专利名称：：急性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤特异的cd43表位及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人急性白血病和'淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上表达的CD43表位及其用途。具体而言，本发明涉及一种在人急性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上表达、但不在成熟造血细胞和造血干细胞上表达的CD43表位，还涉及它在急性白血病和、淋巴母细胞性、淋巴瘤细胞的诊断和治疗上的用途。
背景技术：
：CD43分子也被称为涎福林或白涎蛋白，它是一种在除红细胞外的大多数造血细胞中表达的细胞表面分子。人CD43具有粘蛋白样的胞外域(235个氨基酸(aa))、跨膜域(23个aa)和胞质内域(123个aa)，三者均由一个外显子编码(Pallantetal.,ProcNailAcadSciUSA.1989，86:1328-32;Shelleyetal.，ProcNatlAcadSciUSA1989，86:2819-23)。人CD43的胞外域富含氨基酸丝氨酸(46个残基)和苏氨酸(47个残基)，它们大部分携带大约80个O-连接的糖链。另外，CD43携带1个N-连接的糖链。这些O-聚糖的结构在不同类型的细胞之间不同(Carlsson"fl/.，C7^附.1986，261:12787-95)。CD43基因由被一个378bp的内含子分开的两个外显子组成，藉此，整个翻译产物由第二个外显子编码(Shelleyetal.，肌oc/^附丄1990，270:569-76)。CD43已经被认为是限于除红细胞外的大部分白细胞、血小板和造血干细胞的特异性白细胞型标记(Remold-O'DonnellWfl/.，1987，70:104-9;Fukuda，Glycobiology.1991，1:347-56)。然而，已经证明CD43在非造血源的人肺瘤细胞中表达，所述人肿瘤细胞为例如人宫颈癌细胞系(CaSKI)、人肺癌细胞系(A549)、人乳腺癌细胞系(MCF7)、人纤维肉瘤细胞系(HT108Q)和人结肠腺癌细胞系(COLO205、HT29、Caco國2、DLD國1和SW480)(Fernandez-Rodriguez"a/"rwmo"r祝o/.2002，23:193-201)。CD43还在人结肠癌组织中表达(SikutCa/，/Cflw亂1999，82:52-8;Jung"/，/尸fl麵，38:8-14)。生物合成研究表明，具有大约40kDa的预测大小(包括一个N-聚糖)的CD43前体在电泳时在54kDa的分子量处形成明显迁移条带。该前体随后被转化为一个成熟的糖基化分子，其分子量由于不同的糖基化作用而从115kDa到最高至200kDa以上不等。胸腺细胞、CD4+T淋巴细胞和单核细胞主要表达115kDa的同种型，而130kDa的形式大部分在激活的CD4+T细胞、CD8，静息细胞和激活T细胞、嗜中性并立细胞、血小板和B细月包上存在(Rosensteinetal"ImmunolRes.1999，20:89-99)。在同一细胞的表面似乎可以有多于一种的同种型共表达。被严格调节的翻译后O糖基化模式产生了在不同细胞类型中差异表达的这些特征性分子量同种型。特别地，核心2P-1,6-7V-乙酰葡糖氨基转移酶(C2GnT)的表达使得130kDaCD43同种型在胸腺细胞和T细胞中表达(Pilleretal"JBiolChem.1988，263:15146-50)。直到最近，多于17种的抗-人CD43抗体已经被报道。这些抗体大部分与胞外域上的糖表位作用，并且所有已知的抗-CD43抗体检测到在成熟造血细胞上表达的CD43蛋白质(表l)。因此，它们对检测或消除白血病或淋巴瘤细胞是无效的。表1抗-CD4抗体CD43-阳性细胞CD43-阴性细胞表位*参考文献激活的CD4+T细胞、CD8+T细胞、胸腺细^立细胞、T305胞、骨髓中的髓细胞核心-21,2,红细胞、血小板前体<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*1.Foxeta!"//附附wwc;/.1983，131:762-7;2.Saitohetal.，1991,77:1491-9;3.Remold-O'Do腿lletal"1987，70:104-9;4.Borcheetal"￡^尸J/画画/.1987，17:1523-6;5.Stefa,aetal"F函肠/1988，34:255-65;6.Alvaradoetal"//附m""o/.1995，25:1051-5;7.Strossetal，/C7/w尸fl,/io/.1989，42:953-61;8.Horejsietal"1997，JK/s/"'/wo勿T'Wfl/，_Le"cocj^eT);/7/wg，PW.1^7:附"eO//Z)断尸eWfl"卯JAi紐ew51Garland,NewYorkandLondon;9.Tkaczuketal.，7Y^Me1999，54:1-15;10.Sikutetal"/CVmc".1999，82:52-8;11.Mukasaetal，J/"/画画/.1999,11:259-68.
