负性免疫调节因子的调节和免疫疗法应用的制作方法

专利名称：负性免疫调节因子的调节和免疫疗法应用的制作方法
负性免疫调节因子的调节和免疫疗法应用
背景技术：
在人中不足的抗原呈递以及先天免疫和获得性免疫激活导致人免疫系统不
能控制和淸除多种病原感染和恶性细胞生长。慢性感染和癌症的成功的治疗疫苗 和免疫疗法依赖于诱导强烈免疫应答的有效途径的新方法的发展，该强烈免疫应 答能够控制和清除与其病理相关的攻击性抗原。 T细胞识别抗原的能力依赖于抗原与主要组织相容性复合体(MHC)I或者 (MHC)II蛋白的关联。例如，细胞毒性T细胞应答与MHC-I蛋白关联呈递的抗原。 这样，如果细胞也不表达合适的MHC-I蛋白，应该杀死病毒感染细胞的细胞毒性 T细胞不会杀死该细胞。辅助性T细胞识别MHC-II蛋白。辅助性T细胞活性一般 地依赖于抗原对抗原呈递细胞的识别和在具有"自体"MHC-II蛋白的这些细胞上 的存在。对与自体MHC蛋白关联的抗原的识别要求称为MHC限制性。MHC-I 蛋白在几乎所有的有核细胞的表面上发现。MHC-II蛋白在包括巨噬细胞，B细胞 和脾的树突状细胞和皮肤的朗格汉斯细胞在内的特定细胞的表面上发现。
在哺乳动物中安置免疫应答的关键步骤是激活识别MHC-II限制的外源性 抗原的CD4+辅助性T细胞。这些抗原在抗原呈递细胞如树突状细胞(DCs)的细胞 内体途径被俘获和加工。在内体和溶酶体中，抗原被加工成小抗原肽，该抗原肽 被复合到高尔基区室的MHC-II上以形成抗原-MHC-II复合体。该复合体在细胞表 面表达，其表达诱导了 CD4+T细胞的激活。诱导有效的哺乳动物免疫应答的其它关键事件涉及CD8+T细胞和B细胞的 激活。当期望的蛋白以在细胞表面作为与MHC-I抗原复合的加工蛋白而呈递的方 式穿过细胞时，CD8+T细胞被激活。B细胞通过它们的表面免疫球蛋白(IgM和IgD) 能够与抗原相互作用，而不需要MHC蛋白。然而，CD4+T细胞的激活刺激免疫 系统的所有分支(arm)。激活后，CD4+T细胞(辅助性T细胞)产生白细胞介素。 这些白细胞介素帮助激活免疫系统的其它分支。例如，辅助性T细胞产生白细胞 介素-4(IL-4)和白细胞介素-5(IL-5),这有利于B细胞产生抗体；白细胞介素-2(IL-2), 其激活CD4+T和CD8+T细胞；和7干扰素，其激活巨噬细胞。因为识别MHC-II 限制抗原的辅助性T细胞在激活和克隆扩增细胞毒性T细胞、巨噬细胞、自然杀 伤细胞和B细胞中发挥重要作用，在应答抗原时激活辅助性T细胞的初始事件对 针对该抗原的有效免疫应答的诱导是关键的。已经报到了利用来自溶酶体跨膜蛋
9白的序列刺激辅助性T-细胞激活的尝试。然而，这些尝试对所试验的哺乳动物中 的CD8+T细胞和B细胞来说，没有获得有效的免疫应答诱导。
除了 T细胞在免疫应答中发挥的关键作用，DCs同样重要。DCs是专职的 抗原呈递细胞，其在维持自体抗原的耐受性和激活先天免疫与获得性免疫中发挥 关键的调节作用(Banchereau等人，1998， Nature 392:245-52; Steinman等人，2003， Annu. Rev. Immunol. 21:685-711)。当DCs遇到促炎刺激物如微生物产物时，细胞 的成熟过程就会通过上调细胞表面表达的抗原肽负载的MHC分子和共刺激分子 引发。在成熟和归巢到局部淋巴结后，DCs通过形成免疫突触，建立起与T细胞 的接触，其中T细胞受体(TCR)和共刺激分子聚集在粘附分子包围的中央区 (Dustin等人，2000, Nat. Immunol. 1:23-9)。 一旦被激活，CD8+T细胞能够G主增 殖儿代并且获得细胞毒性功能而无需进一歩的抗原刺激(Kaech等人，2001, Nat. Immunol. 2:415-22; van Stipdonk等人，2001, Nat. Immunol. 2:423-9)。因此，已经 提出DCs提供的肽-MHC复合体(信号l)和共刺激分子(信号2)的水平和持续时间 对于决定抗原特异性T细胞应答的强度和命运是必要的(Lanzavecchia等人，2001， Nat. Immunol. 2:487-92; Gett等人，2003， Nat. Immunol. 4:355-60)。
抗原呈递细胞(APCs)，如树突状细胞(DCs)和巨噬细胞在激活先天免疫和获 得性免疫以及维持免疫耐受性中发挥重要的作用。过去几年已经很好地研究了 APCs认识微生物和引起免疫应答的机制。APCs利用模式识别受体如toll样受体 (TLRs)，识别保守的微生物结构如脂多糖(LPS)、未甲基化细菌DNA (CpG)、和 RNA。 TLRs属于TIR(Toll/白细胞介素-l (IL-1)受体)超家族，其分为两个主要的亚 型IL-1受体和TLRs。 TLRs由11个成员(TLR1-TLR11)组成。该超家族的所有 成员以相似的方式进行信弓-传导，这是由于存在保守的胞质TIR结构域，其激活 共同的信号传导途径，特别是那些导致转录因子核因子-KB (NF《B)和应激活化蛋 白激酶激活的信号途径。通过分泌促炎细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、 IFN、白 细胞介素1 (IL-l)、IL-6和IL-12以及通过表达共刺激分子如CD80、CD86和CD40， NF-kB的激活催化了免疫应答。TNF家族成员，如TNFa和CD40L，与它们的受 体或者配体相互作用，并也激活NF-kB。已经尝试了开发肿瘤疫苗的重要努力，以促进DC成熟和共刺激，作为增 强抗肿瘤免疫的手段。然而，自体肿瘤相关抗原(TAAs)的免疫诱导被内在的抑制 机制限制，其中许多的这些机制有待于被解释。细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4) 和T细胞上的相关分子利用已知的抑制机制，通过与DCs或其它细胞上的B7家 族分子的细胞-细胞接触控制效应T-细胞激活的程度。DC成熟在维持自体耐受性 到诱导免疫性中起着关键的开关作用。然而，仍然不清楚的是，成熟的抗原呈递 DCs是否具有负性免疫调节机制，该机制允许它们控制成熟点之外的获得性免疫 性的强度和持续时间。人们在促炎信号传导方面集中了很大的注意力，却对抑制和解决炎症的机制知道很少。TLR引起的免疫应答的强度和持续时问受促炎信号传导的强度和持 续时间以及受信号转导途径的调节控制。因为TLR诱导的转录因子NF-kB的激活 对大量的促炎基因的转录是必要的，那么可以利用多种机制在多个水平负调节 TLR信号传导，以保护宿主免受过度的免疫应答如败血症休克和在暴露于慢性微 生物如肠道微环境的情况下维持免疫内稳态。TLR信号途径的负性免疫调节因子 包括IRAK-M、 MyD88s、 P13K、 TOLLIP、 A20、 TRIAD3A、 NOD2、可溶性TLR2/4 和含有TIR结构域的膜结合分子如SIGIRR和ST2 (Nat Rev. Immunol. 5:446, 2005)。
细胞因子关键性地参与多种免疫细胞功能的调节(Curtsinger等人，2003， J. Exp. Med. 197:1141-51; Valenzuela等人，2002， J. Immunol. 169:6842-9)。 DCs利用 识别保守微生物结构如脂多糖(LPS)的toll样受体(TLRs)，通过激活核因子-id3 (NF-KB)信号传导途径促进DC成熟(Akira等人，2004， Nat. Rev. Immunol. 4:499-511)。 NF-kB家族成员接着介导促炎细胞因子如IL-12的表达，导致先天免 疫和获得性免疫的诱导(Akira等人，2004, Nat. Rev. Immunol. 4:499-511; Beutler等 人，2003， Nat. Rev. Immunol. 3:169-76; Janeway等人，2002， Annu. Rev. Immunol. 20:197-216)。 DC成熟后，细胞因子的产生和细胞内信号传递途径被认为要进行紧 密调节，以促进对外源性抗原的有益免疫应答，同时限制过多的自身免疫激活。 然而，对这些途径的特异性反馈抑制机制和其导致的控制自体抗原特异性免疫应 答的的重要性的阐释仍然贫乏。 SOCS1是由包括干扰素(IFN)-Y、白细胞介素(IL)-2、IL-6、IL-7、 IL-12和IL-15 的各种细胞因子进行信号传导的可诱导负反馈调节因子(Kubo等人，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等人，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)。 SOCS1 通过与作为假底物抑制剂的上游Jamis激酶(JAKs)的激活环结合和域靶向JAK， 以进行蛋白酶体的降解，抑制多个信号转导及转录激活蛋白(STAT)的信号传导途 径(Kubo等人，2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等人，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)。 SOCS1通过耙向p65蛋白，以通过其SOCS Box区域进行泛 素介导的蛋白质水解，也阻断NF-kB信号传导途径(Ryo等人，2003, Mol. Cell. 12:1413-26)。 SOCSl-缺失(-A)小鼠当其为具有严重的全身性炎症和T细胞与NKT 细胞异常激活的新生鼠时死亡，这主要是由无法控制的细胞因子信号传导造成的 (Marine等人1999, Cell 98:609-16; Alexander等人，1999, Cell 98:597-608; Naka等 人2001， Immunity 14:535-45)。尽管对SOCS1在DCs中的功能知道很少，但最近 的研究提出SOCS1在控制抗原呈递细胞(APCs)中信号传导方面发挥作用(Kubo等， 2003， Nat. Immunol. 4:1169-76; Hanada等，2003， Immunity 19:437-50)。 SOCS1在巨 噬细胞中的表达由LPS或者CpG-DNA刺激诱导，并且SOCSl-Z-鼠对LPS诱导的 休克比其野生型同窝鼠更加敏感(Crespo等人，2000, Biochem. J. 349:99-104; Dalpke 等人，2001， J. Immunol. 166:7082-9; Nakagawa等人，2002， Immunity 17:677-87; Kinjyo等人，2002, Immunity 17:583-91)。而且，在SOCSW-背景下，T细胞和B
11细胞中已恢复S0CS1表达的小鼠SOCSW-DCs对IFNy和LPS超敏感，触发了同 种异型T细胞的扩增和诱导了 B细胞的异常扩增与自体反应抗体的产生(Hanada 等人，2003, Immunity 19:437-50)。尽管对S0CS1在DCs中的功能知道很少，但最近的研究显示了 S0CS1在 调节细胞因子信号转导途径中的作用。例如，已经显示，SOCS1-/-DCS显示更成 熟的表型，并且观察到其对与toll样受体(TLR)4相互作用以进行信号传导的脂多 糖(LPS)高应答。也观察到SOCSW-DCs诱导自体反应抗体的产生。这些观察暗示 可能通过控制JAK7STAT途径和TLR/NF-kB途径，S0CS1在DCs的负调控中可 能发挥作用。在利用DCs进行免疫疗法以刺激哺乳动物的免疫应答方面，已经进行了许 多尝试。在这些努力中，通过把抗原装载到DCs上并使DCs在先体外后体内的环 境下成熟，对DCs进行操作，使得它们刺激癌症患者的抗肿瘤免疫性。关于使用 免疫疗法战胜人免疫缺陷病毒(HIV)方面，还没有产生有效的人免疫缺陷病毒(HIV) 疫苗。因此，在该领域对有效的和针对性的诱发免疫应答的方法存在长期的需要， 以治疗哺乳动物的疾病。本发明满足这种需要。
