专利名称：：用于调控和检测wisp活性的方法和组合物的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及用于调控WISP多肽，特别是W1SP-1多肽活性的方法和组合物。本发明还涉及用于在体外、原位和/或在体内诊断和/或治疗与WISP多肽有关的哺乳动物或病理疾患的方法和组合物
背景技术：
：结締组织生长因子(CTGF)是成纤维细胞中由许多因素(包括TGF-卩)诱导的生长因子，而且是TGF-p诱导不依赖贴壁生长(anchorage-independentgrowth,AIG)(转化细胞的一种特性)的能力所必需的。CTGF对细胞还具有促有丝分裂性和趋化性，因而认为该家族的生长因子在人体组织的正常发育、生长和修复中发挥作用。涉及CTGF的五种蛋白质，包括Cyr61、Nov、WISP-1、WISP2和WISP-3,已经分离，克隆，测序，并表征为属于CCN基因家力臭。OemarandLuescher,v4Wen'oc/er77ram6.&化，S/o/"17:1483-1489(1997);Brigstock,￡wfocr/"eiev.，20:189-206(1999)。发现编码Cyr61的基因促进血管发生、肿瘤生长和血管形成。Babic"a/.,尸rac.Ato/.爿cad5W.95:6355-6360(1998)。nov基因在肾中表达，基本上在胚胎阶段，而且在鸟类成肾细胞瘤和人维尔姆斯氏(Wilms)肿瘤中都检测到nov表达相对于正常肾的改变。Martinerie^"/.,(9wcoge朋，9:2729-2732(1994)。Wtl下调人nov表达，此下调可能代表了正常和肿瘤肾发生中的关键要件。Martinerieea/.,Ocoge"e,12:1479-1492(1996)。CCN家族的不同成员与特定硫酸化糖偶联物中的各种可溶性或基质相关高分子相互作用(Bork,F五^SZ^tera，327:125-130)。利用此相互作用可通过亲和层析在肝素-琼脂糖上纯化Cyr61和CTGF(FrazierWa/.，<//"ves/.De醒to/.，107:404-411(1996);Kireeva""/.，編.Ce〃.肠/.，16:1326-1334(1996》。Cyr61分泌并由于其对硫酸乙酰肝素的亲和力而与胞外基质和细胞表面结合(Yang"W.，Ce〃，￡)#,2:351-357(1991》。最近，WISP-1显示出与饰胶蛋白聚糖(decorin)和双糖链蛋白聚糖(biglycan)(两种分泌型硫酸皮肤素蛋白聚糖)相互作用(Desnoyersefa/.,7!CVzem.，276:47599-47607(2001》。鼠蛋白质ELM1最近在^^转移细胞中得到鉴定。Hashimoto"a/.,/Med,187:289-296(1998)。elml基因，下文公开的WISP-1的小鼠直向同源物，是CNN基因家族的另一个成员。它在体内抑制K-1735鼠黑素瘤细胞的肿瘤生长和转移。关于rCop-l，下文描述的WISP-2的大鼠直向同源物，的另一篇最近的论文记载了此基因在细胞转化后的表达丧失。Zhang"a/.,Afo/.Ce//.18:6131-6141(1998)。Wnt由一个大型基因家族编码，已经在线虫、昆虫、软骨鱼和脊推动物中找到了这个家族的成员。Hollande/fl/.，Dev.S，/"125-133(1994)。认为Wnt在多种发育和生理过程中发挥功能，因为许多不同物种具有多个保守的Wnt基因。McMahon，TrewcfeG匿"8:236-242(1992);NusseandVarmus，Ce〃，69:1073-1087(1992)。Wnt基因编码分泌型糖蛋白，认为这些糖蛋白发挥在数种原始细胞类型中有活性的旁分泌或自分泌信号的功能。McMahon，sw;ra(1992);NusseandVarmus,rapra(1992)。Wnt生长因子家族包括超过十种在'J、鼠中鉴定的基因(Wnt-l、-2、-3A、-3B、-4、-5A、-5B、-6、-7A、-7B、-8A、-8B、-IOB、-11、-12禾口-13)(参见例i口GavinW"/.,Dev.,4:2319-2332(1990);Lee尸rac.Ato/,爿cat/.Sc/.[/&4,92:2268-2272(1995);Christiansenda/.,Mec/z.Dev.，51:341-350(1995))和至少九种通过cDNA克隆在人中鉴定的基因(Wnt-l、-2、-3、-5A、-7A、-7B、-8B、-IOB和-Il)。参见例如VantVeerWa/.，Mo/.Ce〃.所o/.，4:2532-2534(1984)。Wnt-l原癌基因(int-l)最初是从小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)通过插入病毒DNA序列而诱导的乳腺瘤鉴定的。NusseandVarmus,Ce//，31:99-109(1982)。在成年小鼠中，只在精子发育的晚期在睾丸中检测到Wnt-lmRNA表达水平。Wnt-1蛋白约42KDa，包含氨基端疏水区，它可能发挥分泌信号序列的功能(NusseandVarmus，wpra,1992)。在小鼠胎儿和成年组织中检测到Wnt-2表达，而且其分布与Wnt-l的表达模式不交叠。Wnt-3与小鼠乳腺肿瘤发生有关。在小鼠胚胎的神经管和肢芽中检测到Wnt-3表达。在9.5-14.5天发育中的前后肢中检测到Wnt-5a转录物，而且最高水平集中在四肢末端处的顶端外胚层中NusseandVarmus,s，ra(1992)。最近，记载了称为Wnt-x的一种Wnt生长因子(W095/17416)以及在骨组织和骨衍生细胞中*^测到Wnt-x表达。还记载了Wnt-x在维持成熟成骨细胞中的作用及Wnt-x生长因子作为治疗剂或在其它治疗剂用于治疗骨相关疾病的开发中的用途。Wnt可能在局部细胞信号转导中发挥作用。PeiferandPolakis,5We"ce,287:1606-1609(2000)。生化研究显示出许多分泌的Wnt蛋白可发现与细胞表面或胞外基质结合，而非在培养基中自由扩散。PapkoffandSchryver,Mo/.Ce〃.伤o/"10:2723-2730(1990);BradleyandBrown,9:1569-1575(1990)。Wnt基因突变研究表明了Wnt在生长调控和组织模式形成(patterning)中的作用。在果蝇中，wingless(wg)编码Wnt相关基因(Rijsewik"/.,Ce〃，50:649-657(1987)),而且wg突变改变胚胎外胚层^莫式、神经发生和成虫盘长出。MorataandLawerence，Dev.B/o/.，56:227-240(1977);Baker，Dev.B/o/.,125:96-108(1988);KlingensmithandNusse,Dev.&o/.，166:396-414(1994)。在秀丽线虫(Cae"or/zaM/toe/ega"力中，lin-"编码不对称细胞分裂所需要的一种Wnt同源物。HermanandHorvitz，Deve/o/we《120:1035-1047(1994)。小鼠中的敲除突变显示出Wnt是脑发育(McMahonandBradley,Ce〃,62:1073-1085(1990);ThomasandCappechi,淑廳,346:847-850(19卯))及肾(Stark"a/.,Atoww,372:679-683(1994))、尾芽(Takada"/，Ge"esDev.,8:174-189(1994))和肢芽的胚胎原基长出所必需的。ParrandMcMahon,374:350-353(199"。Wnt-l在乳腺中的过表达可导致乳腺增生(McMahon,，ra(1992);NusseandVarmus,呼ra(1992))、过早泡(alveolar)发育(Bradburya/.,Dev.说'o/.,170:553-563(1995))和乳腺腺癌(Li"a/"(9"cog朋e,19:1002-1009(2000》。Wnt-5a和Wnt-5b在7-8天鼠胚胎的后和侧中胚层及胚外中胚层中表达。Gavinda/.,swpra(1990)。这些胚胎域促成AGM区和卵黄嚢组织，由此衍生多能造血前体和HSC。DzierzakandMedvinsky,7>^"&Ge打".，11:359-366(1995);ZoninGluckmanandCoulombel，ed.,Colloque,INSERM,235:17-22(1995),presentedattheJointInternationalWorkshoponFoetalandNeonatalHematopoiesisandMechanismofBoneMarrowFailure,法国巴黎,1995年4月3-6日；KanatsuandNishikawa,Deve/o;we《122:823-830(1996)。Wnt-5a、Wnt-10b和其它Wnt在肢芽中检测到，表明在早期骨微环境的发育和才莫式形成中可能的作用，正如Wnt-7b所显示的。Gavinaa/.,wpra(1990);Christiansen&a/.,Mec/z.Z)eve/.，51:341-350(1995);ParrandMcMahon,sw/7ra(1995)。关于Wnt的综述参见CadiganandNusse,(7e"esc&Z)ev.,11:3286-3305(1997)。Pennica"a/"尸rac.iVa".^cad0X4，95:14717-14722(1998)记载了在Wnt-1转化的小鼠乳腺上皮细胞系C57MG中上调的两种基因WISP-1和WISP-2及第三种相关基因WISP-3的克隆和表征(还可参见WO99/21998,公布于1999年5月6日；WO99/21999，公布于1999年5月6日)。Pennica等人报告了这些WISP基因可能在Wnt-l信号传导的下游，而且结肠癌中的异常水平WISP表达可能在结肠肿瘤发生中发挥作用。WISP-l最近鉴定为受(3-联蛋白(catenin)调控的基因，而且其致癌活性证明了WISP-1可能有助于P-联蛋白介导的肺瘤发生(Xu"d，Ge"e&Deve/o/.,14:585-595(2000))。WISP-1在正常大鼠肾细胞(NRK-49F)中的过表达诱导形态转化，加速细胞生长并增强饱和密度。另外，这些细胞在注入棵鼠后易于形成肿瘤，说明WISP-1可能在肿瘤发生中发挥一些作用(Xua/.，swpra2000)。WISP-1还在转化的人乳腺癌细胞系中及在大约47%的与某些晚期特征有关的原发性人乳腺癌中过表达。XieWa/.,Ca"ceri饥，61:8917-8923(2001);Saxenada/.，Mo/.Ce//所oc/iem.，228:99-104(2001);Michaelson"a/.,(9wcoge"e,20:5093-5099(2001)。一种特定WISP-1变体也已报道在大约86%的人硬化性胃癌(scirrhousgastriccarcinoma)纟田月包中过表达。Tanakaefa/.,Owcogewe,20:5525-5532(2001)。Hurvitz"a/.，A^wrcGe"Wcs,23:94-97(1999)记载了关于WISP3的一项症渐进性假类风湿性发育异常(PPD)有关。Hurvitz等人通过RT-PCR观察到WISP3在人滑膜细胞、关节软骨的软骨细胞和骨髓衍生间质祖细胞中的表达。公布于1998年5月22日的PCT申请W098/21236披露了人结締组织生长因子基因-3(CTGF-3)，它编码生长因子超家族的一个26kD成员。W098/21236披露了CTGF-3氨基酸序列是从人成骨细胞cDNA克隆推导的，而且CTGF-3在多种組织中表达，像卵巢、睾丸、心、肺、骨骼肌、肾上腺髓质、肾上腺皮质、胸腺、前列腺、小肠和结肠。文献中认识到透明质酸(也称为HA、透明质酸盐/酯或乙酰透明质酸)是胞外基质的重要成分(参见例如Hardinghamaa/.，i^S^SJ，6:861-870(1992);LaurentWa/.，Fv4S五B6:2397-2404(1992))。HA是皮肤和间充质组织的一种成分，它在那里在伤口愈合、炎症和胚胎形态发生过程中促进细胞迁移(Knudsonaa/.，T^S五BJ"7:1233-1241(1993);Knudsonda/.,CZBJFow"d5ymp,，143:150-169(1989))。HA还已报道在某些类型的肿瘤转移中发挥作用(Naora/"CZW.'5^wcfwe，Fm"Wo"J^oc/加'oww"/zAeAfo//g"a"f户racew，WvflwceyCawce/"Aeye"/x"/z,AcademicPress(1997),pp.241-319)。HA的最大浓度发现于皮肤和肌肉-骨骼系统，占机体总HA的50%以上(Banerji&a/.,7;Ce〃S/o/"144:789-801(1999))。各方研究人员报告了结合HA的受体。为HA鉴定的受体之一是CD44蛋白参见例如Culty"a/.,JCe〃伤o/ogy,111:2765-2774(1990);AruffoCe〃:61:1303-1313(1990);Naor^a/.,CD化F柳c/7'cwj^wocz.^'cww欣f/zeAfa/一朋Z1尸rac&w，J(ivawc&s1&Cawceri^earc/z,AcademicPress(1997)，pp.241-319;Ropponen"/.，Ca脏rto.,58:342-347(1998);Masaki"a/.，Owcer，92:2539-2546(2001))。CD44是从单一基因通过可变剪接和差异糖基化产生的细胞表面糖蛋白家族(Wielengaa/.，爿w./Pa^o/ogy,154:515-523(1999))。认为CD44发挥细胞粘附受体的功能，将胞外分子，具体是透明质酸盐/酯，连接至细胞和细胞骨架(Wielenga"a/.，swpra)。CD44在上皮、间充质和淋巴细胞上表达(Lesley"a/.,A/v./wmw"o/.,54:271-335(1994))。Wielenga等人报告了CD44表达可能受到WNT途径的调控，该结论基于分析APC或Tcf-4任一有遗传缺陷的小鼠和人肠粘膜中的CD44表达的某些实验(Wielengada/.,swpra)。迄今表征的其它HA受体包括RHAMM(也称为用于透明质酸介导的运动的受体(receptorforhyaluronicacidmedicatedmotility))，在專争4匕的'淋巴纟田月包表面上瞬时表达的一种58kD胞内蛋白质(Hardwicka/.,J.Ce//117:1343-1350(1992);Turleya/.，￡平Ce〃L，207:277-282(1993》。RHAMM在成纤维细胞中的表达据报道促进肿瘤转移且在H-Ras转化中发挥重要作用(Hall"a/.,Z"/ra)。结合HA的另一种受体记载于BanerjiWra;ra。Banerji等人报告了淋巴管壁上称为"LYVE-l"的受体，它是322个残基的I型内在膜多肽，与CD44受体具有41%相似性。与HA的CD44受体不同，LYVE-1蛋白不存在于血管中。另外，layilin(Bonoefa/.，MoZ.伤o/.Ce〃，12:891-900(2001))和HARE(Zhou"a/.，J所o/.CTzem.,275:37733-37741(2000))也记载为HA受体。发明概述申请人令人惊讶的发现，WISP-1可诱导HAS2(乙酰透明质酸合酶2(hyaluronansynthase2))、CD44和RHAMMmRNA表达、CD44蛋白质合成、及HA分泌。此类分子的诱导或分泌可促进或提高癌细胞生长、运动和/或转移潜力。本发明因此提供了例如WISP-1拮抗剂和使用此类拮抗剂的方法。本文所述拮抗剂可用于在体外、原位或在体内诊断或治疗与HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌有关的哺乳动物癌细胞或其它病理疾患等。在本发明的实施方案中，提供了分离的WISP-1拮抗剂。此类拮抗剂可包括抗体，诸如WISP-1抗体。在优选的实施方案中，所述拮抗剂可阻断或中和WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌。此类拮抗性抗体可以是例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。设想用于本发明的WISP-1拮抗剂包括WISP-1免疫粘附素、WISP-l变体、其共价修饰形式、或其融合蛋白。举例而言，此类拮抗剂可包括PEG化WISP-1或者WISP-1与异源序列诸如表位标签或亮氨酸拉链的融合。所述方法设想使用单一类型的拮抗剂分子或者两种或多种类型的拮抗剂的组合。本发明的方法包括治疗哺乳动物中与WISP-1,包4舌WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌，有关或由WISP-l,包括WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌，引起的病理疾患或疾病的方法。在所述治疗方法中，可以将WISP-1拮抗剂施用于患有此类病理疾患或疾病的哺乳动物。例如，本发明提供了如下的方法，包括使哺乳动物细胞，诸如癌细胞暴露于一种或多种WISP-1拮抗剂，所施用的量有效降4氐、中和或阻断WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌。所述细胞可以是在细胞培养物中或者是在哺乳动物中，例如患有例如癌症的哺乳动物中的细胞。本发明还提供了包含一种或多种WISP-1拮抗剂的组合物。任选的是，本发明的组合物将包括药学可接受的载体或稀释剂。优选的是，所述组合物将包括一种或多种WISP-1拮抗剂，其量在治疗上有效治疗病理疾患或疾病。本发明还提供了包含一种或多种WISP-1拮抗剂的制品和试剂盒。本发明还提供了筛选测定法以鉴定诸如小分子化合物、多肽或抗体的候选分子中在阻断或中和WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌方面起拮抗剂作用的分子的方法。本发明的更具体的实施方案包括分离的WISP-1拮抗剂，其在至少一种类型的哺乳动物细胞中抑制或中和天然WISP-1多肽对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌，所述拮抗剂选自抗WISP-1抗体、WISP-1免疫粘附素、WISP-1变体及其融合蛋白。所述拮抗剂可包括抗WISP-1抗体，其结合包含图9A-9C第23-367位氨基酸的天然人WISP-1多肽或者包含本文中序列SEQIDNO:3，4,5,6,7,8,9,10或11所编码的氨基酸的一个或多个WISP-1结构域。所述抗WISP-1抗体可以是嵌合的、人源化的或人的抗体。本发明还提供了包含本文所述拮抗剂和载体的组合物；任选的是，所述载体是药学可接受载体。本发明还提供了抑制或中和哺乳动物细胞中WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌的方法，包括使所述哺乳动物细胞暴露于有效量的WISP-1拮抗剂，其中所述WISP-1拮抗剂选自(a)WISP-1免疫粘附素；(b)与选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白质性质的聚合物相连的WISP-1多肽；(c)WISP-l抗体；和(d)WISP-1变体。所述方法中所采用的WISP-l免疫粘附素可包括与免疫球蛋白Fc区融合的WISP-1序列。所述方法中所采用的抗WISP-1抗体可结合包含图9A-9C第23-367位氨基酸的天然人WISP-l或者下文实施例中所述的一个或多个WISP-1结构域。在所述方法中，所述哺乳动物细胞可包括癌细胞；任选的是，所述细胞包括结肠或结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或脑癌细胞(诸如神经胶质瘤或成力交质细胞瘤)。在其它实施方案中，提供了治疗哺乳动物中的癌症的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的WISP-1拮抗剂。任选的是，在所述方法中，所述拮抗剂可以在至少一种类型的哺乳动物细胞中抑制或中和天然人WISP-1多肽对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌且所述拮抗剂选自抗WISP-1抗体、WISP-1免疫粘附素和WISP-1变体。任选的是，所述拮抗剂可以起抑制癌细胞生长或癌细胞转移的作用。所述哺乳动物中的癌症细胞可以包括结肠或结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌或脑癌细胞(诸如神经力M:瘤或成胶质细胞瘤细胞)。任选的是，所述方法中所采用的拮抗剂抑制或降低癌细胞生长或转移。还有，在所述方法中，还可以对所述哺乳动物施用化疗、放疗、前体药物、细胞毒剂、生长抑制剂或细胞因子。在更具体的实施方案中，提供了特异性结合包含本文中序列SEQIDNO:3，4,5，6,7,8,9,10或11所编码的氨基酸的一个或多个WISP-1多肽结构域(在下文实施例中有进一步描述)的抗体。任选的是，所述抗体是单克隆抗体。任选的是，所述单克隆抗体包括由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤分泌的3D11、11C2、9C10、5D4或9C11抗体。还提供了其结合的表位与由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系生成的3D11、11C2、9C10、5D4或9C11单克隆抗体结合的表位相同的抗体。在其它具体实施方案中，提供了生成单克隆抗体3D11、11C2、9C10、5D4或9C11且保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系，及由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤分泌的单克隆抗体3D11、11C2、9C10、5D4或9C11。还提供了分离的抗WISP-1单克隆抗体，包括结合WISP-1多肽并竟争性抑制由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤生成的单克隆抗体与所述WISP-1多肽的结合的抗体。还提供了嵌合的或人源化的抗WISP-1抗体，其特异性结合WISP-1多肽且包含来源于由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤分泌的3D11、11C2、9C10、5D4或9C11抗体的序列。任选的是，此类抗体可包含来源于3D11、11C2、9C10、5D4或9C11抗体的重链、轻链或可变区。抗WISP-1抗体可以与一种或多种选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化烯的非蛋白质性质聚合物，或者与细胞毒剂、酶、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物相连。附图简述图1A-1F显示了WISP-1对乙酰透明质酸(hyaluronan)生成的促进。颗粒排斥测定法(particleexclusionassay)证明了NRK/WISP-1H(A)和NRK/WISP-1L(B)的表面存在乙酰透明质酸外壳，但NRK/对照(C)没有。用bHABP对NRK/WISP-1H(D)和NRK/对照(E)的乙酰透明质酸染色。F,NRK/WISP-1H和NRK/对照培养液中HA积累的时间进程。图2A-2C显示了WISP-1提高HAS2、CD44和RHAMMmRNA表达及CD44蛋白质表达。A,NRK/WISP-1H、NRK/WISP-1L和NRK/对照细胞中HAS1、HAS2、HAS3、CD44、RHAMM和透明质酸酶(Hyal)mRNA表达的实时RT-PCR分析。结果表述为相对于NRK/对照细胞中的表达的诱导倍数。B,NRK/WISP-lH和NRK/对照细胞中CD44表达的流式细胞术分析。阴影区代表了单独使用二抗的荧光强度。C，NRK/WISP-1H和NRK/对照细胞中CD44蛋白质的Western印迹分析。使用肌动蛋白染色作为加载对照。图3A-3G显示了W1SP-l表达提高细胞运动并改变细胞形态。NRK/对照细胞(A)在以低密度铺涂时形成界限清楚的集落，而NRK/WISP-1L(B)和NRK/WISP-1H(C)细胞分散。与NTRK/对照细胞(D)相比，NRK7WISP-1H(E)显示出去分化的有片状伪足的纺锤形形态。F，使用慢速拍摄显微术(timelapsemicroscopy)测量NRK/WISP-lH和NRK/对照细胞的随才几迁移达l5小时。结果代表了一个视野中的细胞的典型平均迁移距离。G，15小时后使用慢速拍摄显微术通过细胞伤口愈合测定法评估并测量NRK/WISP-lH和NRK/对照细胞的运动。数据代表了典型实验的结果。图4A-4C显示了添加WISP-1诱导NRK细胞的HAS2mRNA表达和趋触性迁移。A,包被表面上接种的NRK细胞中HAS2和CD44表达的实时RT-PCR分析。在某些情况中，包被基质进一步与WISP-l—起温育(处理)。结果表述良Boyden室滤器的下侧，并将NRK细胞(B)或SW480细胞(C)加至上室。在某些情况中，直接添加至下室。通过对迁移至插入物下侧的细胞计数来评估细胞运动。图5A-5E显示了C57MG/Wnt-1细胞和MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤中的WISP-1、HAS2和CD44过表达及升高的细胞运动。A,C57MG/Wnt-1和C57MG/对照细胞中WISP-1、HAS2和CD44表达的实时RT-PCR分析。结果表述为超过C57MG/对照细胞中的表达的诱导倍数。B,C57MG/Wnt-1和C57MG/对照细胞中CD44含量的Western印迹分析。使用肌动蛋白染色作为力口载对照。C,C57MG/对照细胞在以低密度铺涂时形成清楚的集落，而C57MG/Wnt-l细胞分散。MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤中HAS2(D)和CD44(E)的半定量RT-PCR分析。结果表述为超过正常乳腺组织中的表达的诱导倍数。图6A-6H显示了MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤中的WISP-1、HAS2和CD"表达及HA积累。MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤中的WISP-1(A，B)、HAS2(C，D)和CD44(E，F)的原位杂交，CD"(G)的免疫组织化学及乙酰透明质酸(H)的bHABP荧光染色。t,肿瘤；s，基质。图7A-7L显示了WISP-l表达促进转移性肺移生(colonization)和肺瘤生长。为了分析WISP-1的效果，给棵鼠在尾静脉中注射NRK/对照、NRK/WISP-1L或NRK7WISP-1H细胞。在注射后的多个时间，将肺通过MRI成像(A,D，G,J),切除，并记录它们的大体外观(B，E，H,K)和组织学特征(C，F，I,L)。肿瘤侵入肺的严重程度分级为正常(A,B,C);I级(D，E,F);II级(G,H，i)或m级(j,K，L)。图8A-B显示了CD44抗体阻止NRK/WISP-1H细胞转移。给棵鼠在尾静脉中注射NRK/WISP-1H细胞(2.5xl()5个细胞)。每周两次用10mg/kgCD44抗体、同种型对照抗体或只有緩冲液(PBS)处理小鼠。4周后切除肺供大体解剖学分析用。显示了正常肺的图片供比较用。图9A-9C显示了天然人WISP-1的核苷酸序列(SEQIDNO:2)和推定氨基酸序列(SEQIDNO:l)。图10显示了WISP-1表达对NRK转移潜力的影响。图11A-B显示了WISP-1抗体对各种WISP-1构建物和制备物的结合特性。图12A-G显示了WISP-1多肽的各个结构域的示意图及为了鉴定WISP-1抗体11C2、5D4、9C11和3D11分别识别的表位而进行的测定法的结果。图12C图示了SEQIDNO:20所提供的氨基酸序列。图13显示了为了鉴定WISP-1抗体9C10所识别的表位而进行的测定法的结果。图14显示了ELISA的结果，证明了用WISP-1抗体检测到WISP-1。图15显示了ELISA结合测定法的结果，证明了识别WISP-1可变区的WISP-1抗体能抑制WISP-1与肝素的结合。图16A-B显示了测定法的结果，检测WISP-1抗体对NRK细胞趋触性的抑制(16A)，及一张表，总结了WISP-1抗体的特性和特征(16B)。图17A-E显示了WISP-1抗体的效果的体内研究结果。3周后，在WISP-1抗体治疗的动物中看到的损伤严重程度与对照相比大大减弱了(17a，b)。在WISP-1抗体治疗的小鼠(『5)中看到的结节数和转移性病灶平均面积与对照抗体治疗的动物相比降低了(17c，d)。损伤覆盖的肺部总面积与同种型对照抗体治疗的动物相比缩小了82-97%(17e)。图18的条形图显示了4Tl/对照、4T1/WISP-1L、4T1/WISP-1H、NRK/对照、NRK/WISP-1L和WISP-1H细胞系中的WISP-l表达，通过半定量RT-PCR(Taqman)测量。图19显示了体外测定法的结果，关于4Tl/对照、4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1H细胞系的集落形成。图20显示了体外测定法的结果，使用Matrigel改良Boyden室系统和4T1/对照、4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1H细胞系测量侵入指数(invasionindex)。图21A-B显示了WISP-1表达对乳腺上皮细胞肿瘤发生的影响。为了分析WISP-1的效果,在Balb/C小鼠中注射4Tl/对照l、4Tl/对照2、4T1/WISP-1L或4T1/WISP-1H细胞。报告了肿瘤体积(21A)和肿瘤重量(21B)。图22的条形示了通过接种4Tl/对照、4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1H细胞所形成的肿瘤中HAS2和CD44的相对表达。图23A-F图示了WISP-1对乳腺上皮细胞转移的影响，在体内通过给小鼠在乳房脂肪垫中接种4T1细胞并通过微计算机断层照相术和组织学检验转移性传播的程度来评估。31天后，接种4T1/WISP-1L或4T1/WISP-1H细胞的小鼠(图23b，d)与注射4丁1/对照的小鼠(图Z5a，c)相比有广泛的肺部转移。使用免疫組织化学，还观察到4T1/WISP-1肺部转移性病灶表达高水平的CD44(图23e)。在这些肿瘤中，CD44定位于4T1/WISP-l细胞的质膜(图230。图24A显示了NRK/对照、NRK/WISP-1—1234、NRK/WISP-1—134、NRK/WISP-1_234、NRK/WISP-1—123和NRK/WISP-1—124细胞系中的WISP-1表达，通过半定量RT-PCR(Taqman)测量；结果表述为相对于NRK/WISP-l一l234中的WISP-1表达的倍数。图24B图示了这些构建物在体内对肿瘤发生的影响；结果显示为对肿瘤体积的影响。图25显示了图24中提到的切除的肿瘤的组织学分析并揭示了来自NRK/WISP-1一234肿瘤的肿瘤细胞在表型上与来自NRK/WISP-1—1234肿瘤的肺瘤细胞相似。在这些肿瘤中，细胞表现为成纤维细胞的、已分化的和纺锤形的。来自NRK/WISP-1J34肺瘤的肿瘤细胞在表型上不同，表现为分化较差的、频繁多核化的(frequentlymultinucleated)、且有较大的有丝分裂比率(briskmitoticrate)，如多个有丝分裂图所展现的(箭头)。图26显示了图24中提到的NRK/WISP-1J34异种移植物中切除的肿瘤的组织学分析，并揭示了肿瘤细胞侵入了肺瘤附近的数条血管。图27显示了与将空载体转染的HEK293细胞铺涂入改良Boyden室系统的对照相比的侵入倍^:。在将表达构建物WISP-1J234、WISP-1—134或WISP-123的HEK293细胞接种入下室时，4T1细胞展现出侵入升高了4倍。图28A-28B图示了可溶性WISP-1-结构域1对WISP-1促进的4T1细胞侵入的影响，使用Matrigel包被的改良Boyden室系统来评估。结果表述为与4T1/对照细胞相比的相对侵入倍数。WISP-1-结构域1-His和WISP-1-结构域1-Fc展现出针对WISP-l促进的4T1侵入的剂量依赖性拮抗活性。图29图示了来自HPAC人胰腺癌异种移植物模型的组织的原位杂交分析，用于评估WISP-1表达。图30图示了WISP-1构建物在棵鼠模型中对肿瘤体积的影响。图31显示了评估原发性人胰腺癌中的WISP-1表达的原位杂交分析。图32显示了评估原发性结肠腺癌中的WISP-l表达的免疫组织化学染色。发明详述I.定义术语"WISP多肽"指天然序列人和小鼠WISP蛋白质家族及本文所述其基因至少由Wnt-l诱导的变体。该术语包括WISP-1及其变体。此类WISP-1蛋告的US6,387,657Bl及Pennica"a/"iVoc.iVaf/.^c^/.Sc/.95:14717-14722(1998)中有进一步记载。术语"WISP-1多肽'，、"WISP-1同系物"及其语法变体在用于本文时涵盖天然序列WISP-1蛋白质及变体(在下文中有进一步定义)。WISP-1多肽可以从多种来源分离，诸如人组织或其它来源，或者通过重组或合成方法来制备，或者通过这些和类似技术的任意组合。术语"天然序列WISP-1多肽"包括与衍生自自然界的WISP-1多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列WISP-1多肽可以A^自然界分离，或者可以通过重组或合成手段生产。术语"天然序列WISP-1多肽"明确涵盖本文中所公开的天然存在的截短或分泌形式的WISP-1多肽、WISP-1多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式或剪接变体)和天然存在等位变体。在本发明的一个实施方案中，天然序列WISP-l多肽是分别包含图9第23-367位氨基酸或图9第1-367位氨基酸的成熟或全长天然序列人WISP-1多肽，含或不含N-末端曱硫氨酸。在本发明的另一个实施方案中，天然序列WISP-1多肽是包含图9第23-367位或第1-367位氨基酸的全长或成熟天然序列人WISP-1多肽，其中第184位缬氨酸残基或第202位丙氨酸残基已经分别变成异亮氨酸或丝氨酸残基，含或不含N-末端甲硫氨酸。在本发明的另一个实施方案中，天然序列WISP-l多肽是包含图9第23-367位或第l-367位氨基酸的全长或成熟天然序列人WISP-1多肽，其中第184位缬氨酸残基和第202位丙氨酸残基已经分别变成异亮氨酸或丝氨酸残基，含或不含N-末端曱硫氨酸。在本发明的另一个实施方案中，天然序列WISP-1多肽是由包含人WISP-1剪接或其它天然序列变体之一的核苷酸序列编码的，包括W099/21998中所示SEQIDNOS:23,24,25，26，27,28或29，含或不含N-末端曱硫氨酸。术语"WISP-1变体"意指如下文所定义的，与具有图9所示推导氨基酸序列的人成熟WISP-1具有至少约80。/。，优选至少约85%、86%、87%、88%、89%，更优选至少约卯％、91%、92%、93%、94%,最优选至少约95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的活性WISP-1多肽，或其可溶性片段。此类变体包括例如在图9全长或成熟序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的W1SP-1多肽或者在多肽的内部序列或结构域中插入或删除一个或多个氨基酸残基的WISP-1多肽，包括来自其它物种的变体，但排除天然序列WISP-1多肽。优选的是，此类变体起拮抗剂的作用，如下文所定义的。"胞外结构域"、"ECD"或"分泌"蛋白指基本上不含任何跨膜和胞质结构域的多肽形式。"分泌，，形式的蛋白质或多肽可以包含或不包含信号序列。"严格条件"指如下条件(1)釆用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基錄u酸钠，于50。C洗涤；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如曱酰胺，例如50。/。(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠緩冲液pH6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42。C;(3)采用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaC〗，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8),0.1%焦磷酸钠，5xDenhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50吗/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苦，于42。C，及于42。C在0,2xSSC和0.1。/。SDS中洗涤；或(4)采用10%硫酸右旋糖苦，2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50%曱酰胺的緩沖液，55。C,接着于55"C在含EDTA的0.1xSSC中进行高严格性洗涤。"中等严格条件"如Sambrookefa/.，Afo/ecw/orC7om'"gv爿丄a60rato7Afc做"/,NewYork,ColdSpringHarborPress,1989中所记载的，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和SDS的百分比)。中等严格条件的例子是于37。C在含20。/。曱酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于大约37-50。C在lxSSC中洗涤滤膜。熟练技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。"分离的"，在用于描述本文中所公开的各种多肽时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指通常会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然WISP的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。术语"控制序列，，指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的^^喿纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是"可操作连4姿，，的。例唢口，若前序列(presequence)或分泌性前导序列(secretoryleader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可梯:作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，"可操作连接"意味着相连的DNA序列是相邻的(contiguous)，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。"脂质体"指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如本文中所披露的胰岛素和胰岛素变体)的小嚢泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。术语"氨基酸，，指所有天然存在的L-a-氨基酸。此定义意图包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。氨基酸通过单字母或三字母标示鉴别AspD天冬氨酸lieI异亮氨酸ThrT苏氨酸Leu亮氨酸SerS丝氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH组氨酸GlyG甘氨酸LysK赖氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸TrpW色氨酸ValV缬氨酸GinQ谷氨酰胺MetM曱硫氨酸AsnN天冬酰胺在序列表和附图中，可采用某些其它单字母或三字母标示来指向和鉴定序列中给定位置处的两种或多种氨基酸或核苷酸。关于本文所鉴定的多肽序列的"百分比(。/。)氨基酸序列同一性"定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与本文所鉴定的这样一种多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如^i吏用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比4交序列全长实现最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，。/。氨基酸序列同一性值是如下文所述使用序列比较计算机程序ALIGN-2得到的，其中下表中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下表所示源代码已经连同用户文档一起才是交给美国版4又局(U.S.CopyrightO伍ce，WashingtonD.C.,20559),并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech/^司(SouthSanFrancisco,Califomia)得到ALIGN-2程序，或者可从下表中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编i奪成在UNIX操作系统，优选数码UNIXV4.0D上4吏用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。术语"表位标记的"在用于本文时指包含某种多肽且其与"标签多肽"融合的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体。标签多肽优选还是相当独特的，使得其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基，通常在约8个和约50个氨基酸残基之间(优选在约10个和约20个氨基酸残基之间)。在用于本文时，术语"免疫粘附素"指将异源蛋白质("粘附素")的结合特异性与免疫球蛋白恒定域的效应器功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是"异源"的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定域序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分典型的是至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定域序列可以从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG(包括IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型)、IgA(包括IgA-l和lgA-2)、IgE、IgD或IgM。术语"拮抗剂"以最广义使用，包括在体外、原位或在体内部分或完全阻断、抑制或中和WISP-1多肽的一种或多种生物学活性的任何分子。此类WISP-1多肽生物学活性的例子包括至少一种类型的哺乳动物细胞中HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌。拮抗剂可以以直接或间接方式发挥功能。例如，拮抗剂可以在体外、原位或在体内例如由于其直接结合WISP-1多肽的结果发挥功能而部分或完全阻断、抑制或中和WISP-1多肽的一种或多种生物学活性。所述拮抗剂还可以在体外、原位或在体内由于例如阻断或抑制另一种效应器分子的结果间接发挥功能而部分或完全阻断、抑制或中和WISP-1多肽的一种或多种生物学活性。术语"WISP-1拮抗剂"指部分或完全阻断、抑制或中和WISP-1的生物学活性的任何分子，包括但不限于抗体、免疫粘附素、WISP-1免疫粘附素、WISP-1融合蛋白、共价修饰形式的WISP-1、WISP-l变体及其融合蛋白、WISP-1抗体、和高级寡聚物形式的WISP-1(二聚体、聚集体(aggregate))或者同聚体或异聚体形式的WISP-1。为了测定某种WISP-1拮抗剂分子是否部分或完全阻断、抑制或中和WISP-1的生物学活性，可进行测定法来评估该拮抗剂分子对例如各种细胞(如实施例中所述)或在肺癌转移的体内鼠模型中的效果。各种测定法可以以已知的体外或体内测定法形式来进行。优选的是，本文所述方法中所采用的WISP-1拮抗剂将能够阻断或中和至少一种类型的WISP-1活性，该活性可任选在诸如本文所述测定法中测定。术语"抗体，，以最广义使用，明确覆盖例如单一单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体和抗体片段。"抗体"在用于本文时包括完整免疫球蛋白或抗体分子、多克隆抗体、多特异性抗体(即由至少两种完整抗体形成的双特异性抗体)、及免疫球蛋白片段(诸如Fab、F(ab')2或Fv),只要它们展现出本文中所描述的任何期望的拮抗特性。抗体典型的是展现出对特定抗原的结合特异性的蛋白质或多肽。天然抗体通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。典型的是，每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而二硫键数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有所变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(VH),接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有可变域(V。，另一端是恒定域。轻链恒定域与重链第一恒定域排列在一起，而轻链可变域与重链可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻《连与重链可变域之间形成界面(Chothia"a/.,乂Afo/.Ao/.186:651-663(1985);NovotnyandHaber,尸roc.胸/.爿cdSc/.,82:4592-4596(1985))。根据其恒定域^^ifc^列，来自任何脊稚动物物种的抗体的轻链可归入两种截然不同类型中的一种，称作k和X。根据其重链恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白分成五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4;IgAl和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、5、s、Y和p。"抗体片段"包含完整抗体的一部分，一般是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。术语"可变的"在用于本文时描述可变域中的某些部分在抗体序列间有差异且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性通常并非均匀分布于抗体的整个可变域。它典型的集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR,它们大多采取|3-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成(3-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR—起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat,E.A.e"/.,iSe《wewceso/尸厂。to.ra/mw柳o/ogica//"feresf,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1987))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体在本文中包括通过目的抗体的可变域(包括高变区)与恒定域(例如"人源化，，抗体)、或者轻链与重链、或者来自一个物种的链与来自另一物种的链的剪接而产生的嵌合的、杂合的和重组的抗体，或包括与异源蛋白的融合物，不管物种起源或者免疫球蛋白的类或亚类归属，以及抗体片段(例如Fab、F(ab')2和Fv),只要它们展现出期望的生物学活性或特性。参见例^口美国专利第4,816,567号及Mageefa/.,inMowc/owa/Jw^ocfy/V。血criowrec/zm々wes朋(i^4，/z'ca/7'ora,pp.79-97，MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987。如此，修饰语"单克隆"指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由KohlerandMilstein,Atowre256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可通过诸如美国专利第4，816,567号中记载的重组DNA方法来制备。"单克隆抗体"还可从使用例如McCafferty"a/.,A^we348:552-554(1990)中记载的技术构建的噬菌体抗体库分离。非人(例如鼠)抗体的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链、或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或所输入CDR或框架序列中都没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进和优化抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗体最好还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区或恒定域(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。"人抗体"指拥有与由人生成的抗体的氨基S吏序列对应的氨基酸序列和体。人抗体的这种定义包括包含至少一条人重链多肽或至少一条人轻链多肽的抗体，例如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughanetal,,NatureBiotechnology,14:309-314(1996);Sheetsetal.，PNAS(USA)95:6157-6162(1998);HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol..227:381(1991);Marksetal,,J.Mol.Biol"222:581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因组导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物例如小鼠来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集(repertoire)。这种方法记载于例如美国专利5,545，807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5，661,016,及如下科学出版物Marksetal"Bio/Technology,10:779-783(1992);Lonbergetal.，Nature,368:856-859(1994);Morrison,Nature,368:812-13(1994);Fishwildetal"NatureBiotechnology,14:845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology,14:826(1996);LonbergandHuszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对耙抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回卄史，或者可在体夕卜免疫)。