HGFβ链变体的制作方法

文档序号:3557770阅读:368来源:国知局

专利名称::HGFβ链变体的制作方法
技术领域
:本发明总体上涉及分子生物学和生长因子调节领域。更特别地,本发明涉及HGF/c-met信号途径的调节剂,和所述调节剂的用途。背景肝细胞生长因子(HGF),也称为散播因子(scatterfactor,SF),是Met(Bottaroetal.,1991)的配体,Met是由c-m"原癌基因(Cooperetal.,1984a&b)编码的受体酪氨酸激酶。结合Met的HGF诱导胞内激酶结构域的磷酸化,胞内激酶结构域的磷酸化引起复杂的胞内途径复合物系列(set)的活化,其引发许多细胞类型中的细胞生长、分化和迁移;几篇最近发表的综述提供了全面的概述(Birchmeieretal.,2003;TrusolinoandComoglio,2002;Mauliketal.,2002)。除了其在胚胎发育和组织再生中固有的重要性,HGF/Met信号途径也已涉及侵袭性肿瘤生长和转移中并因而代表感兴趣的治疗学輩巴标(Birchmeieretal.,2003;trusolinoandComoglio,2002;Danilkovitch陽MiagkovaandZbar,2002;Maetal"2003)。HGF属于纤溶酶原相关生长因子家族,包括含有N-末端指状结构域(N)和四个Kringle(Kl-K4)结构域的69kDaa-链,和与来自ClanPA(S)/FamilySl的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的蛋白酶结构域(Nakamuraetal.,1989;Donateetal"1994;Rawlingsetal"2002)具有高度相似性的34kDaP-链。像纤溶酶原和其它丝氨酸蛋白酶酶原一样,HGF以单链前体形式(scHGF)分泌。scHGF结合细胞表面上或胞外基质中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,如syndecan-l(Derkseneta1.,2002)。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合N结构域(Hartmannetal.,1998),其也对高亲和力Met结合位于Kl中的氨基酸有促进作用(Lokkeretal.,199勺。虽然scHGF能够以高亲和力结合Met,但是它不能激活受体(Lokkeretal.,1992;Hartmannetal.,1992)。HGF信号活性的获得依scHGF在Arg494-Va1495的蛋白水解裂解(活化)而定,所述蛋白水解裂解引起成熟HGF即二硫4定连接的ot/p异二聚体的形成(Lokkeretal.,1992;Hartmannetal.,1992;Naldinietal.,1992)。HGF的蛋白酶样结构域(HGFp陽链)缺乏催化活性,因为它缺少发现于所有丝氨酸蛋白酶中的所需的Asp[cl02]-His[c57]-Ser[c195](在整个括号中的标准糜蛋白酶原编号)催化三联体(peronaandCraik,1995;Hedstrom,2002),具有Gln534[c57]和Tyr673[cl95]。由于其在调节HGF活性中的重要性,该方法必须由HGF转化酶及其相应的生理学抑制剂所严格控制。scHGF活化由包括肝细胞生长因子活化剂(HGFA)(Miyazawaetal.,1993)、基质蛋白酶(matriptase)/MT陽SPl(Takeuchietal.1999;Linetal.,1999)、尿激酶型纤溶酶原激活物(Naldinietal.,1992)、因子XIIa(Shimomuraetal.,1995)、因子XIa(Peeketal.,2002)和血浆激肽释放酶(plasmakallikrein)(Peeketal.,2002)的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在体外介导。类似于scHGF,这些蛋白酶作为无活性的前体产生;它们的酶学活性也由其它的激活性蛋白酶以及Kunitz-和丝酶抑制蛋白(serpin)-型抑制剂所严格调节。已经描述了丝氨酸蛋白酶和它们的激活过程(Donateetal.,1994)。在丝氨酸蛋白酶中,酶原的活化裂解影响所谓的'活化结构域'的构象重排,产生正确的活性部位和底物/抑制剂相互作用区域。所述活化结构域构成命名为[cl40]-、[cl80]-和[c220]-环的三个表面暴露的环,并且新形成的N-末端插入到疏水嚢中(HuberandBode,1978)。在同源配体/受体对巨噬细胞刺激蛋白(MSP)/Ron中,丝氨酸蛋白酶样MSPp-链提供受体结合的主要能量(Wangetal"1997;MillerandLeonard,1998)。这自HGF/Met系统中逆转,在该系统中Met残基的高亲和力受体结合部位位于HGFa-链中(Lokkeretal.,1994;Okigakietal.,1992)。在正常细胞机能中和临床紊乱的病源学中,HGF/Met信号轴的重要性表明需要开发基于调节该信号轴的高效治疗学手段。然而,特别是考虑到对HGF-HGF和HGF/Met相互作用的机理了解较少,该途径的复杂性已经延緩了这方面的进展,并且使开发一些手段的需求更为突出,这些手段基于对HGF-HGF和HGF/Met相互作用的作用机制的更深了解。下文公开的本发明满足了该需求并提供其它益处。本文引用的所有文献,包括专利申请和出版物均整体加入作为参考。
发明内容肝细胞生长因子(HGF)、纤溶酶原相关生长因子结合于其受体酪氨酸激酶Met(本文也称为C-Met、c-Met或c-met),其参与发育、组织再生和侵袭性肿瘤生长。丝氨酸蛋白酶样HGFp-链自身结合Met。除了结合Met,还不清楚HGFP链中的哪些区域和具体残基是影响通过HGF/Met途径的适当信号转导所必需的。我们预测p链内的特定区域/位点对适当的HGF功能活性作出重要贡献,其中这些贡献可能涉及或者可能不涉及HGF卩链与其关联受体的结合。本文描述的结果表明HGFf3链N端区域和/或二聚化区域中的突变能够破坏HGF/Met生物学功能,基本上削弱或基本上不削弱HGF(尤其是HGF(3链)与C-Met的结合。通常但不是必然地,这些突变不涉及野生型HGF的被认为包括'活化结构域,或'活性部位区域,的位点。本文描述的突变分析提供了设计许多HGF突变的基础,所述HGF突变能够抑制涉及一系列功效的野生型HGF/HGF和HGF/c-met相互作用。本文描述了这些突变的例子。这些突变能够与野生型HGF竟争与c-met的结合,然而显示影响c-met相关生物学功能的能力降低。HGF/c-met轴的完全或实质性抑制不是所希望的情形是特别有益的;这是特别要关注的,因为HGF和c-met在正常细胞和组织中的表达无所不在。这些突变体也能够用作治疗病理学病症的有益的治疗剂,其中所述病症中减弱的但非完全缺失的HGF/c-met生物学活性是需要的。本发明的方法和组合物至少部分地基于这些发现,以下更详细i也描述所述方法和组合物。一个方面,本发明提供包含HGF突变体的HGF/C-Met拮抗剂分子,所述HGF突变体在HGFP链N端区域和/或HGFP链二聚化区域包含突变。HGF(3链N端区域中的突变可以是削弱HGF(3链N-末端插入到HGF结合嚢(pocket)中的任何突变。在一个实施方案中,所得HGF卩链突变体以相对于野生型HGF(3链而言减弱的结合亲和力结合C-Met。在一个实施方案中,所得HGF(3链突变体以基本上与野生型HGFp链相当的亲和力结合C-Met。在一个实施方案中,所得包含突变的HGFP链的全长HGF以相对于全长野生型HGF而言减弱的结合亲和力结合C-Met。在一个实施方案中,所得包含突变的HGF卩链的全长HGF以与全长野生型HGF基本上相当的亲和力结合C-Met。在一个实施方案中,突变在Pl,位置内或者靠近Pl,位置(即,495[cl6]),其中所述突变产生可裂解的HGF突变体,并且其中所述HGF(3链的N-末端未插入到活性部位/结合嚢中。不能插入到活性部位/结合嚢中的例子包括但不限于这样的构型,其中所述突变体在(i)疏水性相互作用、和(ii)涉及N-末端与Asp672[c]194的盐桥形成中任一方面或同时两方面有缺陷,例如,N-末端带有突变的情况,例如,带有正电荷的取代氨基酸残基或带有插入的氨基酸残基。在一个实施方案中,经由该突变体的信号减弱。在一个实施方案中,突变处于位点P1'、P2'、P3'和P4'中一HGF(3链二聚化结构域中的突变可以是预期将减弱两个HGFp链之间的接触以减弱两个链(因此为两个HGF分子)的二聚化的任何突变。从HGF复合体的氨基酸结构来看这些突变将是明显的,例如Kirchhoferetal.,JBiolChem.(2004),279(38):39915-24中所描述的。相关氨基酸位点包括但不限于本文所描述的那些。在一个实施方案中,所得HGF突变体具有减弱的与另一条HGFP链二聚化的能力。在一个实施方案中,HGF(3链二聚化区域中的突变基本上不减弱所得HGF突变体与C-Met的结合。二聚化结构域指与另一条HGF卩链相互作用形成二聚体的HGFP链的区域(例如,在HGF/Met活化复合体中)。当proHGF裂解时,HGFP链经历构象变化。HGFp链N-末端残基495与残基Asp672形成盐桥。在一些实施方案中,HGF|3的二聚化区域包括相应于自HGF(3的大约495至502位残基、包括Y619、T620、G621的[cl40环]氨基酸、包括662至665位的[cl80]环氨基酸、或其混合中的至少一个氨基酸残基(直至所有氨基酸残基),或者基本上由其组成,或者由其组成。在一个实施方案中,所述二聚化结构域包括位于靠近/接近以上列出的一个或多个位点的位置,因此预测将影响所述的一个或多个位点。例如,在该实施方案中,所述二聚化结构域可以进一步包括位点622和626。一个方面,本发明的HGF/Met拮抗剂分子在HGFP链N端区域(Nterminalregion)包含突变,其中所述突变处于位点V495、G498、R502加T503、和/或D672。突变可以是改变HGF卩链N端区域的一级、二级和/或三级结构的任何形式的突变。例如,在一个实施方案中,HGF(3链N端区域中的突变是取代、插入和/或删除,如V495G、V495A、G498I、G498P、G498V、R502de加T503del、或D672N。在另一个实施方案中,HGF(3链N端区域中的突变是V495的删除。改变HGF(3链N端区域的一级、二级和/或三级结构的突变也可能处于不在HGF(3链N端区域本身中的氨基酸位点。例如,消除与HGF卩链N末端形成盐桥的D672的突变(例如,D672N)也将预期改变HGFP链N端区域的一级、二级和/或三级结构。因此,HGF(3链N端区域和HGFp链二聚化区域的突变并不必然互相排斥。例如,如本文所述,以及图l所例举的,预期特定位点的突变将同时影响HGF(3链的N端和二聚化结构域。一个方面,本发明的HGF/Met拮抗剂分子在HGFp链二聚化结构域包含突变,其中所述突变处于位点N497、G498、P500、在或靠近T501和R502、或R502的位置。突变可以是改变HGF(3链二聚化区域的一级、二级和/或三级结构的任何形式的突变。将改变HGF(3链二聚化区域的结构的突变的例子包括向野生型序列中引入带电的或具有大型侧链(例如,体积大的)的残基的突变,由此带电的残基可能引起排斥作用而大型侧链可能引起不利的空间相互作用。此外,也可以引入半胱氨酸突变(例如,L622C、I664C、P500C、和N497C),其可用于被特定的硫醇烷基化试剂如包含马来酰亚胺和卤代乙酰(haloacetyl)基团的那些试剂所修饰。在一个实施方案中,HGF卩链二聚化区域中的突变是取代、插入和/或删除,如N497R或K;G498A或S;P500W、H或E;T501和R502之间的插入(例如,插入R和/或S);或R502del。在一个实施方案中,位点N497的突变不是N497F、A或E。在一个实施方案中,突变处于位点495至503中的一个或多个位置,其中这样的突变可能改变HGF(3链二聚化和/或与受体的结合。在另一个实施方案中,影响二聚化结构域的突变可以与二聚化结构域外的一个或多个位点中的突变组合,例如,位于或靠近494-495裂解部位的突变。例如,在预期不能裂解的(例如R494E:V495G双突变体)并且同时在二聚化结构域中包含突变的突变体中,其仍将显示减弱的生物学功能,即使这样的突变体确实在体内被裂解。在本发明的HGF/Met拮抗剂分子的一些实施方案中,所述分子在位点534、578、619、673、692、693、694、695、696、699、和/或702包含野生型氨基酸。在本发明的HGF/Met拮抗剂的一些实施方案中,所述拮抗剂在位点1^622处包含突变(例如,LM2C或K);在W"处包含突变(例如,I623C);在D626处包含突变(例如,D626K);在L622加D626处包含突变(例如,L622K加D626K);在K663处包含突变(例如,K663C);在1664处包含突变(例如,I664C);在R502处包含突变(例如,502C);在P500处包含突变(例如,PWOC);在NM处包含突变(例如,N497C);在II494加1623处包含突变(例如,R494E加I623C);在N497加G498处包含突变(例如,N497R加G498A、或N497K加G498A);在N497加P500处包含突变(例如,N497R加P500H、或N497K加P500H);在G498力。P500处包含突变(例如,G498A加P500H);在N497加G498加P500处包含突变(例如,N497R加G498A加P500H、或N497K加G498A加P500H);在N497加L622处包含突变(例如,N497R加L622K、或N497K加L622K);在N497加D626处包含突变(例如N497R加D626K、或N497K加D626K);在N497加L622力。D626处包含突变(例如,N497R加L622K加D626K、或N497K加L622K加D626K)。在一个实施方案中,本发明的HGF/Met拮抗剂分子〗叉在HGF活性部位包含突变或者同时包含本文所述的一个或多个突变。所述活性部位的突变包括位点667和/或704的突变。合适的突变包括由C或W取代这两个位点的其中一个或同时取代两个。通常,本发明的HGF/Met拮抗剂分子包括在HGF(3链中具有突变的HGF分子,所述突变减弱正常情况下与野生型HGF有关的一种或多种生物学特性。例如,在一个实施方案中,相对于野生型HGF,所述分子具有减弱的C-Met信号转导能力(例如,Met磷酸化)。在另一个实施方案中,相对于野生型HGF,所述分子具有减弱的刺激细胞迁移的能力。在另一个实施方案中,相对于野生型HGF,所述分子具有减弱的刺激细胞增殖的能力。在另一个实施方案中,相对于野生型HGF,所述分子具有减弱的刺激血管发生(angiogenesis)的能力。本发明的HGF/Met拮抗剂分子通常至少包括HGFa链的一部分,该部分涉及与Met的结合,连接到本文所述的突变的HGF(3链。如本文所描述的突变分析所示,HGFP链中的特定区域和其中的特定氨基酸位点在调节HGF生物学功能中扮演重要角色。相应地,一个方面,本发明也提供特异性地靶向这些区域的HGF/Met调节剂。这样的调节剂包括核酸如适体(aptamer)、和多肽如结合肽和抗体。如此处所用的,数字前的字母表示野生型人HGF多肽中在所述数字指示的氨基酸位点发现的相应的野生型氨基酸,所述数字后的字母(如果存在的话)表示突变型/氨基酸(例如,氨基酸取代、删除(dd)或插入(ins))。一个方面,本发明提供具有HGF/c-met调节活性的HGF突变体,例如HGF/c-met活性的拮抗剂或者显示减小的但非缺失的HGF生物学活性(例如,细胞生长刺激活性)的HGF变体。在一个实施方案中,本发明的拮抗剂能够在体内或体外抑制野生型HGF的生物学活性(这种生物学活性包括但不限于受体磷酸化、刺激细胞增殖、促进细胞存活、促进血管发生、诱导/促进细胞迁移)。在一个实施方案中,HGF突变体提供减弱的细胞生长促进活性(例如,细胞增殖、细胞存活、血管发生、细胞迁移)。在一个实施方案中,本发明的拮抗剂分子与野生型HGF竟争与Met的结合。在一些实施方案中,所述分子抑制c-met受体多聚化(例如,二聚化)。在一些实施方案中,所述分子包括变异的(突变的)P链,所述变异的(突变的)P链具有减弱的与另一条(3链分子相互作用(例如,多聚化/二聚化)的能力。在一些实施方案中,所述分子抑制HGFP链多聚化(例如,二聚化)。在一些实施方案中,所述分子结合c-met但显示减弱的c-met活化的能力(例如,由减弱的c-met磷酸化、减弱的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化、和/或减弱的HGF/c-met依赖的细胞迁移、细胞增殖、细胞存活、细胞形态发生、血管发生等表示。)在相对于野生型的相应序列而言一个或多个位点发生突变的本发明的任何分子中,所述突变可以为改变相应野生型残基的功能效果的任何形式。可以以本领域已知的(和/或根据经验确定的)任何合适的方式获得突变,例如通过取代、插入、添加和/或删除。在一些实施方案中,突变包括非-保守用氨基酸如丙氨酸和丝氨酸取代。一个方面,分子/物质(例如,HGF/c-met调节剂,如本文所述的)连接到毒素如细胞毒剂。这些分子/物质可以与添加剂/增强剂如放射剂(radiationagent)和/或化疗剂一起配制或施用。本发明还提供用于调节疾病状况的方法和组合物,所迷疾病状况与HGF/c-met信号轴的调节障碍有关。因此,一个方面,本发明提供调节患者c-met活化的方法,所述方法包括为所述患者施用本发明的HGF/c-met拮抗剂分子,由此c-met活化被调节。在一个实施方案中,所述分子是抑制HGF/c-met活性的HGF/c-met拮抗剂。在一个实施方案中,所述拮抗剂抑制野生型HGFP与c-met的特异性结合。一个方面,本发明提供治疗患者与c-met活化相关的病理学状况的方法,所述方法包括为所述患者施用本发明的c-met拮#元剂,由此c-met活4匕^皮举p制。HGF/c-met信号途径涉及多种生物学和生理机能,包括例如细胞生长刺激(例如细胞增殖、细胞存活、细胞迁移、细胞形态发生)和血管发生。因此,另一方面,本发明提供抑制c-met激活的细胞生长(例如增殖和/或存活)的方法,所述方法包括将细胞或组织与本发明的拮抗剂接触,由此与c-met活化有关的细胞增殖被抑制。又一方面,本发明提供抑制血管发生的方法,所述方法包括为患与异常血管发生有关的病症的细胞、组织、和/或患者施用本发明的HGF/Met拮抗剂,由此血管发生^皮抑制。