发明概述本发明包括提高免疫细胞的免疫效能的组合物。优选地，组合物包括负性 免疫调节因子(negative immune regulator)的抑制剂(抑制因子)。 一方面，负性 免疫调节因子选自通过泛素化、去泛素化和类泛素化参与分子稳定的蛋白质，和 诱导NFkB抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它们的 任意结合。 —方面，通过泛素化、去泛素化和类泛素化参与分子稳定的负性免疫调节 因子选自A20和SUMO (SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)。另一方面， 作为抑制NFkB靶向基因转录或者诱导NFkB抑制因子表达的转录因子家族的一 部分的负性免疫调节因子选自Twist-l 、 Twist-2、 Foxjl 、 Foxo3a和它们的任何变体。
本发明也包括负性免疫调节因子的抑制剂，其中负性免疫调节因子是细胞 因子信号传导的抑制因子(SOCS)，而且其中SOCS选自SOCSl、 SOCS2、 SOCS3、 SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7和细胞因子诱导的含有SH2结构域的蛋白质(CIS)。
在另一方面，本发明包括含SH2磷酸酶(SHP)的抑制剂，其中SHP选自 SHP-1和SHP-2。在进一步方面，本发明包括活化STATs蛋白抑制因子(PIAS)的抑制因子， 其中PIAS选自PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy。在一方面，负性免疫调节因子选自A20、 SUMO (SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist陽l、 Twist-2)、 SOCS(SOCSl、 SOCS2、 SOCS3、 SOCS4、 SOCS5、 SOCS6、 SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1、 PIAS3、
12PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)以及类似物。在具体的实施方式屮，抑制剂选自小干扰RNA(siRNA)、微RNA、反义核 酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。优选 地，抑制剂是siRNA。在另一方面，siRNA选自双链寡核苷酸、单链寡核苷酸和多核苷酸。
在又一方面，siRNA是化学合成的。本发明的另一个实施方式包括含有负性免疫调节因子的抑制剂的组合物， 其中组合物进一歩包括生理学上接受的载体。优选地，生理学上接受的载体是脂 质体。在另 一个实施方式中，负性免疫调节因子的抑制剂由克隆到表达载休巾的 分离多核苷酸编码。所述表达载体选fi质粒DNA、病毒载体、细菌载体和哺乳动 物载体。在另- 方面，表达载体进--歩包括促进所述分离的多核苷酸整合到宿主 细胞基因组的整合信号序列。本发明也包括提高免疫细胞的免疫效能的组合物，其中，组合物进一步包 括具有至少一个表位的抗原。优选地，表位能够诱发哺乳动物的免疫应答。在另 --个方面，表似诱导哺乳动物的CD4+T细胞应答。另、个方而，表位诱导哺乳动 物的CD8+T细胞应答。另'个方而，表位诱导哺乳动物的B细胞应答。
在另一个实施方式中，抗原由表达载体表达。在另一个方面，抗原是分离 的多肽。在另一个实施方式中，抗原与疾病相关。优选地，所述疾病选自传染病、 癌症和自身免疫性疾病。 方面，传染病是由选自病毒、细菌、真菌和和原生动物的病原微生物引 起。在另一个实施方式中，抗原由病毒基因编码。优选地，所述病毒基因来自 选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒的 病毒。在一个方面，抗原由选自乙型肝炎病毒e抗原基因、乙型肝炎病毒表面抗 原基因和乙型肝炎病毒核心抗原基因的病毒基因编码。在另一个方面，抗原由选自人免疫缺陷病毒Env gpl60基因、Gag某因、
Pol基因、Rev基因、Tat芘因、Vif基因和Nef基闪的病每基因编码。在又一个方面，抗原山选自乳头瘤病靡E7基因和乳头瘤病毒E6基因的病
毒基因编码。在再一个方面，抗原由来自选自单纯性疱疹病毒1型、单纯性疱疹病毒2 型、爱泼斯坦-巴尔病毒、细胞巨化病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7和人疱疹 病毒8的疱疹病毒的病毒基因编码。在一个实施方式中，抗原与癌相关，其中癌选自乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌和前列腺癌。在另一个方面，肿瘤相关抗原选自过度表达肿瘤相关抗原、睾丸肿瘤抗原、 突变肿瘤相关抗原、分化肿瘤相关抗原酪氨酸ij、 MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE曙3、 gp100、 HER-2、 Ras和PSA。在又一个方面，肿瘤相关抗原选自BCR-ABL、 CASP、 CDI(、 Ras、 p53、 HER-2/腦、CEA、 MUC、 TW1、 PAP、存活蛋白、端粒酶、EGFR、 PSMA、 PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、 MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ESO、 RAGE、 SSX墨2、 CD19禾11CD20。在另一个实施方式中，抗原与疾病相关，所述疾病选自类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣和克罗恩病。本发明也包括组合物，所述组合物包括负性免疫调节因子的抑制剂和具有 至少一个能够引发免疫应答的表位的抗原，并进一步包括细胞因子。在一个方面， 细胞因子由表达载体表达。优选地，细胞因子是分离的多肽。在另一个方面，细 胞因子选自IL-12、 TNFa、 IFNa、 IFN卩、IFNy、 IL-7、 IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。本发明也包括组合物，所述组合物包括负性免疫调节因子的抑制剂和具有 至少一个能够引发免疫应答的表位的抗原，并进一步包括toll样受体(TLR)激动剂。 在一个方面，TLR激动剂由表达载体表达。优选地，TLR激动剂是分离的多肽。
本发明也包括含有负性免疫调节因子抑制剂的组合物，其中抑制剂抑制对 Janus激酶(JAK)信号传导的抑制。在另一个实施方式中，包括负性免疫调节因子的抑制剂的组合物抑制了对 toil样受体(TLR)信弓传导的抑制。在又一个实施方式中，包括负性免疫调节因子的抑制剂的组合物抑制了对 NF-KB信号传导的抑制。本发明包括提高细胞免疫效能的组合物，其中组合物包括含有编码抑制剂 的第一多核昔酸的载休，；U:屮抑制剂仰制所述细胞中的负性免疫调节fel子，和编 码具有至少一个表位的抗原的第二多核苷酸，其中所述至少一个表位诱导哺乳动 物中的免疫应答。本发明也包括提高细胞免疫效能的组合物，其中组合物包括，包括编码抑 制剂的第一多核苷酸的载体，而且其中抑制剂抑制所述细胞中的负性免疫调节因 子，和编码细胞因子的第二多核苷酸。优选地，编码细胞因子的第二多核苷酸选 自IL-12、 TNFa、 IFNa、 IFNp、 IFNy、 IL-7、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
本发明也包括含有负性免疫调节因子抑制剂的细胞。优选地，所述细胞选 自APC、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细胞的免疫细胞。
在另一个方面，所述细胞进一步包括具有至少一个表位的抗原，其中至少 一个表位能够引发哺乳动物的免疫应答。
在又一个方面，细胞进一歩包括含有编码细胞因子的多核苷酸的表达载体。
本发明也包括产生沉默细胞的方法，该方法包括将细胞与负性免疫调节因 子抑制剂接触。在另一个实施方式中，本发明包括产生沉默和脉冲致敏细胞(pulsed cell) 的方法，其包括，将细胞与负性免疫调节因子抑制剂接触，和进一步将所述细胞 与具有至少一个表位的抗原接触，其中至少一个表位能够引发哺乳动物的免疫应 答。本发明也包括引发哺乳动物的免疫应答的方法，其包括将包括负性免疫调 节因.P抑制剂的组合物给予^要的哺乳动物。本发明的另一个实施方式包括引发哺乳动物的免疫应答的方法，其包括将 包括沉默细胞的组合物给予需耍的喃乳动物，其中所述沉默细胞包括负性免疫调
节因子的抑制剂。优选地，在给予^i要的喃乳动物沉默细胞之前，使沉默细胞与
抗原在体外接触。在另一个方面，也可以在给予需要的哺乳动物沉默细胞之后， 使沉默细胞与抗原在体内接触。
附图简述为了说明本发明，在附图中描述了本发明的某些实施方式。然而，本发明 不限于附图描述的实施方式中的准确布置和手段。

图1，包括图1A和1B，是显示SOCS1表达被SOCSl-siRNA下调的系列 图。图1A描述用小鼠SOCS1 siRNA共转染的293T细胞的蛋白质印迹分析。图 1B描述用SOCS1 siRNA寡核苷酸转染的(oligo-transfected) DCs的定量RT-PCR分析。图2显示被SOCSl siRNA转染的DCs比被siRNA突变体转染的DCs对LPS 或者IFN-7更有响应，如促炎细胞因子如IL-6和TNF-a的增加的分泌所表明。
图3是重组慢病毒载体LV-SOCS卜siRNA和LV-GFP-siRNA的示意图。
图4，包括图4A和4B，是显示SOCS1在体外负调节DCs刺激抗原特异性 CTL的能力的系列图。图4A描述事实卵清蛋白特异性的TCR T细胞(OT-I)在 SOCS1-siRNA-DC共培养物中比在siRNA-DC突变体共培养物中增殖更多。与这 些数据一致的是，在SOCSl-siRNA-DC共培养物中分泌更高水平的促炎细胞因子 (图4B)。图5，包括图5A到5C，是显示SOCS1在体内负调节DCs引发抗原特异性 的T细胞应答的能力的系列图。图5A指出H2-Kb/卵清蛋白-PE四聚体+T细胞在 总门控CD8+T细胞群中的百分比。图5B描述干扰素-Y(IFN力ELISPOT分析。图 5C描述CTL分析，其显示对给予未成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs的鼠脾细胞的卵 清蛋白+耙细胞具有更强的细胞毒性。图6，包括图6A到6E，是显示体内LPS刺激强烈地增加了由SOCSl-沉默
15的DCs诱导的CTL应答的系列图。图6A描述了卵清蛋白-PE四聚体-阳性T细胞在门控的CD8+ T细胞中的百分数。图6B描述了在用卵清蛋白致敏(pulsed)、转导的或者模拟的DCs免疫而未通过LPS先体外后体内诱导成熟，接着通过体内LPS刺激的小鼠中CD8+ T细胞的IFN-y ELISPOT数。图6C和图6D分别描述了在用成熟DCs免疫，接着通过体内LPS刺激的小鼠中CD8+ T细胞的卵清蛋白-PE四聚体+的百分数和IFN-y ELISPOT数。图6E显示，用各种细胞因子和TLR激动剂体内刺激增加了通过SOCSl-沉默的DCs的CTL应答(ELISPOT)。
图7，包括图7A到7E，是显示山SOCSl-沉默的DCs诱导增加了抗肿瘤免疫性的系列图。图7A描述了事实用卵清蛋白致敏的LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫阻断了先前形成的卵清蛋白+EG7肿瘤的生长。图7B描述了事实抗-CD8抗体而不是抗-CD4抗体破坏了由卵清蛋白致敏的LV-SOCSl-siRNA-DCs诱导的抗肿瘤活性。图7C到7E描述了在小鼠中山SOCSl siRNA寡核苷酸双螺旋转染的(oligoduplex-tmnsfected) DCs增强的抗肿瘤活性。图9，包括图9A到9C，是显示通过SOCS1限制的成熟DC信号传导控制CTL对自体抗原的应答和抗肿瘤免疫性的系列图。图9A描述了在免疫两周后的小鼠中，在脾细胞的CD8+ T细胞中H2-Kb-TRP2-PE四聚体-阳性T细胞的百分数。图9B描述了在免疫后三个月次或三次接受体内LPS剌激的TRP2a脉冲致敏的SOCS1 -siRNA DC免疫鼠中代表性的白癜风。图9C描述了对从多组免疫鼠混合的脾细胞的TRP2+ B16的细胞毒性(上图)和对用TRP2a肽体外再刺激后用SOCS1siRNADC免疫的野生型鼠脾细胞的TRP2—EG7靶细胞的细胞毒性(下图)。