参见仿H口Coleetal.,JvfcnoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985);Boemeretal.，J.Immunol"147(1):86-95(1991);美国专利第5,750，373号。术语"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，它可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可有所变化，然而人lgG重《连Fc区通常定义为从Cys226位置附近或Pro230位置附近的氨基酸残基至Fc区的羧基末端的区段(使用本文中依照Kabatetal.，supra的编号系统)。免疫^求蛋白的Fc区通常包含两个恒定域，CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。"Fc区链"在本文中指Fc区的两条多肽链之一。人IgGFc区的"CH2结构域"(也称为"Cy2"结构域)通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22:161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。"CH3结构域"包含Fc区中CH2结构域至C-末端的一段残基(即自IgG的约第34H立氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的"隆起，，(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的"空腔'，(cavity)的CH3结构域；参见美国专利5，821,333)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。"铰链区"通常定义为自人IgGl的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton,Molec.Immunol,22:161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgGl铰链区。"功能性Fc区"拥有天然序列Fc区的至少一种"效应器功能"。例示性的"效应器功能"包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能通常要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)联合，而且可使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的多种测定法来评估。"天然序列Fc区"包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。"变异Fc区"包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80。/。的序列同一性，更优选至少约90%的序列同一性，最优选至少约95。/。的序列同一性。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性"和"ADCC"指由细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶胞。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRl、FcyRII和Fc7腿。RavetchandKinet,j画.Aev./國画/.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利第5，500,362或5,821,337号中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes"a/.，尸iVAS"f175^」95:652-656(1998)中所披露的。"人效应细胞，，指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。优选的是，该细胞至少表达FcyRIII并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC,如本文中所描述的。术语"Fc受体"和"FcR"用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(y受体)，包括FcyRI、FcYRII和FcYRin亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化受体")和FcyRIIB("抑制受体")，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcyRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcYRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述见Daftxm,iev,15:203-234(1997))。FcR的综述参见RavetchandKinet,J朋w.Tev.T/w簡wo/.9:457-92(1991);Capelefa/"7ww謝ow"/zoii4:25-34(1994);deHaas"a/.,JMC"".Afec/.126:330-341(1995)。术语"FcR"在本文中涵盖其它FcR,包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体(neonatalreceptor),FcRn,它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyer"a/.,J./画画/.117:587(1976)和Kima/.，J.Immunol.24:249(1994》。"补体依赖性细胞毒性"和"CDC"指在存在补体时将靶物溶胞的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(Clq)结合与关联抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano陽Santoro《//附附w"o/.AfeAods202:163(1996)中所记载的。"亲和力成熟的"抗体指在其一个或多个CDR中具有导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的一处或多处改变的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领:威已知流程生成。Marks"a/.,所o/Tec/wo/ogy10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变Barbasefa/.,Prac.Ato.jcadCTS/i91:3809-3813(1994);Schier"a/"169:147-155(1995);Yeltona/.，///wwwrn/.155:1994-2004(1995);Jacksona/.,/mmiwo/.154(7):3310-9(1995);HawkinsMo/.所o/.226:889-896(1992)。术语"免疫特异性"在用于例如"抗体的免疫特异性结合"时指在抗体的抗原结合位点与该抗体所识别的特定抗原之间发生的抗原特异性结合相互作用。术语"癌症"、"癌性"、"转移"和"恶性肿瘤"指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝的癌(livercancer)i者如肝癌(hepaticcarcinoma)和肝瘤(hepatoma)、月旁胱癌、乳A泉癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾的癌(kidneycancer)il"如肾细月包癌(renalcellcarcinoma)和维尔姆斯氏月中瘤(Wilms'tumor)、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、及各种类型的头和颈癌。优选接受本文治疗的癌症包括乳腺癌、胃癌、肺癌、结肠或结肠直肠癌、(神经)胶质瘤和成胶质细胞瘤。术语"前体药物"在用于本申请时指与母药(parentdrug)相比对癌细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的药用活性物质的前体和书亍生物形式。参见例戈口Wilman,"ProdrugsinCancerChemotherapy",BiochemicalSocietyTransactions,14,pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stellaetal""Prodrugs:AChemicalApproachtoTargetedDrugDelivery",DirectedDrugDelivery,Borchardtetal.,(ed.),pp.247-267,HumanaPress(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/S旨前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含J3-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转化为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苦前体药物。可^f汙生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于下文描述的那些化疗剂。术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P"和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。"化疗剂"指可用于治疗像癌症等疾患的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylatingagents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN);磺酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑石粦酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑石克4戈磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树石威(camptothedn)(包括合成类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡4斤来新(carzelesin)和比4斤来^斤(bizelesin)合成类似、物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛4中素(spongistatin);氮芥类(nitrogenmustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(mdphalan)、新氮齐(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亚辟'脲类(nitrosoureas),i者^口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、^畐莫司汀(fotemustine)、；备莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素yll和加利车霉素OIl，参见例如Agnew,CTzem.33:183-186(1994);dynemicin包^"dynemicinA;^矣其斤波霉素(esperamicin);以及*斤制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、力文线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、4禺氮丝氨酉交(azaserine)、十專来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔纟工霉素(daunorubicin)、i也4乇Hl星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、撒榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、《连佐星(streptozocin)、杀结才亥菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);抗代i射物，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、曱氨喋呤(methotrexate)、±菜罗。令(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate);噤呤类似物，诸如氟达^立滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、石危咪噤呤(thiamiprine)和石克鸟噤呤(thioguanine);嘧咬类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎月包香(azacitidine)、6-氮尿苦(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿冲唐胞香(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依i若4也滨(enocitabine)、氟尿苦(floxuridine)、5-FU;》,激素类，i者如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈4也力,酮(dromostanolonepropionate)、表石危名食醇(epitiostanol)、美》#》克(mepitiostane)禾口華内酉旨(testolactone);抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂，i者如亚叶酸(folinicacid);醋葡醛内酯(aceglatone);搭磷酰胺糖苦(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);j衣达曲沙(edatraxate);地石舞酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);i也吖酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);i矣土皮霉素(epothilone);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物石成类(maytansinoids)'i者如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫旅达醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);。比柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(mzoxane);根霉素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺旋锗(spirogermanium);纟田交《连孑包菌酉同酉吏(tenuazonicacid);三亚胺酉昆(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、4干孑包菌素(roridin)A和虫它行菌素(anguidin));乌4立坦(urethan);长春i也辛(vindesine);达卡巴。秦(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);口底泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿斗唐月包苷(arabinoside)("Ara-C");环石粦酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);类紫杉醇类(taxoids),例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)和多西他塞(docetaxel)(TAXOTERE,Rh6ne-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟噪呤(thioguanine);巯基噪口令(mercaptopurine);曱氨喋p令(methotrexate);柏类似物，诸如顺柏(cisplatin)禾口卡4白(carboplatin);长春石威(vinblastine);4白(platinum);依4乇泊香(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);丝裂霉素(mitomycin)C;米托蒽醌(mitoxantrone);长春新减(vincristine);长春瑞滨(vinorelbine);诺维本(navelbine);sfe灭瘤(novantrone);替尼泊苦(teniposide);道i若霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊本膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO);一见黄酉臾(retinoicacid);卡i备4也滨(capecitabine);及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或杏f生物。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY11701S、奥那司酉同(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);及任何上述物质的药剂学可接受盐、酸或衍生物。"生长抑制剂"在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂是显著降低处于S期的过表达所述基因的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新石成(vincristine)和长春石威(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓朴异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epimbicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼+>(prednisone)、达卡巴漆(dacarbazine)、双氯乙基曱胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、曱氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见77zeMo/ecw/wSos^o/Cawcer,MendelsohnandIsrael编，第l章,题为"Cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs",Murakamia/.,WBSaunders,Philadelphia(1995),尤其是第13页。术语"细胞因子"是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-曱硫氨酰人生长激素和牛生长激素；曱状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促曱状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH);肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-a和-(3;Apo-2配体(也称为TRAIL);穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO);神经生长因子；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-ot和TGF-p;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-a、-(3和，；集落刺激因子(CSF),诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF);白介素(IL)，诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-ll、IL-12;及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。"治疗'，或"处理"指旨在预防病症发展或改变病症病理而进行的干预。因此，"治疗"或"处理，，指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减緩(减轻)所针对的病理疾患或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。在病症的治疗中，治疗剂可直接提高或降低病症病理成分的应答程度，或者使得疾病对其它治疗剂(例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等)的治疗更易感。术语"有效量"指WISP-1拮抗剂引起、诱导或导致病理学疾患的可检测改善或减轻的最小浓度。在治疗癌症的方法中，有效量指引起、诱导或导致癌细胞数减少或肿瘤体积缩小的量。此外，"治疗有效量"指施用于哺乳动物、将会有效的至少减轻病理学症状的WISP-1拮抗剂最小浓度(量)。"长期，，施用指以与短期模式相反的连续模式施用药物，从而将初始治疗效果(活性)维持较长的一段时间。"间歇"施用指并非连续不间断进行的处理，本质上是循环的。为了治疗的目的，"哺乳动物"指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、猪、仓鼠等。优选的是，哺乳动物指人。"联合"一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施用。"载体"在用于本文时包括制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH緩沖水溶液。生理学可接受载体的例子包括緩沖剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS、透明质酸(HA)。II.本发明的方法和组合物如下文实施例进一步描述的，申请人令人惊讶的发现，W1SP-1在成纤维细胞中的异位表达触发HA生成，即增强的HA生成诱导其在细胞表面处和在培养物培养基中的积累。认为细胞表面HA可增强不依赖贴壁的生长和致肿瘤性(KosakiCa"cwi^s.,59:1141-1145(1999)),而且可消除细胞增殖的接触抑制，由此促进细胞迁移(Ichikawa"a/.,J/"w^.Derwato/.,113:935-939(1999);Itano"a/.，尸rac.iVa"^cadSc,.99:3609-3614(2002》。乙酰透明质酸壳(Hyaluronancoat)形成还已与细胞转移潜力关联起来(Zhangefa/,,Ca"cerWes"55:428-433(1995);Toole"a/"乂5^/.C7^w.,277:4593-4596(2002))。HA合酶(HAS1、HAS2和HAS3)表达分析揭示了WISP-1促进HAS2诱导，而HAS1和HAS3mRNA水平保持不变。HAS2是生长因子和细胞因子上调的HA合成的主要靶物(Pienimakiea/.,J.说o/.Cfem.,276:20428-20435(2001))。异位HAS2表达提高HA分泌并诱导乙酰透明质酸壳形成(Kosaki"a/.ra)。此外，认为HAS2对心脏形态发生过程中乙酰透明质酸介导的上皮至间充质的转化是重要的(Camenischea/.,J！C""./"vew.，106:349-360(2000))。因为上皮至间充质的转变对肿瘤侵入和转移也是重要的，所以推测HAS2在上皮肿瘤发展中发挥重要作用(Boyerefa/.,尸/zwmaco/.,60:1091-1099(2000);Hay,Jcto爿"a/"154:8-20(1995);Arias,CW/，105:425-431(2001))。这些结果表明，WISP-l诱导的HA分泌对肿瘤侵入和转移可能是重要的。WISP-1还诱导两种HA受体，CD44和RHAMM的表达。通过诱导HA受体表达和提高HA生成，WISP-l可激活自分泌和/或旁分泌环。乙酰透明质酸与CD44和RHAMM的相互作用在体外促进细胞运动和增殖，在体内促进肿瘤生长和转移(Turley"a/.，/脂.C/2缀，277:4589-4592(2002);Sy""/.,C脏7b/.Mz'cto&'o/./w附ww/.，213:129-153(1996);Halla/.,A^wroo"co/.，26:221-229(1995》。在细胞伤口愈合测定法中及通过慢速拍摄显微术分析了WISP-l对细胞迁移的效果，而且数据显示WISP-1表达促进细胞运动力。