发明内容本发明的目的是提供一种急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤相关的CD43表位，其中该表位在人急性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上表达，但不在成熟的造血细胞和造血干细胞上表达。因此，本发明提供一种CD43表位的分离的多肽，包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供识别CD43表位的物质。优选地，本发明提供一种与包括SEQIDNO:1氨基酸序列的CD43表位特异性结合的抗体或其片段。本发明的第三个目的是提供一种产生识别CD43表位的物质的方法。本发明的第四个目的是提供用于急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤诊断的物质。本发明的第五个目的是提供一种对急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤进行诊断的方法。因此，本发明提供一种诊断急性白血病的方法，包括将生物样品中的白血病细胞与抗-CD43表位抗体一起孵育，并检测对抗-CD43表位抗体的阳性反应。本发明提供一种诊断具有白血病急性发作的慢性白血病的方法，包括将生物样品中的白血病细胞与抗-CD43表位抗体一起孵育，并检测对抗-CD43表位抗体的阳性反应。本发明提供一种诊断淋巴母细胞性淋巴瘤的方法，包括将生物样品中的淋巴瘤细胞与权利要求6的抗-CD43表位抗体一起孵育，并检测对抗-CD43表位抗体的阳性反应。本发明的第六个目的是提供一种能杀死急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的肿瘤细胞的药物组合物。本发明的第七个目的是提供一种通过应用本发明的诊断物质进行-诊断的方法。另外，本发明提供一种应用本发明的治疗物质进行治疗的方法。通过在与附图一起考虑时参照下面的详细描述，本发明可得到更好的理解，从而对本发明更为完整的理解及与之相伴的许多优点可容易地显而易见，其中图1是通过杂交瘤克隆的上清液进行的、胸腺的免疫组织化学染色的照片，所述杂交瘤克隆产生特异性针对CD43表位的EB-1单克隆抗体。图2是EB-1单克隆抗体在人胸腺细胞表面的反应性的三色流式细胞术照片。图3是EB-1单克隆抗体在人外周血白细胞和脐带血造血干细胞表面的反应性的三色流式细胞术照片。图4是EB-1单克隆抗体在人骨髓细胞表面的反应性的三色流式细胞术照片。图5是BB-1单克隆抗体在人CD43转染的29T细胞系表面的反应性的单色流式细胞术照片。图6是用或者不用唾液酸酶处理时EB-1单克隆抗体在人Molt-4细胞系表面的反应性的单色流式细胞术照片。图7是用或者不用唾液酸酶处理时，人胸腺细胞和Molt-4细胞系的细胞溶胞产物在SDA-PAGE分析后、经EB-1单克隆抗体免疫印迹的照片。图8是11种类型的CD43缺失突变体示意图。图9是11种类型的CD43缺失突变体的SDA-PAGE分析后、用EB-1单克隆抗体和抗-GST多克隆抗体进行的免疫印迹的照片。图10是EB-1单克隆抗体在人白血病细胞表面的反应性的单色流式细胞术照片。图11是用EB-1单克隆抗体对淋巴母细胞性淋巴瘤组织进行免疫组织化学染色的照片。图12是EB-1单克隆抗体和抗-人I类MHC单克隆抗体在RAG-1缺陷型小鼠的外周血中的白血病细胞表面的反应性的双色流式细胞术照片，所述RAG-1缺陷型小鼠通过静脉内途径注射CCRF-CEM细胞并用EB-1或对照抗体处理。图13是用CD43表位免疫小鼠产生的两种其他抗-CD43抗体(EB-2和EB-3)在CD43转染的ETA细胞系、人胸腺细胞、人外周血白细胞和人白血病样品的表面的反应性的单色流式细胞术照片。图14是5种类型的CD43缺失型突变体的SDA-PAGE分析后的、用EB-2和EB-3单克隆抗体进行免疫印迹的照片。具体实施例方式本发明提供一种在急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的肿瘤细胞上表达、但不在成熟的造血细胞和造血干细胞上表达的CD43表位。本发明的CD43优选为人CD43,其序列已经^皮提交到NCBIGenBank,登记号为No.M61827。CD43表位是任何包括SEQIDNO:1氨基酸序列(下文中，EP6)并且更优选包括SEQIDNO:2氨基酸序列(下文中，EP9)的多肽。EP6:ProLeuTipThrSerIk(SEQIDNO:1)EP9:GluGlySerProLeuTipThrSerHe(SEQIDNO:2)。在一个优选的实施方案中，本发明提供一个长度小于200个氨基酸、更优选长度小于100个氨基酸、更优选长度小于50个氨基酸的多肽，包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的氨基酸序列。本发明也提供了基本上由SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的氨基酸序列组成的多肽。本发明也提供了由SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的氨基酸序列组成的多肽。该CD43表位(EP6和EP9)可以从人组织纯化、通过化学合成或者由生物技术产生。而且，本发明提供了识别本发明的CD43表位的物质。该物质选自抗体、其片段和配体，并且所述抗体优选地选自单克隆抗体和多克隆抗体，更优选地，抗体来源于人和动物。所述抗体包括含抗原识别区域(l&和V￡)的抗体的一部分，因此具有优先识别抗原的能力。另外，它也包括抗体片段，例如F(ab')2、Fab和Fv。优选地，抗体片段(Fv)包含抗体的单链多肽片段(被称为单链Fv)，它通过在Fw和^两个多肽之间插入增加热稳定性的连接肽制备得到。本发明进一步提供了识别本发明的CD43表位的嵌合抗体。本文使用的术语"嵌合抗体"是指这样一种抗体其中来源于一个物种的抗体的可变区与来源于另外一个物种的抗体的恒定区结合，或者是指CDR移植抗体。嵌合抗体通过重组DNA才支术构建，例如Shaw，etal.,J.Immun.，138:4534(1987)，Sun，LK.，etal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:214-218(1987)中对嵌合抗体有所描述。其他已知的技术可以被用来产生CDR移植抗体和嵌合抗体。"