一个方面,本发明提供本发明的拮抗剂在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肺瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。所述拮抗剂可以是本文所述的任何形式,包括抗体、抗体片段、多肽(例如,寡肽、HGF多肽突变体/变异体)、核酸(适体)、或其组合。一个方面,本发明提供本发明的核酸在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肿瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。一个方面,本发明提供本发明的表达载体在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肿瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。一个方面,本发明提供本发明的宿主细胞在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肿瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。一个方面,本发明提供本发明的制品在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肿瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。一个方面,本发明提供本发明的试剂盒(kit)在制备药物中的用途,所述药物用于疾病如癌症、肿瘤、细胞增殖紊乱、免疫(如自身免疫性)紊乱和/或血管发生相关紊乱的治疗性和/或预防性治疗。一个方面,本发明提供抑制c-met激活的细胞增殖的方法,所述方法包括将细胞或组织与有效量的本发明的拮抗剂接触,由此与c-met活化有关的细胞增殖被抑制。一个方面,本发明提供治疗患者与c-met活化的调节障碍相关的病理学状况的方法,所述方法包括为所述患者施用有效量的本发明的拮抗剂,由此所述症状^皮治疗。一个方面,本发明提供抑制表达c-met或肝细胞生长因子的细胞生长的方法,或者同时,所述方法包括将所述细胞与本发明的c-met拮抗剂接触,由此引发所述细胞的生长抑制。在一个实施方案中,用由不同细胞表达的HGF(例如,通过旁分泌效应)4矣触所述细胞。一个方面,本发明提供治疗学上治疗患有癌性肿瘤的哺乳动物的方法,所述癌性肿瘤包括表达c-met和/或肝细胞生长因子的细胞,所述方法包括为所述哺乳动物施用有效量的本发明的拮抗剂,由此有效地治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中,用由不同细胞表达的HGF(例如,通过旁分泌效应)接触所述细胞。一个方面,本发明提供治疗或预防与增强的c-met和/或肝细胞生长因子表达或活性有关的细胞增殖性紊乱的方法,所述方法包括为需要这种治疗的患者施用有效量的本发明的拮抗剂,由此有效地治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中,所述增殖性紊乱是癌症。一个方面,本发明提供抑制细胞生长的方法,其中所述细胞生长至少部分地依赖于c-met和/或肝细胞生长因子的生长促进效应,所述方法包括将所述细胞与有效量的本发明的拮抗剂接触,由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中,用由不同细胞表达的HGF(例如,通过旁分泌效应)接触所述细月包。一个方面,本发明提供治疗学上治疗哺乳动物肿瘤的方法,其中所述肿瘤的生长至少部分地依赖于c-met和/或肝细胞生长因子的生长强化效应,所述方法包括将所述细胞与有效量的本发明的拮抗剂接触,由此有效地治疗所述肿瘤。在一个实施方案中,用由不同细胞表达的HGF(例如,通过旁分泌效应)4妾触所述细月包。本发明的方法可用于影响任何合适的病理状态,例如与HGF/c-met信号途径的调节障碍有关的细胞和/或组织。一个实施方案中,在本发明的方法中作为靶标的细胞是癌细胞。例如,癌细胞可以是选自下组的一种乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(例如,曱状腺的)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、头颈鳞状癌细胞、黑素瘤细胞、多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma)细胞、和白血病细胞。一个实施方案中,在本发明的方法中作为靶标的细胞是过度增殖和/或增生的细胞。一个实施方案中,在本发明的方法中作为靶标的细胞是发育不良的细胞。在又一实施方案中,在本发明的方法中作为靶标的细胞是转移性细胞。本发明的方法可以进一步包括附加的治疗步骤。例如,在一个实施方案中,所述方法进一步包括其中将靶细胞和/或组织(例如,癌细胞)暴露于放射治疗或化疗剂的步骤。在一个实施方案中,本发明的HGF/Met拮抗剂分子与一种或多种其它治疗剂例如erlotinib(TARCEVA⑧)、pemetrexed(ALIMTA⑧)、bevacizumab(AVASTIN⑧)、gefitinib(IRESSA⑧)、trastuzumab(HERCEPTIN⑧)、和rituximab(RITUXAN⑧)一起施用于患者。组合(联合)治疗中治疗剂的施用可以同时或顺序进行。如本文所述,c-met活化是重要的生物学过程,其中的调节障碍引发许多病理学状况。相应地,在本发明方法的一个实施方案中,作为靶标的细胞(例如,癌细胞)是与相同组织起源的正常细胞相比c-met的活化增强的细胞。在一个实施方案中,本发明的方法引发靶细胞的死亡。例如,与本发明的拮抗剂接触可能导致细胞通过c-met途径传输信号的无能,这引发细胞死亡。c-met活化(以及由此发生的信号传输)的调节障碍可能是许多细胞变化包括例如HGF(c-met的关联配体)和/或c-met自身的过表达的结果。相应地,在一些实施方案中,本发明的方法包括把细胞作为目标,其中与相同组织起源的正常细胞相比所述细胞(例如,癌细胞)更多地表达c-met或肝细月包生长因子,或同时更多地表达两者。c-met-表达细胞可能由来自许多来源即自分泌或旁分泌方式中的HGF所调节。例如,在本发明方法的一个实施方案中,用不同细胞中表达的肝细胞生长因子接触/结合靶细胞(例如,经由旁分泌效应)。所述不同细胞可以是相同或不同组织起源的。在一个实施方案中,用由所述靶细胞自身表达的HGF接触/结合靶细胞(例如,经由自分泌效应/环)。在一些实施方案中,本发明的HGF/Met拮抗剂包括HGF突变体,所述突变体包括增强其抑制性和/或治疗学效应(包括,例如,增强的亲和力、改善的药代动力学特性(如半衰期、稳定性、清除率)、对于患者来说减弱的毒性)的修饰。这些修饰包括例如涉及糖基化、聚乙二醇化、用非天然发生的但功能等效的氨基酸、连接基团等取代。合适的修饰是本领域熟知的,而且必要时可以根据经验确定。一个方面,本发明提供包含本发明的一种或多种HGF/c-met拮抗剂和载体的组合物。在一个实施方案中,所述载体是药学上可接受的。一个方面,本发明提供编码本发明的HGF/c-met拮抗剂的核酸。在一个实施方案中,本发明的核酸编码HGF/c-met拮抗剂,该拮抗剂为多肽或者包含多肽(例如,HGF突变体/变体)。在一个实施方案中,本发明的核酸编码HGF/c-met拮抗剂,该拮抗剂为抗体或其片段或者包括抗体或其片段。一个方面,本发明提供包含本发明的核酸的载体。一个方面,本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型的,例如重组载体如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任何一种。在一个实施方案中,宿主细胞是原核细胞,例如,大肠杆菌。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,例如哺乳动物细胞如中华仓鼠卵巢CCHO)细胞。一个方面,本发明提供制备本发明的HGF/c-met拮抗剂的方法。例如,本发明提供制备拮抗剂的方法,所述拮抗剂是或者包括抗体(或其片段),所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗体(或其片段)的重组载体,并回收所述抗体。在另一个例子中,本发明提供制备HGF/c-met拮抗剂的方法,所述HGF/c-met拮抗剂是或者包括多肽(如HGF突变体/变体),所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述多肽的本发明的重组载体,并回收所述多肽。一个方面,本发明提供包含容器的制品;并且组合物包含于所述容器内,其中所述組合物包含一种或多种本发明的HGF/c-met拮抗剂。在一个实施方案中,所述组合物包含本发明的核酸。在一个实施方案中,包含HGF/c-met拮抗剂的组合物进一步包含载体,在一些实施方案中所述载体是药学上可接受的。在一个实施方案中,本发明的制品进一步包括为患者施用所述组合物的说明。一个方面,本发明提供包括第一容器和第二容器的试剂盒,所述第一容器包含含有本发明的一种或多种HGF/c-met拮抗剂的组合物,第二容器含有缓冲液。在一个实施方案中,所述缓冲液是药学上可接受的。在一个实施方案中,包含HGF/c-met拮抗剂的组合物进一步包含载体,在一些实施方案中所述载体是药学上可接受的。在一个实施方案中,本发明的试剂盒进一步包括为患者施用所述组合物的说明。附图简述图l(A)描述不同HGF突变体的特征。举例说明了HGFP链N-末端插入和HGFp链二聚化突变体。"细胞迁移"数据与包含所示突变的全长HGF存在下MDA-MB435细胞的迁移有关,以野生型HGF存在下的迁移的百分数表示。"HGF(3/MetlgG结合"数据和HGF(3链(包含所示的突变)与MetlgG的结合有关,以竟争结合测试中ICs。(突变体)与ICso(野生型)的比值表示。在这些数据中,WT指C604S突变体;HGF卩突变体也包含该突变。^:作为一般性参考,如果预期其破坏潜在的(3链-P链相互作用,则所述突变以粗体表示,如果预期其破坏N-末端的插入,则所述突变以斜体和加下划线(粗体或非粗体)表示。这些预期基于针对各个突变所观测到的或预期的主要影响-即,对(3链-P链相互作用的影响或者对P链N-末端插入到活性部位/结合嚢中的能力的影响。尽管如此,熟练技术人员能够轻易地确定特定突变是否可能具有一种或两种影响,是否在图1A中如此表示。例如,在一些情况下,突变可能同时影响P链-(3链相互作用和N-末端的插入,或者在一些情况下,如所预期的那样,根据经验判断,图1A中所示的影响卩链-(3链相互作用的突变可能显示影响N-末端的插入。类似地,明显"减弱的,,Met结合值以斜体表示,明显"正常的,,结合值以粗体表示,虽然"减弱,,和"正常,,的程度是相对的。(B)竟争结合测试中测定的包含所示突变的全长HGF与Met的结合。数据表示为IC5Q(mut)与ICso(野生型)的比值。(C)包含所示突变的全长HGF对细胞迁移和增殖的抑制。突变HGF和野生型HGF存在时细胞迁移和增殖活性的量(对于迁移,1nM野生型HGF;对于增殖,0.25nM野生型HGF)以仅有野生型HGF存在时观测到的活性百分数表示。图2(A)A549细胞中,所示HGF突变体对HGF-依赖的Met磷酸化的抑制;R424A:R494E指单链HGF。Met磷酸化的量以RLU(相对发光单位(relativelightunit))表示。(B)A549肺癌细胞中,所示HGF突变体对HGF-依赖的Met磷酸化的抑制。Met磷酸化的量以对照的百分数表示(其为0.5nM野生型HGF存在时观测到的量)。图3(A)和(B)野生型和突变HGF存在时A549细胞中Met的磷酸化。Met磷酸化的量以各个野生型HGF浓度下,在野生型HGF存在下观测到的最大磷酸化百分数表示。图4突变HGF存在时的血管发生活性。血管发生量以所示HGF突变体存在时的每珠新芽数(新芽数/珠)(sprouts/bead)表示。实施本发明的方式本发明提供调节HGF/c-met信号途径的方法、组合物、试剂盒和制品。本文提供了这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。一般技术除非另有说明,本发明的实施将使用常规分子生物学(重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、和免疫学技术,其为本领域公知常识。在文献如"MolecularCloning:ALaboratoryManual",第二版,(Sambrooketal.,1989);"OligonucleotideSynthesis,,(M.J.Gait,ed.,1984);"AnimalCellCulture,,(R.I.Freshney,ed.,1987);"MethodsinEnzymology,,(AcademicPress,Inc.);"CurrentProtocolsinMolecularBiology,,(F.M.Ausubeletal"编,1987,定期更新;"PCR:ThePolymeraseChainReaction",(Mullisetal.,编,1994);"APracticalGuidetoMolecularCloning,,(PerbalBernardV.,1988)中充分地阐述了这些技术。定义如本文所用,所给予的氨基酸的名称可以是所属领域已接受的下述一种或多种形式,所有这些本文中可互换使用(i)全名(例如,色氨酸、丝氨酸、甘氨酸等),(ii)三字母缩写(例如,Trp、Ser、Gly等),和(iii)一字母名称(例如,W、S、G等)。相对于肽或多肽序列的"氨基酸序列同一性百分数"定义为在比对序列并引入空位(如有必要),以获得序列一致性最大百分数,并且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分后,候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的目的而进行的比对可以以本领域熟知的多种方式实现,例如,利用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定测量比对的合适参数,包括实施所比较的序列全长的比对所需的任何算法。然而,对于本文的目的,利用如US专利6,828,146所述的序列比较计算机程序ALIGN-2获得氨基酸序列同一性%的值。如本文所用的,术语"肽"和"多肽"可互换使用,除了术语"肽"通常指包含少于200个连续氨基酸的多肽之外。术语"肽,,通常指连续的相对短的由肽酰键连接的氨基酸序列。典型地但非必然地,肽具有大约2至50个氨基酸、4-40个氨基酸或10-30个氨基酸的长度。本文所用术语"载体"意指能够转运已经连接到其上的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是"质粒",指附加的DNA片段可以连接在其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体,其中附加的DNA片段可以连接到所述病毒基因组中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。当引入到宿主细胞中时,其它载体(例如,非附加体哺乳动物载体)能够整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。另外,某些载体能够引导其所可操作连接的基因的表达。本文中这样的载体称为"重组表达载体"(或者简单地说,"重组载体")。通常,重组DNA技术中表达载体往往以质粒形式应用。在本说明书中,"质粒"和"载体"可以互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。"多核苷酸",或者"核酸",本文中可互换使用,指任何长度的核苷酸的多聚物,包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物,或者能够由DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入到多聚物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸,如曱基化核苷酸及其类似物。如果存在,可以在多聚物组装之前或之后修饰核苷酸结构。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分打断。合成后可以进一步修饰多核苦酸,例如通过偶联标记。其它类型的修饰包括例如"帽子"、用其类似物取代一个或多个天然发生的核苷酸、核苷酸间修饰,例如具有不带电荷的连接的那些(例如,膦酸曱酯(methylphosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、磷酰胺酯(phosphoamidates)、氨基曱酸酯等)和具有带电荷的连接的那些(例如,硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等)、含有附加部分(pendantmoiety)如蛋白质的那些(例如,核酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸等)、具有嵌入剂(intercalators)的那些(例如,吖啶、补骨脂素(psoralen)等)、含有螯合剂(例如,金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、包含烷化剂(alkylators)的那些、具有修饰键的那些(例如,a端基异构(anomeric)核酸等),以及所述多核苷酸的未修饰形式。另外,通常存在于糖中的任何羟基可以例如用膦酸基、磷酸基替换,用标准保护基保护,或者被活化以在附加的核苷酸上产生附加的键,或者可以偶联于固体或半固体支持物上。5'和3'端OH可以被磷酸化或者用胺类或1至20个碳原子的有机加帽基团取代。其它羟基也可以衍生为标准保护基。