另外，分离的细胞显示出迁移增强，说明WISP-1能通过自分泌机制起作用。纯化的重组WISP-l促进HAS2和CD44表达，尽管是在附着于表面时。此诱导在WISP-l经由其与饰胶蛋白聚糖(decorin)的相互作用而系留时进一步增强。类似地，WISP-1在表面结合时促进细胞运动力，说明WISP-1在系留至基质时可能还经由旁分泌机制起作用。通过用抗CD44抗体消除迁移，本文实施例显示了WISP-1诱导的细胞运动力是由CD44介导的。WISP-1诱导的细胞运动力还受到WISP-l抗体的抑制。此外，WISP-l的趋触(haptotactic)活性不局限于单一细胞类型，因为它诱导正常成纤维细胞和结肠腺癌细胞二者的迁移。因为认为WISP-1是Wnt-1下游效应器，所以对C57MG/Wnt-1细胞系分析在NRK7WISP-1细胞中发现的表型。与WISP-1在Wnt-1下游的作用一致，C57MG/Wnt-1细胞过表达HAS2和CD44,而且与亲本细胞系相比具有更高的CD44蛋白含量。另外，C57/Wnt-1细胞在培养物中自发分散，而且展现出与NRK/WISP-1H细胞相似的去分化纺锤样形态。还对一组MMTV-Wnt-1乳^^瘤进行了表达分析，而且在所有来自MMTV-Wnt-l转基因小鼠的乳腺瘤中检测到升高的CD44和HAS2表达。在这些肿瘤中，WISP-1表达定位于基质成纤维细胞，而CD44和HAS2由肿瘤上皮细胞表达。尽管HAS2表达是阴性的，肿瘤周围的基质含有高水平的HA,而肿瘤实质对HA只有微弱染色。尽管公认成纤维细胞负责HA生成，然而并未明确知道基质HA的起源。因为HAS2表达仅发现于实质，所以本文所公开的实验结果说明肿瘤细胞负责HA合成及在基质中的沉积。在数种类型的肿瘤中频繁遭遇乙酰透明质酸在肿瘤周围基质中的积累，而且先前有关于卵巢、乳房、前列腺和结肠腺癌在这方面的报告(Ropponenefa/.,OmcwAas.,58:342-347(1998);Lippo謹efa/"￡mk/Ca"cer,37:849-856(2001);Auvinenefa/.,爿w.J尸W/zo/.，156:529-536(2000);Anttila"a/"Ca"cwWw.,60:150-155(2000》。此外，基质中的高HA水平与不良分化、转移行为和不良预后有关。因为HA和CD44与肿瘤侵入有关，所以在体内评估了表达WISP-1的细胞的转移潜力。尾部接种后，NRK/WISP-1细胞容易地在所注射小鼠的肺部移生并形成侵入性肿瘤。NRK/WISP-1细胞展现出显著的转移潜力，而NRK细胞则不然。组织学观察结果揭示了NRK/WISP-1细胞在血管系统定居(populate)并侵入肺部气道。肺部移生与所注射细胞H注射后时间和WISP-1表达成比例。另外，申请人发现转移潜力与CD44和HAS2表达水平成比例，而且用CD44抗体或WISP-1抗体治疗接种NRK/WISP-1H细胞的小鼠大大减少/减小肺中肿瘤的数目和大小。如此，很有可能各种WISP-1水平通过乙酰透明质酸-CD44机制而促进肺部移生。这与先前证明CD44及其与HA的相互作用对肿瘤生长、转移和转移细胞保持在肺部血管系统的重要性的报告一致(Sy"fl/.,swpra;ICogerman"a/.,/Voc.A^".^cad94:13233-13238(1997))。尽管APC或(3-联蛋白(catenin)突变对Wnt途径的激活可能典型地与结肠直肠癌有关，然而数项证据说明它还在其它类型的癌症中发挥作用，所述癌症包括乳腺腺癌(Polakis,Dev.,14:1837-1851(2000);Brown,C朋cw7",3:351-355(2001))。在人乳腺癌细胞系中发现了APC截短和f3-联蛋白水平升高(Schlosshauer"a/.,Carc〖woge恥^s,21:1453-1456(2000))。在原发性乳腺癌中发现了APC基因的体细胞突变(Furuuchi"a/.,尸o决o/.,156:1997-2005(2000))。另外，卩-联蛋白活化性突变促进小鼠乳腺腺癌(Michaelson"a/.,Owcogewe,20:5525-5532(2001))。在侵入性导管乳腺癌中发现了Wnt-l和(3-联蛋白水平升高，而且与不良预后有关(Lin"a/.,Prac.Ato/.JcW."W,97:4262-4266(2000))。因此，有可能的是，在某些乳腺癌中发现的WISP-1表达源自Wnt途径激活。申请人还通过Taqman分析发现，WISP-1在诸如乳腺肺瘤和神经胶质瘤等癌症中过表达。至少出于这些原因，认为WISP-1拮抗剂在治疗和诊断各种病理病症，诸如癌症中将特别有用。本发明因此提供了用于调控、阻断或中和哺乳动物细胞中的WISP-1活性的方法，包括使细胞暴露于期望量的WISP-1拮抗剂。优选的是，WISP-1拮抗剂所釆用的量将是足以降低或抑制癌细胞生长、转移或运动的量。这可以依照例如下文和实施例中描述的方法在体内或回体(exvivo)实现。例示性的可用此类WISP-1拮抗剂治疗的疾患或病症包括哺乳动物中临床上称为癌症的疾患。本文中还提供了诊断方法。例如，所述拮抗剂可用于检测侵入性或转移性癌症。所述拮抗剂分子可以例如在测定法中用于样品中转移性癌细胞的检测或定量。可以将诸如从哺乳动物得到的细胞的样品在存在经标记拮抗剂时温育，并;f全测样品中所结合的经标记拮抗剂。所述方法中可采用的拮抗剂包括但不限于WISP-1免疫粘附素、包含WISP-1的融合蛋白、共价修饰形式的WISP-1、WISP-1变体、其融合蛋白、和WISP-l抗体。本文中描述了可用于生成拮抗剂的各种技术。例如，描述了用于制备WISP-l多肽的方法和技术。还描述了多肽的进一步修饰及WISP-1的抗体。在本文所述全长天然序列WISP-1多肽以外，还涉及了可制备WISP-1多肽变体。WISP-l变体可通过将适宜的核苦酸改变引入编码DNA和/或通过合成期望多肽来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变WISP-1多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。可在本文所述WISP-1多肽中进行变异，例如使用例如美国专利5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码多肽的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致氨基S吏序列相对于天然序列多肽的改变。任选的是，变异是通过WISP-1多肽的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较WISP-1多肽的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统进行氨基酸插入、替代或删除，并对所得变体测试由全长或成熟天然序列展示的活性来确定可容许的变异。本文提供了WISP-1多肽的片段。例如，在与全长天然蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于WISP-1多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。WISP-1多肽片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生多肽片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA,并分离期望的片段。还有一种合适的技术涉及分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5'和3'引物。在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见下表标题"优选替代"下所示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入下表中称为"例示替代"的更实质性改变，或者如下文关于氨基酸类別进一步所述的，并筛选产物。表<table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>Complextableseetheoriginaldocumentpage37<table>对WISP-1多肽功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于共同的侧链特性，将天然存在残基如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、亲水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威'性的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影响链取向的残基Gly、Pro;及(6)芳香力矣的Trp、Tyr、Phe。非保守替代将需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。变异可使用本领域已知的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carteretal.，Nucl.AcidsRes.13:4331(1986);Zolleretal.，Nucl.AcidsRes.10:6487(1987))、盒式诱变(Wdlsetal"Gene34:315(1985))、限制性选择诱变(restrictionselectionmutagenesis)(Wellsetal"Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA317:415(1986))或其它已知技术以产生WISP-1多肽变体DNA。可采用扫描氨基酸分析沿着连续的序列鉴定一个或多个氨基酸。优选的扫描氨基酸中是相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这一类中的优选扫描氨基酸，因为它消除了p-碳的侧链且不大可能改变变体的主链构象(CunninghamandWells,Science,244:1081(1989))。丙氨酸通常还因为它是最常见的氨基酸而成为优选的。此外，在隐藏的和暴露的位置都经常可以找到它(Crdghton，《TheProteins》，W.H.Freeman&Co.,NY;Chothia,J.Mol,Biol.,150:1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可以使用等构(isoteric)氨基酸。任何不涉及保持WISP-1多肽正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向WISP-l多肽中添加半胱氨酸键以改善其稳定性。下面的描述主要涉及通过培养用包含WISP-1多肽编码核酸的载体转化或转染的细胞来生成WISP-1多肽。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备WISP-1多肽。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成适宜核酸序列或其部分(参见例如Stewartetal.,Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA，1969;Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动4t合成可例长口"f吏用AppliedBiosystemsPeptideSynthesizer(FosterCity,CA)依照制造商的说明书来完成。WISP-1多肽的各个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成期望的WISP-1多肽。所述方法和技术类似地适用于生成WISP-1变体、经修饰形式的WISP-l和WISP-l抗体。1.编码WISP-1多肽的DNA的分离编码WISP-l多肽的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述WISP-l多肽mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的WISP-l多肽DNA可以方便地从以人组织制备的cDNA文库获得。WISP-l多肽编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)<曰狄付。可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989所述。分离编码WISP-l多肽的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrooketal.,见上文；Dieffenbachetal.,PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)。用于筛选cDNA文库的技术是本领域众所周知的。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous),使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域/〉知的，包括使用放射标记物，像"P-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrooketal,见上文。在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列篩选选定的cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrooketal.,见上文所述常规引物延伸方法来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工的中间产物。2.宿主细胞的选择和转化将宿主细胞用本文所述用于WISP-1多肽生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由熟练技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler，ed.,IRLPress,1991和Sambrooketal"见上文。真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl2、CaP04、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrooketal.,见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Jgro^"en'ww^me/ac/em)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shawetal.,Gene23:315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用GrahamandvanderEb,Virology52:456-457(1978)的磷酸钩沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照VanSolingenetal.,J.Bact.130:946(1977)和Hsiaoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76:3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显^敬注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keownetal.,MethodsinEnzymology185:527-537(1990)和Mansouretal.，Nature336:348-352(1988)。适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌抹是公众可获得的，诸如大肠杆菌KU菌株MM294(ATCC31，446);大肠杆菌XH76(ATCC31,537);大肠杆菌菌抹W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(￡^/zen'c/^)例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌，(五.co/(j)、肠杆菌属(五"teroZ)acfer)、欧文氏菌属(五nWw'a)、克雷伯氏菌属(尺/eZwW/a)、变形菌属()、沙门氏菌属(Sa/mcwe〃")例如鼠伤寒沙门氏菌(Sa/wo朋〃a(yp/n'附,/wm)、沙雷氏菌属(5"ewaria)例^口丰占质沙雷氏菌(Serrc^'am^rwcara)、和志贺氏菌属(57w'ge〃a)，以及芽孢杆菌属(Sac/肌)诸如枯草芽孢杆菌(及和地衣芽孢杆菌(及歸抓/o層;0(例如1989年4月12日出版的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(尸sewob7wwas)诸如铜绿々足单胞菌(Z5化rwg/wtra)、和《连霉菌属(Sfr印to,77yCM)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌林。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型to"A大肠杆菌W3110菌抹9E4，其具有完整基因型to"Jp/r3;大肠杆菌W3110菌抹27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型to"J;f/^//zoJ￡/5f^gF-/flc」/<59大肠杆菌W3110菌林37D6，其具有完整基因型to"J/&3p/zo4￡75—/ac」J/69^gPom/7>^7//vG:fo2,/;大肠杆菌W3110菌抹40B4，它是具有非卡那霉素抗性cfeg尸删除突变的菌抹37D6;及具有1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌抹。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是WISP-1多肽编码载体的合适克隆或表达宿主。酉良酒糖酵母(Ajcc/^ramyc"是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(5W7&oacc/MTo"，&pow6e)(BeachandNurse,Nature290:140(1981);EP139,383,1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(K/M_yveram_ycw)宿主(美国专利4，943，529;Fleeretal.，Bio/Technology9:968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K/acfe)(MW98-8C,CBS683，CBS4574;Lo画ncourtetal"LBacteriol.154(2):737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(〖/ra^'to)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.^/gan'cus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(尺.w法画z7)(ATCC24,178)、丽////(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(Lcimy。;/w7flr謹)(ATCC36,906;VandenBergetal.,Bio/Technology8:135(19卯))、耐热克鲁维酵母(尤Aennoto/eraw)、和马克思克鲁维酵母(尺mw;da"^);亚罗酵母属(KwroWa)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(尸/c/z/a戸納;？)(EP183,070;Sreekrishnaetal"J.BasicMicrobiol.28:265-278(1988));假丝酵母属(Ca^/Wa);瑞氏木霉(7Hc/zc^/e/7^reew'a)(EP244,234);粗糙脉孢菌(脸w冊戶racrawa)(Caseetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263(1979));许旺酵母属(5b/w朋m'om少ca)诸如许旺酵母(Sc/7wa"m'om少cesocc^ewtofo)(EP394,538,1990年10月31日公开)；和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(A^wmy;ora)、青霉属(尸e"/c,7Z/ww)、弯颈霉属(7b/炉c歸訓)(WO91/00357,1991年1月10日公开)、和曲霉属()宿主i者^口片勾巢曲霉(Am'(iw/a"s)(Balanceetal"Biochem.Biophys.Res.Gommun.112:284-289(1983);Tilburnetal.,Gene26:205-221(1983);Yeltonetal.，Proc.Natl.Acad,Sci.USA81:1470-1474(1984》和黑曲霉(Am'ger)(KellyandHynes,EMBO丄4:475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropicyeast)适于本发明，包括但不限于能够在曱醇上生长的、选自以下属的酵母汉逊氏酵母属(J/arae"w/a)、假丝酵母属(Ow^Wa)、克勒克氏酵母属(A7oecfera)、毕赤氏酵母属(朽c/2/fl)、糖酵母属CSacc/2flram少ce》、球拟酵母属(7brw/o/wZ"、和红酵母属(i/2odotora/a)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs,269(1982)。适用于表达糖基化WISP-1多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊推动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9,以及植物细胞，诸如棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的细胞培养物。已经鉴定了许多杆状病毒抹和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜虫我OS/cxiopfera/rwgz^enia)(毛虫)、i矣及4尹虫丈(/le(iesaegy/")(虫文子)、白纟丈《尹虫丈(Je(i&ya/io/z.c&力(虫丈子)、，繁、腹果虫黾(Drosc^/z//(3we/awogo^er)(果虫黾)和家蚕CBowxmo,力等宿主。公众可获得多种病毒抹用于转染，例如苜蓿尺蠖(jwtograp/wca/z/orm'ca)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5抹，而且此类病毒可依照本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾(5^c^optera/rag7)9erab)纟田月包。然而，最受关注的是脊推动物细胞，而且培养(组织培养)中脊推动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Grahametal.,J.GenVirol.36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞Z-DHFR(CHO,Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CVl，ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细月包(Matheretal"AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细月包；FS4细胞；和人肝脏肿瘤细胞系(HepG2)。将宿主细胞用上述用于WISP-1多肽生成的表达或克隆载体转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当改良的常规营养培养基中培养。3.复制型载体的选择和使用可以将编码WISP-1多肽的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。WISP-1不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的编码WISP-1多肽的DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、a因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的a-因子前导序列，后者见美国专利5，010，182)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4曰公开的EP362,179)、或19卯年11月15日公开的WO90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取WISP-1多肽编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和扩增如Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的/^7基因(Stinchcombetal.，1979，Nature282:39;Kingsi碰etal"1979,Gene7:141;Tschemperetal"1980,Gene10:157)。