图10，包括图10A到10D，是显示通过SOCS1-siRNADC免疫根除先前形成的B16肿瘤的系列图。图10A和10B分别描述了经过和未经LPS体内刺激的野生型鼠的肿瘤生长曲线。图10C描述了监控60天后小鼠的存活百分数。图10D描述了 CD8+ T细胞的IFN-y ELISPOT分析，CD8+ T细胞从用LPS共注射和用TRP2a肽刺激的免疫小鼠的混合脾细胞中分离。图11，包括11A到IIC，是显示通过SOCS1沉默的DCs诱导强烈的CTL应答和抗肿瘤活性的系列图，其中SOCSl沉默的DCs用高或者低亲和力的肽脉冲(pulse)。图11A描述了流式细胞术分析未经LPS刺激(图11A-l)和经LPS刺激(图11A-2)的转导DCs上的共刺激柳制分子。图IIB描述了通过用低或者高亲和力肽脉冲致敏的SOCSl-siRNA DCs根除先前形成的B16肿瘤。图11C描述了如通过IFNY ELISPOT分析测量的用TRP2a或者TRP2b肽剌激的抗原特异性的CTL应答
16比较。图12，包括图12A到12D,是显示缺少通过IL-12 KO S0CS1 siRNA-DCs诱导有效抗肿瘤应答的系列图。图12A和12B分别描述了肿瘤的休积和存活。图12C描述了通过TRP2a肽体外刺激后IF所ELISPOT分析。图12D描述了用TRP2+B16靶细胞通过TRP2a肽体外刺激后的CTL分析。图13，包括图13A到13D，是显示S0CS1通过DCs控制IL-12和IL-12诱导的细胞因子产生的系列图。图13A描述了在应答LPS和板包被的抗-CD40mAb持续刺激吋通过S0CS1 siRNADC分泌的L-12水平。图13B描述在第一个24小吋刺激后除去这些刺激物之后的IL-12水平。图13C描述了在应答LPS和板包被的抗-CD40 mAb刺激24小时，接着除去这些刺激物吋，通过SOCS1 siRNADC分泌的TNFa禾口 IL-6的水平。图13D描述了在应答LPS和板包被的抗-CD40 mAb连续刺激时通过p35V-或者wt SOCSl-siRNADC分泌的TNFa禾H IL-6水平。
图14包括图14A和14B，是显示IL-12体内给药提高了 S0CS1沉默的DC免疫的系列图。图14A描述了通过IL-12体内给药提高了抗肿瘤活性。图14B描述了通过IL-12增加的TRP2特异性的CTL应答。图15，包括图15A到15D，是显示通过沉默DCs中的SOCS1增加的gpl20特异性抗体和CTL应答的系列图。图15A说明LV-SOCSl-siRNA-DCs比对照LV-GFP-siRNA-DCs显著地引发更强的gpl20特异性的IgM和IgG应答。图15B显示与相应的LV-GFP siRNA-DC鼠的亚类相比，在用LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的鼠中HIV Env-特异性的抗体的滴定度(效价)剧烈增加。图15C显示在LV-SOCSl-siRNA-DC鼠中，CTL对于gpl20脉冲的耙细胞的活性显著强于在LV-GFP-siRNA-DC鼠中。图15D显示在LV-SOCS-siRNA-DC鼠中有更高百分数的IFN-Y+T细胞。图16，包括图16A到16D，是显示通过SOCS1沉默的DCs增加Thl-和Th2-极化细胞因子的产生的系列图。图16A描述了与在用LPS刺激后的GFP-siRNA-DCs相比，通过LV-SOCSl-siRNA-DCs产生的IL-12、 IFN-y和TNFa的水平。图16B描述了 gpl20特异性的CD4+T细胞的频率。图16C说明了在应答gpl20脉冲的DCs刺激时，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的CD4+ T细胞比LV-GFP-siRNA-DC小鼠的CD4+T细胞增殖更活跃。图16D显示在SOCS1沉默的DCs中，Thl极化的(IFN-y、 IL-2和TNFa)和Th2极化的(IL-4和IL-10)细胞因子的水平都增加。图17，包括图17A到17D，是显示通过SOCS1沉默的DCs增加gpl20特异性的B细胞激活的系列图。图17A描述了在经LPS刺激后APRIL和BAFFmRNA的表达水平。图17B描述了在LV-SOCSl-siRNA-DC和LV-GFP-siRNA-DC鼠中，产抗-gpl20IgG的B细胞的频率。图17C描述了当用抗-CD40和IL-4共刺激时，LV-SOCSl-siRNA-DC鼠的B细胞比LV-GFP-siRNA-DC鼠的B细胞增殖
17更加活跃。图17D描述了 LV-SOCSl-siRNA-DCs鼠的B细胞在应答各种刺激时，产生更高水平的包括IL-6、 IL-2和TNF-a的各种细胞因子。图18，包括图18A到18B，是显示通过S0CS1沉默的DCs诱导的长期gpl20特异性的抗体和CTL应答的系列图。图18A描述了与LV-SOCSl-siRNA-DC免疫的鼠相比，在LV-GFP-siRNA-DCs免疫的鼠中gpl20特异性的抗体。图18B说明了与LV-GFP-siRNA-DC鼠相比在LV-SOCS1-siRNA-DC鼠中的gpl20特异性的CTL应答。图18C说明了在免疫后6个月，与LV-GFP siRNA-DC鼠相比，在LV-SOCSI-siRNA-DC鼠屮CD44hi和IFN" CD8+ T细胞的百分数。图18D说明了免疫后6个月，在LV-SOCS1 -siRNA-DCs鼠中，gp 120特异性的CD4+ Th应答被维持并被迅速地诱导。图19，包括19A到19E，是显示SOCS1沉默的DCs对HIV Env-介导的免疫抑制的抗性的系列图。图19A说明了在存在gpl20蛋白时，LV-SOCS1 siRNA-DCs保持响应LPS的能力。提前暴露于gpl20蛋白对LV-SOCS1-siRNA-DCs诱导OVA特异性的抗体应答的能力没有明显的效果(图19B和19C)，也不危害LV-SOCSl-siRNA-DCs诱导的OVA特异性的CD8+ CTL和CD4+ Th应答(图19D和19E)。图20，包括图20A到20D，是显示通过SOCS1 siRNA增加HIV DNA疫苗的系列图。图20A描述了在用pSuper-SOCS 1 -siRNA DNA共免疫的小鼠中HIV Env特异性抗体滴定度的增加。图20B和20C说明了通过共注射pSuper-SOCSl-siRNADNA，显著提高了 HIV Env特异性的CTL应答，分别通过CTL和ELISPOT分析所示。图20D描述了事实通过共注射SOCSl-siRNA DNA提高HIV Env特异性口、j ll/"+t i ii ^甘o图21，包括21A到21C是显示人单核细胞来源的DCs中的人SOCS1沉默的系列图。图21A说明了人SOCSl siRNA有效地下调了人SOCS1表达。图21B说明了合成siRNA双螺旋向来源于人单核细胞的DCs的转染效率。图21C描述了在用hSOCSl siRNA双螺旋转染的总DC群体中hSOCSl mRNA的水平。
图22，包括图22A到22C，是表征人SOCS-1沉默的DCs的系列图。图22A描述了流式细胞术分析所指的人SOCSl。图22B和22C说明了同siRNA突变体转染的人DCs比较，促炎细胞因子如IL-12、 IL-6和TNF-a在hSOCSl siRNA转染DCs中的分泌水平。图23，包括图23A到23C，是显示提高人SOCSl沉默的DCs引发抗原特异性CTL应答的免疫刺激效能的系列图。使用不同HLA-A2+供体的四个独立实验中的一个显示，在门控的CD3+和CD8+ T细胞群体中MAGE3-PE四聚体+ T细胞的百分数(图23A)、细胞内IFNy+T细胞的百分数(图23B)，以及IFN-Y+ ELISPOT数(图23C)。图24描述了在人源化HLA-A2.1转基因鼠中增加人MAGE3特异性的CTL
18应答。图25，包括图25A和25B，是显示通过人SOCSl-siRNA-DCs激活的人CTLs的肿瘤溶解活性的系列图。在存在或者不存在抗-人IL-12抗体时，MAGE3脉冲致敏的hSOCSl-siRNA DCs或者对照DCs与自体T细胞共培养两周后，针对人MAGE3+、 HLA-A2+黑素瘤细胞(SK-Mel-37)(图25A)和对照人MAGE3+、 HLA-AZ黑素瘤细胞(NA-6-Md)(图25B)的细胞溶解活性通过四个独立实验中的一个显示。
图26，包括图26A和26B,是显示免疫HLA-A2.1转基因鼠的激活CTLs的肿瘤溶解活性的系列图。在体外用MAGE3肽再刺激5天后，测量了对人SK-Mel-37细胞(图26A)和对照人HLA-A2- NA-6-Mel纟出胞(图26B)的细胞毒性，并且通过三个实验中的一个显示。图27，包括图27A和27B，是显示用S0CS1 siRNA寡核苷酸双螺旋共免疫提高体内蛋白免疫的系列图。图28描述了表达人S0CS1 siRNA的复制缺陷型腺病毒载体的示意图。图28也显示了通过Ad-人S0CS1 siRNA对人DCs的转染。图29描述了通过SOCS1 siRNA寡核苷酸双螺旋转染T细胞提高的CTL活性。图30描述了候选siRNA的核酸序列。图31显示，利用定量RT-PCR分析测量的A20 mRNA在A20-siRNA (siA20)转染的BM-DCs中的表达被siA20寡核苷酸下调。图32，包括图32A到32D，是显示体内OVA脉冲的、siA20寡核苷酸转染的BM-DCs免疫刺激能力提高的系列图。图32A到图32D分别描述了 H2-Kb/卵清蛋白-PE四聚体+T细胞占用下述免疫的鼠的总门控CD8+T细胞群体的百分数突变siRNA DC (CpG不存在时)、A20-2 siRNA DC(CpG不存在时)、突变的siRNADC(CpG存在时)和A20-2 siRNADC(CpG存在时)。图33，包括图33A和33B，是显示分别在存在和不存在聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激时，抗-OVA CD8 T细胞应答在体内OVA脉冲的、siA20寡核苷酸转染的BM-DCs中增加的系列图。图34，包括图34A和34B，是显示分别在存在和不存在聚肌胞苷酸刺激时，抗-OVACD4 T细胞应答在体内OVA脉冲致敏的、siA20寡核苷酸转染的BM-DCs中增强的系列图。图35，包括图35A和35B，是显示抗-TRP2 CD8 T细胞在体内TRP2脉冲的、siA20寡核苷酸转染的BM-DCs中应答增加的系列图。图35A和35B分别描述了在存在和不存在聚肌胞苷酸刺激时，在TRP2脉冲的、转染的或者模拟DCs免疫的小鼠中，CD8+T细胞的IFN-yELISPOT数。图36是肿瘤生长曲线图，其显示在不存在CpG体内刺激时，通过OVA脉冲的、siA20寡核苷酸转染的DC免疫根除先前形成的EG7肿瘤。
图37是肿瘤生长曲线图，其显示在存在CpG体内刺激时，通过OVA脉冲
的、siA20寡核苷酸转染的DC免疫根除先前形成的EG7肿瘤。图38显示通过沉默DCs屮的SOCSl、 A20、 SUM01或者Foxjl增加OVA
特异性抗体应答。图39描述了 TRP2特异性的IFN-f占TRP2脉冲的、LV-siA20转导的DCs
免疫鼠中CD8 T细胞的百分数。图40描述了 OVA特异性的IFN-y+占OVA脉沖的、LV-siA20转导的DCs免疫鼠中CD4+T细胞的百分数。图41显示了 OVA脉冲的、LV-siA20或者siFoxjl转导的DC免疫对先前形成的B16-OVA肿瘤的抑制。图42描述了用OVA脉冲的、LV-siA20转导的DC或者siFoxjl转导的DC
免疫的鼠存活率。图43显示了在用HHIV gpl20脉冲的、LV-siA20转导的DC免疫的小鼠中，增加的HIV gpl20特异性的CD8+ T细胞应答。图44是蛋白质印迹分析图，显示Foxjl表达DNA和Foxjl-siRNA(siFoxjl)寡核苷酸共转染的293细胞中Foxjl蛋白的下调。图45显示同siRNA突变体转染的DCs比较，siFoxjl寡核苷酸转染的DC对LPS剌激应答更强，这通过增加的IL-6分泌显示出。图46，显示了在TRP2脉冲的、转导DCs免疫的鼠中TRP2特异性的CD8禾口 CD4T细胞。图47,显示了在HIV gpl20脉冲的、转导DCs免疫的鼠中HIV gpl20特异图48是蛋白质印迹分析图，显示了在Twist 1和Twist 2表达DNA与Twist2-siRNA (si Twist 2)寡核苷酸共转染的293细胞中，Twist 2蛋白的下调。
