后将混合物倒入标称为2.0g容量的制栓剂用模型中并冷却。
实施例6 混悬液，每5.0ml剂量含有50mg药剂，制备方法如下 成分量 活性成分50.0mg 黄原胶 4.0mg 羧甲基纤维素钠(11％) 微晶纤维素(89％)50.0mg 蔗糖1.75g 苯甲酸钠10.0mg 香料和颜料 适量 纯净水加至 5.0ml 将活性成分、蔗糖和黄原胶混匀并通过美国产10目滤网进行过滤，然后与事先制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠水溶液混合。边搅拌边加入用适量水稀释的苯甲酸钠、香料和颜料。最后加水至需要量。
实施例7 药品配方还可以按下述方法制备 质量 成分(mg/粒) 活性成分15.0mg 淀粉407.0mg 硬脂酸镁3.0mg 总计425.0mg 活性成分、淀粉和硬脂酸镁混匀并通过美国产20目滤网进行过滤，以425.0mg的量填充于明胶硬胶囊中。
其它适合本发明使用的配方可以参照Remington′s Pharmaceutical Sciences，主编是E.W.Martin(Mack出版公司于1990出版，第18次修订版)。
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序列表
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<130>P17156PC00
<140>PCT/SE2006/000638
<141>2006-05-30
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<151>2005-05-30
<160>15
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>PRT
<213>Human
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Leu
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<213>Human
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1 5 10
<210>11
<211>10
<212>PRT
<213>Human
<400>11
Thr Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5 10
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Human
<400>12
Ser Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210>13
<211>8
<212>PRT
<213>Human
<400>13
Glu Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210>14
<211>7
<212>PRT
<213>Human
<400>14
Gly Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 5
<210>15
<211>6
<212>PRT
<213>Human
<400>15
Met Asp Gly Cys Glu Leu
1 权利要求
1.一种或多种氨基酸，由下述序列编码
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.1
GTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.2
TQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.3
QGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.4
GRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.5
RLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.6
LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7
CNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.8
NKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.9
KTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.10
TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11
SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12
EGMDGCEL SEQ.ID.NO.13
GMDGCELSEQ.ID.NO.14
MDGCEL SEQ.ID.NO.15
或其甲酰基化衍生物。
2.如权利要求1的一种或多种氨基酸，包括
NKTSEGMDGCEL
KTSEGMDGCEL
TSEGMDGCEL
SEGMDGCEL
EGMDGCEL
GMDGCEL
MDGCEL
或其甲酰基化衍生物。
3.一种或多种氨基酸在制备用于通过抑制癌细胞运动来治疗癌症的药物组合物中的应用，其中，氨基酸按下述序列编码
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL
TQGRLCNKTSEGMDGCEL
QGRLCNKTSEGMDGCEL
GRLCNKTSEGMDGCEL
RLCNKTSEGMDGCEL
LCNKTSEGMDGCEL
CNKTSEGMDGCEL
NKTSEGMDGCEL
KTSEGMDGCEL
TSEGMDGCEL
SEGMDGCEL
EGMDGCEL
GMDGCEL
MDGCEL
或其甲酰基化衍生物。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述氨基酸选自下面的组中
NKTSEGMDGCEL
KTSEGMDGCEL
TSEGMDGCEL
SEGMDGCEL
EGMDGCEL
GMDGCEL
MDGCEL
或其甲酰基化衍生物。
5.含有一治疗活性量的一种或多种抑制癌细胞运动的肽的药物组合物，其中，
肽序列选自由下列序列组成的组中
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.1
GTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.2
TQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.3
QGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.4
GRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.5
RLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.6
LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7
CNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.8
NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9
KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10
TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11
SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12
EGMDGCELSEQ.ID.NO.13
GMDGCEL SEQ.ID.NO.14
MDGCEL SEQ.ID.NO.15
或其甲酰基化衍生物，可选择与惰性载体或赋形剂结合使用。
6.如权利要求6的药物组合物，其中，活性肽选自由下列序列组成的组中
NKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.9
KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10
TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11
SEGMDGCEL SEQ.ID.NO.12
EGMDGCELSEQ.ID.NO.13
GMDGCEL SEQ.ID.NO.14
MDGCEL SEQ.ID.NO.15
或其甲酰基化衍生物。
7.如权利要求6的药物组合物，其中，活性肽是
MDGCELSEQ.ID.NO.15
或其甲酰基化衍生物。
8.一种通过给药一治疗有效量的一种或多种肽以抑制人体中，尤其是患乳腺癌的人体中癌细胞的运动的方法，其中，所述的肽序列选自由下列序列组成的组中
LGTQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.1
GTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.2
TQGRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.3
QGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.4
GRLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.5
RLCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.6
LCNKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.7
CNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO.8
NKTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.9
KTSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.10
TSEGMDGCEL SEQ.ID.NO.11
SEGMDGCELSEQ.ID.NO.12
EGMDGCEL SEQ.ID.NO.13
GMDGCEL SEQ.ID.NO.14
MDGCEL SEQ.ID.NO.15
或其甲酰基化衍生物。
全文摘要
乳腺癌患者的Wnt-5a蛋白失表达与无复发生存率缩短和乳腺细胞系的运动性增加有关。基于Wnt-5a肽的序列分析结果鉴定出13个肽片断，并对它们模拟Wnt-5a蛋白对乳腺细胞黏附力和活力影响的能力进行研究。其中的两种片断可以明显增加非致瘤性乳腺癌细胞系的黏附力并抑制它们的运动性，二者的Wnt-5a蛋白都表现为低表达。为了鉴定仍具有抗运动性的最短肽片段，我们依次删除了其中较短肽片断中N-末端的两个氨基酸。结果表明肽片断对肿瘤细胞黏附力的影响逐渐减弱，当只剩下6个氨基酸残基时，这种作用彻底消失。但是，这个六肽N-末端甲硫氨酸的甲酰化作用恢复了其对肿瘤细胞黏附力的影响和对肿瘤细胞运动性的抑制作用。这个新的甲酰-蛋氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸肽配体可以作为首先药物，它们对＜＜50％的内源性Wnt-5a降低的乳腺癌患者的肿瘤迁移有治疗作用。
文档编号C07K14/475GK101189258SQ200680019197
公开日2008年5月28日 申请日期2006年5月30日 优先权日2005年5月30日
发明者汤米·安德森 申请人:南方佛斯卡专利公司