fr//基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变林，例如ATCCNo.44076或PEP4-l提供了选择标志(Jones，1977,Genetics85:12)。表达和克隆载体通常包含与WISP-l多肽编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括P-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Changetal.,Nature275:615(1978);Goeddeletal.，Nature281:544(1979》、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel,NucleicacidsRes.8:4057(1980);EP36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码WISP-1多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzemanetal.,J.Biol,Chem.255:2073(1980))或其它糖酵解酶(Hessetal.,J.Adv.EnzymeReg.7:149(1968);Holland,Biochemistry17:4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氬酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氛代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP73,657。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录WISP-1多肽受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细月包系统相容的话。可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码WISP-1多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp,作用于启动子以增加转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、a-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于WISP-1多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码WISP-1多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。适合在改动后在重组脊推动物细胞培养物中合成WISP-1多肽的其它方法、载体和宿主细胞见Gethingetal.，Nature293:620-625(1981);Manteietal.,Nature281:40-46(1979);EP117,060;和EP117,058。4.培养宿主细胞可以在多种培养基中培养用于生成本发明W1SP-1多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细月包的i条养基Hametal"1979,Meth.Enz.58:44;Barnesetal.，1980，Anal.Biochem.102:255;美国专利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、和磷酸盐)、緩冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显然的。5.检测基因扩增/表达基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci,USA77:5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双《连体在所述表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列WISP-1多肽或特定抗体表位的外源序列来制备抗体。6.WISP-1多肽的纯化可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的WISP-l多肽。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X100)或通过酶促裂解使其从膜释放。WISP-1多肽表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化WISP-1多肽。下面的流程是合适纯化流程的例示在离子交换柱上的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC;在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE;硫酸铵沉淀；^吏用例如SephadexG-75的凝月交过滤；蛋白ASepharose柱以除去污染物诸如IgG;及结合WISP-1多肽的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher,MethodsinEnzymology,182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag，NewYork(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用制备方法的性质和所产生的具体WISP-1多肽的性质。本发明的方法中可以采用可溶形式的WISP-l作为拮抗剂。此类可溶形式的WISP-1可以包含修饰，如下文所述(诸如通过与免疫球蛋白、表位标签或WISP-l免疫粘附素可包含各种形式的WISP-1,诸如全长肽以及可溶形式的WISP-1或其片段。在具体的实施方案中，所述分子可包含WISP-l多肽与免疫球蛋白或其特定区域的融合物。对于二价形式的免疫粘附素，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融和物。Ig融合物优选包含用可溶形式的(跨膜结构域删除或灭活的)多肽代替Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的铰链、CH2和CH3，或者铰链、CH1、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融合物的生成还可参见美国专利第5,428,130号，1995年6月27日公告及Chamowetal.，TIBTECH,14:52-60(1996)。最简单且最直接的免疫粘附素设计是将粘附素(例如WISP-1)的结合结构域与免疫球蛋白重链的Fc区进行组合。通常，在制备本发明的免疫粘附素时，将编码粘附素结合结构域的核酸融合在编码免疫球蛋白恒定区序列N-末端的核酸的C-末端，然而N-末端融合物也是可能的。通常，在此类融合物中，所编码的嵌合多肽将至少保留有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区铰链、CH2和CH3结构域。还可以对恒定区Fc部分的C-末端进行融合，或者紧挨着重链CHl或轻链对应区的N-末端进行。进行融合的精确位点不是至关重要的；具体位点是众所周知的，而且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。在一个优选的实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白G1(IgGl)Fc区的N-末端。有可能将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，更优选的是，在融合中使用在铰链区中紧挨着在化学上定义IgGFc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216,以重链恒定区的第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游开始的序列。在一个特别优选的实施方案中，将粘附素氨基酸序列与IgG重链的(a)铰链区、CH2和CH3，或者(b)CH1、铰链、CH2和CH3结构域融合。对于双特异性免疫粘附素，将免疫粘附素装配成多聚体，特别是异二聚体或异四聚体。通常，这些装配好的免疫球蛋白将具有已知的单元结构。基本的四链结构单元就是IgG、IgD和IgE存在的形式。四链单元在更高分子量的免疫球蛋白中重复；IgM通常作为通过二硫键保持在一起的四链基本单元的五聚体存在。IgA球蛋白及偶尔的IgG球蛋白也可以以多聚体的形式存在于血清中。在多聚体的情况中，各个四链单元可以是相同的或不同的。下面示意性的列举了在本文范围内的各种例示性的装配好的免疫粘附素(a)ACL-ACL;(b)ACh-(ACh,ACl-ACh,ACl-VhCh,或VlCl-ACh);(c)ACL-AC"ACl-ACh,ACl-VhCh,VlCl-ACh,或VlCl-VhCh)(d)ACL-VHC"ACH,ACL-VHCH,或VlCl-ACh);(e)VLCL-ACH-(ACL_VHCH,或VlCl-ACh);及(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2,其中各个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；V^是免疫球蛋白轻链可变区；Vh是免疫球蛋白重链可变区；Cl是免疫球蛋白轻链恒定区；Ch是免疫球蛋白重链恒定区；n是大于l的整数；Y代表共价交联剂的残基。为简短起见，上述结构只显示了关键特征；它们没有标明免疫球蛋白的连接(J)或其它结构域，也没有显示二硫键。然而，若结合活性需要此类结构域，则构建时它们应当存在于它们在免疫球蛋白分子中所占据的通常位置。或者，可以将粘附素序列插入免疫球蛋白重链与轻链序列之间，从而得到包含嵌合重链的免疫球蛋白。在这个实施方案中，将粘附素序列融合在免疫球蛋白每个臂中的免疫球蛋白重链的3，端，或是在铰链与CH2结构域之间，或是在CH2与CH3结构域之间。类似的构建物已报道于Hoogenboometal.,Mol.Immunol.,28:1027-1037(1991)。尽管本发明的免疫粘附素中不需要存在免疫球蛋白轻链，然而免疫球蛋白轻链，可以与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合的形式存在，或是以直接与粘附素融合的形式存在。在前一种情况中，通常将编码免疫球蛋白轻链的DNA与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后，杂合重链与轻链将共价结合以提供包含二个二硫键相连的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适于制备此类结构的方法披露于例如美国专利第4，816，567号，公告于1989年3月28日。最方便的是通过将编码粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列以符合读码框的形式融合来构建免疫粘附素。然而，也可以使用与基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例^口Aruffoetal.,Cell,61:1303-1313(1990);Stamenkovicetal,,Cell,66:1133-1144(1991))。后一种类型的融合要求存在Ig调控序列以供表达。编码IgG重链恒定区的cDNA可以根据已发表的序列自衍生自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库分离，通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术。将编码免疫粘附素的"粘附素"和免疫球蛋白部分的cDNA串联插入在所选宿主细胞中高效表达的质粒载体。在另一个实施方案中，WISP-1或WISP-l拮抗剂可以通过以美国专利Nos.4,640,835;4,496,689;4,301,144;4,670,417;4，791，192或4,179,337中所列方式将受体多肽与多种聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯，或者其它类似分子诸如聚谷氨酸酉旨/盐(polyglutamate)连接而共价修饰。此类PEG化形式可使用本领域已知技术来制备。本发明还设想了亮氨酸拉链形式的这些分子。"亮氨酸拉链"是本领域中用于指增强、促进或驱动其融合配偶体(例如亮氨酸拉链与之融合或连接的序列或分子)二聚化或三聚化的富含亮氨酸序列的术语。本领域已经记载了多种亮氨酸拉链多肽。参见例如Landschulzetal.,Science,240:1759(1988);美国专利5,716，805;WO94/10308;Hoppeetal.，FEBSLetters,344:1991(1994);Maniatisetal"Nature,341:24(1989)。本领域技术人员将领会，亮氨酸拉链序列可以融合在WISP-1或WISP-1拮抗剂分子的5'或3'端。本发明的WISP-1多肽还可以以如下方式修饰，即通过将多肽与另一种异源多肽或氨基酸序列融合而形成嵌合分子。优选的是，所述异源多肽或氨基酸序列的作用是使嵌合分子寡聚化。在一个实施方案中，此类嵌合分子包括WISP-1多肽与标签多肽的融合，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选#^生结合的表位。通常将表位标签置于多肽的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的多肽的存在情况可使用针对标签多肽的抗体来检测。还有，表位标签的提供使得多肽易于使用抗标签抗体或结合表位标签的其它类型亲和机制通过亲和纯化进行纯化。多种标签多肽及其相应的抗体是本领域众所周知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Fieldetal"Mol.Cell.Biol"8:2159-2165(1988》;c-myc标签及其抗体8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10(Ev肌etal.,MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985》；及单纯疱渗病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborskyetal.,ProteinEngineering,3(6):547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hoppetal.,BioTechnology,6:1204-1210(1988));KT3表位肽(Martinetal.,Science,255:192-194(1992));a-微管蛋白表位肽(Skinneretal.,J.Biol.Chem"266:15163-15166(1991));及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuthetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990))。设想了抗WISP-1抗体也可用于当前公开的方法。此类分子的例子包括可降低癌细胞生长、转移或运动的中和性或阻断性抗体。抗WISP-l抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如KohlerandMilstein,Nature256:495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂将典型地包括WISP-1多肽或其融合蛋白，诸如WISP-l-IgG融合蛋白。通常，若希望人起源的细胞，使用外周血淋巴细胞("PBL，，)，或者若希望非人哺乳动物来源，使用脾细胞或淋巴结细胞。然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress(1986),pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄噤呤鸟噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄。票呤、氨基喋呤和胸苷("HAT培养基")，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定地高水平表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠源骨髓瘤细胞系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiege，California,USA)和美国典型i咅养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,Virginia,USA)获得。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeuretal"MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1987)pp.51-63)。然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定针对WISP-1的单克隆抗体的存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA),测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如MunsonandPollard,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding,见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基或腹水分开或纯化。单克隆抗体还可通过重组DNA技术来生成，诸如美国专利4,816，567中所述。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核香酸^t笨针)。杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA,例如通过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序歹ll(Morrisonetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851(1984))，或者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。通常用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定区，或者用它们替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，其包含对WISP-1具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。嵌合或杂合抗体也可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法来制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键:来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚胺酸曱酉旨(methyl陽4-mercaptobutyrimidate)。也可以生成单链Fv片段，诸如Iliadesetal"FEBSLetters,409:437-441(1997)中所述。此类单链片段使用各种接头的偶联记载于Korttetal.,ProteinEngineering,10:423-433(1997)。本领域知道用于重组生产和操作抗体的多种技术。下文更为详细的描述了熟练技术人员通常使用的此类技术的例示性例子。(i)人源化抗体通常，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作"输入，，残基，它们通常取自"输入"可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Riechmannetal.,Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal"Science239:1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类"人源化"抗体是嵌合抗体，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从共有和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。人抗体人单克隆抗体可通过杂交瘤方法生成。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有描述，例如Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeuretal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1987)。现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits"a/.,iVoc.Ww/.Jcad5W.90:2551-255(1993);Jakobovits"a/"胸脏362:255-258(1993)。Mendez等人(NatureGenetics15:146-156(1997))进一步改进了技术，生成了称为"Xenomousell"(异种移植物小鼠)的转基因小鼠品系，它在受到抗原攻击时生成高亲和力的完全人的抗体。这是如上所述通过将数百万碱基的人重链和轻链基因座种系整合到内源JH区段删除的小鼠中而实现的。XenomouseII携带1,020kb人重链基因座，包含大約66科Vh基因、完整的Dh和Jh区、及三种不同的恒定区((i、5和5C),还携带800kb人K基因座，包含32种Vic&因、Jk区段和Cic^因。这些小鼠中生成的抗体在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和全集。由于内源Jh区段的刪除防止了鼠基因座的基因重排，因此人抗体较之内源抗体优先表达。或者，噬菌体展示技术(McCafferty"a/.,Ato,348:552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变区(V)基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，KevinS.andChiswell,DavidJ"Q^re"f(9;/m'朋/"^n/"Mra/祝o/ogy3:564-571(1993)。V基因区4爻的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson"a/.，Atowe352:624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗a恶唑酮抗体。可本质上遵循Marks"a/.,J嵐編.222:581-597(199l)或Griffith"a/.,五MS(9J:12:725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高比率积累突变(体细胞高变)。导入的有些变化将赋予更高亲和力，展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原攻击过程中优先复制和分化。这种天然过程可通过采用称为"链改组"的技术来模拟(Marksetal.，Bio/Technol.10:779-783(1992))。在这种方法中，通过噬菌体展示得到的"初始"人抗体的亲和力可通过用从未免疫供体得到的V结构域基因天然存在变体(全集)的全集相继替换重链和轻链V区基因而提高。此技术得以生成亲和力在nM范围中的抗体和抗体片l殳。Waterhouseetal.,Nucl.AcidsRes.21:2265-2266(1993)记载了用于构建非常大的噬菌体全集(也称为"所有文库的母库"(themother-of-alllibraries))的策略。基因改组也可用于从啮齿类抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿类抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为"表位印记"(epitopeimprinting),通过嗟菌体展示#支术得到的啮齿类抗体的重链或轻链V结构域基因用人V结构域基因全集替换，产生啮齿类-人嵌合物。针对抗原进行的选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即表位决定(imprints)配偶体的选择。在重复该过程以替换剩余啮齿类V结构域时，得到人抗体(参见PCT专利申请WO93/06213,公开于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植进行的啮齿类抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含啮齿类起源的框架或CDR残基。正如下文所讨论的，本发明的抗体可任选包括抗体单体、抗体二聚体、以及抗体的多价形式。本领域技术人员可通过本领域已知技术来构建此类二聚体或多价形式。用于制备单价抗体的方法也是本领域众所周知的。