图49是OT-I四聚体染色图，显示了体内OVA脉冲的、siTwist2寡核苷酸转染的BM-DCs的免疫刺激效能提高。图50是IFN-y ELISPOT分析图，显示了 Twist 2沉默提高了体内OVA脉冲的、siTwist寡核苷酸转染的BM-DCs的免疫刺激效能。图51显示，SUMOl沉默提高了体内siSUMOl (SUMOl-2和SUM01-3)寡核苷酸转染的BM-DCs的免疫刺激效能。图51描述了体内聚肌胞苷酸剌激的卵清蛋白脉冲的、转染或者模拟DCs免疫的鼠中，CD8+ T细胞的IFN-y ELISPOT分析。图52是显示SUMOl siRNA(siSUMOl)转染的DCs中IK(3a激活增强的图。
图53描述了 A20、 SUMOl 、 SUM02、 SUM03、 SUM04、 Twist-l、 Twist-2、Foxjl和Foxo3a的siRNA靶向序列。发明详述本发明涉及通过调节免疫细胞中的负性免疫调节因子提高免疫细胞的免疫效能。本发明提供了通过调节负性免疫调节因子调节免疫细胞的抗原呈递的组合物和方法。负性免疫调节因子可以属于不同的蛋白家族，包括但不限于参与信号转导的蛋白质的抑制性同源物(如，可溶的诱饵TLRs、抑制性的TIR同源物、抑制性的信号传导分子同种型、抑制性的细胞因子同源物等)、参与分子稳定的蛋白、信号传导分子复合体的抑制性组分、参与调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制NFKB耙向基因转录的转录因子、参与调节RNA翻译和稳定的蛋白、细胞因子信号传导调节因子等。本发明提供通过调节负性免疫调节因子提高免疫细胞的免疫效能的疫苗和疗法。另外，本发明也提供肿瘤接种中破坏自休耐受性的机制。因此本发明提供了在免疫细胞中，通过提高细胞的免疫刺激能力，千扰促炎信号转导途径如TLR-、TNFR-介导的信号传导和细胞因子受体介导的JAK7STAT信号传导的负性免疫调节因子的治疗益处。
定义如本文所用，以下每个术语在该部分具有与其相关的意思。本文所用的冠词"一个(a)"和"一个(an)"指的是一个或者一个以上(即
至少为一个)的该冠词语法对象。例如，"一种元素(an element)"意思是一种元素
或者一种以上元素。术语"大约"被本领域的普通技术人员理解，并且在其所用的语境中会在一疋々玍/叉工叉Hi。"同种异体的(allogeneic)"指来自同种的不同动物的移植物。
"同种异体抗原(alloantigen)"指与受体表达的抗原不同的抗原。
本文所用的术语"抗体"，指免疫球蛋白分子，其能够特异性地结合到抗原的特定表位上。抗体可以是天然来源的或者重组来源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、Rv、 Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化的抗体(Hariow等人，1988; Houston等人，1988;Bird等人，1988)。本文所用的术语"抗原"或者"Ag"被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或者特定的免疫活性细胞的激活或者两者。本领域普通技术人员会理解，包含几乎所有蛋白或者肽在内的任何大分子能够充当抗原。而且，抗原可以来自重组的或者基因组DNA。本领域普通技术人员将会理解，包括编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或者部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用的术语"抗原"。而且本领域的普通技术人员将会理解，不需要通过基
21因的全长核苷酸序列单独编码抗原。显而易见的是，本发明包括但不限于，利用一个以上基因的部分核苷酸序列和以不同的结合排列这些核苷酸序列，以引发期望的免疫应答。而且，本领域普通技术人员将会理解，抗原根本不需要通过"基因"编码。显而易见的是，抗原可以合成产生或者可以来自生物样品。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或者生物流体。
"抗原呈递细胞"(antigen presenting cell, APC)是能够激活T细胞的细胞，包括但不限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(DCs)。
术语"树突状细胞(dendritic)"或者"DCs"指在淋巴或者非淋巴组织中发现的形态相似细胞类型的各种群体的任何成员。这些细胞的特征是它们独特的形态、高水平的表面MHC- II类表达。DCs可以从许多组织来源分离。DCs具有敏化MHC限制性T细胞的强大能力，并且很有效地将抗原呈递到原位的T细胞。抗原可以是在T细胞发育和耐受过程中表达的自体抗原和在正常免疫过程中存在的外源抗原。如本文所用，"活化DC"是已经用抗原脉冲的和能够激活免疫细胞的DC。
本文所用的术语"成熟DC"被定义为表达高水平的MHC II类、CD80(B7.1)和CD86 (B7.2)分子的树突状细胞。反之，不成熟的树突状细胞表达低水平的MHCII类、CD80(B7.1)和CD86(B7.2)分子，但具有获取抗原的强大能力。
"抗原负载的(antigen-loaded) APC"或者"抗原脉冲的(antigen-pulsed)APC"包括已经暴露于抗原并被抗原激活的APC。例如，APC可以变为体外Ag负载，如在存在抗原的培养过程中。通过暴露于抗原APC可以在体内被负载。-
通过两种途径的一种，常规制备"抗原负载的APC": (l)被称为抗原肽的小肽片段，被直接"脉冲(pulsed)"到APCs的外部；或者(2)将APCs与全蛋白或者蛋白颗粒温育，这些蛋白接着被APC摄取。这些蛋白被APC消化为小的肽段，并且最后被运输和呈递到APC表面。另外，也可以通过将编码抗原的多核苷酸导入细胞，产生抗原负载的APC。如本文所用，术语"沉默的(silenced) APC"或者"沉默的DC"分别指这样的APC或者DC，其暴露于负性免疫调节因子的抑制剂(另外被认为抑制负性免疫调节因子)，由此负性免疫调节因子与调节免疫应答相关联。所述抑制剂(抑制因子)能够抑制在此公开的任何负性免疫调节因子，包括但不限于，sTLR、RP105、 SIGIRR、 ST2、 NOD2、 MyD88s、 IRAK(IRAKM 、IRAKI 、IRAK2)、 IRF-4、 FLN29、TWEAK、 TRIAD3A、 CYLD、 Cbl、 A20、 SUMO(SUMOl 、 SUM02 、 SUM03 禾n SUM04)、 IkB 蛋 白、MKPs、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST (Twist 1 、 Twist 2)、 Roquin、 Dok(Dok-l 、Dok-2)、 PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、 SOCS (S0CS1 、SOCS2、 SOCS3、 SOCS4、 SOCS5、 SOCS6、 SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1、 PIAS3、PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)以及类似物。当同未用负性免疫调节因子
22的抑制剂处理的其他相同的APC比较时，沉默的APC提高了免疫效能。
"反义(antisense)"具体指编码多肽的双链DNA分子非编码链的核酸序列，或者与非编码链基本同源的序列。如本文定义，反义序列与编码多狄的双链DNA分子序列互补。反义序列不必与DNA分子编码链的编码部分完全互补。反义序列可以与编码多肽的DNA分子编码链上规定的调节序列互补，其中调节序列调控编码序列的表达。本文所用的术语"自身免疫性疾病(autoimmune disease)"被定义为自身免疫应答导致的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原不当和过度应答的结果。自身免疫性疾病的例子包括但不限于，阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫氏病、格-巴二氏综合症、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎和其它疾病。
如本文所用，术语"自身的(autologous)"意思是指来自同一个体的任何物质，这些物质后来又被导入该个体。本文所用术语"癌症"被定义为其特征为异常细胞快速和失控的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或者通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部分。各种癌症例子包括但不限于，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、-结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和类似癌症。
"细胞因子信号传导调节因子(cytokine signaling regulator)"或者"细胞因
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的调节因子(regulator ofcytokine signal transduction)"指能够负调控细胞中细胞因
子信号转导通路的蛋白质。细胞因子信号转导的调节因子包括但不限于，细胞因
子信号转导的抑制因子(SOCS 1-SOCS7，细胞因子诱导的含SH2结构域蛋白(CIS))、
含SH2磷酸酶(SHP)和活化STAS的蛋白抑制因子(PIAS)。本文所用的术语"DNA"被定义为脱氧核糖核酸。"供体抗原(donor antigen)"指供体组织表达的移植到受体中的抗原。"受体抗原(recipient antigen)"指免疫应答供体抗原的靶。如本文所用，"效应细胞(effector cell)"指介导免疫应答抗原的细胞。效
应细胞的例子包括但不限于T细胞和B细胞。"编码"指多核苷酸的特异性核苷酸序列如基因、cDNA或者mRNA充当合成生物过程中其它多聚体和大分子的模板的固有性质，这些多聚体和大分子具有限定的核苷酸序列(如，rRNA、 tRNA和mRNA)或者限定的氨基酸序列和由此获得的生物性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞和其它生物系统中产生了蛋白，那么该基因就编码蛋白质。编码链——与mRNA序列相同的核苷酸序列并且通常通过序列表提供，和非编码链——其用作转录基因或者cDNA 的模板，都可以指编码该基因或者cDNA的蛋白质或者其他产物。
如本文所用，"内源的(endogenous)"指来自或者产生于生物、细胞、组 织或者系统内部的任何物质。如本文所用，术语"外源的(exogenous)"指从生物体、细胞、组织或者 系统外部导入或者产生的任何物质。本文所用的术语"表位(epitope)"被定义能够引发免疫应答的抗原上的小 化学分子，其诱导B细胞和/或T细胞应答。抗原可以具有一个或者多个表位。大 多数抗原具有许多表位，即它们是多价的。-一般，表位大小大约为5个氨基酸和/ 或糖。本领域普通技术人员理解， 一般地，分子的全部三维结构，而非具体的线 性序列是抗原特异性的主要标准，并因此将-一个表位同另一个区别开来。