多核苷酸还可以包含本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的糖的类似形式,包括例如2'-O-曱基-、2'-0-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖、碳环糖类似物、ct-端基异构糖、差向异构糖如阿拉伯糖、木糖或来苏糖(lyxoses)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptuloses)、非环状类似物和脱碱基(abasic)核苷类似物如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被其它连接基团所取代。这些连接基团包括但不限于磷酸酯用P(O)S("硫代酸酯,,(thioate))、P(S)S("二硫代酸酯,,(dithioate))、(0)NR2("酰胺酯"(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("曱缩醛,,(formacetal))替代,其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基(l-20个C),任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。本文所用"寡核苷酸"通常指短的、一般为单链的合成多核苷酸,其长度通常但非必然小于约200个核苷酸。术语"寡核苷酸"和"多核苷酸"不是互相排斥的。以上对多核苷酸的描述同样完全适用于寡核苷酸。除非特别指明,本文所用术语"肝细胞生长因子"或"HGF,指任何天然的或变异的(无论是天然的还是合成的)HGF多肽,其能够在允许发生这种进程的条件下激活HGF/c-met信号途径。术语"野生型HGF"通常指包含天然发生的HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。术语"野生型HGF序列"通常指发现于天然发生的HGF中的氨基酸序列。本文所用短语"基本上不削弱"、"基本上不减弱"、"基本上类似"或"基本上等同"、及其变化形式表示两个数值之间足够高的相似程度,以致于所述领域的技术人员将所述两个数值之间的差异视为在用所述数值度量的生物学特征的上下文中几乎没有生物学意义。所述两个数值之间的差异优选小于约50%、优选小于约40%、优选小于约30%、优选小于约20%、优选小于约10%。"两个数值"的例子包括与野生型蛋白质有关的数值和与所述蛋白质的突变形式有关的数值。术语"抗体"和"免疫球蛋白,,在最广义上可互换使用,包括单克隆抗体(例如,全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体,只要它们显示所需的生物学活性),也可能包括特定抗体片段(如本文中更详细描述的)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲合成熟的。"抗体片段,,只包含完整抗体的一部分,其中所述部分优选保留至少一种、优选大多数或全部功能,所述功能正常情况下与存在于完整抗体中的那部分相关。在一个实施方案中,抗体片段包含完整抗体的抗原结合部位,因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中,抗体片段例如包含Fc区的一种抗体片段保留了正常情况下与存在于完整抗体中的Fc区相关的生物学功能中的至少一种,如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中,抗体片段是具有基本上近似于完整抗体的体内半衰期的单价抗体。例如,这样的抗体片段可能包含一个抗原结合臂,该抗原结合臂连接到能够赋予所述片段体内稳定性的Fc序列上。本文所用术语"单克隆抗体"指由基本上同质的抗体群体获得的抗体,即除了可能少量存在的天然发生的突变之外,组成所述群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单一抗原。另外,与典型地包括针对不同决定簇(表位)的多克隆抗体制品相反,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。本文中单克隆抗体特别包括"嵌合"抗体以及这些抗体的片段,其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源,而链的其余部分与源于其它物种或属于另一种抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源,只要它们显示所需的生物学活性(美国专利4,816,567;和Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。"人源化"形式的非人(例如,鼠)抗体为包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上,人源化抗体指其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)高变区的残基所置换的人免疫球蛋白(受体抗体),所述非人物种为例如具有所需特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。一些情况下,人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人残基所置换。另外,人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。构建了这些修饰以进一步改善抗体性能。总的来说,人源化抗体基本上包含至少一个、典型地两个可变区的全部,其中所有的或者基本上所有的高变环相应于非人免疫球蛋白的那些高变环,并且所有的或者基本上所有的FR均为人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。更多详情参见Jonesa/.,iVafwre321:522-525(1986);Riechmanna/.,A^fwre332:323-329(1988);和Presta,C釘.沐1m".肠/.2:593-596(1992)。也可参见其中引用的下述综述"i仑文和文献VaswaniandHamilton,j〃er^,y^AmacS;/wwwwo/.1:105-115(1998);Harris,B/oc/zem.5bc.77ywii3c/7'cws23:1035-1038(1995);HurleandGross,Cwr.pp.所ofec/.5:428-433(1994)。"人抗体,,指拥有相应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体,和/或已别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。"亲和力成熟的,,抗体指在其一个或多个CDRs中有一个或多个改变的抗体,与不拥有那些改变的亲本抗体相比,所述改变导致抗体对抗原的亲和力提高。优选的亲和成熟抗体对目标抗原将有纳摩尔或者甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟抗体通过本领域已知的方法生产。Marksez1a/,所o/rec/z"o/ogy10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。Barbase"/.淑.&/,腦91:3809-3813(1994);Schierda/.G冊169:147-155(1995);Yeltonefa/.J/mw磨/.155:1994-2004(1995);Jackson""/.,/mm,/.154(7):3310-9(1995);和Hawkins"a/'Mo/.所o/.226:889-896(1992)描述了CDR和/或框架的随机诱变。"阻断"抗体或"拮抗剂,,抗体指抑制或减弱其结合抗原的生物学活性的本文所用"激动剂抗体"指模拟感兴趣多肽的至少其中一种功能活性的抗体。"紊乱"或"病理学状况"指将受益于用本发明的物质/分子或方法治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病,包括那些使哺乳动物易感染所述紊乱(病症)的病理学状况。本文所要治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤或癌症;非白血病和淋巴恶性肿瘤;神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑及其它腺体、巨口盆细胞、上皮、基质和嚢胚腔的病症;以及炎性、免疫学、神经变性病症、血管发生相关紊乱和与线粒体或代谢缺陷有关的病症。术语"细胞增殖性紊乱(病症)"和"增殖性紊乱(病症)"指与一定程度的异常细胞增殖有关的紊乱(病症)。在一个实施方案中,所述细胞增殖性紊乱(病症)是癌症。本文所用"肿瘤"指所有肿瘤细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,以及所有前癌性和癌性细胞和组织。本文提到的术语"癌症"、"癌性的"、"细胞增殖性紊乱(病症),,、"增殖性紊乱(病症)"和"肿瘤"不是互相排斥的。术语"癌症"和"癌性的"指或者描述典型地以无限制的细胞生长/增殖为特征的哺乳动物生理学病症。癌症的例子包括但不限于癌(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。这些癌症更特别的例子包括多发性骨髓瘤、鳞状细胞癌、小纟田胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌(squamouscarcinoma)、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌症、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌(例如,肾细胞癌)、肝脏癌症(livercancer)、前列腺癌、阴道癌、曱状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)和多种类型的头颈癌。抗体。本文所用"治疗"指临床干预以试图改变正在治疗的个体或细胞的天然过程,可以为了预防或者在临床病理学过程中进行。所期望的治疗效果包括预防疾病的发生或反复、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病发展的速率、改善或緩和疾病状况、和緩解或改善预后。在一些实施方案中,本发明的抗体用于延緩疾病或紊乱的发生。"有效量"指在剂量和时间上有效获得所需的治疗学或预防性结果必需的量。本发明的物质/分子、激动剂或拮抗剂的"治疗有效量"可根据一些因素如个体的疾病状况、年龄、性别、和体重以及所述物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所需应答的能力而有所不同。治疗有效量还指所述物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗学上有利的作用超过了其中的任何毒性或不良作用的量。"预防有效量"指在剂量和时间上,有效获得所需的预防性结果必需的量。典型地但非必然地,由于用于患者的预防剂量在疾病之前或者在疾病的早期,因而预防学有效量将小于治疗学有效量。术语"细胞毒剂,,在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re'86、Re188、Sm153、Bim、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊普(etoposide))、多柔比星(doxorubicin),美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycinC)、苯丁酸氮芥(chlorambucil柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂、酶及其片段如溶核酶、抗生素、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素,包括其片段和/或变体、以及以下公开的多种抗肿瘤或抗癌药剂。其它细胞毒剂描述如下。杀肿瘤药剂导致肿瘤细胞的破坏。"化疗剂,,指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents),诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide);碌酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和艰泊舒凡(piposulfan);氮丙口定类(aziridines),诸如笨佐j齐派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥—,派(meturedepa)禾口乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克^R/岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三轻曱蜜胺(trimethylolomelamine);番蒸一支内酉旨类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树石咸(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan);苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素l和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189禾口CB1-TM1);艾对留塞〉各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛才卬素(spongistatin);氮芥类(nitrogenmustards),诸长口苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、月旦石粦酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酉交氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲石岸胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亚;肖脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素丫11和加利车霉素11(参见例如Agnew,C7^附./"//.£d33:183-186(1994));蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;二膦酉臾盐类(bisphosphonates),诸^口氯膦酉吏盐(clodronate);i矣斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克4立霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramydn)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮—5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epimbicin)、依索比星(esorubicin)、4尹达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromydn、噪呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司4也丁(zinostatin)、佐柔比星(zombicin);抗代谢物类,诸如曱氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧咬(5-FU);叶酸类似物,诸如二曱叶酸(denopterin)、曱氨虫茉呤(methotrexate)、*莱罗?令(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);。票呤类似物,i者如氟达4立滨(fludarabine)、6-3克基嘌口令(mercaptopurine)、硫咪。票呤(thiamiprine)、石克鸟。票呤(thioguanine);嘧咬类似物,诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苦(azacitidine)、6-氮尿香(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依i若4也滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表石克左*醇(epitiostanol)、美名,.