例如，一种方法涉及免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任意点截短以防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或删除以防止交联。双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选人或人源化抗体。在本案中，一种结合特异性是针对WISP-1。例如，特异性结合WISP-1或WISP-l变体和另一种CNN家族成员(例如WISP-2、WISP-3、CTGF、Cyr61或Nov)或其它分子诸如CD44的双特异性抗体也在本发明的范围内。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(MillsteinandCuello,Nature305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产率低。1993年5月13日公开的WO93/08829及Trauneckeretal.,E固O10:3655-3659(1991)中披露了类似的流程。依照一种不同的且更优选的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于1994年3月3日公开的PCR申请WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh"五/72ymo/ogy121:210(1986)。(iv)异源偶联抗体异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)及用于治疗HIV感染(PCT申请WO91/00360和WO92/200373;EP03089)。异源偶联抗体可使用任何方便的交联方法来生成。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利4,676,980。(v)抗体片段在某些实施方案中，抗WISP-1抗体(包括鼠的、人的和人源化的抗体，及抗体变体)是抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto"a/.，7肠c/zew.所—,Me^zotfc24:107-117(1992);Bre画n"a/.,Sc/e脏229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片革殳。例如，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter"a/.,所o/Tec/wo/ogy10:163-167(1992))。在另一个实施方案中，F(ab')2片段是使用亮氨酸拉链GCN4形成的，以促进F(ab')2分子的装配。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离Fv、Fab或F(ab')2片段。用于生成抗体片段的多种技术对熟练从业人员将是显而易见的。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的例子记载于94年12月22日公开的WO94/29348和美国专利4，342，566。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作Fab片段，各自具有单一抗原结合位点，及残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生F(ab'》片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。抗体消化中产生的Fab片l爻还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH,)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH,结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。抗体在其恒定区中的保守位置发生糖基化(JefferisandLund，Chem.Immunol.65:111-128(1997);WrightandMorrison,TibTECH15:26-32(1997))。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boydetal.,Mol.Immunol.32:1311-1318(1996);WittweandHoward,Biochem.29:4175-4180(1990)),及糖蛋白各部分间的分子内相互作用，它可影响糖蛋白的构象和所呈3见的三维表面(HefferisandLund，supra;WyssandWagner,CurrentOpin.Biotech.7:409-416(1996))。寡糖还可用来使给定糖蛋白靶向基于特定识别结构的某些分子。例如，已有报道，在无半乳糖基化IgG中，寡糖模块从CH2间空间伸出，末端N-乙酰葡糖胺残基得以结合甘露糖结合蛋白(Malhotraetal.，NatureMed.1:237-243(1995))。用糖肽酶除去中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中所生成的CAMPATH-1H(—种识别人淋巴细胞CDw52抗原的重组人源化鼠单克隆IgGl抗体)上的寡糖导致补体介导的溶胞(CMCL)完全降低(Boydetal.,MoLImmunol.32:1311-1318(1996)),而用神经氨酸酶选4奪性消除唾液酸残基不导致DMCL的丧失。还有报道，抗体的糖基化影响抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。具体而言，有报道说，其中(3(l，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶in(GnTIII)(催化等分GlcNAc形成的糖基转移酶)的表达受四环素调控的CHO细胞具有改进的ADCC活性(Umanaetal.，MatureBiotech.17:176-180(1999))。抗体的糖基化变体指其中抗体的糖基化样式发生改变的变体。改变意味着删除抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，向抗体中添加一个或多个碳水化合物模块，改变糖基化(糖基化样式)的组成、糖基化的程度、等。糖基化变体可以通过例如在编码抗体的核酸序列中消除、改变和/或添加一个或多个糖基化位点来制备。抗体的糖基化典型的或是N-逸接的或是0-逸接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列4吏其包含一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向初始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。还可以在不改变潜在核芬酸序列的前提下改变抗体的糖基化(包括糖基化样式)。糖基化很大程度上取决于用于表达抗体的宿主细胞。由于用于表达作为潜在治疗剂的重组糖蛋白例如抗体的细胞类型很少是天然细胞，因此可预期抗体的糖基化样式将有显著变异(参见例如Hseetal.,J.Biol.Chem.272:卯62-9070(1997))。在宿主细胞的选择之外，在抗体的重组生成过程中影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用(oxygenation)、pH、纯化方案、诸如此类。已经提出多种方法用于改变在特定宿主生物体中实现的糖基化样式，包括导入或过表达参与寡糖生成的某些酶(美国专利5,047,335;5,510,261和5.278,299)。糖基化或某些类型的糖基化可从糖蛋白中酶促清除，例如使用内切糖苷酶H(EndoH)。另外，可对重组宿主细胞进行遗传工程改组，例如使其在加工某些类型的多糖方面缺陷。这些和类似的技术是本领域众所周知的。抗体的糖基化结构可通过碳水化合物分析的常规技术容易地分析，包括凝集素层析、NMR、质谱、HPLC、GPC、单糖成分分析、序贯酶促消化和HPAEC-PAD，它利用高pH阴离子交换层析根据电荷来分离寡糖。为分析目的释放寡糖的方法也是知道的，包括但不限于酶促处理(常常使用肽-N-糖苷酶F/内切-P-半乳糖苷酶进行)、使用强碱环境的消除以释放主要是O-连接结构、及使用无水肼的化学方法以释放N-和O-连接寡糖二者。三链抗体(triabody)也在本发明的范围内。此类抗体记载于例如Iliadesetal.,supra和Korttetal"supra。可以通过将抗体与细胞毒剂(像毒素分子)或前体药物活化酶偶联来修饰本发明的抗体，所述前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂，参见WO81/01145)转变为活性抗癌药。参见例如WO88/07378和美国专利第4,975，278号。这种技术也称为"抗体依赖性酶介导的前体药物疗法"(AntibodyDependentEnzymeMediatedProdrugTherapy,ADEPT)。可用于ADEPT的免疫偶联物的酶组分包括能够以这样一种方式作用于前体药物从而将其转变为更有活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于本发明方法的酶包括但不限于可将含磷酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸盐/酯的前体药物转变为游离药物的芳基^5危酸酯酶；可将无毒5-氟胞嘧啶转变为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；可将含肽的前体药物转变为游离药物的蛋白酶，诸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶B和L);胱天蛋白酶，诸如胱天蛋白酶3;可转化含D-氨基酸替代的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；可将糖基化前体药物转变为游离药物的碳水化合物切割酶，诸如(3-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；可将用(3-内酰胺衍生的药物转变为游离药物的P-内酰胺酶；及可将在其氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转变成游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作"抗体酶(abzyme)",将本发明的前体药物转变为游离活性药物(参见例如Massey,Nature328:457-458(1987))。可如本文所述制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶投递至肿瘤细胞群。可通过本领域众所周知的技术将酶与抗体共价结合，诸如使用异双功能交联剂。或者，可使用本领域众所周知的重组DNA技术构建包含与本发明酶例如Neubergeretal.,Nature312:604-608(1984))。还设想了其它抗体修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、或其它分子诸如聚谷氨酸S旨/盐。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于《Remington'sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol,A.编，1980。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利第5,739,277号中所述将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语"补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgG,、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。配制剂任选在载体中采用本文所述WISP-1拮抗剂。合适的载体及其配制剂记载于i柳/"gto"'sP/zar應cewft'ca/5We"ces,第16版,1980,MackPublishingCo.，Osol等人编。典型的是，在载体中使用适宜量的药剂学可接受盐，使得配制剂等渗。载体的例子包括盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。载体的pH优选约5至约8，更优选约7.4至约7.8。对于本领域技术人员显而易见的是，根据例如施用路径及所施用活性剂的浓度，某些载体可能是更优选的。载体可以是冻干配制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂优选在所采用的剂量和浓度对细胞和/或接受者是无毒的，包括緩冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的緩冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二曱基卡基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯曱酸烷基酯，诸如对羟基苯曱酸曱酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA;糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如tweentm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选那些活性互4卜且彼此没有不利影响的化合物。本文所述拮抗剂还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶嚢中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微胶嚢)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶嚢)，或在粗滴乳状液中。此类4支术4皮露于's尸/2anwacew/7.ca/S"'e"cas1,第16片反,Osol,A.纟扁(1980)。用于体内施用的配制剂应当是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有活性剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶嚢。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酉旨)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子长达l00天，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。治疗模式本文所述分子可用于治疗多种病理疾患，诸如癌症。这些疾患可通过施用一种或多种本文所述拮抗剂来治疗。哺乳动物中本文所述各种病理疾患的诊断可以由熟练从业人员来进行。诊断技术是本领域可得到的，它们容许例如诊断或检测哺乳动物中的癌症或免疫相关疾病。例如，癌症可通过包括4旦不限于触^t、血液分析、x射线、NMR等技术来鉴定。拮抗剂可依照已知方法来施用，诸如静脉内施用，推注(bolus)或一段时间连续输注的形式，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。任选的是，可使用各种商品化装置通过微型泵灌输进行施用。拮抗剂还可以使用本领域已有记载的基因疗法技术而采用。施用拮抗剂的有效剂量和进度表可凭经验决定，而且做出这样的决定在本领域技术范围内。可采用单个或多个剂量。目前认为单独使用拮抗剂的有效剂量或有效量的范围可以是每天约l吗/kg至约100mg/kg体重或更多。可以以本领i或已知方式进4亍剂量的物种间定标，例如Mordentida/.,P/zarmacewf.8:1351(1991)中所披露的。在采用体内施用拮抗剂时，正常剂量的范围可以是每天约10ng/kg至高达100mg/kg哺乳动物体重或更多，优选约lpg/kg/天至10mg/kg/天，^L决于施用路径。文献中提供了有关具体剂量和投递方法的指导；参阅例如美国专利4,657,760;5,206,344;或5,225,212。预期不同配制剂将对不同治疗用4匕合物和不同病症有效，即例如靶向一种器官或组织的施药可能必须以不同于另一器官或组织的方式投递。本领域技术人员将理解，必须施用的拮抗剂剂量将根据例如将接受激动剂或拮抗剂的哺乳动物、施用路径、和正施用于该哺乳动物的其它药物或疗法而变化。根据细胞的类型和/或疾病的严重程度，将约l吗/kg至约15mg/kg(例如约0.1-20mg/kg)的拮抗性抗体作为施用的初始侯选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。根据上述因素，典型的每日剂量可在约liag/kg到100mg/kg或更多的范围内。对于持续数天或更长时间的重复施用，根据状况，维持治疗直到发生对疾病症状的期望遏制。然而，其它剂量方案也可使用。本发明的方法中可使用单一类型的拮抗剂。例如，可施用WISP-1免疫粘附素分子。或者，熟练从业人员可选择在所述方法中采用拮抗剂的组合，例如WISP-1免疫粘附素与WISP-1抗体的组合。设想了可以在所述方法中采用体在上文章节I中进一步详尽定义的放射疗法、细胞因子、生长抑制剂、化疗剂、细胞毒剂、酪氨酸激酶抑制剂、ras法呢基转移酶抑制剂、血管发生抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。此外，还有基于靶向肿瘤抗原的治疗性抗体诸如RituxanTM或HerceptinTM以及抗血管发生抗体诸如抗VEGF的疗法。化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书进行，或者由技术人员凭经验决定。此类化学疗法的准备和剂量给药方案也可参阅CTzemoAera;;/6"erWceEd.,M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore,MD(1992)。化疗剂可在施用例如拮抗剂之前或之后施用，或者可同时给药。例如，拮抗剂还可以与抗雌激素化合物诸如他莫昔芬或抗孕酮化合物诸如奥那司酉同(参见EP616812)以此类分子的已知剂量联用。可能期望还施用针对其它抗原的抗体，诸如结合CD20、CDlla、CD18、CD40、CD44、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、血管内皮生长因子(VEGF)或其它TNFR家族成员(诸如DR4、DR5、OPG、TNFR1、TNFR2)的抗体。或者/另外，可将本文中所公开的结合相同或两种或多种不同抗原的两种或多种抗体共施用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。在一个实施方案中，本文拮抗剂与生长抑制剂共施用。例如，可以先施用生长抑制剂，接着是本发明的拮抗剂。拮抗剂和一种或多种其它疗法可以同时或序贯施用。在施用拮抗剂后，可分析体外处理的细胞。若采用的是体内治疗，则可以以熟练从业人员熟知的多种方式监测所治疗哺乳动物。制品在本发明的另一个方面中，提供了包含可用于治疗上文所述病症的物质的制品。制品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器和试管。容器可以用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效治疗疾患的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内使用溶液袋或小管)。组合物中的活性剂可包括拮抗剂。容器上的或与容器有关的标签指示该组合物用于治疗选定疾患。制品可进一步包括第二容器，其中装有药剂学可接受的緩沖剂，诸如磷酸盐緩冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它緩沖剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和印有使用说明书的包装插页。提供以下实施例仅出于例示目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。将本说明书中所引用的所有专利和参考文献完整收入本文作为参考。实施例除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。除非另有说明，本发明采用重组DNA技术的标准流程，诸如上文和以下教科书中所"i己载的Sambrooka/.,Mo/ecw/arC7om'wg.'J丄a6orato^Afawwa/,ColdSpringHarborPressN.Y"1989;Ausubelfl/"Cwrew/iVofoco/sA/o/ecM/orS/o/o^,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y.,1989;Innisa/.,尸CiZVofocofa..爿Gw^feto7kfef/zo(is<3<i4pp"ca^.o"s,AcademicPress,Inc.,N.Y"1990;Harlow"a/.,y4ri6oc//esv^丄a6oratoryTkfawwa/,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,1988;Gait,M丄,Wgowwc/e加VfeS声/2esz's,IRLPress,Oxford,1984;R丄Freshney，^m'應/CW/Cw/rt#^，1987;Coligan"<a/,，Cwrre"f/Vofoco/s/mmimo/ogy，1991。下面提供了下文实施例中提到的测定法和材料的说明蛋白质和抗体:全长人WISP-l-Fc融合蛋白如先前所述表达和纯化(Desnoyersda/.,/所o/.C/zem.276:47599-47607(2001))。纯化的小鼠抗大鼠CD44抗体(克隆OX49)来自BDBioscience(Bedford,MA)。小鼠gG2a同种型对照抗体来自Pharmingen。FITC偶联的小鼠抗大鼠CD44来自Serotec(Raleigh，NC)，FITC偶联的小鼠IgGl同种型对照抗体来自DAKO(Denmark)。大鼠抗小鼠CD44(克隆KM114)来自Pharmingen。肌动蛋白抗体(克隆C4)来自ICNbiomedicals(Aurora,OH)。鼠抗人WISP-1单克隆抗体使用2002年5月14日公告的美国专利第6,387,657号实施例中记载的方案和试剂生成，其中使用WISP-l-Fc作为免疫原。申请人已经将五种此类单克隆抗体和分泌保藏于ATCC,如下所述。细』包和组织样本:NRK-49F和SW4S0细胞系(ATCC，Manassas,VA)在补充有10%胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(HGDMEM)中维持。亲本C57MG、表达Wnt-l的C57MG(C57MG/Wnt-1)、表达高水平hWISP-l的NRK-49F(NTRK/WISP-1H)、表达较低水平hWISP-l的NRK-49F(NRK/WISP-1L)和含空载体的NRK-49F(NRK/对照)得自ArnoldLevine(PrincetonUniversity,Princeton,NJ)并在含2.5)ig/ml噪呤霉素的培养基中维持(Xua/.,Ge"eyZ)ev.14:585-595(2000》。将得自HaroldVarmus(NationalCancerInstitute,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)的Wnt-l转基因小鼠与得自JacksonLaboratories(BarHarbor,MA)的p53缺失小鼠(nullmice)交配，以产生Wnt-l转基因/p53敲除小鼠。从那些小鼠切除乳腺瘤和乳腺导管上皮的样本供分析用。颗粒排斥测定法(ParticleExclusionAssay):如先前所述4吏用红细胞沉降测定法，但做微小修改(Knudson&Ce〃99:227-235(1991))。将NRK/WISP-1(经WISP-1转染的正常大鼠肾成纤维细胞；参见Xu^a/.,Dev.14:585-595(2000))和NRK/对照细胞(正常大鼠肾成纤维细胞；得自ArnoldLevine,PrincetonUniversity,Princeton,NJ)(1x105纟田月包/孑L)才妄种到Falcon6孔板(BectonDickinson,FranklinLanes,NJ)中，并在补充有10%胎牛血清(FBS)(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)的高葡萄糖Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基中于37。C、5%(302维持过夜。次日，除去培养基，加入750plPBS/0.1%BSA(BoehringerMannheim,Indianapolis,IN)中的1C)8个绵羊RBC(Inter-CellTechnologies,Hopewell,NJ)并让其沉降15分钟。使用NikonDiaphot300倒置显微镜观察细胞，使用SONYDKC-5000数码相机(Japan)获取数字图像。培养细胞的乙酰透明质酸染色:乙酰透明质酸染色如先前所述进行，但做微小修改(Pienimaki"a/.,J说o/.C/zew.276:20428-20435(2001))。将NRK/WISP-l和NRK/对照细胞(8-10x103)铺到8孔塑料室载波片中，并(如上所述)于37。C、5。/。C02维持过夜。次日，将细胞用磷酸盐緩冲盐水(PBS)清洗，并用PBS中的4。/。低聚曱醛于室温固定20分钟。