CDR"或"互补决定区"或"高变区"被定义为抗体的轻链和重链上的这样一种氨基酸序列，所述氨基酸序列形成有助于形成抗原结合位点的三维的环结构。本文使用的术语"CDR移植"抗体是指具有这样一段氨基酸序列的抗体其中在轻链和/或可变域中的一个或多个CDR序列的至少一部分^f皮来自一种抗体的CDR序列的类似部分取^，所述抗体对给定的抗原或受体具有一种不同的结合特异性。术语"轻链可变区"和"重链可变区"分别指轻链和重链的N-末端部分的区域或结构域，对于每种抗体，它们具有各不相同的一级氨基酸序列。抗体的可变区由轻链和重链的氨基末端结构域组成，它们折叠在一起形成抗体的三维结合位点。据报道，类似的CDR序列是被"移植"到底物或受体抗体上。"供体"抗体是提供CDR序列的抗体，接受置换序列的抗体是"底物"抗体。用这里提供的教导并结合本领域已知的方法(见Borrebaeck，C.A.，AntibodyEngineering:APracticalGuide,W.H.FreemanandCompany,NewYork,1992，通过引用纳入)，本领域的技术人员可以容易地产生这些CDR移植抗体。本发明还提供识别本发明的CD43表位的人源化抗体。本文使用的术语"人源化抗体"是指包含非人类(例如鼠类)抗体和人抗体的序列的抗体形式。这些抗体是包含来自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体可包括至少一个可变区、通常两个可变域的几乎全部，其中所有的或几乎所有的高变环与非类人免疫球蛋白的高变区对应，并且所有的或几乎所有的FR区域为人免疫球蛋白序列的FR区域。任选地，人源化抗体也可以包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常包括人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。参见例如美国专利4，816，567(Cabilly);Queenetal.(1989)Proc.Nat'lAcad.Sci.USA86:10029-10033;和ANTIBODYENGINEERING:APRACTICALAPPROACH(OxfordUniversityPress1996)。在本发明的一个优选的实施方案中，抗体与由SEQIDNO:l中显示的氨基酸序列组成的肽相结合。抗体或其片段可以进一步包括选自放射性同位素、毒素、荧光物质和染色物质的标记物质。荧光物质的实例有荧光素-5-异硫氰酸(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)和生物素，但是不局限于这些。抗体或其片段可以进一步包括选自放射性同位素、毒性化学物质、毒性蛋白质和抗肿瘤剂的毒性物质。抗体或其片段与毒性蛋白质结合产生融合蛋白。毒性蛋白质的实例包括蓖麻毒蛋白、皂草毒蛋白、多花白树毒蛋白、苦瓜毒蛋白、白喉类毒素和假单胞菌毒素，但是不局限于这些。本发明也提供产生该物质的一种方法，并且提供产生该抗体的细胞。产生该抗体或其片段的方法包括如下步骤(a)用包含CD43表位的多肽、蛋白质或者蛋白质片段或表达CD43表位的细胞免疫动物，(b)从该免疫的动物提取脾细胞，(c)将脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并(d)筛选产生针对CD43表位的抗体的杂交瘤细胞。该物质可以通过体外培养或将产生该物质的细胞注射到动物中获得。该物质可以从腹膜内注射产生该物质的细胞的动物的腹水中获得。该物质可以通过离子交换色谙或亲和柱色谱从培养上清液或腹水中纯化。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性、淋巴瘤的药物组合物，包括抗CD43表位抗体或其片段和可药用载体。根据本发明的抗体或其片段的给药可以使用药物组合物的任何可接受的给药模式进行。因此，给药例如可以是，抗原识别物质可以以固体、半固体、冻干粉剂的形式，或者以液体剂型，例如片剂、栓剂、丸剂、软弹性明胶胶嚢和硬明胶胶嚢、粉剂、溶液、悬浮液、或气雾剂等等，优选以适合精确剂量的简单给药的单位剂型，口服给予或更优选通过肠胃外途径给予患者。该药物组合物通常包括常规的药物载体或赋形剂和作为活性药剂(或其中一种活性药剂)的本发明的抗体，并且另外可以包括其他医学试剂、药用试剂、载体、佐剂、稀释剂、运载体或它们的组合。这些可药用的赋形剂、载体或添加剂以及用于各种给药模式的药物组合物的制备方法是本领域的技术人员所熟知的。活性组分的合适剂量可以基于受试者的状况选择，例如每天从3mg到6,000mg。在一个实施方案中，本发明涉及一种使用抗体或其片段治疗急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的方法，所述抗体或其片段选自抗体、抗体片段、单链多肽抗体片段和配体。该抗体或抗体片段优选选自单克隆抗体和多克隆抗体，并且更优选地，它来源于人和动物。优选地，该抗体或其片段进一步包括选自放射性同位素、毒性化学物质、毒性蛋白和抗肿瘤剂的毒性物质。而且，本发明提供了一种使用抗体或其片段进行急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤诊断的方法。该方法包括如下步骤(a)将抗体或其片段与生物样品中的细胞一起孵育，并(b)检测显示出针对该抗体的阳性反应的样品。肿瘤优选为急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病或淋巴母细胞性淋巴瘤。另外，本发明提供了一种利用该物质的急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的诊断试剂盒。除了该物质外，该诊断试剂盒可包括检测抗原-抗体反应的方法。