烷(mepitiostane)、睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲)各司坦(trilostane);叶酸#卜充剂,诸如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉交(aminolevulinicacid);恩尿口密口定(eniluracil);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地磷酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptini腿acetate);埃坡霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物石威类(maytansinoids),i者如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米4乇胍腙(mitoguazone);米4乇蒽醌(mitoxantrone);莫艰达醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);外匕柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酉吏(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖复合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);纟田交纟连孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺;单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和虫它行菌素(anguidin));乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴漆(dacarbazine);甘露莫司'汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);派泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖月包香(ambinoside)("Ara-C,,);环石奔酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids),例如TAXOL帕利他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANECremophor-free、帕利他塞的清蛋白改造纳米茅贞4立制剂(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,IUinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne画PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR⑧吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟噪呤(thioguanine);巯基嘌呤(mercaptopurine);甲氨蝶p令(methotrexate);4白类似4勿,i者3口"顷4自(cisplatin)禾口卡4白(carboplatin);长春碱(vinblastine);柏(platinum);依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽酉昆(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);NAVELBINE长春瑞滨(vinorelbine);能灭瘤(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基虫莱口令(aminopterin);xeloda;伊本膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids),诸如视黄酸(retinoicacid);卡培他滨(capecitabine);以及任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物。上述定义"化疗剂,,还包括担负调节或抑制作用于肿瘤的激素的抗激素制剂例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基4也莫昔芬(hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)、和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂,其调节肾上腺中雌激素的生产,例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕S同(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏氯唑(vorozole)、FEMARA来曲唑(letrozole)、和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);以及抗雄激素例如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(>0乂&(^31^116)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸,特别是抑制参与粘附细胞增殖的信号转导途径中的基因表达的那些,例如,PKC-a、Ralf和H-Ras;核酶如VEGF表达抑制剂(例如,ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表达抑制剂;疫苗如基因治疗疫苗,例如,ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗、和VAXID⑧疫苗;PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓朴异构酶l抑制剂;ABARELIXrmRH;以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。本文中使用"生长抑制剂"时指抑制细胞生长的化合物或组合物,所述细胞的生长依赖于体外或体内HGF/c-met活化。因此,所述生长抑制剂可以是明显减小S期HGF/c-met-依赖细胞的百分数的抑制剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期运转(在非S期位置)的试剂,如诱导Gl停滞和M-期停滞的试剂。经典M-期阻断剂包括长春碱类(长春新碱和长春碱)、紫杉烷类(taxanes)、和拓朴异构酶II抑制剂如多柔比星、表柔比星(epimbicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷、和博来霉素(bleomycin)。阻滞G1的那些药剂也溢出到S-期停滞中,例如,DNA烷化剂如他莫昔芬、强的松(prednisone)、达卡巴口秦(dacarbazine)、氮芥(mechlorethamine)、顺粕、曱氨虫莱呤(methotrexate)、5-氟尿嘧。定、和ara-C。可以在TheMolecularBasisofCancer,MendelsohnandIsrael,eds.,第1章,Murakamietal.(WBSaunders:Philadelphia,1995)标题为"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",尤其是第13页中查找更多信息。紫杉烷类(帕利他塞(paclitaxel)和多西他塞(docetaxel))都是源于紫杉树的抗癌药。多西他塞(TAXOTERE⑧,Rhone-PoulencRorer),源于欧洲紫杉,是帕利他塞的半合成类似物(TAXOL,Bristol-MyersSquibb)。帕利他塞和多西他塞促进来自微管蛋白二聚体的微管的组装并通过阻止解聚而稳定微管,导致细胞中有丝分裂的抑制。"多柔比星"是蒽环类抗生素。多柔比星的化学全称是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-a-L-来苏』比喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,ll-三羟基羟基乙酰基)-l-曱氧基-5,12-萘二酮((8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione)HGF/Met拮抗剂-肽/多肽(包括抗体)本发明的一个方面有关HGF(3链-(3链相互作用和HGF-Met相互作用的分离的肽/多肽和抗体调节剂。在一个实施方案中,调节剂(如肽/多肽和抗体)可以利用标准蛋白质纯化技术通过合适的纯化方案从细胞或组织来源分离。在另一个实施方案中,所述调节剂通过重组DNA技术制备。作为重组表达的替代方案,调节剂可以利用标准肽合成技术化学合成。本发明的HGF/Met拮抗剂分子包括图1中描述的那些。本发明还提供突变的或变异的蛋白质,其中任一残基与这些肽/多肽的相应残基相比可以变化,虽然仍然编码保持调节活性的肽/多肽。在一个实施方案中,肽/多肽拮抗剂的变体与所参照的肽/多肽拮抗剂的序列有至少50%、60%、70°/0、80%、90%、95%、98%、99%的氨基酸序列同一性。大体上,根据本领域接受的结合测试定量单位/度量,所述变体与所参照的结合肽/多肽拮抗剂相比基本上显示相同或更高的结合亲和力,例如至少为所参照的结合肽/多肽/配体的结合亲和力的0.75X、0.8X、0.9X、l.OX、1.25X或1.5X,同时保留了所期望程度的拮抗剂活性。大体上,本发明的变体包括序列中特定位点的残基已被其它氨基酸所取代的变体,还包括在亲本蛋白质/肽的两个残基之间插入附加的一个或多个残基的可能性以及从亲本序列删除一个或多个残基或向亲本序列添加一个或多个残基的可能性。本发明包括任何氨基酸取代、插入、或删除。在理想状况下,所述取代是本文所述的保守性取代。"分离的"或"纯化的"肽、多肽、蛋白质或生物学活性片段是从其天然环境成分中分离和/或回收的。污染物组分包括典型地会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料,可以包括酶、激素、和其它的蛋白质或非蛋白质材料。以非所需污染材料(污染物)的干重计,优选具有少于30%、优选少于20%、10°/。、且优选少于5%的污染物的制品基本上认为是分离的。分离的、重组生产的肽/多肽或其生物学活性部分优选基本上是无培养基的,即优选培养基占肽/多肽制品量的20%以下、优选约10%以下、优选约5%以下。污染物的例子包括细胞碎片、培养基、和所述肽/多肽体外合成期间使用和产生的物质。肽/多肽的保守性取代如表A中"优选取代"栏所示。如果这些取代导致生物学活性的改变,那么可以引入表A中命名为"示例性取代"或依照下述的关于氨基酸类别的更实质性的改变,并筛选产物。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>胎/多胎生物学特性的实质性改变伴随选择取代,所述取代对维持(A)取代区域中多肽骨架的结构,例如片层或螺旋构象,(b)目标部位分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积的影响方面差异显著。基于常见侧链特性将天然发生的残基分为以下的组(1)疏水性氨基酸正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性亲水性氨基酸cys、ser、thr;(3)酸性氨基酸:Asp、Glu;(4)石咸'l"生氨基酉lt:asn、gln、his、lys、arg;(5)影响链方向的残基Gly、Pro;和(6)芳香氨基酸Trp、Tyr、Phe。非保守性取代必然会伴随用这些类别中其中一类的成员交换另一类。还可以根据本领域已知的信息制备抗体调节剂的变体,而基本上不影响抗体的活性。例如,抗体变体在抗体分子可以至少有一个氨基酸残基被不同的残基所替换。对于抗体,最感兴趣的取代诱变部位通常包括高变区,但也预期框架区(FR)变化。对于抗体,一种取代变体类型涉及取代亲本抗体的一个或多个高变区残基(例如人源化抗体或人抗体)。通常,选择用于进一步开发的所得变体相对于生产所述变体的亲本抗体而言会具有改善的生物学特性。用于生产这些取代变体的适当路线涉及利用噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说,突变几个高变区位点(例如6-7个位点),在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体作为融合物从丝状噬菌体颗粒展示,所述融合物融合于M13的基因III产物,包装在每个颗粒内部。然后如本文所述筛选噬菌体展示变体的生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可以进行丙氨酸扫描诱变,以鉴定明显促进抗原结合的高变区残基。或者,或除此之外,分析抗原抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与抗原之间的接触点可能是有益的。根据本文详细描述的技术,这些接触的残基和邻近的残基是用于取代的候选残基。一旦制备了这样的变体,如本文所述筛选这一系列变体,可以选择在一种或多种相关测试中具有优越特性的抗体用于进一步的开发。编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然发生的氨基酸序列变体的情况下)或者通过寡核普酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变、以及早先制备的变体或抗体的非变异型式的盒式诱变。可能希望在本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区引入一个或多个氨基酸修饰,从而获得Fc区变体。所述Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如,人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区),其在一个或多个氨基酸位点包含氨基酸修饰(例如取代),包括铰链半胱氨酸的修饰。在一个实施方案中,所述Fc区变体可以显示改变的新生儿Fc受体(neonatalFcreceptor,FcRn)结合亲和力。这样的变异的Fc区在Fc区氨基酸位点238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中的EU索引的编号。与FcRn有减弱的结合的Fc区变体可以在Fc区氨基酸位点252、253、254、255、288、309、386、388、楊、415、433、435、436、439或447中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中残基的编号为Kabat中EU索引的编号。或者,上述Fc区变体与FcRn可以显示增强的结合,并在Fc区氨基酸位点238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中EU索引的编号。与FqR有减弱的结合的Fc区变体在Fc区氨基酸位点238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中EU索引的编号。例如,所述Fc区变体可以显示与FcYRI减弱的结合,在Fc区氨基酸位点238、265、269、270、327或329中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中EU索引的编号。所述Fc区变体可以显示与Fc7RII减弱的结合,在Fc区氨基酸位点238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中EU索引的编号。感兴趣的Fc区变体可以显示与FcyRIII减弱的结合,在Fc区氨基酸位点238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437中的任何一个或多个位点处包含氨基酸修饰,其中Fc区中的残基编号为Kabat中EU索引的编号。具有改变(即增强或减弱)的Clq结合和/或补体依赖的细胞毒(CDC)的Fc区变体描述于W099/51642。这样的变体可在Fc区氨基酸位点270、322、326、327、329、331、333或334中的一个或多个位点处包含氨基酸取代。也可参见Duncan&WinterAtowre322:738-40(1988);美国专利5,648,260;美国专利5,624,821;和涉及Fc区变体的W094/2935L载体构建编码本文所述的肽/多肽的多核香酸序列可以利用标准重组:忮术获得。所需的多核苷酸序列可以从合适的细胞来源分离并测序。抗体的细胞来源可能包括抗体产生细胞如杂交瘤细胞。或者,可以利用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苦酸。一旦获得编码免疫球蛋白的序列,就将其插入到能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。许多本领域可获得的已知载体能够用于本发明的目的。合适载体的选择将主要取决于所要插入到载体中的核酸的大小和要用所述载体转化的特定宿主细胞。每种载体包含多种成分,这取决于其功能(异源多核苷酸的扩增或表达,或两者都有)及其与其所驻留的特定宿主细胞的相容性。载体组分通常包括但不限于复制起点(尤其是当所述载体插入到原核细胞中时)、选择标志基因、启动子、核糖体结合部位(RBS)、信号序列、异源核酸插入物和转录终止序列。通常,包含源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。所述载体通常携带复制位点,以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标志序列。例如,典型地用源于大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨千青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因,并因此提供了鉴别转化细胞的便利手段。pBR322、其衍生物、或者其它微生物质粒或噬菌体也可以包含或者被修饰而包含启动子,所述启动子能够被所述微生物利用而表达内源性蛋白。此外,包含能够与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体能够用作与这些宿主相关联的转化载体。例如,在制备重组载体时可以利用噬菌体如入GEM.TM.-ll,所述重组载体可用于转化感受态宿主细月包如大肠杆菌LE392。根据特定场合的需要,本发明可以使用组成性启动子或可诱导的启动子,这可以由本领域熟练技术人员所确定。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是熟知的。可以通过从DNA源去除启动子而将所选启动子可操作地连接到编码本文所述多肽的顺反子DNA,其中启动子的去除通过限制酶消化和将分离的启动子序列插入到所选载体中而实现。天然启动子序列和许多异源启动子均可用于直接扩增和/或表达目标基因。然而,异源启动子是优选的,因为与天然目标多肽启动子相比,它们通常容许所表达的目标基因的更强的转录和更高的产率。