本文所用的术语"表达(expression)"被定义为通过其启动子驱动的特定 核苷酸序列的转录和/或者翻译。本文所用的术语"表达载体(expressionvector)"指含有能够被转录的、编 码至少部分基因产物的核酸序列的载体。在一些情况下，RNA分子接着被翻译成 蛋白质、多肽或者肽。在其它情况下，例如在产生反义分子、siRNA、核酶和类似 情况中，这些序列不翻译。表达载体可以含有多种控制序列，控制序列指，在特 定宿主生物体中，转录和可能翻译可操作地连接的编码序列所需要的核酸序列。 除了调控转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体也可以含有发挥其它功能的 核酸序列。本文所用的术语"辅助性T细胞(hdperTcdl)"被定义为其主要功能为促 进其它B和T淋巴细胞和或者巨B笠细胞活化和发挥功能的效应T细胞。大多数辅 助性T细胞是CD4T细胞。本文所用的术语"异源的(heterologous)"被定义为来自不同种的DNA或 者RNA序列或者蛋白质。本文所用的"同源的(homologous)"指两个聚合物分子之间的亚单位序列 相似性，如两个核酸分子，如两个DNA分子或者两个RNA分子之间，或者两个 多肽分子之间。当两个分子的亚单位的位置都被相同的单体亚单位占据时，例如， 如果两个DNA分子的每个分子的位置被腺嘌呤占据，那么它们在该位置是同源的。 两个序列之间的同源性是匹配的或者同源的位置的数目的直接函数，例如，如果 在两个复合序列中半数(如，长度为10个亚单位的聚合物中的5个位置)的位置是 同源的，那么这两个序列是50%同源，如果卯％的位置，例如10个中有9个，是 匹配的或者同源的，这两个序列共享90°/。的同源性。例如，DNA序列3'ATTGCC5' 和3'TATGGC共享50%的同源性。如本文所用，"同源性(homology)"与"同一性(identity)"同义地使用。
如本文所用，"免疫原(imrmmogen)"指能够刺激或者诱导哺乳动物中的体液抗体和/或者细胞介导的免疫应答的物质。本文所用的术语"免疫球蛋白(immunoglobulin)"或者"Ig"被定义为作 为抗体发挥功能的一类蛋白。该类蛋白包含的5个成员是IgA、 IgG、 IgM、 IgD和 IgE。 1gA是身体分泌物如，唾液、服泪、母乳、胃肠分泌物和呼吸道与泌尿生殖 道的粘液分泌物中存在的主要抗体。IgG是最普通的循环抗体。IgM是大多数哺乳 动物中在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是在凝集、补体结合和其它 抗体反应中最有效的免疫球蛋白，在防御细菌和病毒中具有重要的作用。IgD是抗 体功能还未知的免疫球蛋白，但是可能作为抗原受体。IgE是暴露于变应原后，通 过引起介体从肥大细胞和嗜碱性细胞释放而介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所用，"负性免疫调节因子(negative immune regulator)"或者"负 调节因子(negativeregulator)"或者"免疫应答的负调节因子"指能够负调控细胞 中免疫信号传导转导途径的蛋白质。优选地，负性免疫调节因子负调控促炎信号 转导途径。本文公丌的负性免疫调节因子包括但不限于，sTLR、 RP105、 SIGIRR、 ST2、 NOD2、 MyD88s、 IRAK (IRAKM， IRAKI ， IRAK2)、 IRF-4、 FLN29、 TWEAK、 TRIAD3A、 CYLD、 Cbl、 A20、 SUMO(SUMOl， SUM02, SUM03禾B SUM04)、 IkB蛋白、MKPs、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST (Twist 1 ， Twist 2)、 Roquin、 Dok(Dok-l， Dok-2)、 PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、 SOCS(SOCSl， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7禾CI CIS)、 PIAS(PIAS1， PIAS3， PIASx 和PIASy)、 SHP (SHP-1和SHP-2)和类似物。负性免疫调节因子可以属于不同的 蛋白家族，包括但不限于参与信号转导的蛋白质的抑制性同源物(例如，可溶性的 诱馆TLRs、抑制性的TIR同源物、抑制性的信号传导分子同工型、抑制性的细胞 囚子同源物等)、参与分了稳定的蛋白质、信号传导分子复合体的抑制性组分、参 与调控信号传导分子磷酸化的蛋白质、抑制NFicB靶向基因转录的转录因子、参 与调控RNA翻译和稳定性的蛋白质、细胞因子信号传导调控因子和类似物。 一方 面，抑制免疫细胞的一个或者多个负性免疫调节因子起到提高细胞免疫效能的作 用。"分离的核酸(isolated nucleic acid)"指从以自然状态位于其两侧的序列分 离出来的核酸节段或者片段，即，从通常与其相邻的序列移出的DNA片段，即， 在自然状态下在基因组中与该片段邻接的序列。该术语也适用于从其它自然伴随 核酸的组分中被基本纯化的核酸，即，RNA或者DNA或者蛋白质，它们在细胞 中天然地伴随有核酸。该术语因此包括，例如整合到载体、自我复制的质粒或者 病毒或者原核生物或者真核生物基因组DNA的重组DNA，或者独立于其他序列 作为单独分子存在的重组DNA(g卩，通过PCR或者限制性酶切消化产生的cDNA 或者基因组的或者cDNA的片段)。它也包括重组DNA，其是编码另外的多肽序列 的杂化基因的一部分。在本发明的上下文中，使用以下的通常存在的核酸碱基縮写。"A"指腺苷，
25"C"指胞嘧啶，"G"指鸟苷，"T"指胸苷，禾U "U"指尿苷。
本文所用的术语"主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)"或者"MHC"被定义为特定的基因簇，它们中的许多编码参与抗原呈 递的在进化上相关的细胞表而蛋白，它们是最重要的组织相容性决定子之一。I类 MHC或者MHC-I主要在呈递抗原至CD8 T淋巴细胞中发挥功能。11类MHC或者 MHC-II主要在呈递抗原至CD4T淋巴细胞中发挥功能。如本文所用，术语"调节(modulate)"意思是指生物状态的任何变化，即 增加、减少等。例如，术语"调节"指正或者负调控负性免疫调节因子的表达或 者活性的能力，包括但不限于期望的负性免疫调节因子mRNA的转录、期望的负 性免疫调节因子rnRNA的稳定性、期望的负性免疫调节因子mRNA的翻译、期望 的负性免疫调节因子mRNA的翻译后修饰或者它们任意的结合。而且术语调节被 用于指活性的增加、减少、掩蔽、改变、控制或者恢复，包括但不限于与树突状 细胞免疫效能相关的期望负性免疫调节因子的活性。术语"调节"适用于本文公 开的任何负性免疫调节因子，包括但不限于sTLR、 RP105、 SIGIRR、 ST2、 NOD2、 MyD88s、 IRAK(IRAKM， IRAKI, IRAK2)、 IRF-4、 FLN29、 TWEAK、 TRIAD3A、 CYLD、 Cbl、 A20、 SUMO(SUMOl， SUM02， SUM03和SUM04)、 IkB蛋白、 MKPs、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST (Twist 1 ， Twist 2)、 Roquin、 Dok(Dok-l， Dok-2)、 PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、 SOCS(SOCSl， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)等。除非另外说明，"编码氨基酸序列的核苷酸序列"包括 为相互简并型和编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或者 RNA的核苷酸序列也可以包含内含了，其程度为编码蛋白质的核苷酸序列可以在 某些变型中含有内含子(一个或多个)。本文所用的术语"多核苷酸(polynucleotide)"被定义为核苷酸链。而且， 核酸是核苷酸的多聚体。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域 的普通技术人员具有核酸是多核苷酸的常识，多核苷酸可以水解为单体"核苷酸"。 单体核苷酸可以被水解为核苷。本文所用的多核苷酸包括但不限于，通过本领域 可用的任何方法获得的所有核酸序列，所述方法包括但不限于重组方法，即利用 常规的克隆技术和PCRTM等并通过合成方法克隆来自重组文库或者细胞基因组的 核酸序列。本文所用的术语"多肽"被定义为通常具有确定序列的氨基酸残基的链。 如本文所用，术语多肽与术语"肽"和"蛋白质"是相互包含的。
本文所用"增殖"指形式相似的实体的生殖或者繁殖，例如细胞的增殖。 即增殖包括产生更多数量的细胞，并且除了其它方法外，可通过简单计数细胞、 测量细胞中的3H-胸苷的整合量以及类似方法进行测量。本文所用的术语"启动子(promoter)"被定义为被细胞的合成机器或导入的合成机器识别的DNA序列，其是起始多核苷酸序列的特定转录所需耍的。
如本文所用，术语"启动子/调节序列(promoter/regulatory sequence)"意思 是与启动子/调节序列可操作地相连的基因产物表达所需要的核酸序列。在一些情 况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况下，该序列也可以包括基因产 物表达所需要的增强子序列和其它调节元件。例如，启动子/调节序列可以是以组 织特异性的方式表达基因产物的启动子/调节序列。"组成型(constitutive)"启动子是这样的核苷酸序列当其与编码或者限 定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下， 其导致细胞中基因产物的产生。"诱导型"启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因 产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在 时，其导致所述基因产物在细胞内产生。"组织特异性"启动子是这样的核苷酸序列当可操作地与编码或者限定 基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细 胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
本文所用的术语"RNA"被定义为核糖核酸。本文所用的术语"重组DNA"被定义为通过连接不同来源的DNA段产生 的DNA。本文所用的术语"重组多肽"被定义为利用重组DNA方法产生的多肽。
本文所用的术语"自身抗原(self-antigen)"被定义为宿主细胞或者组织表 达的抗原。自身抗原可以是肿瘤抗原，但在某些实施方式中，在正常和肿瘤细胞 中都表达。本领域普通技术人员容易理解自身抗原可以在细胞中过度表达。
如本文所用，"基本纯化的"细胞是基本不含有其它细胞类型的细胞。基本 纯化的细胞也指从在自然存在状态下通常与其关联的其它细胞类型分离的细胞。 在一些情况下，基本纯化的细胞群指同种细胞群。在其它情况下，该术语仅仅指 从在它们的自然状态下与其自然相关联的细胞中分离出来的细胞。在一些实施方 式中，所述细胞是体外培养物。在其它实施方式中，所述细胞未在体外培养。
在此所用的术语"T细胞"被定义为来自胸腺的细胞，其参与多种细胞介 导的免疫反应。在此所用的术语"B细胞"被定义为来自骨髓和成者脾的细胞。B细胞能 够发育成制造抗体的浆细胞。如本文所用，"治疗有效量"是对被给予组合物的哺乳动物足以提供有益作 用的治疗组合物的量。本文所用的术语"转染的(transfected)"或者"转化的(transformed)"或 者"转导的(transduced)"指外源核酸被运输或者导入宿主细胞的过程。"转染 的"或者"转化的"或者"转导的"细胞是已经用外源核酸转染的、转化的或者转导的细胞。所述细胞包括原代细胞和其子代。本文所用的短语"在转录控制下(under transcriptional control)"或者"可
操作地连接(operatively linked)"意思是，启动子处于与多核苷酸相关的正确位置