该检测方法优选地选自流式细胞术、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)和发光免疫测定(LIA)。该检测方法包括标记物质，选自酶(例如辣根过氧化物酶(HRP))、荧光物质(例如FITC)、发光物质(例如鲁米诺、异氨基苯二酰肼和光泽精)和同位素(例如1251、3H、14C和1311)，但是并不认为以任何方式仅限于这些。抗原识别物质的反应性可以利用检测酶反应、荧光、发光或辐射的装置确定。该诊断试剂盒可以被做成包含抗体或其片段的流式细胞术试剂盒、免疫组织化学试剂盒、ELISA试剂盒或条带试剂盒(stripkit)。参考如下的实施例对本发明作进一步地更详细地解释。然而，这些实施例并不能以任何方式解释为对本发明的范围的限制。实施例1为了研究胸腺细胞上的特异性细胞表面蛋白质，按照以下实施例，将人胸腺细胞给予至Balb/c小鼠体内，以产生针对人胸腺细胞的抗体。107个人胸腺细胞经腹膜内给予至Balb/c小鼠并将其免疫，六周内每两周免疫一次。在最后一次给药后3天取出该Balb/c小鼠的脾脏来制备脾细胞悬液。通过将人胸腺细胞免疫的Balb/c的脾细胞与对9-氮鸟噤呤具有抗性的SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合产生单克隆抗体。细月包融合方法参照Koeler和Milstein的方法(Koeler&MilsteiniVflZwre，1975，256，495-497)。用50%的聚乙二醇4000使108个脾细胞与107个骨髓瘤细胞融合。洗涤细胞并将其重新悬浮于DMEM(Dulbeco'smodifiedEagle'smedium)培养基中，该培养基含20%牛血清白蛋白、100(iM的次黄嘌呤、0.44nM氨基蝶呤和16nM脱氧胸腺嘧啶苷(HAT培养基)。将细胞接种到四个96-孔板上并且在37°0和5%C02的培养箱中培养。经过两周时间当集落形成后，制备上清液并且用免疫组织化学和流式细胞术观察抗体的反应性。每孔含有105个以上细胞的孔被认为是阳性组。从含有高反应性抗体的孔中收集细胞，并且通过有限稀释法以每个孔0.5个细胞进行亚克隆以产生具有高反应性抗体的稳定的杂交瘤克隆。这个杂交瘤克隆分泌抗体至培养基中，存储上清液为下一步备用。实施例2为了在实施例1产生的杂交瘤克隆中发现分泌可识别胸腺细胞上的特异性细胞表面抗原的抗体的克隆，根据通过将抗生物素蛋白和生物素结合的抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)染色法，利用实施例1产生的杂交瘤克隆的上清液，在4pm厚的新鲜组织切片和福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片上进行免疫过氧化物酶染色。单克隆细胞的上清液用作一抗。石蜡包埋的组织在除去石蜡之后用正常小鼠血清处理，并且保持1小时以防止非特异性背景染色。在加入一抗后，将它们放置过夜并用磷酸盐緩冲盐水(PBS)洗涤三次。加入用作二抗的生物素化的山羊抗小鼠免疫球蛋白。在室温下放置l小时，用PBS洗涤三次。然后加入链亲和素和辣根过氧化物酶的缀合物。将DAKO生产的3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和H202溶液加入到染色细胞中，处理20分钟并用PBS洗涤三次。盖上盖玻片后在光学显微镜下观察。选出产生特异性针对人胸腺细胞的抗体的杂交瘤克隆系。具有识别胸腺细胞的抗体的一个克隆叫做EB-1。图1是用产生EB-1抗体的杂交瘤克隆的上清液进行胸腺免疫組织化学染色的照片。如图1所示，大部分的胸腺细胞被阳性染色。胸腺细胞的细胞表面被强染色，因此EB-1抗体识别的抗原是细胞表面抗原。实施例3为了根据胸腺细胞的发育阶段评估EB-1抗体的反应性，进行了流式细胞术。将在心外科手术中从患者体内摘除的人胸腺充分地剪碎，制备成单细胞的悬浮液。将lxl(^个细胞悬浮于100nlPBS中，并且分装到各测试管中。加入IOOnlEB-1培养上清液并搅拌。使该溶液在4。C下反应30分钟，以1,500rpm离心5分钟，沉淀用PBS洗涤两次以除去未反应的抗体。将该沉淀悬浮于含稀释的二抗(FITC-缀合的山羊抗-30小鼠Ig，由Zymed生产)的50|ul溶液中，在4。C避光反应30分钟。洗涤两次以后，将沉淀悬浮于含藻红蛋白(PE)-缀合的抗-CD8抗体和别藻蓝蛋白(APC)-缀合的抗CD4抗体的50!il溶液中，在4"C避光反应30分钟，然后洗涤两次。最后，在离心后，向细胞沉淀中加入200plPBS。根据CD4和CD8的表达模式将胸腺细胞分成四种亚型(即CD4CD8双阴性胸腺细胞、CD4+CD8+双阳性胸腺细胞和CD4+CD8或CD4CD8+单阳性胸腺细胞)，用流式细胞术分析EB-l-阳性细胞的比率和EB-1染色的强度。图2显示三色流式细胞术分析的结果，显示了BB-1对所有胸腺细胞亚型的反应性，特别地，在双阳性胸腺细胞上的染色强度最高。在图2中，实线表示EB-1抗体的染色，实心直方图表示无关抗体的阴性染色图。实施例4为了获得EB-1分泌型杂交瘤克隆分泌的高浓度的抗体，制备腹水。在将0.5ml的降植烷(pristine)通过腹膜内途径给予Balb/c小鼠体内后三周，用含10%牛血清的DMEM培养107个EB-1杂交瘤克隆。在2到3周后，收集腹水。这时抗体的浓度是5到10mg/ml。因为有许多污染蛋白质，例如腹水中的白蛋白，仅纯化对人胸腺细胞有应答的免疫球蛋白。为了从含大量抗体的腹水中纯化抗体，进行Q-Sepharose色i普和羟基磷灰石(Bio-gelHTPGel，由Pharmacia生产)色谱过程，所述腹水是从经腹膜内途径给予了EB-1单克隆杂交瘤细胞的Balb/c小鼠获得的。在冰上，向每10ml腹水中緩慢加入3.14g硫酸铵(用50%的(NH4)2S04沉淀)。将混合物以15，000rpm离心30分钟，重新悬浮于去离子水中并用l升緩冲液(20mM磷酸盐，pH7.4)透析。