适于与原核生物宿主一起使用的启动子包括PhoA启动子、(3-半乳糖酶(galactamase)和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子如toc或rrc启动子。然而,在细菌中有功能的其它启动子(如其它已知的细菌或噬菌体启动子)同样是合适的。已经公开了它们的核苷酸序列,从而使熟练技术人员能够利用接头或衔接子将它们可操作地连接至编码目标轻链和重链的顺反子(Siebenlistetal.(1980)Cdl20:269)以提供任何所需的限制性位点。在一些实施方案中,重组载体中的每个顺反子都包含引导所表达的多肽跨膜转运的分泌信号序列组分。通常,所述信号序列可以是所述载体的组分,或者可以是插入到载体中的目标多肽DNA的一部分。为了本发明的目的而选择的信号序列应当是被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶裂解的)的信号序列。对于不识别和加工相对于异源多肽为天然的信号序列的原核生物宿主细胞来说,用例如选自下组的原核生物信号序列取代所述信号序列碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、Pe旧、OmpA和MBP。适于表达多肽的原核生物宿主细胞包括古细菌(archaebacteria)和真细菌(Eubacteria),如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物。可用细菌的例子包括埃希氏杆菌(Escherichia)(例如,大肠埃希氏菌(大肠杆菌))、芽孑包杆菌(Bacilli)(例如,枯草芽孑包軒菌(B.subtilis))、肠杆菌(Enterobacterial假单胞菌(Pseudomonas)各菌种(例如,铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)),鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、净占质沙、雷氏菌(Serratiamarcescens)、克雷4白氏菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。优选使用革兰氏阴性细胞。优选所述宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶,可以根据需要在细胞培养物中加入附加的蛋白酶抑制剂。肽/多肽生产用上述表达载体转化或转染宿主细胞并培养在经改良的常规培养基中,所述培养基经改良适合于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码所需序列的基因。转染指宿主细胞摄取表达载体,无论事实上是否有任何编码序列表达。许多转染的方法是普通熟练技术人员已知的,例如,CaP04沉淀和电穿孔。转化意思是作为染色体外成分或者以染色体组成部分的方式向原核生物宿主中引入DNA以使所述DNA为可复制的。取决于所4吏用的宿主细胞,利用适合于这种细胞的标准技术完成转化。使用氯化钙的钙处理通常用于包含实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法使用聚乙二醇/DMSO。所使用的又一种技术为电穿孔。用于生产本发明的肽/多肽的原核细胞培养于本领域已知的适于培养所选择的宿主细胞的培养基中。适当的培养基的例子包括luriabroth(LB)加必需的营养添加物。在优选实施方案中,所述培养基还包含选择药剂,以选择性地允许包含所述表达载体的原核细胞的生长,所述选择药剂根据所述表达载体的构建而选择。例如,向培养基添加氨千青霉素用于表明氨苄青霉素抗性基因的细胞的生长。除了碳、氮、和无机磷酸盐源之外,还可以包含合适浓度的任何必需添加物,这些必需添加物单独加入或者作为与另一种添加物的混合物或培养基如复合氮源加入。任选所述培养基可以包含一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸盐(酯)、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。将所述原核生物宿主细胞培养于适当温度下。例如,对于大肠杆菌的生长,所述优选温度自约20。C至约39。C,更优选自约25°C至约37。C,更加优选为约30。C。培养基的pH可以为约5到9范围内的任何pH,主要取决于宿主生物。对于大肠杆菌,pH优选为约6.8至约7.4,更优选约7.0。如果在表达载体中使用可诱导的启动子,在适于活化所述启动子的条件下诱导蛋白质表达。例如,如果用PhoA启动子控制转录,转化的宿主细胞可以培养在磷酸盐-限制培养基中用于诱导。根据所使用的载体构建体,可以使用许多其它的诱导物,这是本领域已知的。本文所述在微生物中表达的肽/多肽可以分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收典型地包括破坏所述微生物,通常通过渗透性休克、超声处理或裂解这样的手段进行。破坏细胞后,可以通过离心或过滤除去细胞碎片或完整细胞。可以通过例如亲合树脂层析进一步纯化蛋白质。或者,可以将蛋白质转运到培养基中并从中分离。可以从培养物除去细胞,过滤并浓缩培养物上清以进一步纯化所生产的蛋白质。可以利用通常已知的方法分离并鉴别表达的多肽,例如免疫亲合或离子交换柱上的分级分离;乙醇沉淀;反相HPLC;在硅石(silica)或阳离子交换树脂如DEAE上层析;层析聚焦(chromatofocusing);SDS-PAGE;石克酸铵沉淀;利用例如SephadexG-75凝胶过滤;疏水亲合树脂、利用固定于基质上的适当抗原的配体亲合以及Western印迹测i式。除原核生物宿主细胞之外,真核宿主细胞系统也是本领域沿用已久的。适当的宿主包括哺乳动物细胞系例如CHO、和昆虫细胞例如下述的那些。肽/多肽纯化可以纯化生产的肽/多肽以获得基本上均质的制品用于进一步的测试和应用。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。下述方法是示例性的适当的纯化方法免疫亲合或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石或阳离子交换树脂如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和利用例如SephadexG-75的凝胶过滤。本发明的方法
技术领域
:本发明提供基于在HGFp链特定区域内发现的突变的多种方法,所述突变导致所述分子生物学活性的改变,从而这样的突变分子在HGF/Met途径的调节中显示拮抗效应。许多物质或分子(包括肽/多肽等)可以用作根据本发明的方法中的治疗剂。可以根据已知的方法配制这些物质或分子以制备药学上可用的组合物,从而此处的产品与药学上可接受的载体媒介物组合为混合物。通过将具有所需纯度的活性成分与可选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合而制备冻干制剂或水溶液形式的治疗学制剂(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(19S0))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度对于受体来说是无毒的,包括緩沖液如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸緩冲液;抗氧化剂包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,如血清白蛋白、白明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合剂如EDTA;糖醇如甘露醇或山梨醇;成盐反离子(counterions)如钠;和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURON1CSTm或PEG。要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过在冻干和重建之前或之后的无菌过滤膜过滤而轻易实现。本文的治疗剂组合物通常置于具有无菌存取口的容器中,例如静脉内使用的溶液袋或带有可用皮下注射针穿透的塞子的管形瓶。给药途径依照已知的方法,例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内(intraarterial)或损伤部位内等途径、局部施用、或通过緩释系统注射或输注。本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可以依据预想的特定用途而改变。合适的剂量或给药途径的确定是普通熟练医师所熟知的。动物试验为确定人类治疗的有效剂量提供可靠的指导。可以按照Mordenti,J.andChappell,W."Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics"InToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobietal.,Eds.,PergamonPress,NewYork1989,pp.42-96制定的原则度量物种间的有效剂量。当体内施用本发明的物质或分子时,根据给药途径,正常剂量可以为每天自约10ng/kg直至100mg/kg哺乳动物体重或更多,优选约l吗/kg/天至10mg/kg/天。文献中提供了关于特定剂量和递送方法的指导;参见例如美国专利4,657,760;5,206,344;或5,225,212。预期不同的制剂对不同的治疗化合物和不同的病症将是有效的,例如以一种器官或组织为目标的给药可能需要以不同于对另一种器官或组织的方式递送。需要以具有释放特征的制剂方式持续施用物质或分子时,可预期微嚢化的物质或分子,其中所述释放特征适于需要施用所述物质或分子的任何疾病或紊乱的治疗。已经用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白介素-2、和MNrgpl20成功地获得了用于緩释的重组蛋白的微嚢化。Johnsonetal.,Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther.,27:1221-1223(1993);Horaetal.,Bio/Technology,8:755-758(1990);Cleland,"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"inVaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,PowellandNewman,eds,(PlenumPress:NewYork,1995),pp.439-462;WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399;和美国专利5,654,010。由于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-lactic-coglycolicacid,PLGA)的生物相容性和广泛的可生物降解特性,用其开发了这些蛋白质的緩释制剂。PLGA的降解产物乳酸和轻基乙酸能够在人体内很快清除。另夕卜,根据其分子量和成分,可以将该多聚物的降解能力从数月调节至数年。Lewis,"Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer,"in:M.ChasinandR.Langer(Eds.),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990),pp.1-41。鉴定HGF(3链内在HGF/Met信号转导途径中对于HGF功能至关重要的区域提供了HGF(3链内拮抗剂能够靶向的位点。潜在的拮抗剂的例子包括结合HGF[3链N-末端和/或二聚化区域的寡核苷酸(其可以是适体(aptamer))、以及特别是抗体包括但不限于多克隆和单克隆抗体和抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、以及这样的抗体或片段的嵌合的或人源化的型式、以及人抗体和抗体片段。适体是能够结合目标分子的核酸分子。适体的生产和治疗学用途是本领域熟知的。参见例如美国专利5,475,096,和Macugen(Eyetech,NewYork)治疗年龄相关黄斑变性的治疗学功效。如本文所述,本发明的HGF/Met拮抗剂物质/分子可以是肽或多肽(包括抗体)。获得这种肽和多肽的方法是本领域熟知的,包括从肽和多肽文库筛选结合适当的目标抗原的结合剂。在一个实施方案中,适当的目标抗原包含HGF(3链(或其包含N-末端和/或二聚化区域的部分),本文将详细描述该目标抗原。在一个实施方案中,适当的目标抗原将包含Met,例如Met的胞外结构域。肽和多肽文库是本领域熟知的,也可以根据现有技术的方法制备。参见例如,Clarketal.,美国专利6,121,416;和Garrardetal.,5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717、和5,658,727。融合于异源蛋白成分如噬菌体外壳蛋白的肽和多肽文库是本领域熟知的,例如Clarketal.和Garrardetal.,^7J:所描述的。第一种所选择的肽或多肽结合剂的变体可以通过筛选肽或多肽的突变体以获得感兴趣的特征(例如增强目标结合亲和力、增强药代动力学、减弱的毒性、提高的治疗指数等)而获得。例如感兴趣的特征可以是结合Met的能力,但激活HGF相关生物学活性如细胞增殖、Met磷酸化、细胞迁移、和血管发生的能力减弱。诱变技术是本领域熟知的,突变的区域将在HGFP链内,特别是本文所述与HGFP链N-末端插入和/或(3链-|3链二聚化有关的位点。另外,扫描诱变技术(如基于丙氨酸扫描的那些)尤其可能有助于评估肽或多肽内各个氨基酸残基的结构和/或功能重要性。可以通过检测候选物质/分子在体外或体内测试中的调节能力来确定本发明的候选物质/分子调节HGF/c-met信号转导和/或与所述信号有关的生物学活性的能力,这是本领域熟知的,例如Okigakietal.,/^Li:;Matsumotoetal.,^J:;Dateetal.,FEBSLet.(1997),420:1-6;Lokkeretal.,/^7J:;Hartmannetal.,^7J:;Kirchhoferetal.,JBiol.Chem.(2004),279:39915-24;Stamosetal.(2004)EMBOJ.23:2325-35;Kirchhoferetal.,FEBSLett.(2005)579:1945-50;和Nakatsuetal.(Microvasc.Res.66:102,2003)中戶斤述。HGF(3链抗体本发明进一步提供包括应用抗体的方法。示例性抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性、和异源偶联抗体。1.多克隆抗体抗体可以包含多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员已知的。可以例如通过注射一次或多次免疫制剂和,如果需要的话,佐剂在哺乳动物中产生多克隆抗体。典型地,免疫制剂和/或佐剂通过多次皮下或腹膜内注射而注射于哺乳动物。所述免疫制剂可以包括HGF(3链(或其一部分)或其融合蛋白。将免疫制剂偶联于已知在被免疫的哺乳动物体内为免疫原性的蛋白质可能是有用的。这种免疫原性蛋白的例子包括但不限于匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛曱状腺球蛋白、和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰脂质A(MonophosphoryllipidA,MPLA)、合成的trehalosedicorynomycolate)。本领域熟练技术人员无需过度实验即可选择免疫方案。2.单克隆抗体或者所述抗体可以是单克隆抗体。可以用杂交瘤方法,如KohlerandMilstein,Nature,256:495(1975)描述的方法制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中,用免疫制剂免疫小鼠、仓鼠、或其他适当的宿主动物,以激发产生或能够产生抗体的淋巴细胞,所述抗体将特异地结合所述免疫制剂。或者,可以体外免疫淋巴细胞。所述免疫制剂将典型地包括HGF卩链(或其一部分)或其融合蛋白。通常,如果需要人类起源的细胞,则使用外周血单个核细胞("PBLs"),或者如果需要非人哺乳动物来源的则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后用适当的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与永生细胞系融合,以形成杂交瘤细胞[Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)pp.59-103]。永生细胞系通常是转化的哺乳动物细胞,特别是啮齿类动物、牛和人类起源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或者小鼠骨髓瘤细胞系。可以将杂交瘤细胞培养于适当的培养基中,所述培养基优选包含一种或多种抑制未融合的永生细胞生长或存活的物质。例如,如果亲本细胞缺乏次黄。票呤鸟噪呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),用于所述杂交瘤的培养基典型地将包括次黄。票呤、氨基蝶呤、和胸苷("HAT培养基"),这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的永生细胞系是那些有效地融合、支持所选择的抗体生产细胞稳定高水平地表达抗体、并对培养基如HAT培养基^:感的细胞系。更优选的永生细胞系是鼠骨髓瘤细胞系,其可以例如从SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California和美国典型培养物保藏中心,Manassas,Virginia获得。