和方向，以控制通过RNA聚合酶的转录的起始和多核苷酸的表达。本文所用的术语"疫苗"被定义为在给予哺乳动物所述物质后，用于激发
免疫应答的物质。本文所用的术语"变体(variant)"是核酸序列或者肽序列，其在序列上分 别不同于参比核酸序列或者肽序列，但是保留参比分子的基本性质。核酸变体的 序列的变化可不改变参比核酸编码的肽的氨基酸序列，或者导致氨基酸的取代、 加成、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化是基本冇限的或者保守的，以致参 比肽和所述变体的序列总体非常相似，并且在许多区域相同。变体和参比肽的氨 基酸序列可以通过一个或者多个替代、加成、缺失的任意结合而不同。核酸或者 肽的变体可以是天然存在的如等位变体，或者可以是未知的天然存在的变体。非 天然存在的核酸和肽的变体可以通过突变技术或者通过直接合成制备。
"载体(vector)"是物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可以被用于 将所述分离核酸传输到细胞的内部。本领域已知许多载体，包括但不限于，线性 多核苷酸、与离子型或者两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术 语"载体"包括自主复制的质粒或者病毒。所述术语也被解释为包括促进将核酸 运输到细胞中的非质粒性和非病毒性化合物，如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体 等。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载 体和类似载体。本文所用的术语"病毒"被定义为山包裹在蛋白外壳中的核酸(P、NA或者 DNA)构成的颗粒，有或者没有脂质外膜，其能够在完整细胞内复制。
"异种的(xenogeneic)"指来自不同种的动物的移植物。
发明详述哺乳动物中应答免疫反应的失控的信号转导可能具有灾难性的生物学后 果。因此，信号传导途径在不同的水平被严格地调控。存在各种类型的免疫应答 调控因子。 一种调控免疫应答的方法是通过负性免疫调节因子。因此，本发明涉 及抑制免疫细胞的负性免疫调节因子，以提高细胞的免疫效能。
负性免疫调节因子可以属于不同的蛋白家族，包括但不限于参与信号转导 的蛋白的抑制性同源物(如，可溶的诱饵TLRs、抑制性的TIR同源物、抑制性的 信号传导分子的同种型、抑制性的细胞因子同源物等)、参与分子稳定的蛋白、信 号传导分子复合体的抑制性组分、参与调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制 NFKB粑向基因转录的转录因子、参与调节RNA翻译和稳定的蛋白、细胞因子信 号传导调控因子等。负性免疫调节因子的例子包括但不限于，sTLR、 RP105、
28SIGIRR、 ST2、 N0D2、 MyD88s、 IRAK(1RAKM, IRAKI' 1RAK2)、 IRF-4、 FLN29、 TWEAK、 TRIAD3A、 CYLD、 Cbl、 A20、 SUMO(SUMOl， S函02, SUM03禾ll SUM04)、 1kB蛋白、MKPs、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST (Twist 1' Twist 2)、 Roquin、 Dok(Dok-l，Dok-2)、PI3K、前列腺素、TRAIL-R、抑制蛋白、TOLLIP、SOCS (SOCS1 ， SOCS2， SOCS3, SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7和CIS)、 PIAS(PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1禾fl SHP-2)和类似物。在一个方面，所述负性免疫调节因子是细胞因子信号传导的调控因子，其 包括但不限于细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)、含有SH2的磷酸酶(SHP)和活 化的STATs的蛋白抑制因子(PIAS)。细胞因子信号传导的诱导型抑制因子是细胞因子信号传导的抑制因子 (SOCS)蛋白，其中有8个家族成员SOCS1-SOCS7和细胞因子诱导的含有SH2 结构域的蛋白(CIS)。 SOCS蛋白识别细胞因子受体或者相关的JAKs，并且通过直 接干扰信号传导和通过靶向受体复合物进行泛素介导的蛋白酶体降解，衰减信号 转导。SHP蛋白，包括但不限于(SHP-1和SHP-2)，被组成型表达，并且能够通过 将信号传导中间体如hnus激酶(JAK)及其受体去磷酸化而衰减细胞因子信号转 导。活化的STATs的蛋白抑制因子(protein inhibitors of activated STATs， PIAS)家族 的成员，包括但不限于PIAS1、 PIAS3、 PIASx和PIASy，也是组成型表达的，并 且通过抑制STAT的活性衰减信号转导。苏素化过程涉及对PIAS介导的STAT活 性的抑制。本发明涉及发现对负性免疫调节因子的抑制对哺乳动物提供了治疗益处。 即，抑制免疫细胞的负性免疫调节因予起到增强与提高细胞的免疫效能相关的信 号传导途径的作用。 一方面，抑制参与信号转导的蛋白的抑制性同源物(如，可溶 的诱饵TLRs、抑制性的TIR同源物、抑制性的信号分子的同种型、抑制性的细胞 因子同源物等)、参与分子稳定的蛋白、信号传导分子复合体的抑制性组分、参与 调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制NFkB靶向基因转录的转录因子、参与调 节RNA翻译和稳定的蛋白、细胞因子信号传导调控因子或者它们的任意的结合， 对哺乳动物提供了治疗益处。因此，本发明包括抑制免疫细胞的负性免疫调节因子的组合物和方法，由 此提高所述免疫细胞的免疫效能。优选地，抑制选自下列的一个或者多个负性免 疫调节因子A20、 SUMO (SUMO 1,SUMO2,SUM03,SUMO4)、 Foxjl 、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l，Twist-2)、 SOCS (SOCSl， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5' SOCS6， SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2) 等，以提供治疗益处。进一步方面，抑制来自细胞因子信号调控因子家族的任何一个或者多个成 员提供了治疗益处。因此，本发明包括调控免疫细胞的细胞因子信号传导调控因子的组合物和方法，由此提高所述免疫细胞的免疫效能。不考虑所抑制的期望的负性免疫调节因子，本发明提高细胞的免疫效能的 组合物包括下列至少一个或者多个的任意结合负性免疫调节因子的抑制因子 (如，所述抑制因子是对应于期望的负性免疫调节因子的抑制因子)、抗原、沉默 的免疫细胞、脉冲的细胞、用抗原脉冲的沉默的免疫细胞、细胞因子等。所述组 合物可以是用于体内免疫和/或先体外后体内治疗的疫苗。作为一般方法(generic mean)，本发明提供了沉默的APC，以通过使APC 的临界调控点失去能力而提高疫苗的效能。接种本发明的负性免疫调节因子的抑 制因子或者沉默的APC，提高了抗原特异性免疫，因为负性免疫调节因子的沉默 允许抗原呈递的免疫原性APC在体内持续地刺激抗原特异性的T细胞。在本发明 的实施方式中，沉默的APC能够通过增强APC的成熟和提高阻止调控T细胞抑 制的促炎细胞因子的产量，关闭调控T细胞。除了产生沉默的APC，本发明也包括沉默的细胞毒性的T淋巴细胞(CTL)。 本公开内容显示，用本发明的方法沉默的CTL显示增强的细胞溶解活性。具有增 强的细胞溶解活性的CTL在细胞疗法和/或疫苗接种中提供了治疗益处。
抑制负性免疫调节因子基于本文提供的公开内容，本发明包括抑制负性免疫调节因子的总体构思， 由此所述负性免疫调节因子与调控免疫应答相关。所述负性免疫调节因子可以属 于不同的蛋白家族。每个家族的负性免疫调节因子具有不同的调控免疫应答的策 略。所述不同的家族包括，但不限于参与信号转导的蛋白的抑制性同源物(如，可 溶的诱饵TLRs、抑制性的TIR同源物、抑制性的信号传导分子的同种型、抑制性 的细胞因子同源物等)、参与分子稳定的蛋白、信号传导分子复合体的抑制性组分、 参与调节信号传导分子磷酸化的蛋白、抑制NFkB靶向基因转录的转录因子、参 与调节RNA翻译和稳定的蛋白、细胞因子信号传导调控因子等。基于本文提供的 公开内容，抑制免疫细胞的负性免疫调节因子提高了所述细胞的免疫效能。
在一些方面，抑制免疫细胞的负性免疫调节因子提高了细胞中Toll样受体 (TLR)和肿瘤坏死因子(TNFR)的信号传导。增强细胞TLR和TNFR信号传导的结 果是所述细胞的免疫效能提高。
参与信号转导的蛋白的抑制性同源物有效的免疫应答是由于在应答致病性感染时的DC激活。这种激活包括通 过病原识别受体如TLRs的信号传导。TLRs成员以相似的模式进行信号传导，这 是因为存在保守的、胞质Toll/白细胞介素-l受体(TIR)结构域，其激活共同的信号 传导途径，尤其是那些导致NFKB和应激活化蛋白激酶激活的信号传导途径。NFKB 的激活通过分泌促炎细胞因子如TNF、 IFN、白细胞介素1 (IL-1)、 IL-6和IL-12
30和通过表达共刺激分子如CD80、 CD86和CD40而催化免疫应答。
经常使用的用于调控细胞内基于TLR信号传导的免疫应答的策略是，通过 它们在TLR的细胞外部分不具有刺激活性的非功能同源物或者同工型，竞争性地 抑制关键的信号传导分子。在该负性免疫调节因子家族中的蛋白包括，但不限于 可溶的诱饵TLRs (sTLR)。 sTLR抑制TLRs与病原产物(如，微生物产物)之间的相 互作用。例如，可溶的诱饵TLR2与TLR2竞争，以便与相应的微生物配体相互作 用。在另一个例子中，可溶的诱馆TLR4与MD2之间相互作用并且抑制MD2-TLR4 复合体的形成，由此通过TLR4阻断LPS介导的信号传导。基于本公开内容，本领域普通技术人员可以理解，本发明包括抑制负性免 疫调节因子的组合物和方法，其中所述负性免疫调节囚子是信号传导分子的非功 能性同源物。优选地，信号传导分子的非功能性同源物是可溶的诱饵TLR。抑制 信号传导分子的非功能性同源物(或者在其他方面，抑制sTLR)起到抑制非功能性 同源物对所述信号传导分子的抑制作用的作用。除了抑制可溶的诱饵TLRs，增强TLR信号传导的另一个策略是抑制在TLR 的胞质区含有非功能的TIR同源物或者同工型的蛋白质。这些蛋白质是共有膜结 合的非功能性TIR同源物的蛋白家族成员，所述非功能性TIR同源物含有不具有 刺激活性的TIR结构域(另外被称为非功能性受体)。这样的蛋白质包括，但不限 于SIGIRR (单免疫球蛋白IL-1R相关分子)、ST2和RP105。