将该溶液经过并吸附于预先用緩沖液(20mM磷酸盐，pH7.4)平衡过的Q-Sepharose柱，然后使緩冲液再次通过该柱以除去柱中的游离蛋白质，在这之后用緩冲液I(20mM磷酸盐，pH7.4)和緩冲液I1(20mM磷酸盐和8.5MNaCl,pH7.4)以0M到0.8MNaCl的线性梯度洗脱柱中吸附的蛋白质。每个级分在SDA-PAGE中进行电泳，收集含EB-1抗体的级分。该级分然后用緩冲液(20mM磷酸盐，pH6.8)透析，并且通过预先用緩冲液(20mM磷酸盐，pH6.8)平衡过的羟磷灰石柱。緩冲液(20mM磷酸盐，pH6.8)中的级分经过柱子以除去游离蛋白质，并且用緩沖液III(20mM磷酸盐，pH6.8)和緩冲液(300mM磷酸盐，pH6.8)以0到0.3M的磷酸盐线性梯度洗脱。每个级分在SDS-PAGE中进行电泳，收集含多于95%的EB-1抗体的级分。收集的EB-1抗体用合适的緩沖液透析并存储。经过重复实验，从1ml的腹水制备得到5至10mg的BB-1抗体。实施例5使用实施例4所纯化的EB-1抗体作为一抗，根据实施例3的流式细胞分析实施本实施例，来研究EB-1抗体是否对胸腺之外的正常白细胞产生反应。对于此分析，将纯化的EB-1抗体直接结合到FITC或PE，在这种情况下不需要使用二抗来获得荧光，或者生物素-缀合的EB-1抗体与荧光-缀合的链亲和素结合使用。下面的表2显示正常外周血白细胞、培养在含10吗/ml植物凝集素(PHA)或5吗/ml抗-CD3抗体的培养基中的激活的外周血单核细胞、正常脾细胞、正常胸腺细胞和脐带血中的CD34+AC133+造血干细胞的细胞表面上EB-1抗体的反应性。除了胸腺细胞外，所有这些细胞都对EB-1抗体呈阴性。正常白细胞的流式细胞分析的代表性结果在图3中显示，其中实线代表EB-1抗体的染色，实心直方图表示无关抗体的阴性染色图。表2细胞EB-l-阳性外周血细胞红细S包>-淋巴细胞_单核细胞-粒细胞-血小板-激活的外周血PHA(10|Hg/ml)-抗CD3抗体(5|ag/ml)-脾细胞-胸腺细胞++*脐带血中的CD34+AC133+造血-干细胞_*阴性染色**多于90%细胞阳性染色PHA，植物凝集素实施例6使用实施例4所纯化的EB-1抗体作为一抗，根据实施例2的免疫组织化学测定法实施本实施例，以确定BB-1抗体是否对胸腺之外的正常组织产生反应。下面的表3显示EB-1抗体在各个不同组织中的反应性。除了胸腺细胞之外，所有其他组织包括外周淋巴组织、小脑、胰、卵巢和睾丸、皮肤、肺、肾上腺和肾均为阴性染色。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例7使用实施例4所纯化的EB-1抗体作为一抗，根据实施例3的流式细胞分析实施本实施例，来研究EB-1抗体是否对正常骨髓细胞产生反应。对于此分析，将生物素-缀合的EB-1抗体和APC-缀合的链霉亲和素，与FITC-缀合的抗CDIO、抗CD33、抗CD38、抗CD71或抗AC133和PE-缀合-抗CD34结合使用。图4是三色流式细胞分析的结果，其中对CD34+细胞设门。多能干细胞被定义为骨髓或脐带血中的CD34+AC133+(图4A)或CD34+CD38々暗(图4B)细胞，并且它们完全不会显示出对EB-1抗体的反应性。另外，含有几乎所有的集落形成细胞(例如能够形成粒细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞(CFU-GEMM)、CFU-GM和爆发集落形成单位红细胞的祖细胞)的CD34+CD33+细胞(图4D)和CD34+CD71"工细胞定向祖细胞(图4E)也没有被EB-1抗体染色。相反，在大部分的淋巴定向CD34+CD10+前体(图4C)上观察到EB-1抗体的阳性染色。总结本结果，EB-1-反应性^^限制在胸腺细胞和骨髓中的部分造血前体中，但是在包括成熟外周血细胞和造血干细胞的任何其他造血细胞和非造血组织中不存在。实施例8为了明确EB-1抗体识别的抗原，4吏用Invitrogen生产的poly(A)十RNA和pcDNA3表达载体制备人胸腺细胞的cDNA文库。该文库包含3.5xl(^个独立集落。使用的宿主菌的菌抹是大肠埃希氏菌(Ew/ien'c/n'flco//)MC1061/P3。质粒pMIK/D3T31的构建是通过将Gb3合酶克隆pD3T31(Haraguchietal"Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.1994，91:10455-9)的Xhol片段插入到pMIK/Neo表达载体中。如前人所述(Davisetal.，MethodsinMolecularBiology,ElsevierScience,NewYork1986:285-289),先扩增cDNA文库的质粒并使用DEAE-葡聚糖将其与质粒pMIK/D3T-31—起转染到293T细胞中。10-cm的培养皿上1.5xl(^个未完全汇合的293T细胞用cDNA文库质粒和pMIK/D3T-31各8pg共转染。在60h后，转染的细胞从培养皿上解离并且与1:200稀释的EB-1抗体在冰上共孵育45分钟。如前人所述(Wysockietal"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1978,75:2844-8),将细胞接种于包#1了山羊抗小鼠IgM的培养亚上。将从长于培养亚中细胞(pannedcell)获得的质粒DNA转化到293T中。扩增得到的质粒DNA被再次转染，并且同样的步骤被再重复4次。之后制得每个包含30个集落的96个孔(pool)并通过EB-1反应性进行筛选。最后，筛选出来自两个阳性孔的17个克隆，并且利用微量DEAE-葡聚糖转染和免疫荧光测定分离在293T上产生EB-1反应性的三个单克隆。分离的cDNA质粒用Xhol和HindIII消化，并且克隆进噬菌净立BhieScript(pBSK)KS(+)载体中。