也已描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂交瘤细胞系用于生产人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,111:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.,NewYork,(1987)pp,51-63]。然后可以测试培养所述杂交瘤细胞的培养基中抗HGF(M连单克隆抗体的存在。优选通过免疫沉淀或者通过体外结合测试如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测试(ELISA)测定由所述杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。这些技术和测试是本领域已知的。例如可以通过MunsonandPollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力。鉴定所需的杂交瘤细胞后,可以通过有限稀释程序亚克隆所述克隆并用标准方法培养[Goding,^A]。用于该目的的适当培养基包括例如Dulbecco,sModifiedEagle'sMedium和RPMI-1640培养基。或者,所述杂交瘤细胞可以在哺乳动物中作为腹水体内培养。由所述亚克隆分泌的单克隆抗体可以用传统免疫球蛋白纯化程序,例如蛋白质A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲合层析从培养基、腹水流体分离或纯化。所述单克隆抗体也可以用重组DNA方法,如美国专利4,816,567中描述的那些方法制备。利用常规程序(例如,通过使用能够特异地结合编码鼠抗体重链和轻链的寡核普酸探针)可以很容易地分离编码本发明的单克隆抗体的DNA并测序。本发明的杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离了DNA,可以将其置于表达载体中,然后将其转染到原本不生产免疫球蛋白的宿主细胞如猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中,以实现单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。也可以例如通过用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序列[美国专利4,816,567;Morrisonetal.,/^丄]或者通过将免疫球蛋白编码序列连接到非-免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列而改造DNA。这样的非-免疫球蛋白多肽可以寻皮本发明抗体的恒定区取代,或者可以被本发明抗体的一个抗原结合部位的可变区取代,以构建嵌合二价抗体。所述抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法是本领域熟知的。例如,一种方法涉及免疫球蛋白轻链和修饰重链的重组表达。通常在Fc区中的任一点截断重链以阻止重链交联。或者,相关半胱氨酸残基被另一种氨基酸残基取代或者被删除以阻止交联。体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生产其片段尤其是Fab片段可以利用本领域已知的常规技术实现。还可以通过筛选以适当的/所需的亲和力结合HGF卩链(或等效物)的抗体或抗体片段噬菌体展示文库获得抗体。这些技术是本领域熟知的,例如,美国专利5,750,373;5,780,279;5,821,047;6'040,136;5,427,908;5,580,717及其中的参考文献所公开的。3.人和人源化抗体本发明的HGF(3链抗体可以进一步包含人源化抗体或人抗体。人源化形式的非人(例如,鼠)抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它的抗原结合子序列),其包含源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)的CDR的残基所置换的人免疫球蛋白(受体抗体),所述非人物种为例如具有所需特异性、亲和力、和能力的小鼠、大鼠或兔。一些情况下,人免疫球蛋白的Fv框架区残基由相应的非人残基所置换。人源化抗体也可以包含在受体抗体中和引入的CDR或框架序列中均未发现的残基。总的来说,人源化抗体包含至少一个、和典型地两个可变区的基本上全部的序列,其中所有的或者基本上所有的CDR区相应于非人免疫球蛋白的那些CDR区,并且所有的或者基本上所有的FR区为人免疫球蛋白Fc区共有序列。人源化抗体最佳地还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)典型地人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。[Jonesetal.,Nature,321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature,H2:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。人源化非-人抗体的方法是本领域熟知的。通常人源化抗体具有从非人来源导入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被认为是"引入的"残基,其典型地从"引入的"可变区获取。基本上可以按照Winter及其同事的方法实施人源化[Jonesetal.,Nature,^11:522-525(1986);Riechmannetal"Nature,112:323-327(1988);Verhoeyenetal.,Science,239:1534-1536(1988)],通过用啮齿类动物CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。因此,这样的"人源化"抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中基本上小于化抗体典型地为人抗体,在该人抗体中,一些CDR残基可能还有一些FR残基被来自啮齿类动物抗体的类似位点所取代。人抗体还可以利用本领域已知的许多技术生产,包括噬菌体展示文库[HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,222:381(1991);Marksetal.,J.Mol.Biol.,222:581(1991)]。Cole等和Boerner等描述的技术也可用于制备人单克隆抗体(Coleetal"MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)和Boerneretal.,J.Immunol.,147(1):86-95(1991)]。类似地,可以通过将人免疫球蛋白基因座引入到转基因动物中而制备人抗体,例如引入到内源免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的小鼠中。攻击后,观测人抗体的产生,其在各个方面都非常类似于在人体中观测的结果,包括基因重排、組装、和抗体的全体成员(repertoire)。例如,在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016,以及下述科学出版物中描述了该方法Marks"a/"Bio/Technology辺,779-783(1992);Lonberg"a/.'Nature368856-859(1994);Morrison,Nature368,812-13(1994);Fishwild&a/.,NatureBiotechnologyM,845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14,826(1996);LonbergandHuszar,Intern.Usv.Immunol.1365-93(1995)。所述抗体也可以是利用如上所述的已知的选择和/或诱变方法实现亲和力成熟的。优选的亲和力成熟抗体具有比起始抗体(通常为鼠抗体、人源化抗体或人抗体)大5倍、更优选10倍、再优选20或30倍的亲和力,其中所述成熟抗体从所述起始抗体制备。4.双特异性抗体双特异性抗体是单克隆的优选人的或人源化的抗体,其具有针对至少两个不同抗原的结合特异性。在当前例子中,其中一种结合特异性是针对HGFP链的,另一种是针对任何其它抗原的,且优选针对细胞表面蛋白或受体或受体亚基。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上,双特异性抗体的重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达,其中所述两个重链具有不同的特异性[MilsteinandCuello,Nature,305:537-539(1983)1。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些四体瘤(quadromas)生产10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确的分子的纯化通常通过亲和层析步骤完成。公开于1993年5月13日的WO93媚29和Trauneckeretal.,EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合部位)可以融合于免疫球蛋白恒定区序列。所述融合优选与免疫球蛋白重链恒定区融合,所述免疫球蛋白重链恒定区至少包括铰链区的一部分、CH2区和CH3区。优选在至少一种融合物中存在有第一个重链恒定区(CH1),其包含与轻链结合必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和,如果需要的话,免疫球蛋白轻链的DNA插入到各自独立的表达载体中,共转染到合适的宿主生物中。生产双特异性抗体的更多详情参见例如,Sureshetal.,MethodsinEnzymology,121:210(1986)。依据WO96/27011中描述的另一种方法,可以工程化一对抗体分子之间的接触面(interface),以最大化从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比。优选的接触面至少包括抗体恒定区的一部分CH3区。在该方法中,来自第一抗体分子接触面的一个或多个小型氨基酸侧链被更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)所替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链,在第二抗体分子的接触面上形成了与大型侧链大小相同或相似的补偿"腔"。这提供了增加异二聚体产率的机制,所述产率超过不需要的终产物如同二聚体的产率。抗体)。文献中已描述了从抗体片段生产双特异性抗体的技术。例如,可以用化学连接制备双特异性抗体。Brennanetal"Science229:81(1985)描述了一种方法,在该方法中通过完整抗体的蛋白水解生产F(ab,)2片段。在二巯基配位剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段,以稳定附近的二巯基并阻止分子间二硫化物的形成。然后将所得到的Fab,片段转变为三硝基苯磺酸(TNB)衍生物。然后通过巯基乙胺还原,将其中一种Fab'-TOB书f生物再转变为Fab'-硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合,形成双特异性抗体。所生产的双特异性抗体可用作酶选择性固定的试剂。可以直接从大肠杆菌回收Fab,片段并化学偶联形成双特异性抗体。Shalabyetal.,J.Exp.Med.,175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab,)2分子的生产。将从大肠杆菌各自独立分泌的每种Fab'片段在体外定向化学偶联,形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞,还激发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤目标的裂解活性。已经描述了多种直接从重组细胞培养物中制备分离的双特异性抗体片段的技术。例如,已用亮氨酸拉链生产了双特异性抗体。Kostelnyefa/.,LImmunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接于两种不同抗体的Fab'部分。在绞链区还原抗体同二聚体以形成单体,然后再将其氧化,形成抗体异二聚体。该方法还可用于抗体同二聚体的生产。Hollingeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)描述的"双抗体(diabody)"技术已提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。所述片段包含通过连接序列连接到轻链可变区(vo的重链可变区(VH),连"t妄序列非常短,不允许两个结构域在同一条链上配对。因此,迫使一个片段的Vh和V^结构域与另一片段的互补Vl和VH结构域配对,由此形成两个抗原结合部位。还报导了利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见,Gruberg/a/.,J.Immunol.152:5368(1994)。可以预期超过二价的抗体。例如,可以制备三特异性抗体。Tutt"fl/.,iImmunol,147:60(1991)。示例性双特异性抗体可以结合HGF(3链上的两个不同表位或者结合HGF(3链上的表位和另一种多肽(例如,c-met或HGFa链)上的表位。5.异源偶联抗体异源偶联抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。已建议用这些抗体将免疫系统细胞引导到不需要的细胞[美国专利4,676,980],用于HIV感染的治疗[WO91/00360;WO92/200373;EP03089]。预期可以利用合成蛋白化学中已知的方法包括涉及交联剂的方法体外制备抗体。例如,可以利用二硫键交换反应或者通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于该目的的适当试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺酸曱酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和例如美国专利4,676,980中公开的那些。6.效应器功能工程化对于效应器功能,可能希望改造本发明的抗体,以增强所述抗体在治疗癌症中的效能。例如,可以将半胱氨酸残基引入到Fc区中,从而允许在该区域形成链间二硫键。如此制备的同二聚体抗体可能具有改善的内在化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。参见Carone/a/.,J.ExpMed.,176:1191-1195(1992)和Shopes,J.Immunol.,148:2918-2922(1992)。也可以如Wolffetal.CancerResearch,53:2560-2565(1993)所述用杂合双功能交联连接剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。或者,可以工程化抗体使之具有双Fc区,可能由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson"a/.,Anti-CancerDrugDesign,3:219-230(1989)。7.免疫偶联物本发明还涉及包含偶联于细胞毒剂如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶学活性毒素,或其片段)、或放射性同位素(即放射性偶联物)的抗体的免疫偶联物。以上已经描述了用于生产这种免疫偶联物的化疗剂。可以使用的酶学活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A纟连(来自4同纟录"(艮单月包菌/^ez/iicw7(9"asaerwg7'waa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(v4/eW/fe/oW")毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(尸/^to/acaamen'ca憩)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Moworafcac/zflra油'fl)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草Oapaowor/a0^cz'"(3"力4中制物、白初十毒蛋白(gelonin)、丝片木霉素(mitogdlin)、局P艮曲菌素(restrictocin)、f》霉素(phenomycin)、依"i若霉素(enomycin),口单^^孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括^Bi、mI、131In、WY和1861^。利用多种双功能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒剂的偶联物,所述偶联剂为例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二曱酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯曱酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对-重氮笨曱酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如曱苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可如Vitettaetal.,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的l-异硫氰酸根合苯曱基-3-曱基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。