将细胞用PBS清洗，并将非特异性结合位点用含1%牛血清清蛋白(BSA)和0.1。/。TritonX-100(Calbiochem,LaJolla,CA)的蒸馏水饱和30分钟。加入生物素化HA结合蛋白(HA-BP)(SeikagakuAmerica,Falmouth,MA)(5|ig/ml，；容于PBS/3。/。BSA)并于室温温育过夜。次日，将细胞用PBS清洗，并与TBS/1。/。BSA中的1:1000FITC偶联的链霉亲合素(DAKO，Carpinteria,CA)—起温育30分钟。将细胞在PBS中清洗，使用含l[ig/mlHoechst33342(MolecularProbes,Eugene,OR)的Vectashield(Burlingame，CA)制作标本，并在NikonEclipse800荧光显微镜下显现。使用连接AppleG3计算机的Photometrics300CCD相机获取图像，于-40。C操作。相同流程还用于来自Wnt-1转基因小鼠的乳腺肿瘤冷冻切片的染色。实时RT-PCR:如先前所述使用实时RT-PCR测定相对RNA表达水平(Winer"a/.,^朋/.270:41-49(1999》。使用Tri试剂依照制造商的方案(MolecularResearchCenter)自细胞提取总RNA。设计特异性引物和焚光探针，用于扩增和定量基因表达水平。将基因的特异信号相对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶持家基因的特异信号进行标准化。对每种条件的一式三份数据集取平均值。所有TaqManRT-PCR试剂购自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。为了测试重组WISP-1对基因表达的影响，将培养皿(35mm)用PBS中的75吗/mlhWISP-l-Fc于4。C包被过夜。次日，将细胞(3x105细胞/皿)铺到包被表面上，并在18小时后进行表达分析。在某些情况中，将包被表面清洗并于室温再处理2小时，然后4妻种细月包。FACS分析.'将细胞通过胰蛋白酶消化收获，用PBS清洗，并在含lMg/mlFITC偶联的抗CD44(Serotec，Raleigh,NC)或同种型对照抗体(DAKO，Denmark)的PBS1%BSA/20%葡萄糖中于室温温育30分钟。将细胞用相同緩沖液清洗并在EPICSXL-MCL(Coulter,Miami,FL)上分析。Western印迹:将NRK/C和NRK/W1H在10cm2板中培养至汇合。将纟田胞用PBS清洗并用300fi1TBS中的1%Triton-X100提取5分钟。通过向提取物中加入10倍体积的丙酮来沉淀蛋白质。将样品还原，变性并加载到4-20。/。梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上。将凝胶转移至PVDF膜，用抗大鼠CD44抗体(OX49)或抗'J、鼠CD44(KM114)以1吗/ml浓度探查并用HRP偶联的抗'J、鼠IgG二抗和AmershamECL检测试剂检测。使用样品中的肌动蛋白检测作为加载对照。分散测定法(ScatterAssay):将细胞以低浓度(约1000个细胞/孔)铺到24孔板中并让其形成集落达3天。将细胞用Diff-Quik(DadeBehring,Newark,DE)染色并在显微镜下观察集落。细胞伤口愈合测定法:如先前所述使用细胞伤口愈合测定法来评估细胞迁移，但做微小修改(Pienimaki"a/.,J历o/.C/zew,276:20428-20435(2001))。简而言之，将细胞培养至它们达到汇合。用配有一次性黄色移液枪头(tip)的微量移液器在细胞层中划一条线(约lmm)。通过慢速拍摄显微术(timelapsemicroscopy)观察越过清除区的细胞迁移达15小时。使用经镜台测微计(stagemicrometer)校准的MH图像软件测量这段时间后细胞重新占据的面积。慢速拍摄显微术:将细胞铺到HGDMEM/10。/。FBS中，并使用慢速拍摄显微术观察它们的随机迁移达l5小时。使用经镜台测微计校准的MH图像软件测量细胞覆盖的距离。迁移测定:如先前所述使用改良的Boyden室系统测量趋触性(haptotaxis)(Bourguignonefa/.,5z'o/.CAem.275:1829-1838(2000))。811m多孔性24孔格式PET膜滤器(Falcon)的下侧用50jalPBS中的蛋白质(50吗/ml)于4。C包被过夜。将经包被的插入物在无血清培养基中漂洗，并将0.5mlHGDMEM/10%FBS中的0.5xl()S个NRK细胞加至上室。将下室充满0.75ml相同培养基，并将板于37。C温育过夜。次日，用棉签擦拭上室，将迁移至插入物下侧的细胞用Diff-Quik染色试剂盒(DadeBehringInc.)染色并在显微镜下计数。对每种条件的一式三份数据集取平均值。在某些情况中，将包被插入物清洗并于室温再处理2小时。原位杂交:设计PCR引物，扩增NM—018865跨越nt440-1180的鼠WISP-1的740bp片段(上部-5，GGCTGCCATCTGTGACCCA(SEQIDNO:12)及下部-5，CATAGGACCTGCCGGGAGAAA(SEQIDNO:13))或NM—018865跨越nt204-910的鼠WISP-1的706bp片4殳(上部-5，GCCGTGGCAGTCCTGAGGG(SEQIDNO:14)及下部-5，CAGCACCGGGCATTGACGTTA(SEQIDNO:15))或M27129的跨越nt144-608的鼠CD44的部-5'TGGGGTGCTCTTCTCGATGG(SEQIDNO:17))或鼠HAS2的跨越NM—008216的nt927-1557的630bp片,殳(上部-5，GGACAAATCGGCCACGTACAT(SEQIDNO:18)及下部-5，CTTGCTCCATCGGGTCTGC(SEQIDNO:19))。引物包含编码27个核苷酸的T7或T3RNA聚合酶起始位点的延伸，从而分别能够在体外从扩增产物转录有义或反义探针(Lu"a/.，Ce〃1:169-176(1994))。将所有组织在4%福尔马林中固定并在石蜡中包埋。如先前所述将3-5^:米厚的切片脱石蜡，在4mg/ml蛋白酶K中于37。C脱蛋白质达30分钟，并进一步加工供原位杂交用(Holcomb"a/"5M5(9JAug20001;19(15):4046-55)。将33p-UTP标记的有义和反义探针与切片于55。C杂交过夜。通过在20mg/mlRNA酶A中于37。C温育30分钟来除去未杂交的探针，接着在0.1XSSC中于55。C进行高严格性洗涤达2小时并通过分级乙醇脱水。将载波片浸入NBT2核径迹乳液(nucleartrackemulsion),在放有干燥剂的密封塑料载波片盒中于4。C曝光4周，显影，并用苏木精和曙红复染。实施例l表达高水平(NRK/WISP-1H)或低水平(NRK/WISP-1L)WISP-1的稳定成纤维细胞细胞系和含有空载体的对照细胞系(NRK/对照)用于评估WISP-1对HA生成的影响。如颗粒排斥测定法所证明的，NRK/WISP-1H细胞在细胞周围积累了一大层乙酰透明质酸，它能够排斥沉降中的红细胞(图la)。NRK/WISP-1L在细胞周围积累了较少的基质(图lb)，而NRK/对照(图lc)或经透明质酸酶处理的NRK/WISP-1H细胞(数据未显示)没有积累基质。还使用生物素化HA结合蛋白(bHABP)通过荧光染色评估了与HA有关的细胞表面的积累。染上色揭示了HA在NRK7WISP-1H细胞表面积累(图ld),而在NRK对照细胞上没有检测到染色(图le)。通过比较HA在NRK/WISP-lH与NRK/对照的培养液中随时间的积累，评估了WISP-1对HA分泌的影响。24小时后，NRK/WISP-1H培养液中的HA浓度比NRK/对照细胞培养液中的高3.5倍，并在144小时后逐渐升高至8倍(图1f)。这些结果合起来显示了NRK细胞中的WISP-1表达促进HA在细胞表面和在培养液中的积累。实施例2为了鉴定负责WISP-1触发的HA生成的酶，分析了NRK/WISP-1H、NRK/WISP-lL和NRK/对照细胞中已知的HA合酶(HAS1、HAS2和HAS3)的表达。HAS2表达在产WISP-1细胞中升高可达10倍，而HAS1和HAS3mRNA水平与对照相同(图2a)。CD44和RHAMMmRNA水平在NRK/WISP-l细胞系中也升高，而透明质酸酶表达保持不变(图2a)。此外，HAS2、CD44和RHAMMmRNA水平与WISP-l表达成比例。如FACS分析(图2b)和Western印迹(图2c)所证明的，NRK/WISP-1H细胞中CD44mRNA表达的升高导致CD44蛋白质水平升高4倍。实施例3HA显示出通过与两种细胞表面受体即CD44和RHAMM相互作用而刺激细月包迁移(Hall"a/.,ra;ra;Bourguignonefa/"rapra)。因为WISP画1既4是高HA生成又增强CD44和RHAMM的表达，所以评估了WISP-1表达细胞的运动力。在以低密度分配时，NRK/对照细胞增殖并形成清楚限定的集落(图3a)。增殖中的NRK/WISP-1L细胞形成限定较不清楚的集团，即有些细胞离开生长中的集落(图3b)。没有看到NRK/WISP-1H集落，细胞以随机样式分散(图3c)。与对照(图3d)相反，WISP-1表达细胞也揭示了过度延长的形态，及高运动力的片状伪足伸展特征(图3e)。使用慢速拍摄显微术，观察到NRK/WISP-1H的迁移距离与对照细胞相比升高了4倍(图3f)。NRK/WISP-1H还显示出细胞伤口愈合测定法中的迁移面积升高了2.5倍(图3g)。这些结果合起来证明了WISP-1表达可促进细胞迁移。实施例4为了测定异位添加WISP-1是否能促进HAS2表达和细胞迁移，使用纯化的重组WISP-l-IgG进行测定法(Desnoyersda/.,wpra)。向培养液中添加WISP-1不促进HAS2表达(数据未显示)。将NRK细胞铺到WISP-l-IgG包被的表面上后，HAS2表达与铺到未包被的塑料上或无关IgG嵌合蛋白(TNFR-IgG)包被的表面上的HAS2相比升高了(图4a)。尽管单独的饰胶蛋白聚糖(decorin)促进HAS2表达，然而这种诱导在将包被表面与WISP-1—起温育后进一步升高了3倍。还检验了异位添加WISP-1对NRK细胞迁移的影响。在transwell(转孔)测定法中，WISP-1-IgG在包被到滤器的下表面上时诱导NRK细胞的趋触性迁移(haptotacticmigration)(图4b)。包被无关IgG嵌合蛋白(TNFR-IgG)或添加WISP-l-IgG至下室不促进迁移。CD44或WISP-1抗体(图4b)抑制由WISP-1诱导的趋触性迁移。此外，WISP-1趋触活性不限于成纤维细胞，因为它还促进细胞SW480(—种结肠腺癌细胞系)的迁移(图4c)。这些结果合起来证明了异位添加WISP-1通过CD44介导的机制提高HAS2表达并促进细胞迁移。虽然尚未完全理解，认为WISP-1呈递对于迁移可能是重要的，因为它可能需要系留至基质以引发此活性。实施例5因为认为WISP-1是Wnt-l的下游效应器，分析了经Wnt-l稳定转染的乳腺上皮细胞系(C57MG/Wnt-l)中的WISP-l、HAS2和CD44表达。在与对照细胞系(C57MG)相比时，C57MG/Wnt-1细胞显示出WISP-1、HAS2和CD44mRNA表达分别升高了2.7、5.8和3倍(图5a)。如Western印迹所证明的，C57/Wnt-1细胞还显示出CD44蛋白质含量升高了6倍(图5b)。此外，与对照细胞系不同，Wnt-l表达细胞在以低密度进行培养时未能形成清楚的集落而分散了(图5c)。这些结果合起来显示出HAS2和CD44表达及细胞运动力在Wnt-1触发WISP-1表达的细胞系中升高了。实施例6在转基因小鼠中，乳腺上皮中的Wnt-l表达促进肿瘤形成(Liefa/.,(9"coge"e19:1002-1009(2000);Tsukamoto"a/"Ce〃55:619-625(1988》。因为WISP-1是Wnt-1的推定下游效应器，测量了来自MMTV-Wnt-1转基因小鼠的自发性乳腺瘤中HAS2和CD44的mRNA表达。在与乳腺导管上皮相比时，HAS2mRNA表达在所分析的所有乳腺瘤中升高了2.5-5.5倍(n=5;图5d)。类似的，CD44mRNA表达在所有肿瘤中诱导了2.2-4.2倍(n=5;图5e)。这些结果显示出HAS2和CD44在表达WISP-1的MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤中过表达。实施例7原位杂交证明了MMTV-Wnt-l转基因小鼠乳腺瘤的肿瘤周围基质中的WISP-1表达升高(图a和b)。相反，只在肿瘤上皮细胞中发现了HAS2(图6c和d)和CD44(图6e和f)表达。CD44在肿瘤实质中的定位得到了免疫组织化学的证实(图6g)。连接蛋白染色揭示了与肿瘤基质有关的乙酰透明质酸积累(图6h)。在紧挨着肿瘤小叶处发现了最高染色强度，而较弱的染色定位于正常乳腺导管上皮。这些发现与WISP-1可能调控肿瘤与牵涉透明质酸和CD44的基质细胞之间的相互作用的意见一致。实施例8如先前所述评估了转4b系的转移和生长潜力(Welchea/.，Owcer60:1552-1556(2000))。使用9周龄Swissnu/nu雌性小鼠。简而言之，将细胞通过胰蛋白酶消化收获并用PBS清洗两次。给每只小鼠在侧面尾静脉中注射100^il含5xl(f或2.5xl0S个细胞的悬浮液。在注射后2、3和4周，使用运动(cine)-磁共振成像(MRI)对小鼠检验肺部损伤的影像，并进行尸检。将肺用Bouin氏固定剂灌注，切除，并制作苏木精&曙红染色切片供评估肺肿瘤移生用。评估左肺的多个纵向切片及右肺顶叶(craniallobe)、中叶(mediallobe)、尾叶(caudallobe)和副叶(accessorylobe)的一个横向切片。在组织学上，患病肺中纺锤形肺瘤细胞浸润肺间质。然而，因为变化的严重程度是多变的，所以建立了下面的分级系统。1=最低限度累及肺间质_10-20%的肺受到影响。纺锤形(spindloid)肿瘤细胞的巢和簇多病灶性地破坏肺间质。病灶常常沿着胸膜表面，延伸入间质。血管和大气管没有受到影响。11=中度累及肺间质-20-50%的肺受到影响。纺锤形肿瘤细胞的巢和簇多病灶性地破坏肺间质。有些血管或大气管充满了纺锤形细胞。纺锤形细胞频繁形成宽带或大块，在胸膜下面并延伸入间质。上面的间皮(overlyingmesothelium)是々包满的(反应性的)。111=严重累及肺间质-50-100°/。的肺受到影响。纺锤形肿瘤细胞的巢和簇多病灶性地破坏肺间质。血管或大气管充满了纺锤形细胞。纺锤形细胞频繁形成宽带或大块，在胸膜下面并延伸入间质。纺锤形细胞常常包埋在灰白色的嗜碱性至两嗜性非细胞物质中。上面的间皮是饱满的(反应性的)。剩下没受影响的最低限度换气面积。图7和10总结了接种NRK/WISP-1H、NRK/WISP-lL和NRK/对照细胞的棵鼠中的肺部移生结果。在接种NRK7WISP-1H或NRK/WISP-1L的小鼠中，细胞以时间和剂量依赖方式形成肺部团块。在注射2.5xl0S个NRK/WISP-lH并在注射后4周尸检的小鼠中看到了最严重的损伤。在注射后2和3周，小鼠具有较不严重但进行性的肿瘤形成(I-II级；见上文分级系统)。注射2.5xl05个NRK/WISP-1L的小鼠至注射后4周只具有最低限度的肺部肿瘤形成。注射后4周后，接种0.5xl()S个NRK/WISP-lL细胞的小鼠或是正常的或是具有最低限度的肿瘤浸润(I级)，而注射0.5xl()S个NRK/WISP-lH细胞的小鼠显示出升高的肺瘤浸润(I-II级)。组织学观察结果揭示了接种NRK/对照细胞的动物的肺是正常的(图7a-c)。在注射NRK/WISP-1的动物中，赘生性纺锤形细胞首先形成小簇，在肺的胸膜面内、自肺的胸膜面凸出、或在肺的胸膜面下(I级；图7d-f)，常常包埋在灰白色的嗜碱性至两嗜性非细胞物质中。在更严重的患病动物中，肿瘤细胞在胸膜下面形成宽阔的汇合带(II级；图7g-i)。在最严重的患病动物中，血管和大气管充满了纺锤形细胞(III级；图7j-l)。MRI分析显示了具有组织学n级和m级侵入的动物中沿着胸膜的左右肺轮廓的密度提高(超信号(hypersignal))。MRI上损伤的严重程度与组织学得分一致(图7a,d,g,j)。这些结果表明WISP-1表达促进细胞转移性生长潜力。实施例9在4果鼠的尾静脉中接种NRK/WISP-1H细胞(2.5xl()5个细胞)。自细胞接种曰起，每周两次给小鼠腹膜内注射10mg/kgCD44抗体、同种型对照抗体或只有緩沖液(PBS)。4周后将肺固定并切除供大体解剖学分析用。4周后，在用CD44抗体治疗的动物(n-5)中看到的损伤严重程度的变化范围自正常至I级，而用对照抗体或盐水治疗的所有动物(11=10)具有111级损伤(图8a)。用CD44抗体治疗的动物的肺中的转移性病灶的平均面积与用对照抗体治疗的动物相比缩小了99。/。(P〈0.00003)(图8b)。实施例IO进行了一种测定法以检验某些WISP-1抗体的结合特异性。将全长'j、鼠WISP-1(GenBank编号NM—018865)和全长人WISP-1(GenBank编号AF100779;图9)克隆入表达载体，该表达载体在WISP-1序列下游编码人IgGlFc区。使用S昆虫细胞在杆状病毒表达系统中合成所得重组融合蛋白(WISP-1-Fc)，并在蛋白A-Sepharose4FastFlow(AmershamPharmaciaBiotech)上通过亲和层析自不含血清的条件培养基纯化至均质。还在大肠杆菌菌株中一起表达全长人WISP-l与氨基末端六组氨酸标签(WISP-l-His)。将溶胞物在Ni2+-NTA琼脂糖柱(Qiagen)上进行层析。用0-500mM咪唑梯度洗脱WISP-l-His。合并并分析含洗脱的WISP-l-His的级分。来自哺乳动物表达系统的人WISP-l是通过用SDS-PAGE样品緩沖液将稳定转染人WISP-l(ArnoldLevine;PrincetonUniversity,Princeton,NJ)的NRK细月包溶月包得到的。对照细月包溶胞物是由空载体转染的NRK细胞产生的。将来自各种表达系统的WISP-1(50ng)在SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电转移到聚二氟乙烯(PVDF)膜上，并用不同WISP-l单克隆抗体探查。WISP-1抗体3D11.D7(在本文中也称为"3D11")、11C2.C10(在本文中也称为"11C2")、9C11.C7(在本文中也称为"9C11")和5D4.F6(在本文中也称为"5D4")特异性结合杆状病毒、细菌和哺乳动物表达系统产生的WISP-1(图lla)。这些抗体不结合来自杆状病毒的鼠WISP-1且不识别来自对照溶胞物的任何蛋白质。只在WISP-1用杆状病毒表达载体产生时，WISP-1抗体6F8、3A7、10H12、3A11、6E3、3H10、5G1和10B1才识别人和鼠WISP-1二者(图llb)。在WISP-1用细菌或哺乳动物表达系统生成时，这些抗体不识别人WISP-1。来自克隆9C10的抗体在Western印迹后不结合任何蛋白质。这些结果说明了WISP-1抗体3D11、11C2、9C11和5D4特异性识别人WISP-1且可用于通过Western印迹进行的WISP-1检测。实施例ll进行了一种测定法以鉴定WISP-1抗体11C2、9C11、5D4和3D11所识别的表位。将全长人WISP-1(GenBank编号AF100779)克隆入pIRESpuro2表达载体(ClontechLaboratories,PaloAlto，CA)，该载体在WISP-1序列下游编码6个组氨酸还通过消除人WISP-1的1个、2个或3个结构i或产生了删除突变体。也将所得构建物克隆入pIRESpuro2表达载体。用于鉴别不同WISP-1构建物的命名法参照它们包含的结构域(见图12B)。结构域l是胰岛素样生长因子结合蛋白(IFGBP)结构域，结构域2是冯维勒布兰德氏(vonWillebrand)因子C(VWFc)结构域，结构域3是血小板反应蛋白(TSP)结构域，而结构域4是C-末端(CT)结构域。可变区残基位于位于结构域2与3之间。WISP-1的这些区(region)和域(domain)图解于图12A。编码WISP-l的这些结构域的序列如下WISP-1构建物的序列结构域l:AATTAATTC(SEQIDNO:3)结构域2:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage73</formula>结构域3:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage73</formula>结构域4:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage73</formula>结构域1,2:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage73</formula><sequence>complexsequenceseeoriginaldocumentpage74</sequence><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage75</formula>TA(SEQIDNO:9)结构域1,3，4:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage75</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage76</formula>结构域2，3,4:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage76</formula>GTCTGCGA(SEQIDNO:11)用不同构建物转染细胞(HEK293T)，并在48小时后收集培养液。将lml培养液与20nl钴-琼脂糖一起温育l小时，离心，并洗涤。通过将沉淀物在20(11SDS-PAGE样品緩沖液中于100。C加热5分钟来洗脱吸附的蛋白质。将这些样品电泳，电转移到PVDF上，并用不同WISP-1抗体一笨查。抗体11C2、9C11和5D4只识别包含位于结构域2与3之间可变区前19个氨基酸的WISP-1构建物(图12C;12E;12G)。WISP-1抗体3D11只识别包含结构域1的WISP-1构建物(第24-117位氨基酸；图12D;12F)。这些结果表明抗体11C2、9C11和5D4特异性识别WISP-1的可变区，而抗体3D1l特异性识别WISP-1的结构域l。实施例12进行了一种测定法以鉴定WISP-1抗体9C10.F5(在本文中也称为"9C10")所识别的表位。将来自各种WISP-1删除构建物(如上文实施例11所述)转染的HEK293T细胞的培养液与lpgWISP-l抗体9C10和20pl蛋白A-琼脂糖一起于室温温育l小时。将免疫复合物通过离心沉淀并通过将沉淀物在20iilSDS-PAGE样品ll冲液中于100。C加热5分钟洗脱。将样品电泳，电转移到PVDF上，并用WISP-1抗体11C2探查。抗体9C10只免疫沉淀包含WISP-1的结构域1的构建物(图13)。这些结果证明了抗体9C10特异性识别WISP-1的结构域1且可用于免疫沉淀。实施例131将Maxisorb板用WISP-l抗体9C10(lOO)il，2pg/ml，溶于碳酸盐緩冲液pH9.6)于4。C包被过夜。将板用200^1PBS/3%BSA封闭1小时。为了绘制标准曲线，配制WISP-l-Fc的连续稀释液(100(il，溶于PBS/3。/。BSA)并温育l小时。温育后，将板用100nlPBS/0.05%Tween洗涤，并与PBS/3。/。BSA中的WISP-1抗体(lOO(il,2吗/ml)(生物素化11C2、或55B)—起温育1小时。对于生物素化的11C2，将板与2[xg/mlHRP偶联的链霉亲合素一起再温育。对于55B，将板洗涤，并与HRP偶联的驴抗兔IgG—起温育l小时。温育结束时，将孔用20(^1含0.05%Tween-20的PBS洗涤6次，并用100pl辣根过氧化物酶显色底物TMB(Kirkegaard&PerryLaboratories)显现信号。用lOOpl1M磷酸停止反应并测量450nm处的OD。通过省略樣i量滴定孔包被，在平行温育中测定非特异性结合。在省略WISP-l-Fc或WISP-l抗体时不产生信号。使用抗体9C10来捕获并使用抗体11C2和55B来检测，进行了能够检测低达0.4(ig/ml的WISP-l浓度的ELISA(图14)。此ELISA可用于检测生物学流体诸如血清中的WISP-1蛋白质。实施例14将Maxisorb板用S0pl/孔10吗/ml肝素(Sigma)于4。C包被过夜。将非特异性结合位点用200ialPBS/3%BSA封闭1小时。然后将板与50plPBS/3%BSA中的6吗/mlhWISP-l-Fc—起在存在连续稀释的WISP-l抗体条件下温育l小时。将板用PBS/0.05%Tween洗涤，并与50plPBS/3%BSA中的2jug/mlHRP偶联的抗人IgG-Fc—起再温育l小时。将板洗涤，并加入100plHRP底物(TMB)。用100|illM石粦酸停止显色并测量450nm处的OD。WISP-1抗体11C2、5D4和9C11抑制WISP-1与肝素的结合，IC50分别为1.9、2.5和3.7pg/ml(图15)。抗体3D11适度降低WISP-1与肝素的结合，在所测试的最高浓度(40叫/ml)达到最大抑制62。/。。抗体9C10不削弱WISP-1与肝素的结合，显示出与无关抗体对照相似的抑制曲线。这些结果证明了识别可变区的抗体能抑制WISP-1与肝素的结合。因为识别结构域1的两种WISP-1抗体对WISP-1与肝素的结合略有影响或没有影响，所以目前认为结构域1不太可能参与这种相互作用。实施例154吏用改良Boyden室系统(modifiedBoydenChambersystem)测量趋触性。8nm多孑L性24孔格式PET膜滤器(BectonDickinson,FranklinLakes,NewJersey)的下侧用50plPBS中的蛋白质(50i!g/ml)于4。C包被过夜。将正常大鼠肾细胞(NRK;5xl04/0.5mlHGDMEM/10%FBS)加至上室，将下室充满相同培养基，并将板于37。C温育。次日，用棉签擦拭上室，将迁移至插入物下侧的细胞染色并在显微镜下计数。对每种条件的一式三份数据集取平均值。在某些情况中，将包被的插入物清洗并于室温再处理2小时。