该克隆的缺失型突变体用Kilo-S叫uence缺失试剂盒制备。使用T3/T7染料引物或者四个其他常用的双脱氧终止子进行双脱氧核香酸终止测序，用的是AppliedBiosystems生产的PRISM染料终止子循环测序试剂盒和377型DNA测序仪。通过这个方法鉴定的DNA序列的Blast检索表明EB-1抗体识别的抗原是人CD43。为了确认EB-1抗体识别的人CD43抗原，用EB-1抗体和一种已知的抗CD43抗体DFT-1对人CD43转染的293T细胞染色。如图5所示，EB-1抗体对野生型293T细胞不反应，而CD43转染的293T细胞被EB-1和DFT1两种抗体染色。因此，EB-1是抗人CD43的单克隆抗体。因为CD43是高度糖基化的蛋白质，所以我们研究了对CD43分子的唾液酸酶处理是否改变EB-1抗体对CD43抗原的免疫反应性。图6显示经过或未经过唾液酸酶处理的Molt-4细胞的流式细胞分析。虛线表示无关抗体的阴性染色曲线，细实线和粗实线分别表示EB-1抗体对未经过和经过唾液酸酶处理的Molt-4细胞的免疫反应性。BB-1抗体对Molt-4细胞的免疫反应性不受唾液酸酶处理的影响。为了确认这些结果，进行了SDS-PAGE和Western印迹。将lx107个经过或未经过唾液酸酶处理的人胸腺细胞或Molt-4肿瘤细胞悬浮于1ml的裂解緩冲液(50mMTris國HCl，pH74，150mMNaCl，0.5%w/vNonidetP-40和lmM苯曱磺酰氟(PMSF))中，4'C下振摇30分钟，并且在13,000g下离心15分钟除去细胞核。在还原的条件下，在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上电泳分离上清液。分离胶的丙烯酰胺的浓度是10%，并使用合适分子量的标记。蛋白质向硝酸纤维素膜的电泳转移在45V下进行16小时。在蛋白转移以后，该硝酸纤维素膜用含5%脱脂乳和0.05%吐温20的PBS的封闭緩冲液孵育两个小时，然后与经封闭緩冲液稀释、浓度为1ng/ml的EB-1抗体孵育过夜。该膜用洗涤緩冲液(含0.05%吐温20的PBS)冲洗三次，并且与亲和纯化的山羊抗小鼠免疫球蛋白G孵育1h，该免疫球蛋白G缀合有辣根过氧化物酶，并由封闭緩冲液1:3000稀释。在洗涤三次以后，每个反应蛋白带用AmershamPharmaciaBiotech生产的增强化学发光(ECL)试剂盒检测。图7显示胸腺细胞(A&B)和Molt-4细胞(C&D)的溶胞产物采用EB-1抗体的SDA-PAGE和Western印迹分析。泳道A和C表示未经过唾液酸酶处理的细胞溶胞产物的电泳，而泳道B和D是经过唾液酸酶处理的溶月包产物的电泳。EB-1抗体识别经过和未经过唾液酸酶处理的两种CD43分子。这说明EB-1抗体可能识别CD43分子的未糖基化的区域。实施例9为了确定EB-1抗体识别的CD43表位，构建CD43突变体。人CD43基因的编码序列从CD43cDNA扩增得到并被用来构建表达栽体。例如，为了产生谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-融合蛋白，通过将PCR片段克隆进Pharmacia生产的pGEX-2T载体中来构建CD43重组质粒。PCR扩增用的引物的选择是基于GeneBank中的序列，并且经过修饰以包含BamHI和EcoRl或者和BglII限制性位点，以易于克隆。纯化的PCR产物和pGEX-2T载体都被BamHI和BglII或者和EcoRl在37°C下消化过夜，用由生产的T4DNA连接酶在16。C连接过夜，并且接着用来转化大肠埃希氏菌感受态TOPIOF'细胞。图8显示出11个CD43缺失型突变体的示意图。例如，pGEXl-253表示包含人CD43的第1到第253个氨基酸的pGEX-2T载体。为了表达含人CD43序列的GST融合蛋白，用重组质粒转化的大肠埃希氏菌TOP10细胞在含50jig/ml氨千青霉素的LB(Luriabroth)培养基中37。C培养过夜。过夜培养的细胞用含相同浓度的氨千青霉素的新鲜LB培养基稀释20倍，并在37。C下培养3到4h，直至光密度值达到0.6。在培养物中加入终浓度1mM的IPTG以诱导基因表达。37。C下持续振摇孵育4h之后，4。C下6000g离心15分钟沉淀细胞，然后每克沉淀细胞用3ml的裂解緩沖液(50mMTris-HCI，pH8.0，1mMEDTA,100mMNaCl)重新悬浮。悬浮液中加入终浓度0.2mM的PMSF，水育30min。为了用BB-1抗体进行CD43突变体的Western印迹，GST-CD43融合蛋白每个溶胞产物的等份试样用10%的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后被印迹到硝酸纤维素膜上。该硝酸纤维素膜用EB-1抗体或抗-GST多克隆抗体染色，并且每个反应蛋白带用根据实施例8的方法的增强化学发光检测。图9显示用EB-1(A)和抗-GST(B)抗体进行的CD43突变体的Western印迹分析。泳道1代表pGEXl-253、泳道2为pGEXl-98、泳道3为pGEXl-87、泳道4为pGEXl-81、泳道5为pGEXl-75、泳道6为pGEXl-70、泳道7为pGEX70-99、泳道8为pGEX71-81、泳道9为pGEX73-81、泳道10为pGEX76-81、泳道11为pGEX73-80、泳道12为pGEX2T,以及泳道13为人胸腺细胞溶胞产物。如图9中所示，pGEX73-81包含通过EB-1进行CD43抗原识别的最小序列，因此针对EB-1抗体的CD43表位是CD43的第73到第81位氨基酸序列。该序列如下GluGlySerProLeuTrpThrSerlie(SEQIDNO:2)。因此，从EB-1抗体识别的表位不在成熟血细胞、造血干细胞、骨髓中的造血前体的亚型或任何非造血组织中表达这一角度来看，该序列是非常有用的。实施例10实施例3、5、6和7显示，EB-1免疫反应性局限于骨髓中除造血千细胞之外的造血前体的亚型。