在另一个实施方案中,所述抗体可以偶^:于"受体"(如链霉亲和素)以用于肿瘤预靶向,其中将抗体-受体偶联物施用于患者,然后用澄清剂(clearingagent)从循环中去除未结合的偶联物,接下来施用偶联于细胞毒剂(例如,放射性核苦酸)的"配体"(例如,抗生物素蛋白)。8.免疫脂质体本文公开的抗体也可配制为免疫脂质体。包含所述抗体的脂质体通过本4页i或已欢口的方法制备,i口EpsteinWa/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,3688(19S5);Hwang"fl/"Proc.NatlAcad.Sci.USA,22:4030(1980);和美国专利4,485,045和4,544,545中描述的。美国专利5,013,556公开了循环时间增加的脂质体。特别有用的脂质体可以用脂质组合物通过反相蒸发法生产,所述脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇、和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通过孔径确定的滤器挤出脂质体,产生具有所需直径的脂质体。可以通过二石克化物交换反应如Martin"a/.,J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述将本发明抗体的Fab'片段偶联于脂质体。化疗剂(如多柔比星)任选包含在所述脂质体内。参见Gabizon"a/.,J.NationalCancerInst.,81(19):1484(1989)。9.抗体的药物组合物可以以药物组合物的形式施用抗体以治疗许多紊乱(病症)。如果将完整抗体用作抑制剂,则优选内在化抗体。然而,脂质体转染法(lipofections)或脂质体也可以用于将本发明的抗体递送到需要的细胞中。使用抗体片段时,最小的抑制性片段是优选的。例如,基于抗体的可变区序列,可以设计保留了结合HGFP链和/或干扰HGF(3链和c-met之间的相互作用、千扰HGF[3链N-末端插入、和/或干扰HGF卩链-p链相互作用的能力的肽和多肽分子。可以化学合成和/或通过DNA重组技术生产这些肽和多肽。参见,例如,Marasco"Proc.Natl.Acad.Sd.USA,巡7889-7893(1993)。本文的制剂也可以包含一种以上的对所治疗的特定病症来说必需的活性化合物,优选具有互补活性而相互之间又没有不利影响的那些活性化合物。或者,或除此之外,所述组合物可以包含增强其功能的药糸l例如细胞毒剂、细胞因子、化疗剂、或生长抑制性药剂。这样的分子在组合药物中适合以对预定目标有效的量提供。例如,也可以通过团聚技术或界面聚合将活性成分包装于所制备的微胶嚢中,例如分别包装于羟曱基纤维素或白明胶-微胶嚢和聚-(甲基丙烯酸曱酉旨)微胶嚢中,包装于胶状药物递送系统(例如,脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒、和纳米胶嚢)或者包装于常规乳液中。这些技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences,/^7上要用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易通过除菌滤膜过滤而实现。可以制备緩释制品。适当的緩释制品的例子包括包含抗体的固态疏水性聚合物半透性基质,其中基质为成形产品形式的,例如,薄膜、或微胶囊。緩释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如,聚(2-羟乙基-丙烯酸曱酯)、或聚乙烯醇)、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟丁酸。多聚物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够使分子释放超过100天,而特定的水凝胶释放蛋白较短的时间。当包裹的抗体长期残留于体内时,它们由于暴露于37°C的湿气而产生变性或凝集,导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性改变。可以根据所涉及的机理设计用于稳定化的合理策略。例如,如果发现聚集原理是通过硫代-二硫键交换而形成了分子间S-S键,那么可以通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制湿度、利用合适的添加剂、以及生成特异性多聚物基质组合物而实现稳定化。以下是本发明的方法和组合物的例子。在给出了以上提供的一般描述的前提下,可以理解能够实施许多其它具体方案。实施例才才谇+和方法基本上如Kirchhofer"a/.,JBiol,Chem.(2004),279:39915-24;Stamos"。/.(7004)EMBOJ.23:2325-35中所述制备HGF突变体。利用Kirchhofer等,/^7兰和Stamos等,/^7J:所述试剂和方法实施Met结合和MDA-MB435细胞迁移测试。基本上如Kirchhofer等,/^7J:所述利用A549细胞实施Met磷酸化测试。除了利用50ng/mlHGF以剂量依赖的方式添加HGF突变体以抑制磷酸化之外,以类似的方法实施Met磷酸化的抑制。基本上如Kirchhoferetal.,FEBSLett.(2005)579:1945-50所述在BxPC3测试中实施细胞增殖抑制。基本上如Nakatsuetal.(Microvasc.Res,66:102,2003)所述实施体外血管发生测试。在6天的试验期间,每隔一天以10|ig/ml的浓度向培养基中添加HGF突变体。试验结束时定量每J朱新芽数(numberofsproutsperbead),以4个独立试验的平均值士SD表示。结果利用竟争ELISA测试鉴定具有所示突变的HGF(3链突变体(仅仅为(3链和作为全长HGF)与野生型HGFP链(仅仅P链和全长HGF)相比较的MetIgG结合能力。为了最小化任何潜在的二硫键连接的二聚体形成,在C604S背景制备野生型HGF(3和HGF(3链突变体;这样野生型HGFp事实上为HGF卩C604S。此外,在细胞迁移测试中评估所选择的全长2个链HGF突变体(fUll-length2-chainHGFmutant)对生物学功能的影响(如果有的话),其为P链中突变的结果。结果示于图1A、B、C。如图2所示,HGF突变体G4981以剂量依赖的方式抑制Met的HGF-依赖的磷酸化;还显示了HGF突变体R424A:R494E(单链HGF)的结果。如图3所示,与野生型HGF相比,在Met磷酸化测试中,HGF突变体G498I和G498P激活Met明显减弱;也显示了HGF突变体R424A:R494E的结果。Met的HGF-依赖的磷酸化以剂量依赖的方式调节。突变体HGFG498I和G498P还抑制BxPC3细胞增殖,具有野生型HGF的2.5°/。和56%的活性。另外,在体外测试中,所选择的10吗/ml浓度的全长HGF突变体(D672N、V495G、G498I、R424A:R494E)抑制血管发生(图4),这样进一步证实了HGFp链(以及所选其突变)对HGF的整体生物学功能的重要性。部分参考文献Angeloni,D.,Danilkovitch-Miagkova,A.,Miagkov,A.,Leonard,E.丄,andLerman,M.I.(2004).ThesolublesemadomainoftheRONreceptorinhibitsMSP-inducedreceptoractivation.J.Biol.Chem.,279,3726-3732.Birchmeier,C.,Birchmeier,W"Gherardi,E.,andVandeWoude,G.F.(2003).Met,metastasis,motilityandmore.NatureRev.Mol.CellBiol.《915-925.Boose,J.A.,Kuismanen,E.,Gerard,R.,Sambrook,J.,andGething,M.J.(1989).Thesingle-chainformoftissue-typeplasminogenactivatorhascatalyticactivity:Studieswithamutantenzymethatlacksthecleavagesite.Biochemistry2S,638-643.Bottaro,D.P.,Rubin,J.S.,Faletto,D.L,Chan,A.M.,Kmiecik,T.E.,VandeWoude,GF.,andAaronson,S.A.(1991).Identificationofthehepatocytegrowth'factorreceptorasthec-metproto-oncogeneproduct.Science257,802-804.BrozeJr.,G.J.(2001).ProteinZ-dependentregulationofcoagulation.Thromb.Haemost.S(5,8-13.CCP4(1994).TheCCP4suite:Programsforproteincrystallography.ActaCrystallogrZ)50,760-763.Chirgadzeetal.,FEBSLetters(1998),430:126-129.Cohen,G.H.(1997).Align-aprogramtosuperimposeproteincoordinates,accountingforinsertionsanddeletions.JAppl.Crystallog,1160-1161.Cooper,C.S.,Blair,D.G.,Oskarsson,M.K.,Tainsky,M.A.,Eader,L.A.,andVandeWoude,G.F.(1984a).Characterizationofhumantransforminggenesfromchemicallytransformed,temtocarcinoma,andpancreaticcarcinomacelllines.CancerRes.",1-10.Cooper,C.S.,Park,M.,Blair,D,G"Tainsky,M.A.,Huebner,K.,Croce,C.M.,andVandeWoude,G,F.(1984b).Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline.Nature3/7,29-33.Danilkovitch,A.,Miller,M.,andLeonard,E.J.(1999).Interactionofmacrophage-stimulatingproteinwithitsreceptor.J.Biol.Chem.27《29937-29943.Danilkovitch-Miagkova,A.,andZbar,B.(2002).DysregulationofMetreceptortyrosinekinaseactivityininvasivetumors.J.Clin.Invest.709,863-867.Dateetal"FEBSLett.(1997),徵1-6.Dennis,MS.,Eigenbrot,C.,Skelton,N.J.,Ultsch,M.H.,Santell,L.,Dwyer,M.A.,O'Connell,M.R,andLazarus,R.A.(2000).PeptideexositeinhibitorsoffactorVilaasanticoagulants.Nature丰似,465-470.Derksen,RW.,Keehnen,R.M.J.,Evers,L.M.,vanOers,M.H.J.,Spaargaren,M.,andPals,S.T,(2002).Cellsurfaceproteoglycansyndecan-1mediateshepatocytegrowthfactorbindingandpromotesMetsignallinginmultiplemyeloma.Blood卯,1405-1410.DiCera,E.,Guinto,E.R.,Vindigni,A.,Dang,Q.D.,Ayala,Y.M.,Wuyi,M.,andTulinsky,A.(1995).TheNa+bindingsiteofthrombin.J.Biol.Chem.276,22089-22092.Dickinson,C.D.,Kelly,C.R.,andRuf,W.(1996).IdentificationofsurfaceresiduesmediatingtissuefactorbindingandcatalyticflmctionoftheserineproteasefactorVila.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,14379-14384.Donate,LE.,Gherardi,E.,Srinivasan,N.,Sowdhamini,R.,Aparicio,S.,andBlundell,T.L.(1994》Molecularevolutionanddomainstructureofplasminogen-relatedgrowthfactors(HGF/SFandHGFl/MSP).ProteinSci.3,2378-2394.Drain,J.,Bishop,J.R.,andHajduk,S.L.(2001).Haptoglobin-relatedproteinmediatestrypanosomelyticfactorbindingtoTrypanosomes.J.Biol.Chem.风30254-30260.Gherardi,E.,Youles,ME.,Miguel,R.N.,Blundell,T.L.,Iamele,L.,Gough,J.,Bandyopadhyay,A.,Hartmann,G.,andButler,P.J.(2003).FunctionalmapanddomainstructureofMET,theproductofthec-metprotooncogeneandreceptorforhepatocytegrowthfactor/scatterfactor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA12039-12044.Hartmann,G.,Naldini,L.,Weidner,K.M.,Sachs,M.,Vigna,E.,Comoglio,P.M.,andBirchmeier,W.(1992).Afunctionaldomainintheheavychainofscatterfactor/hepatocytegrowthfactorbindsthec-Metreceptorandinducescelldissociation.Proc.Natl.Acad.Sci.USAS9,11574-11578.Hartmann,G"Prospero,T.,Brinkmann,V"Ozcelik,C.,Winter,G"Hepple,J"Batley,S.,Bladt,R,Sachs,M.,Birchmeier,C.'"(1998).EngineeredmutantsofHGF/SFwithreducedbindingtoheparansulphateproteoglycans,decreasedclearanceandenhancedactivityinvivo.Curr.Biol.S,125-134.Hedstrom,L.(2002).Serineproteasemechanismandspecificity.Chem.Rev.风4501-4523.Huber,R.,andBode,W.(1978).Structuralbasisoftheactivationandactionoftrypsin.AccChem.Res.",114-122.Kunkel,T.A.(1985)Prac.Wa".v4cd腦82,488-492.Kurosky,A.,Barnett,D.R.,Lee,T.H.,Touchstone,B.,Hay,R.E.,Amott,M.S.,Bowman,B.H.,andFitch,W.M.(1980).Covalentstructureofh腿anhaptoglobin:aserineproteasehomolog.Proc.Natl.Acad.Sci.USA77,3388-3392.Lijnen,H.R.,VanHoef,B,,Nelles,L.,andCollen,D.(1990).Plasminogenactivationwithsingle-chainurokinase-typeplasminogenactivator(scu-PA).Studieswithactivesitemutagenizedplasminogen(Ser,Ala)andplasmin-resistantscu-PA(Lys158^Glu).J,Biol.Chem.2(55,5232-5236.Lin,C,Y"Anders,J.,Johnson,M.,Sang,Q.A.,andDickson,R.B.(1999).MolecularcloningofcDNAformatriptase,amatrix-degradingserineproteasewithtrypsin陽likeactivity,J.Biol.Chem.27《18231-18236.Lokker,N.A.,Mark,M.R.,Luis,E.A.,Bennett,G.L,Robbins,K.A.,Baker,J.B.,andGodowski,P.J.(1992).Structure-functionanalysisofhepatocytegrowthfactor:identificationofvariantsthatlackmitogenicactivityyetretainhighaffinityreceptorbinding.EMBOJ.仏2503-2510.Lokker,N.A.,Presta,L.G"andGodowski,P,J.