不希望束缚于任何具体的理论，这些蛋白质通过阻止或者隔绝TLR结合其 相应的信号传导分子，抑制TLR信号传导。例如，SIGIRR通过同TLR4竞争与信 号传导分子相互作用，衰减TLR4信号传导。因此，本发明包括抑制负性免疫调节 因子的组合物和方法，其中所述负性免疫调节因了是膜结合的非功能性TIR同源 物，以增强免疫细胞TLR信号传导。该策略对抑制负性免疫调节因子以提高免疫 细胞的免疫效能的总体构思提供了支持。 TLR信号传导也可以通过NOD2调节。NOD2是能够识别细菌产物胞壁酰 二肽(MDP)的核酸结合的寡聚结构域家族成员。NOD2是TLR2信号传导的负性调 节因子。基于本文提供的本公开内容，抑制免疫细胞的NOD2抑制了NOD2对细 胞中TLR信号传导的抑制作用。因此，在免疫中抑制NOD2提高了所述细胞的免 疫效能。调节TLR信号传导的另一个策略是调节胞质信号传导蛋白，如MyD88和 IRAK。抑制胞质信号传导分子的负性免疫调节因子被认为是TLR信号传导中关键 信号传导分子的非功能性同工型(或者另外称为信号传导分子同工型)。被认为是 非功能性同工型的负性免疫调节因子的例子是可选剪接的短MyD88变体，其缺少 中间结构域。该MyD88剪接变体，其被表示为MyD88s,已经被发现抑制TLR信 号传导。例如，MyD88s抑制LPS诱导的NFKB的激活。可以相信的是，MyD88s 抑制LPS诱导的NF-kB的激活，这是由于其不能结合到IRAK4和促进IRAKI的磷酸化。基于本文提供的公丌内容，抑制负性免疫调节因子，其中所述负性免疫 调节因子是细胞的非功能性同工型(如，MyD88s)，提供了增强细胞中的TLR信 号传导的方法，并且山此提高了所述细胞的免疫效能。属于参与信号转导的蛋白质的抑制性同源物家族的蛋白质的另一个例子是 IRAK。所述IRAK激酶家族包括四个成员IRAKI 、 IRAK2、 1RAK4和IRAKM。 并且，IRAKM缺少激酶活性，其作为细胞中TLR信号传导的球形负性免疫调节 因子发挥功能。因此，抑制负性免疫调节因子，其中，所述负性免疫调节因子是 非功能性同工型如IRAKM，对抑制负性免疫调节因子以提高免疫细胞的免疫效能 的总体构思提供了支持。 TLR信号传导的其它负性免疫调节因子包括，但不限于转录因子的IFN调 节因子(IRF)家族的成员、FLN29(新干扰素和LPS诱导的基因)和TWEAK。因此， 抑制这些负性免疫调节因子的任何--个或者多个可以阻止每个负性免疫调节因子 对免疫应答的抑制作用。因此，抑制这些负性免疫调节因子的任何一个或者多个 提供了增强细胞的TLR信号传导的方法，并由此提高所述细胞的免疫效能。
分子稳定性负性免疫调节因子的一个家族利用调节信号传导分子稳定性的策略。该策 略与通过泛素化/去泛素化调控关键信号传导分子的稳定性相关，并且通过苏素化 和其它机制增加信号传导分子复合体的抑制性组分的稳定性。许多这些负性免疫 调节因子如，TRIAD3A、 Cyld、 Cbl、 A20和SUMO是泛素修饰的酶，其修饰靶 TLRs和信号传导分子。并且促进它们的降解以衰减TLR信号转导。在一些例子中， 这些负性免疫调节因子也可以衰减TNFR信号转导。因此，基于木文提供的公开 内容，本领域普通技术人员将会理解，抑制免疫细胞中的这些负性免疫调节因子 的一个或者多个增强细胞中的TLR和/或者TNFR信号传导。增强细胞中的TLR 和/或者TNFR信号传导的结果是提高所述细胞的免疫效能。
参与调节分子稳定性的其它负性免疫调节因子包括抑制蛋白家族。基于本 公开内容，本领域普通技术人员将会理解，抑制免疫细胞中的抑制蛋白家族成员， 抑制了抑制蛋白家族成员对NFkB激活的抑制作用。对抑制蛋白家族成员的抑制 因此提高了所述细胞的免疫效能。
信号传导分子复合体的抑制性组分作为信号传导分子复合体的抑制性组分家族成员的负性免疫调节因子包括 IkB蛋白。包括IkBoc、 IkBP和IkBs的IkB蛋白隔绝胞质中的NF-kB蛋白，由此 抑制NF-k:B发挥其正常功能。IkB蛋白通过掩蔽NF-kB亚单位上的核定位序列 (NLSs)而保留胞质中的NF-kB。在激活NF-kB中的重要事件是通过IkB激酶(IKK)复合体的IkB磷酸化。
32所述IKK复合体是用于通过包括TLR配体和TNF的各种刺激激活NF-kB的汇集 点。所述IKK复合体含有两个催化亚基，IKKa禾[IKKp，并控制NF-kB转录因 子的激活。IKK卩在应答促炎细胞因子和微生物产物时介导NF-kB的激活。已经观 察到，IKKa在调控NF-kB激活中的负调控作用。IKKa通过加速NF-kB亚单位 RelA和c-Rel的降解，和从促炎基因启动子中除去RelA和c-Rel，有助于抑制NF-kB 的活性。基于本文提供的公丌内容，负调控NF-kB或者在其它方面阻止NF-kB激活 的蛋白质是利用本文公开的方法靶向抑制以提高细胞的免疫效能的候选者。本领 域普通技术人员将会理解，抑制IKP蛋白、IKKa禾口 IKK(3或者任意的结合能够抑 制这些蛋白对NF-kB激活的抑制作ffl 。
信号传导分子磷酸化的调节 MAPK信号传导途径与免疫应答的激活相关。MAPK途径受到MAPK磷酸 酶(MKPs)的反馈抑制，因为所述磷酸酶在MAPK途径激活后被诱导。基于本文提 供的公开内容，抑制MKP(如，MKP5和MKP6)起到抑制MKP对其相应的MAPK 途径的抑制作用的作用。MKP5和MKP6巳经显示，通过抑制它们各自的MAPK 靶的活性而负调控T细胞的激活。基于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员将会理解，抑制MKP(如， MKP5和MKP6)能够抑制所述磷酸酶对MAPK信号传导途径的抑制作用。抑制免 疫细胞中的MKP能够提高所述细胞的免疫效能。
紀基因转录的调节调节免疫应答的另一个策略是抑制NFkB靶向基因的转录或者增强信号传 导分子复合体中的负组分(negative component)的转录。这样的策略包括抑制包 括但不限于Twist-l、 Twist-2、 Foxjl和Foxo3a的负性免疫调节因子。本文提供的 公开内容显示，抑制这些蛋白的至少一个的水平能够提高所述细胞的免疫效能。
Foxo3a和Foxjl是叉头转录因子(forkhead transcription factor)家族成员， 其积极地参与NF-kB的负调控。Twist是NF-kB的另一个负性免疫调节因子。Twist 结合到细胞因子启动子的E框(E box)并且抑制结合到临近的kb位点的NF-kB 活性。
抑制负性免疫调节因子的方法基于本文的公开内容，本发明包括抑制细胞中的负性免疫调节因子以提高 所述细胞的免疫效能的总体构思。优选地，本发明包括抑制一个或者多个选自以 下的负性免疫调节因子A20、 SUMO (SUMO 1， SUM02, SUM03，和SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l，Twist-2)、 SOCS(SOCSl， SOCS2, SOCS3， SOCS4，SOCS5，SOCS6，SOCS7和CIS)、PIAS (PIASl'PIAS3，PIASx和PIASy)、SHP(SHP-l
和SHP-2)和类似物。在一个实施方式中，本发明包括提高免疫细胞的免疫效能的组合物。优选 地，所述组合物包括抑制一个或者多个选fi以下的负性免疫调节因子的抑制因子 A20 、 SUMO (SUMOl, SUM02, SUM03, SUM04) 、 Foxjl 、 Foxo3a 、 TWIST(Twist-l，Twist-2)、 SOCS (S0CS1， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7和ClS)、 PIAS (PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2) 和类似物。包括负性免疫调节因子的抑制因子的所述组合物选自小千扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变的表达载体、细胞内抗 体、肽和小分子。本领域普通技术人员将会理解，基于本文提供的公开内容，减少负性免疫 调节因子如细胞中的细胞因子信号传导调节因子的mRNA和/或蛋白质水平的一个 方法是通过降低或者抑制编码所述调节因子的核酸的表达。因此，细胞中的所述 负性免疫调节因子的蛋白质水平也可以利用抑制或者降低基因表达的分子或者化 合物——如反义分子或者核酶加以降低。在优选的实施方式中，调节序列是通过质粒载体表达的反义核酸序列。所 述反义表达载体被用于转染哺乳动物细胞或者哺乳动物本身，由此造成所述期望 的负性免疫调节因子内源表达减少。然而，本发明不应该被解释为被限于通过用 反义分子转染细胞以抑制负性免疫调节因子的表达。相反，本发明包括本领域已 知的抑制细胞中蛋白质的表达或者活性的其它方法，包括，但不限于使用核酶、 表达非功能性负性免疫调节因了(即反式显性负突变体)和使用细胞内抗体。
反义分子和其抑制基因表达的用途已经被本领域所熟知(见，如Cohen, 1989， 在Oligodeoxyribonucleotides， Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press)。 反义核酸分子是互补的DNA或者RNA分子，正如本术语在本文的其它地方被定 义，与至少部分的特定mRNA分子互补(Weintraub， 19卯，Scientific American 262:40)。在细胞中，反义核酸分子杂交到相应的mRNA，形成双链分子，由此抑 制基因的翻译。使用反义方法抑制基因的翻译被本领域所知，并且如在Marcus-Sakura (1988， Anal. Biochem. 172:289)中被描述。这样的反义分子可以通过Inoue, 1993，美 国专利号5,190,931所教导的使用编码反义分子的DNA进行的基因表达被提供给 所述细胞。可选地，本发明的反义分子可以合成制备，接着提供给细胞。大约10到大 约30之间和更优选的大约15个核苷酸的反义寡聚物是优选的，因为它们容易合 成和导入到耙细胞中。本发明考虑的合成的反义分子包括本领域已知的寡核苷酸 衍生物，其与未修饰的寡核苷酸相比，具有提高的生物学活性(见美国专利号5，023，243)。核酶及其抑制基因表达的用途也为本领域所熟知(见如，Cech等人，1992, J. Biol. Chem. 267:17479-17482; Hampel等人，1989, Biochemistry 28:4929-4933; Eckstein等人，国际公丌号WO 92/07065; Altaian等人，美国专利号5,168,053)。
核酶是这样的RNA分子，其具有以类似于DNA限制性内切核酸酶的方式特异性 裂解其它单链RNA的能力。通过修饰编码这些RNAs的核酸序列，分子可以被设 计以识别RNA分子中特定的核酸序列并切割它(Cech， 1988， J. Amer. Med. Assn. 260:3030)。这个方法的主要优点是核酶是序列特异性的事实。
存在两种基本类型的核酶，即，四膜虫属类型(Hassdhoff, 1988, Nature 334:585)和綞头型。四膜虫属型的核酶识别长度为四个碱基的序列，而锤头型核酶 识别长度为11-18个碱基的序列。序列越长，所述序列在靶mRNA种中唯一发生 的可能性越大。结果，锤头型核酶比四膜虫型核酶用于失活特异性的mRNA种更 优选，并且18碱基的识别序列比可以在各种非相关mRNA分子中随机存在的更短 序列更优选。对抑制负性免疫调节因子的表达有用的核酶可以通过将靶序列整合到基本 的核酶结构中被设计，所述靶序列与期望的负性免疫调节因子的mRNA序列互补。 靶向期望的负性免疫调节因子的核酶可以利用商业购买的试齐U(AppUedBiosystems, Inc., Foster City, CA)合成，或者它们可以从编码它们的DNA进行基因表达。
在本发明的另一个方面，所述负性免疫调节因子可以通过失活和/或隔绝所 述期望的负性免疫调节因子被抑制。这样，抑制所述负性免疫调节因子的作用可 以通过使用反式显性负突变体得以实现。可选地，可以使用对所述期望的负性免 疫调节因子特异性的细胞内抗体，或者被称为所述负性免疫调节因子的拮抗物。 在一个实施方式中，所述拮抗物是具有同所述负性免疫调节因子的结合配体相互 作用的期望性质并且由此同相应的野生型负性免疫调节因子竞争的蛋白质/或者化 合物。在另一个实施方式中，所述拮抗物是具有同所述负性免疫调节因子相互作 用的期望性质并由此隔绝所述负性免疫调节因子的蛋白质/或者化合物。
小干扰RNA (siRNA)小千扰RNA (siRNA)是包括一组靶向感兴趣基因或者多核苷酸的核苷酸的 RNA分子。如本文所用，术语"siRNA"包括所有形式的siRNA，其包括但不限 于(i)双链RNA多核苷酸、(ii)单链多核苷酸和(iii)(i)或者(ii)的多核苷酸，其中这样 的多核苷酸在其中具有一个、两个、三个、四个或者更多的核苷酸变更或者取代。
双链多核苷酸形式的siRNA包括长度为大约18个碱基对、大约19个碱基 对、大约20个碱基对、大约21个碱基对、大约22个碱基对、大约23个碱基对、 大约24个碱基对、大约25个碱基对、大约26个碱基对、大约27个碱基对、大 约28个碱基对、大约29个碱基对或者大约30个碱基对。所述双链siRNA能够干