在本实施例中，才艮据实施例3的流式细胞分析，对EB-1抗体识别的CD43表位在白血病细胞上的表达进行研究。来自白血病患者的外周血被收集在EDTA管中，并且红细胞和成熟粒细胞用AmershamPharmaciaBiotech生产的Ficoll-Hypaque离心除去。该纯化的细胞用FITC-缀合的EB-1染色并用流式细胞仪分析。下面的表4是采用流式细胞术并利用EB-1抗体进行的白血病样品的标记分析的结果。在38个白血病病例(包括急性骨髓性白血病(AML)、急性成淋巴性白血病(ALL)和具有白血病急性发作的慢性骨髓性白血病(CML))中的31例(81.6%)，肺瘤细胞都被EB-l抗体染色。图IO示出使用了EB-1抗体的白血病细胞代表性流式细胞染色图。实线表示EB-1抗体的染色，实心直方图表示无关抗体的阴性染色图。表4白血病类型EB-1阳性例数例数%AML222090.9Ml66100.0M2887.5M311100.0M444100.0其他3266.7AIX13969.2具有白血病急性发作的CML3266.7全部383181.6使用实施例4所纯化的EB-1抗体作为一抗，根据实施例2的免疫组织化学分析实施本实施例，以研究EB-1抗体是否对淋巴母细胞性淋巴瘤细胞有反应。图11显示出〗吏用EB-1抗体的淋巴母细胞性'淋巴瘤组织代表性免疫染色图。总体来说，9个淋巴母细胞性淋巴瘤病例中有4例(44.4%)表现出EB-1抗体染色阳性。因此，EB-1抗体及其CD43表位可能是各类急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的有力的诊断和治疗工具。实施例11为了确定EB-1抗体的治疗能力，开发了EB-1免疫毒素和人白血病模型。为了产生免疫毒素，将Sigma生产的皂草毒蛋白和EB-1抗体通过化学插入的巯基(SH)基团间的二硫键缀合(Politoetal.,2004)。通过将300pl体积的PBS中的2x105个CCRF-CEM细胞注射到RAG-l-缺陷型小鼠的尾静脉中建立小鼠的人白血病模型。一周以后，每隔一天(即第7、9、11和13天)，通过快速浓注(在300pl体积的PBS中)至尾静脉，每只小鼠用四个100pg剂量的EB-1抗体，EB-l-皂草毒蛋白免疫毒素或者无关抗体处理。在CCRF-CEM细胞静脉注射后四周，根据实施例3和10的流式细胞分析，用FITC缀合的EB-1抗体和PE-缀合的抗人I类MHC抗体，对从眼眶后网状组织(retro-orbitalplexus)取得的血样染色。图12是小鼠血液中的白细胞的流式细胞分析的代表性结果。在对照小鼠中，23.4。/。的外周血细胞是人CD43和人I类MHC双阳性的CCRF-CEM细胞，其中CCRF-CEM细胞在EB-1-皂草毒蛋白免疫毒素处理的小鼠中的减少最高到1.3%。与对照小鼠的白血病细胞负荷相比，仅用EB-l抗体处理的小鼠的白血病细胞负荷也降低大约2倍。因此，EB-l抗体可提供治疗急性白血病细胞的有效的工具，这是通过将毒性物质送递到肺瘤细胞、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)或其他机制实现。实施例12EB-1抗体识别CD43的第73至第81位的氨基酸序列即GluGlySerProLeuTipThrSerlie(SEQIDNO:2)。本实施例的进行是为了开发对白血病和淋巴瘤的诊断和治疗有用的新的抗-CD43抗体。编码包括SEQIDNO:2在内的CD43的第70至第98位的氨基酸序列的DNA片段被克隆到pQE-40栽体中，并且随后被用于转化感受态的大肠埃希氏菌TOP10F'细胞。转化的TOP10F'细胞根据实施例9的方法培养，并且通过使大肠埃希氏菌溶胞产物通过AmershamPharmaciaBiotech生产的Nickel柱，将CD43融合蛋白从大肠埃希氏菌溶胞产物中纯化出来。将100SY-CD43融合蛋白与完全弗氏佐剂混合并通过腹膜内途径给予至Balb/c小鼠并将其免疫。四周以后，与不完全弗氏佐剂混合的另外2个100|ag剂量的SY-CD43融合蛋白间隔两周经腹膜内给药。在最后的加强免疫后三天，从免疫小鼠中取脾并且根据实施例1的融合方法制备杂交瘤细胞。杂交瘤细胞的培养上清通过流式细胞术用人CD43-转染的鼠EL4细胞篩选，选出两个与CD43-转染的EL4细胞反应的杂交瘤克隆，并分别命名为EB-2和EB-3。图13显示使用了EB-2和EB-3抗体的CD43-转染的EL4细胞系、人胸腺细胞、人外周血细胞和人急性白血病细胞的流式细胞分析。CD43-转染的EL4细胞系、人胸腺细胞和人急性白血病细胞为阳性，但是人外周血细胞对EB-2和EB-3抗体两者均呈阴性。因此，EB-2和EB-3抗体两者的染色模式与EB-1的类似。实施例13根据使用了CD43缺失型突变体的实施例9的SDS-PAGE和Western印迹进行本实施例，以确定EB-2和EB-3抗体识别的CD43表位。图14显示采用了EB-2和EB-3的CD43突变体的Western印迹分析。EB-3抗体的CD43表位与EB1的类似。即，EB-1抗体和EB-3抗体的最小表位都是CD43的第73至第81位的氨基酸序列(SEQIDNO:2;GluGlySerProLeuTrpThrSerlie)。然而，EB-2抗体可识别比EB-1和EB-3更短的肽序列。EB-2的最小表位是CD43的第76至第81位的氨基酸序列。其序列如下ProLeuTrpThrSerlie(SEQIDNO:1)。通过确定该CD43表位是否在组织检查或外周血检查中表达，本发明的CD43表位可用于急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤的诊断，原因在于本发明的CD43表位不存在于正常的非造血组织、成熟血细胞和除胸腺细胞外的激活的外周血中。