(1994).MutationalanalysisandmolecularmodelingoftheN-terminalkringle-containingdomainofhepatocytegrowthfactoridentifiesaminoacidsidechainsimportantforinteractionwiththec-Metreceptor.ProteinEng.7,895-903.Ma,P,C.,Maulik,G"Christensen,J.,andSalgia,R.(2003).c-Met:structure,functionsandpotentialfortherapeuticinhibition.CancerMetastasisRev.",309-325.Malkowski,M.G.,Martin,P.D.,Guzik,J.C.,andEdwards,B.F.R(1997).Theco-crystalstructureofunligandedbovine-thrombinandprethrombin-2:movementoftheTyr-Pro-Pro誦Trpsegmentandactivesiteresiduesuponligandbinding.ProteinSci.6,1438-1448.Mark,M.R.,Lokker,N.A.,Zioncheck,T.F.,Luis,E.A.,andGodowski,P.J.(1992).Expressionandcharacterizationofhepatocytegrowthfactorreceptor-IgGfusionproteins.Effectsofmutationsinthepotentialproteolyticcleavagesiteonprocessingandligandbinding.J.Biol.Chem.2<57,26166-26171.Matsumoto,K.,Takehara,T.,Inoue,H.,Hagiya,M.,Shimizu,S.,andNakamura,T.(1991).Biochem.Biophys.Res.Commun.甜,691-699.Matsumoto,K"Kataoka,H.,Date,K.,andNakamura,T.(1998).Cooperativeinteractionbetween-and-chainsofhepatocytegrowthfactoronc-Metreceptorconfersligand-inducedreceptortyrosinephosphorylationandmultiplebiologicalresponses.J.Biol.Chem.273,22913-22920.Maulik,G,Shrikhande,A.,Kijima,T.,Ma,RC.,Morrison,P.T.,andSalgia,R.(2002).Roleofthehepatocytegrowthfactorreceptor,c-Met,inoncogenesisandpotentialfortherapeuticinhibition.CytokineGrowthFactorRev.73,41-59.Miller,M.,andLeonard,E.J.(1998).Modeofreceptorbindingandactivationbyplasminogen-relatedgrowthfactors.FEBSLett.429,1-3.Miyazawa,K.,Shimomura,T.,Kitamura,A.,Kondo,J.,Morimoto,Y"andKitamura,N.(1993).MolecularcloningandsequenceanalysisofthecDNAforahumanserineproteaseresponsibleforactivationofhepatocytegrowthfactor.J.Biol.Chem.10024-10028.Naka,D.,Ishii,T"Yoshiyama,Y"Miyazawa,K.,Hara,H.,Hishida,T.,andKitamura,N.(1992).Activationofhepatocytegrowthfactorbyproteolyticconversionofsinglechainformtoaheterodimer.丄Biol.Chem.267,20114-20119.Nakamura,T.,Nishizawa,T.,Hagiya,M.,Seki,T.,Shimonishi,M.,Sugimura,A.,Tashiro,K.,andShimizu,S.(1989).Molecularcloningandexpressionofhumanhepatocytegrowthfactor.Nature3仏440-443.Naldini,L.,Tamagnone,L.,Vigna,E.,Sachs,M.,Hartmann,G.,Birchmeier,W.,Daikuhara,Y.,Tsubouchi,R,Blasi,F.,andComoglio,RM.(1992).Extracellularproteolyticcleavagebyurokinaseisrequiredforactivationofhepatocytegrowthfactor/scatterfactor.EMBOJ.仏4825-4833.Okigaki,M,,Komada,M.,Uehara,Y"Miyazawa,K.,andKitamura,N.(1992).Functionalcharacterizationofhumanhepatocytegrowthfactormutantsobtainedbydeletionofstructuraldomains.Biochemistry37,9555-9561.Parry,M.A.,Fernandez-Catalan,C.,Bergner,A.,Huber,R.,Hopfner,K.P.,Schlott,B.,Guhrs,K.H.,andBode,W,(1998).Theternarymicroplasmin-staphylokinase-microplasmincomplexisaproteinase-cofactor-substratecomplexinaction.Nat,Struct.Biol.5,917-923.Peek,M.,Moran,P.,Mendoza,N.,Wickramasinghe,D.,andKirchhofer,D.(2002).Unusualproteolyticactivationofpro-hepatocytegrowthfactorbyplasmakallikreinandcoagulationfactorXIa.J.Biol.Chem.277,47804-47809.Peisach,E.,Wang,J,,delosSantos,T"Reich,E.,andRinge,D.(1999).Crystalstructureoftheproenzymedomainofplasminogen.Biochemistry35,11180-11188.Perona,J.J.,andCraik,C.S.(1995).Structuralbasisofsubstratespecificityintheserineproteases.ProteinSci.4,337-360.Rawlings,N.D.,O'Brien,E.,andBarrett,A.J.(2002).MEROPS:theproteasedatabase.Nucl.AcidRes,30,343-346.Renatus,M.,Engh,R.A.,Stubbs,M.T"Huber,R.,Fischer,S.,Kohnert,U.,andW.,B.(1997).Lysine156promotestheanomalousproenzymeactivityoftPA:X-raycrystalstructureofsingle-chainhumantPA.EMBOJ./6,4797-4805.Richardson,J.L.,Kroger,B.,Hoeffken,W.,Sadler,J.E.,Pereira,P.,Huber,R.,Bode,W"andFuentes-Prior,P.(2000).Crystalstructureofthehuman-thrombin-haemadincomplex:anexositeIl-bindinginhibitor.EMBO丄79,5650-5660.Shimomura,T.,Miyazawa,K.,Komiyama,Y.,Hiraoka,H.,Naka,D.,Morimoto,Y.,andKitamura,N.(1995).Activationofhepatocytegrowthfactorbytwohomologousproteases,blood-coagulationfactorXIIaandhepatocytegrowthfactoractivator.EurJBiochem229,257-261.Stubbs,M.,andBode,W.(1993).Aplayerofmanyparts:Thespotlightfallsonthrombin'sstructure.Thromb.Res.眠1-58.Takeuchi,T"Shuman,M.A.,andCraik,C.S.(1999).Reversebiochemistry:useofmacromolecularproteaseinhibitorstodissectcomplexbiologicalprocessesandidentifyamembrane-typeserineproteaseinepithelialcancerandnormaltissue.ProcNatlAcadSciUSA9《11054-11061,Trusolinoetal.,FASEBJ.(1998),12:1267-1280.Trusolino,L,andComoglio,P.M.(2002).Scatter-factorandsemaphorinreceptors:cellsignallingforinvasivegrowth.NatureRev.Cancer2,289-300.Tsiang,M.,Jain,A.K.,Dunn,K.E.,Rojas,M.E.,Leung,L.L.K.,andGibbs,C.S.(1995).Functionalmappingofthesurfaceresiduesofhumanthombin.J.Biol.Chem,270,16854-16863.Vijayalakshmi,J.,Padmanabhan,K.P.,Mann,K.G"andTulinsky,A.(1994).Theisomorphousstructuresofprethrombin2,hirugen-,andPPACK-thrombin:changesaccompanyingactivationandexositebindingtothrombin.ProteinSci.3,2254-2271.Wang,D.,Bode,W"andHuber.R(1985).BovinechymotrypsinogenA:x-raycrystalstructureanalysisandrefinementofanewcrystalformat1.8人resolution.J.Mol.Biol.595-624.Wang,D.,Julian,F.M.,Breathnach,R.,Godowski,P.J.,Takehara,T.,Yoshikawa,W.,Hagiya,M.,andLeonard,E.J.(1997).Macrophagestimulatingprotein(MSP)bindstoitsreceptorviatheMSPchain.J.Biol.Chem.272,16999-17004.权利要求1.包含HGF突变体的HGF/C-Met拮抗剂分子,所述HGF突变体在HGFβ链N端区域和/或HGFβ链二聚化区域包含突变。2.权利要求1的拮抗剂分子,其中HGFP链N末端区域中的突变削弱HGF(3链N-末端向HGF结合嚢中的插入,其中与野生型HGF相比,所得HGF突变体具有基本上减弱的生物学功能。3.权利要求2的拮抗剂分子,其中所述生物学功能为细胞增殖、细胞迁移、Met磷酸化或血管发生。4.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGFp链N末端区域中的突变削弱HGF(3链N-末端向HGF结合嚢中的插入,其中与野生型HGF相比,所得HGF突变体以基本上减弱的结合亲和力结合C-Met。5.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGF(3链N末端区域中的突变削弱HGF(3链N-末端向HGF结合嚢中的插入,其中所得HGF突变体以基本上与野生型HGF等同的亲和力结合C-Met。6.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中所述分子在HGF(3链二聚化区域包含突变,其中与野生型HGF相比,所得HGF突变体具有基本上减弱的生物学功能。7.权利要求6的拮抗剂分子,其中所述生物学功能为细胞增殖、细胞迁移、Met磷酸化或血管发生。8.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中所述分子在HGF[3链二聚化区域包含突变,其中所得HGF突变体具有减弱的与另一条HGFP链二聚化的能力。9.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGF链二聚化区域中的突变基本上不削弱所得HGF突变体与C-Met的结合。10.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGF卩链N末端区域中的突变位于位点V495、G498、R502加T503、或D672。11.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGF卩链N末端区域中的突变为V495G、V495A、G498I、G498P、G498V、R502del加T503del、或D672N。12.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGFP链二聚化区域中的突变位于位点N497、G498、P500、T501加R502、或R502。13.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中HGFP链二聚化区域中的突变为N497R或K,G498A或S,P500W、H或E,T501和R502之间的插入(例如,插入R和S),或R502del。14.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中位点N497的突变不是N497F、A或E。15.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中所述分子在位点534、578、619、673、692、693、694、695、696、699和/或702包含野生型氨基酸。16.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中与野生型HGF相比,所述分子具有减弱的C-Met信号能力。17.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中与野生型HGF相比,所述分子具有减弱的刺激细胞迁移的能力。18.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中与野生型HGF相比,所述分子具有减弱的刺激细胞增殖的能力。19.前述任一项权利要求的拮抗剂分子,其中与野生型HGF相比,所述分子具有减弱的刺激血管发生的能力。20.调节患者c-met活化的方法,所述方法包括为所述患者施用权利要求1-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子,从而调节c-met活化。21.调节患者细胞增殖的方法,所述方法包括为所述患者施用权利要求1-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子,从而调节患者的细胞增殖。22.调节患者细胞迁移的方法,所述方法包括为所述患者施用权利要求l-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子,从而调节患者的细胞迁移。23.调节患者细胞的血管发生活性的方法,所述方法包括为所述患者施用权利要求1-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子,从而调节患者细胞的血管发生活性。24.治疗患者与c-met活化有关的病理学状况的方法,所述方法包括为所述患者施用权利要求1-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子,从而治疗所述病理学状况。25.权利要求24的方法,其中所述病理学状况为癌症。26.编码权利要求1-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子的核酸。27.包含权利要求26的核酸的宿主细胞。28.包括含有权利要求1-19任一项的一种或多种HGF/c-met拮抗剂分子的容器的制品。29.制备权利要求l-19任一项的HGF/c-met拮抗剂分子的方法,所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述拮抗剂分子的核酸,并从所述细胞回收所迷拮抗剂分子。全文摘要本发明提供包含HGF的HGF/Met调节剂,所述HGF在影响HGF功能的区域具有突变,本发明同时提供以所述区域为目标的拮抗剂。本发明进一步提供鉴定、制备和利用这些调节剂的方法。文档编号C07K14/00GK101193910SQ200680020815公开日2008年6月4日申请日期2006年4月17日优先权日2005年4月15日发明者丹尼尔·K·柯克霍弗,克里斯琴·威斯曼,罗伯特·A·拉扎勒斯申请人:健泰科生物技术公司
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1