在转孔测定法(transwellassay)中，包被在滤器下表面上的WISP-l-Fc诱导NRK细胞的趋触性迁移(图16A)。包被无关IgG嵌合蛋白(TNFR-IgG)或添加WISP-1-IgG至下室不促进迁移。在存在包被的WISP-l-Fc时，五种不同的WISP-1抗体(9C10、11C2、3D11、9C11、5D4)显著抑制细胞迁移。在不存在包被的WISP-l-Fc时，这些抗体不显示出对细胞迁移的任何效果。这些结果证明了WISP-1抗体在存在WISP-1时能调控细胞迁移。通过阻断细胞迁移，WISP-l抗体可以在预防癌症进展(progression)中发挥重要的治疗作用。图16B中提供了上述实施例中所讨论的3D11、9C10、11C2、5D4和9C11抗体的特征和特性的总结。实施例16给9周龄Swissnu/nu雌性小鼠在侧面尾静脉中注射100|^含2.5乂105个细胞的悬浮液。自接种日起，半周一次(semiweekly)通过腹膜内注射(1Omg/kg)WISP-1抗体(9C11、11C2、5D4、9C10、3D11)或同种型对照抗体来治疗小鼠。3周后，将肺用4%中性緩冲的福尔马林灌注，切除，并制作苏木精&曙红染色切片。评估左肺的纵向切片及右肺顶叶、中叶、尾叶和副叶的横向切片。对每张载波片上的转移病灶数计数，并使用SPOTRT软件(DiagnosticInstrumentsIncorporated,Burlingame,Califomia)观'J量孝争移'l"生病灶的平均面禾只。至少为4张肺切片中的5个个别转移性病灶测定面积()im2)。3周后，在用WISP-1抗体治疗的动物中看到的损伤严重程度与对照相比大大减轻(图17a,b)。在用WISP-1抗体治疗的小鼠(『5)中看到的结节数和转移性病灶平均面积与用对照抗体治疗的动物相比降^f氐了(图17c,d)。此外，在WISP-l抗体治疗后，损伤覆盖的肺部总面积与用同种型对照抗体治疗的动物相比缩小了82-97%(图17e)。这些结果证明了WISP-1抗体在减轻与转移有关的肿瘤负荷方面的体内功效。虽然尚未完全了解WISP-1抗体的作用机制，但是认为它们的功效可能是由于降低生长的能力和/或抑制癌细胞在组织位点的运动、侵入和播种的能力而实现的。实施例17将全长小鼠WISP-1(GenBank编号NM—018865)克隆入pRK哺乳动物表达载体。将所得构建物(pRK-WISP-l;18吗)与2pgpSVi-嘌呤霉素质粒一起使用Fugene6(Roche)依照制造商的说明书共转染入4T1小鼠乳腺腺癌细胞系(4寻自Dr.FredMiller,BarbaraAnnKarmanosCancerInstitute,Detroit,MI)。2天后，在2ng/ml噤呤霉素中选择细胞。2周后，分离克隆并通过免疫焚光评估WISP-1表达。使用相同流程，用空载体产生对照细胞系。将所得4Tl/对照和4T1/WISP-1细胞系在含100/。FBS和3叫/ml嘌呤霉素的Iscove氏培养基中维持。使用不区分人和小鼠WISP-1基因的引物和探针，通过半定量RT-PCR(Taqman)测量4T1/对照、4T1/WISP-1L、4T1/WISP-1H、MIK/对照、NRX/WISP-1L和NRK/WISP-1H细胞系中的WISP-1表达。WISP-l在4Tl/对照细胞系中不表达。4T1/WISP-1H细胞系中的WISP-1表达比4T1/WISP-1L中的高2倍，但比NRK/WISP-1H中的低700倍(图18)。实施例18为了评估WISP-1对4T1细胞分散的影响，将IOO，OOO个4Tl/对照、4T1/WISP-1L或4T1/WISP-1H细胞在含10%胎牛血清的Iscove氏培养基中接种到6孔板中。在以低密度铺板时，4Tl/对照细胞增殖并形成清楚界定的集落(图19)。增殖中的4T1/WISP-1L细胞形成界定较不清楚的集团，即有些细胞离开生长中的集落(图19)。没有看到4T1/WISP-1H集落，细胞以随机样式分散(图19)。这些结果合起来说明了WISP-l表达促进细胞迁移。实施例19还使用8fim多孔性24孔格式PET膜滤器(Falcon)的Matrigel包被的改良Boyden室系统评估WISP-1对4T1细胞侵入(invasion)的影响。将4Tl/对照、4T1/WISP-1L或4T1/WISP-1H细胞(100，000个细胞)在0.5mlIscove氏培养基中加至上室。将下室充满0.75ml含5。/。胎牛血清的相同培养基并将板于37。C温育过夜。次日，用棉签擦拭上室，将迁移至插入物下侧的细胞用Diff-Quik染色试剂盒(DadeBehringInc.)染色并在显微镜下计数。对每种条件的一式三份数据集取平均值。4T1/WISP-1H和4T1/WISP-1L细胞展现出与4Tl/对照相比侵入分别升高了12倍和6倍(图20)。这些结果说明了WISP-1促进致瘤性乳腺上皮细胞侵入并可能在转移中发挥作用。实施例20为了评估WISP-1对乳腺上皮细胞肿瘤发生的影响，将1.5xl()S个细胞(4T1/对照1、4Tl/对照2、4T1/WISP-1L或4T1/WISP画1H)注射到6-8周龄雌性BALB/c小鼠(6只小鼠/组)的第四乳房脂肪垫中。每周三次测量肿瘤体积。注射后31天，处死小鼠，切除肿瘤并称重。接种4T1/WISP-1L细胞(图21a;空心方形)和4T1/WISP-1H细胞(图21a;实心方形)产生了与4Tl/对照l和4Tl/对照2细胞(图21a;空心和实心圆形)相比生长更快的肿瘤。31天后，由所接种4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1L形成的胂瘤比4Tl/对照细胞形成的肺瘤大4倍(图21a)和重3倍(图21b)。这些结果说明了WISP-1可提高乳腺上皮肿瘤细胞的增殖。实施例21测量通过接种4Tl/对照、4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1H细胞形成的肿瘤中的HAS2和CD44表达。在与4Tl/对照细胞肿瘤进行比较时，4T1/WISP-1细胞肿瘤中的CD44表达升高了5和23倍(图22)。另一方面，HAS2表达在所分析的所有肿瘤中维持相同。这些结果说明了WISP-1提高了接种4T1细胞的小鼠中的CD44表达。CD44在这些肿瘤中的过表达可能有助于促进转移。实施例22为了评估WISP-1对乳腺上皮细胞转移的影响，在乳房脂肪垫中接种4T1细胞(见实施例20)，并通过微计算机断层照相术和组织学检验转移性传播的程度。31天后，接种4T1/WISP-1L或4T1/WISP-1H细胞的小鼠(图23b和23d)与注射4Tl/对照的小鼠(图23a和23c)相比有广泛的肺部转移。在4T1/WISP-1L和4T1/WISP-1H细胞的转移潜力之间没有看到显著差异。接种4T1/对照细胞的小鼠具有平均2.11个肺部病灶，平均重量(mass)0.68克；而接种4T1/WISP-1细胞的小鼠具有平均20.25个肺部病灶，平均重量(mass)12.46克。还有，注射4T1/WISP-1细胞的小鼠的肺的平均组织学得分是0.92,而注射NRK/对照细胞的小鼠为0.11。使用免疫组织化学方法，还观察到4T1/WISP-1肺部转移病灶表达高水平的CD44(图23e)。在这些肿瘤中，CD44定位于4T1/WISP-1细胞的质膜(图23f)。这些结果合起来证明了WISP-1促进4T1细胞的转移潜力，增加肺部转移病灶的数目(IO倍)和大小(18倍)。还有，升高的CD44表达在4T1/WISP-1转移至肺部后得到维持。接种4T1/对照1或4T1/WISP-1细胞的小鼠的临床观察结果证明了WISP-1表达促进别的继发部位的转移。接种4T1/WISP-1H的两只小鼠在肾上有脱色的白色块，而其它小鼠没有发现肾肿瘤的证据。实施例23将上文所述人WISP-1全长和删除突变体构建物转染入正常大鼠肾细胞(NRK-49F)。48小时后，给培养液补充2Mg/ml。票呤霉素。2周后，分析有表达的细胞的集合并在补充有10。/。胎牛血清(FBS)和2吗/ml嘌呤霉素的高葡萄糖Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(HGDMEM)中维持所得细胞系。通过半定量RT-PCR(Taqman)测量NRK/对照、NRK7WISP-1—1234、NRK7WISP-1一134、NRK7WISP-1—234、NRK/WISP-1一123和NRK7WISP-1一124细胞系中的WISP-1表达。结果表述成相对于NRK/WISP-1一1234中的WISP-1表达的倍数(图24A)。NRK/WISP-1—134和NRK/WISP-1—234中的WISP-1表达与NRK7WISP-1—1234相比分别是0.035和0.09倍。与NRK/WISP-1J234相比，NRK/WISP-1—123表达16.1倍而NRK/WISP-1—124表达7.6倍。为了评估特定结构域对WISP-1促进的肿瘤发生的贡献，将给6-8周龄雌性棵鼠(10只小鼠/组)皮下注射5xl0S个细胞(NRK/对照、NRK7WISP-l—1234、NRK/WISP-1—123、NRK/WISP-1—124、NRK/WISP-1—134、NRK/WISP-1一234细胞)。每周一次测量肺瘤体积。35天后，处死小鼠，切除胂瘤，并进行组织学分析。接种NRKAVISP-1—1234(图24B;实心三角形)、NRK/WISP-1—134(图24B;实心圓形)和NRK/WISP-1—234(图24B;实心方形)细胞产生了肿瘤。然而，接种NRK/WISP-1J23(图24B;空心方形)、NRK/WISP-1J24(图24B;空心圆形)和NRK/对照(图24B;空心三角形)没有产生肿瘤。35天后，由NRK/WISP-1一234细胞形成的胂瘤与由NRK/WISP-1一1234细胞形成的肿瘤大小相当。然而，由NRK/WISP-1—134细胞形成的肿瘤比由NRK/WISP-1—1234细胞形成的肿瘤大2.5倍。这些结果i兌明，结构域1和2不是WISP-1促进的NRK胂瘤发生所必需的，但是结构域3和4是WISP-1促进的NRK肿瘤发生所需要的。认为本发明的WISP-l拮抗剂可能优选结合和/或阻断WISP-l的结构i或3和/或4。另外，结果说明，删除WISP-1的结构域2可提高其致瘤潜力。对切除的肿瘤的组织学分析(图25)揭示了，来自NRK/WISP-L234肿瘤的胂瘤细胞在表型上与来自NRK/WISP-1—1234肺瘤的肺瘤细胞相似。在这些胂瘤中，细胞表现为成纤维细胞形的、已分化形的和纺锤形的。然而，来自NRK/WISP-1J34肿瘤的肿瘤细胞在表型上不同，表现为分化较差的(lessdifferentiated)、频繁地多核化的(frequentlymultimucleated)、且有较大的有丝分裂比率(briskmitoticrate),如多个有丝分裂图所展现的(箭头)。另夕卜，肺瘤细胞侵入NTRK/WISP-1一134肿瘤附近的多条血管(图26)。这些结果表明，WiSP-l—134表达可能通过促进NRK细胞的体内生长和侵入潜力而赋予其以致瘤性(tumorigenidty)。此外，这种构建物的表达诱导攻击性肺瘤细胞的表型转化特征。实施例24使用8pm多孔性24孔格式PET膜滤器(BDBiosciences)的Matrigel包被的改良Boyden室系统评估特定WISP-1结构域对受到促进的4T1细胞侵入的贡献。将稳定表达先前所述WISP-1构建物(WISP-1—1234、WISP-1J34、WISP-1一123、WISP-1一12、WISP-1一23、WISP-1一3、WISP-1一1和WISP-1一4)的HEK293细胞(20x106)在0.75ml含5。/。胎牛血清的50:50培养基(DME与Ham氏F-12培养基的l:l混合液)中接种到下室中，并将板于37。C放置过夜。次日，将4T1纟田月包(100,000个细胞)在0.5ml不含血清的50:50培养基中加至上室，并将板于37。C温育过夜。次日，用棉签擦拭上室，将迁移至插入物下侧的细胞用Diff-Quik染色试剂盒(DadeBehringInc.)染色并在显微镜下计数。对每种条件的一式三份数据集取平均值并将结果表述成与对照(其中将空载体转染的HEK293细胞铺入下室)相比的侵入倍数。在将表达构建物WISP-1—1234、WISP-1—134或WISP-123的HEK293细胞接种到下室中时，4T1细胞展现出侵入升高了4倍(图27)。表达构建物WISP-1—12的HEK293细胞增强4T1细胞侵入只2.5倍。在将表达WISP-1—23、WISP-1—3、WISP-1J或WISP-1一4的HEK293细胞铺入下室时，4T1细胞侵入的升高是微弱的(marginal),这些结果说明结构域1是WISP-1促进的4T1细胞侵入所需要的。另外，数据显示，单独的WISP-1结构域1有可能不足以促进4T1细胞侵入。实施例25进行了一种测定法以评估WISP-1的结构域1对WISP-1促进的4T1细胞侵入的拮抗活性。将WISP-1的结构域1克隆入表达载体，恰好在人IgGlFc区序列的上游。使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞在哺乳动物表达系统中合成所得重组融合蛋白(WISP-l-结构域l-Fc),并在蛋白A-Sepharose4FastFlow(AmershamPharmaciaBiotech)上通过亲和层析自条件培养基纯化至均质。还在CHO表达系统中一起表达WISP-1的结构域1与氨基末端六组氨酸标签(WISP-l-结构域l-His)，并在N产-NTA琼脂糖柱(Qiagen)上通过亲和层析自培养物上清液纯化至均质。然后合并并透析含洗脱的WISP-l-结构域l-His的级分。使用8lim多孔性24孔格式PET膜滤器(BDBiosciences)的Matrigel包被的改良Boyden室系统评估纯化的可溶性WISP-l-结构域l对WISP-l促进的4Tl细胞侵入的拮抗效果。将4T1/对照或4T1/WISP-1细胞(100，000个细胞)在0.5mlIscove氏培养基中加至上室。将下室充满0.75ml含5。/。胎牛血清的相同培养基。向上室和下室中加入各种浓度的WISP-l-结构域l-Fc或WISP-l-结构域l-His,并将板于37。C温育过夜。次日，用棉签擦拭上室，将迁移至插入物下侧的细胞用Diff-Quik染色试剂盒(DadeBehringInc.)染色并在显微镜下计数。对每种条件的一式三份数据集取平均值。结果表述成与4Tl/对照细胞相比侵入的相对倍数。WISP-l-结构域l-His和WISP-l-结构域l-Fc展现出剂量依赖性的针对WISP-1促进的4T1侵入的拮抗活性(图28)。WISP-l-结构域l-His和WISP-l-结构域l-Fc都显示出0.01吗/ml的表观IC50。这些结果说明，纯化的WISP-1-结构域1拮抗WISP-1促进的细胞侵入。实施例26进行了动物研究以评估人胰腺癌的HPAC异种移植物模型中的WISP-l表达。给6-8周龄雌性棵鼠皮下注射5xl0M"人胰腺癌细胞(HPAC细胞系，cat.no.CRL-2119;ATCC，Manassas,VA,USA)。21天后，处死小鼠，切除肿瘤，并使用人WISP-1特异性探针和小鼠WISP-1特异性探针通过原位杂交分析WISP-1表达(图29)。结果证明了对应于肿瘤基质的区域中有强烈的小鼠WISP-l表达。另一方面，在切除的肿瘤中没有发现人WISP-1表达。另外，肿瘤揭示了肿瘤基质上强烈的a-平滑肌肌动蛋白和微弱的波形蛋白(vimentin)免疫组织化学染色。这些结果表明棵鼠中接种HPAC细胞诱导表达WISP-1的小鼠肌成纤维细胞基质的募集。实施例27进行了动物研究以评估WISP-1-结构域1在延迟肿瘤生长方面的体内功效。将克隆到表达载体(pIRESpuro2;ClontechLaboratories,PaloAlto,CA)中的人WISP-1—1、WISP-1—12构建物转染到HPAC人胰腺癌细胞系中。48小时后，给培养液补充2pg/ml噪呤霉素。2周后，分析有表达的细胞的集合并在补充有10。/。胎牛血清(FBS)和2jug/ml嘌呤霉素的50:50培养基(DME与Ham氏F-12培养基的1:1混合液)中维持所得细胞系。为了评估WISP-1-结构域1在延迟肺瘤生长方面的体内功效，给6-8周龄的雌性棵鼠(10只小鼠/组)皮下注射5xl()6个细胞(HPAC/WISP-1—12、HPAC/WISP-1一1细胞)。每周两次测量肿瘤体积直到第25天。结果证明了HPAC细胞中的WISP-1—1或WISP-1—12表达延迟它们的体内生长。HPAC/WISP-1J2和HPAC/WISP-1—1细胞的肿瘤体积分别比HPAC对照细胞肿瘤小12%和54%(图30)。这些结果表明HPAC细胞所表达的WISP-l-结构域1和WISP-1-结构域12延迟了它们的肿瘤生长，可能是通过拮抗、鼠WISP-1肿瘤4足进活性。实施例28进行了原位杂交研究以评估原发性人胰腺癌中的WISP-1表达。使用肿瘤微阵列(TMA),显示出68%(125/184)的样品对WISP-1表达的得分是阳性的。另外，在这些样品中，WISP-1表达局限于基质隔室(图31)。这些结果表明人原发性胰腺瘤的基质隔室(compartment)中有高发生率的WISP-1表达。实施例29进行了免疫组织化学染色以评估原发性结肠腺癌中的WISP-1表达。将一组15例原发性人腺癌样品对WISP-1染色，使用WISP-1特异性多克隆山羊抗体(R&Dsystems;cat.No.AF1627)。在所分析的所有(100%)(15/15)样品中抬r测到WISP-1。在所有情况中，WISP-1位于围绕肿瘤的基质隔室(图32)。这些结果表明WISP-l普遍存在于人结肠腺癌的基质隔室中。WISP-1构建物结构域2，3:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage86</formula>CGA(SEQIDNO:21)结构域l-IgG:<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage86</formula><formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage87</formula>材料保藏以下材料已经保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,USA)(ATCC):材料ATCC保藏号保藏曰3D11.D7PTA-46242002年9月4日11C2.C10PTA-46282002年9月4日9C10.F5PTA-46262002年9月4日5D4.F6PTA-46252002年9月4日9C11.C7PTA-46272002年9月4日此保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(BudapestTreaty)及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起维持保藏的存活培养物30年。保藏物可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司与ATCC之间的协议，它保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以两者中居先者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且保证了依据35USC§122及依照它的管理章程(包括37CFR§1.14,特别要提及886OG638)由美国专利和商标局长批准的个人将有资格获得保藏培养物的后代。1本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在合适条件下培养时死亡、丟失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的另一份材料所授予的权利实施本发明的许可。认为前述书面描述足以使本领域技术人员能够实施本发明。本发明并不限于本文所呈现实施例的范围。实际上，根据上面的描述，在本文所显示和描述之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。权利要求1.分离的WISP-1拮抗剂，其在至少一种类型的哺乳动物细胞中抑制或中和天然WISP-1多肽对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌，所述拮抗剂选自抗WISP-1抗体、WISP-1免疫粘附素和WISP-1变体。2.权利要求l的拮抗剂，其中所述拮抗剂包括抗WISP-1抗体。3.权利要求2的拮抗剂，其中所述抗WISP-1抗体结合包含图9A-9C(SEQIDN0:1)第23-367位氨基酸的天然人W1SP-1多肽或者包含序列SEQIDNO:3，4,5，6,7,8,9，10或11所编码的氨基酸的一个或多个WISP-1多肽结构域。4.权利要求2或3的拮抗剂，其中所述抗WISP-1抗体是嵌合的、人源化的或人的抗体。5.权利要求l的拮抗剂，其中所述拮抗剂包括WISP-1免疫粘附素。6.权利要求5的拮抗剂，其中所述拮抗剂包括人WISP-1序列与免疫球蛋白Fc区的融合。7.包含权利要求l-6任一项的拮抗剂和载体的組合物。8.权利要求7的组合物，其中所述载体是药学可接受载体。9.抑制或中和哺乳动物细胞中WISP-1对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌的方法，包括使所述哺乳动物细胞暴露于有效量的WISP-1拮抗剂，其中所述WISP-l拮抗剂选自(a)WISP-1免疫粘附素；(b)与选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚氧化歸的非蛋白质性质的聚合物相连的WISP-1多肽；(c)WISP-1抗体；和(d)WISP-1变体。10.权利要求9的方法，其中所述W!SP-l免疫粘附素包括与免疫球蛋白Fc区融合的WISP-1序列。11.权利要求9的方法，其中所述抗WISP-1抗体结合包含图9A-9C(SEQIDNO:l)第23-367位氨基酸的天然人WISP-l或者包含序列SEQIDNO:3，4，5，6，7,8，9,10或11所编码的氨基酸的一个或多个WISP-1多肽结构域。12.权利要求9或11的方法，其中所述抗WISP-1抗体是嵌合的、人源化的或人的抗体。13.权利要求9的方法，其中所述哺乳动物细胞包括癌细胞。14.权利要求13的方法，其中所述哺乳动物细胞包括结肠或结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或脑癌细胞。15.治疗哺乳动物中的癌症的方法，包括对所述哺乳动物施用有效量的WISP-1拮抗剂，其中所述拮抗剂选自抗WISP-1抗体、WISP-1免疫粘附素和WISP-1变体。16.权利要求15的方法，其中所述癌症细胞包括结肠或结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌或脑癌细月包。17.权利要求15的方法，其中所述拮抗剂抑制或降低癌细胞生长或转移。18.权利要求15的方法，其中所述抗WISP-1抗体结合包含图9A-9C(SEQIDNO:l)第23-367位氨基酸的天然人WISP-l或者包含序列SEQIDNO:3，4,5,6,7,8,9，10或ll所编码的氨基酸的一个或多个WISP-l多肽结构^t19.权利要求15或18的方法，其中所述抗WISP-1抗体是嵌合的、人源化的或人的抗体。20.权利要求15的方法，其中还对所述哺乳动物施用化疗、放疗、前体药物、细胞毒剂、生长抑制剂或细胞因子。21.权利要求15的方法，其中所述拮抗剂在至少一种类型的哺乳动物细胞中抑制或中和天然人WISP-1多肽对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌。22.单克隆抗体，包括由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA~4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤分泌的3D11、11C2、9C10、5D4或9C11抗体。23.单克隆抗体，其结合的表位与由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系生成的3D11、11C2、9C10、5D4或9C11单克隆抗体结合的表位相同。24.杂交瘤细胞系，其生成由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体3D11、11C2、9C10、5D4或9C11。25.分离的抗WISP-1抗体，包括结合WISP-1多肽并竟争性抑制由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、PTA-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体3D11、11C2、9C10、5D4或9C11与所述WISP-1多肽的结合的抗体。26.权利要求25的抗体，其是嵌合的、人源化的或人的抗体。27.嵌合的抗WISP-1抗体，其特异性结合WISP-1多肽且所述抗体包含自由保藏在ATCC、编号分别为PTA-4624、PTA-4628、P丁A-4626、PTA-4625或PTA-4627的杂交瘤细胞系生成的3DU、11C2、9C10、5D4或9C11单克隆抗体来源的序列。28.权利要求27的抗体，其中所述来源的序列是3D11、11C2、9C10、5D4或9C11单克隆抗体的可变区或高变区。29.前述权利要求任一项的WISP-1拮抗剂或抗体，其中所述抗体是与选自非蛋白质性质聚合物、细胞毒剂、酶、放射性同位素、荧光化合物和化学发光化合物的一种或多种药剂相连的抗W1SP-1抗体。30.权利要求16的方法，其中所述拮抗剂在哺乳动物中原发性肺肿瘤部位继发的或不同的部位抑制或降低肺癌细胞转移。全文摘要本发明提供了用于调控WISP-1多肽活性的方法和组合物。WISP-1拮抗剂包括在至少一种类型的哺乳动物细胞中抑制或中和天然人WISP-1多肽对HAS2、HA、CD44或RHAMM的诱导或分泌的抗WISP-1抗体、WISP-1免疫粘附素和WISP-1变体(及其融合蛋白)。本发明还提供了用于在体外、原位和/或在体内治疗与天然WISP-1多肽有关的哺乳动物细胞或病理疾患的方法。文档编号C07K16/22GK101198623SQ200680021547公开日2008年6月11日申请日期2006年4月13日优先权日2005年4月14日发明者卢克·德斯诺耶斯,埃伦·菲尔瓦罗夫申请人:健泰科生物技术公司