本发明的CD43表位可以用作急性白血病、具有白血病急性发作的慢性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤治疗的靶物质，因为它不在造血干细胞和除胸腺细胞和骨髓中造血前体的亚型的正常组织中表达。具有生物学活性的多肽的例示性实施方案的描述是对本发明的说明。但是，由于对于本领域技术人员而言改变是显而易见的，因此本发明并不旨在局限于以上的具体实施方案。本发明的范围在以下的权利要求中限定。权利要求1.一种CD43表位的分离的多肽，包括SEQIDNO1的氨基酸序列。2.根据权利要求1的分离的多肽，其长度小于100个氨基酸。3.根据权利要求l的分离的多肽，其长度小于50个氨基酸。4.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述CD43表位在胸腺细胞、骨髓中的造血前体的亚型、急性白血病细胞、具有白血病急性发作的慢性白血病的母细胞和淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上特异性表达。5.根据权利要求1的分离的多肽，其中所述CD43表位包括SEQIDNO:2的氨基酸序列。6.—种特异性结合一种CD43表位的抗体或其片段，所述CD43表位包括SEQIDNO:1的氨基酸序列。7.—种特异性结合由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成的肽的抗体或其片段。8.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述CD43表位在胸腺细胞、骨髓中的造血前体的亚型、急性白血病细胞、具有白血病急性发作的慢性白血病的母细胞和淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上特异性表达，而不在成熟造血细胞、造血干细胞和非造血细胞上特异性表达。9.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体特异性结合包括SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽。10.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体是通过用包括SEQIDNO:1氨基酸序列的多肽免疫动物，并且筛选与包括SEQIDNO:1氨基酸序列的多肽特异性结合的抗体而产生的。11.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。12.根据权利要求11的抗体或其片段，其中所述抗体为人或动物单克隆抗体。13.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。14.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段用选自放射性同位素、荧光物质、发光物质、酶和染色物质的化合物标记。15.根据权利要求6或7的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段被连接到选自放射性同位素、毒性化学物质、毒性蛋白质和抗肿瘤剂的毒性物质上。16.根据权利要求15的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与所述毒性蛋白质结合以产生融合蛋白。17.—种产生权利要求6或7的抗体或其片段的细胞。18.—种i貪断急性白血病的方法，包括将生物样品中的白血病细胞与权利要求6或7的抗-CD43表位抗体孵育，并检测对抗-CD43表位抗体的阳性免疫反应。19.根据权利要求18的诊断急性白血病的方法，其中所述阳性免疫反应的检测可以用检测酶反应、荧光、发光或辐射的装置确认。20.—种诊断具有白血病急性发作的慢性白血病的方法，包括将生物样品中的白血病细胞与权利要求6或7的抗-CD43表位抗体孵育，并^r测对抗-CD43表位抗体的阳性免疫反应。21.—种诊断淋巴母细胞性淋巴瘤的方法，包括将生物样品中的淋巴瘤细胞与权利要求6或7的抗-CD43表位抗体孵育，并检测对抗CD43表位抗体的阳性免疫反应。22.—种治疗急性白血病的方法，包括给予治疗有效量的权利要求6或7的抗-CD43表位抗体。23.#4居权利要求22的治疗急性白血病的方法，其中所述抗-CD43表位抗体被连接到选自放射性同位素、毒性化学物质、毒性蛋白质和抗肿瘤剂的毒性物质上。24.—种治疗具有白血病急性发作的慢性白血病的方法，包括给予治疗有效量的权利要求6或7的抗-CD43表位抗体。25.—种治疗淋巴母细胞性淋巴瘤的一种方法，包括给予治疗有效量的权利要求6或7的抗-CD43表位抗体。26.—种治疗急性白血病的药物组合物，包括权利要求6或7的抗-CD43表位抗体和一种可药用载体。27.—种治疗具有白血病急性发作的慢性白血病的药物组合物，包括权利要求6或7的抗-CD43表位抗体和一种可药用载体。28.—种治疗淋巴母细胞性淋巴瘤的药物组合物，包括权利要求6或7的抗-CD43表位抗体和一种可药用载体。29.—种白血病诊断试剂盒，包括权利要求6或7的抗-CD43表位抗体。30.—种淋巴瘤诊断试剂盒，包括权利要求6或7的抗-CD43表位抗体。全文摘要本发明涉及一种在人急性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤细胞上表达的CD43表位及其用途。更具体地，本发明涉及一种在人急性白血病、淋巴母细胞性淋巴瘤细胞表达，但不在成熟造血细胞、造血干细胞和非造血细胞上表达的CD43表位，还涉及它在急性白血病和淋巴母细胞性淋巴瘤上的诊断和治疗应用。文档编号C07K14/435GK101193912SQ200680020846公开日2008年6月4日申请日期2006年3月10日优先权日2005年5月11日发明者崔银玲,朴圣会,朴承杓,郑景天申请人:狄诺纳有限公司