35扰负性免疫调节因子的表达和/或者活性。单链siRNA包括靶向感兴趣基因或者多核苷酸的部分RNA多核苷酸序列。 单链siRNA包括长度为大约18个碱基对、大约19个碱基对、大约20个碱基对、 大约21个碱基对、大约22个碱基对、大约23个碱基对、大约24个碱基对、大 约25个碱基对、大约26个碱基对、大约27个碱基对、大约28个碱基对、大约 29个碱基对或者大约30个碱基对的多核苷酸。所述单链siRNA能够千扰如下的 靶多核苷酸的表达禾l]/或者活性A20、SUMO (SUMOl, SUM02， SUM03, SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l，Twist-2)、 SOCS(SOCSl， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5，SOCS6， SOCS7和CIS)、PIAS (PIAS1 ，PIAS3，PIASx和PJASy)、SHP(SHP-l 和SHP-2)等。所述单链siRNA也能够复性为互补序列，生成能够干涉负性免疫调 节因子的表达和/或者活性的dsRNA。在另一个方面，所述siRNA包括多核苷酸，所述多核苷酸包括双链或者单 链多核苷酸，其中所述siRNA在其序列上具有一个、两个、三个、四个或者更多 的核苷酸变更或者取代。 siRNA多核苷酸是一般认为通过转录后基因沉默机制干扰RNA活性的RNA 核酸分子。siRNA多核苷酸优选地包括双链RNA(dsRNA)，但不旨在如此地被限 定，和可以包括单链RNA(见，如Martinez等人，2002 Celll 10:563-74)。本发明包 括的siRNA多核苷酸可以包括其它天然存在的、重组的或者如本文所提供的合成 单链或者双链的核苷酸多聚体(核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者两者的结合)， 和/或者核苷酸类似物的多聚体(如，通常5'到3'磷酸二酯键的寡核苷酸或者多核苷 酸等)。因此，将会被理解的是，某些在此作为DNA序列公开的、能够引导所述 siRNA多核苷酸转录的代表性序列，鉴T已为公众接受的互补的碱基配对原则， 也可以被用于描述所述相应的RNA序列和它们的互补体。也可以使用含有用于RNA聚合酶启动子的启动子的DNA(基因组的，cDNA 或者合成的)作为模板转录siRNA。例如，所述启动子可以是U6启动子或者HlRNA 聚合酶III启动子。可选地，所述siRNA可以是合成来源的RNA分子。在某些实 施方式中，siRNA多核苷酸可以具有平端。在某些其它的实施方式中，所述siRNA 多核苷酸的至少一条链具有至少一个，优选地两个核苷酸"突出(overhang)"(即， 与相对链的互补碱基不进行碱基配对)在所述siRNA多核苷酸的任一条链的3'端。 在本发明的优选实施方式中，所述siRNA多核苷酸双链体的每个链在3'端具有两 个核苷酸的突出端。所述两个核苷酸的突出端优选地是胸苷二核苷酸(TT)，但也可 以包括其它碱基，例如TC二核苷酸或者TG二核苷酸，或者任何其它二核苷酸。 所述突出的二核苷酸也可以与被靶向以用于干扰的多核苷酸序列5'端的两个核苷 酸互补。关于siRNA多核苷酸3'端的论述见如WO 01/75164。
优选的siRNA多核苷酸包括双链的大约18-30个核苷酸碱基对的多核苷酸， 优选地，大约18、大约19、大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约
3625、大约26或者大约27个碱基对，在其它优选的实施方式中，大约19、大约20、 大约21、大约22或者大约23个碱基对、或者大约27个碱基对，由此，使用"大 约"表明，在某些实施方式中和在某些条件下，加工切割歩骤——其可以产生能 够干扰所选择的多肽的表达的功能性siRNA多核苷酸，可能不是绝对有效。因此， siRNA多核苷酸可以包括一个或者多个siRNA多核苷酸分子，这些siRNA多核苷 酸分子在长度上可以有一个、两个、三个、四个或者更多碱基对的不同(如，通过 核苷酸插入或者缺失)，这是由于加工、生物合成或者人工合成siRNA的变异性所 致。本发明的siRNA多核苷酸也可以包括通过与特定序列有一个、两个、三个或 者四个核苷酸不同(如，通过包括转换或者颠换的核苷酸取代)而表现出变异性的多 核苷酸序列。这些不同可以发生在特定siRNA多核苷酸序列的任何核苷酸位置， 这取决于分子的长度，不管其位于双链多核苷酸的有义链或者反义链上。所述核 苷酸的差异可以在双链的多核苷酸的一条链上发现，其中取代核苷酸将与其通常 形成氢键碱基对的互补核苷酸可不必相应地被取代。在优选的实施方式中，就具 体的核苷酸序列而言，siRNA多核苷酸是均质的。包括本发明的所述siRNA多核苷酸的多核苷酸在一些实施方式中可以来自 单链多核苷酸，所述单链多核苷酸包括单链的寡核苷酸片段(如，大约18-30个核 苷酸)和典型地被间隔序列分开的其反向互补链。根据某些这样的实施方式，间隔 区的裂解提供了单链寡核苷酸片段和其反向互补链，这样，任选地利用可以造成 从任一条链或者两条链的3'端和/或5'端添加或者除去一个、两个、三个或者更多 核苷酸的附加加工歩骤，它们可以退火复性形成本发明的双链siRNA多核苷酸。 在一些实施方式中，所述间隔区是这样的长度，其允许片段和其反向互补链退火 并形成双链结构(如，类似发夹型多核苷酸)，然后再进行间隔区裂解，和江选地随 后进行可以造成从任一条链或者两条链的3'端和/或5'端添加或者除去一个、两个、 三个、四个或者更多核苷酸的加工步骤。因此，间隔区序列可以是本文所提供的 任何多核苷酸序列，其位于两条互补的多核苷酸序列区域之间，所述互补的多核 苷酸序列区域，当退火为双链核酸时，生成siRNA多核苷酸。优选地，所述间隔 区序列包括至少4个核苷酸。在一些实施方式中，所述间隔区可以包括5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21-25、 26-30、 31-40、 41-50、 51-70、 71-90、 91-110、 111-150、 151-200个或者更多的核苷酸。来自包括 由间隔区隔开的两个互补核苷酸序列的单核苷酸链的siRNA多核苷酸的例子已经 被描述(如，Brummelkamp等人，2002 Science 296:550; Paddison等人，2002 Genes Develop. 16:948; Paul等人，2002 Nat. Biotechnol. 20:505-508; Grabarek等人，2003 BioTechniques 34:734-44)。多核苷酸变体可以含有一个或者多个取代、添加、缺失和/或者插入，使得 siRNA多核苷酸活性基本不降低。核苷酸内容的任何这样的变更对所述siRNA多 核苷酸活性的影响一般可以根据本文其它地方的描述进行评价。变体与编码下列天然物质的多核苷酸序列的一部分优选地显示至少大约75%, 78%, 80%, 85%， 87%， 88%或者89%的同一性，以及更优选地显示至少大约卯％， 92%, 95%, 96%或者97% 的同一性A20、 SUMO (SUM01, SUM02, SUM03, SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l,Twist-2)、 SOCS (SOCS1 ， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5, SOCS6, SOCS7禾卩CIS)、 PIAS (PIAS1， PIAS3' PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2) 等。通过使用本领域普通技术人员熟知的任何方法，包括计算机算法，比较多核 苷酸序列与靶多核苷酸的相应部分，可以容易确定同一性百分比。这些包括比对 (Align)或者BLAST算法(Altschul， 1991 J. Mol. Biol. 219:555-565; Henikoff和 Henikoff， 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919)。某些siRNA多核苷酸变体可以与编码靶多肽的多核苷酸的一部分基本同 源。来自这些多核苷酸变体的单链多核苷酸能够在中等严格条件下杂交到编码靶 多肽的自然存在的DNA或者RNA序列。在中等严格条件下可检测地杂交到编码 靶多肽的多核苷酸序列的siRNA多核苷酸可以具有这样的核苷酸序列，其包括与 特定的靶多核苷酸互补的至少IO个连续核苷酸，更优选地ll、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或者30个连续核苷 酸。在一些优选的实施方式中，这样的siRNA序列(或者其互补序列)对编码期望 干扰表达的耙多肽的单个特定多核苷酸是唯一的。一些其它的实施方式中，序列(或 者其互补链)可以被编码期望干扰多肽表达的靶多肽的两个或者更多的相关多核苷 酸共有。合适的中等严格条件包括，例如，在5XSSC，0.5y。SDS, 1.0mMEDTA(pH 8.0)溶液中预洗多核苷酸；在50°C-70°C下、在5X SSC中杂交所述多核苷酸1-16 小时(如，过夜)；接着用含有0.05-0.1% SDS的2X、 0.5X和0.2X SSC的一种或者 多种在22-65。C漂洗所述多核苷酸一次或者两次20-40分钟。对附加的严紧性，杂 交条件可以包括在0.1X SSC和0.1% SDS中在50-60°C下另外漂洗15-40分钟。本 领域普通技术人员将会理解，杂交条件严紧性的变化可以通过改变用于所述预杂 交、杂交和漂洗步骤的时间、温度和/或者溶液浓度获得。合适的条件也可以部分 取决于所用探针的具体核苷酸序列和印迹的、先证者核酸样品的具体核苷酸序列。 因此，将会被理解的是，当所述多核苷酸的期望选择性被鉴定时，基于其与一个 或者多个某些先证者序列杂交而与某些其它先证者序列不杂交的能力，合适的严 格条件可以容易地进行选择，而不需要过多的实验。可以利用几个标准的一个或者多个设计本发明的序列特异性siRNA多核苷 酸。例如，为了设计具有大约21个连续核苷酸与编码感兴趣多肽的序列同一的 siRNA多核苷酸，可以对所述多核苷酸序列的开放阅读框进行具有下列一个或者 多个特征的大约21碱基序列长度的扫描(1) A+T/G+C之比为大约1:1但不超过 2:1或者1:2; (2)在5'端具有AA 二核苷酸或者CA 二核苷酸；(3)内部发夹环，其 解链温度小于55°C; (4)同源二聚体解链温度小于37。C(使用本领域普通技术人员
38已知的计算机软件可以确定(3沐(4)中所描述的解链温度的计算)；(5)至少16个连 续核苷酸的序列，其未被鉴定存在于任何其它己知的多核苷酸序列中。可选地， 使用从不同的卖主，如OligoEngine.TM. (Seattle, Wash.); Dharmacon， Inc. (Lafayette, Colo.); Ambion Inc. (Austin, Tex.)和QIAGEN， Inc. (Valencia, Calif,)商业购买的计算 机软件可以设计和选择siRNA多核苷酸序列。也可以见Elbashir等人，2000 Genes & Development 15:188-200; Elbashir r等人，2001 Nature 411:494-98。然后，根据本 领域已知的和本文其它地方描述的方法，可以测试所述siRNA多核苷酸干扰靶多 肽表达的能力。对siRNA多核苷酸的效力的确定包括，不仅要考虑其干涉靶多肽 的表达的能力，而且也要考虑所述siRNA多核苷酸是否对宿主细胞有毒。例如， 期望的siRNA将具有RNA千扰活性并也将不表现山不需要的生物学后果。不需耍 的生物学后果的例子是，山于所述siRNA被导入宿主细胞导致不期望的细胞死亡 的细胞程序性死亡。基于本公开内容，应该理解的是，本发明的所述siRNA可以不同程度地实 现所述靶多肽表达的沉默。因此必须首先检验所述siRNA的效力。基于给定siRNA 干扰或者调节靶多肽表达的能力，由此做出siRNA选择。因此鉴别能够千扰期望 靶多肽表达的具体siRNA多核苷酸需要产生和测试各siRNA。测试各siRNA和选 择合适的siRNAs用于本发明的方法在本文的实施例中被充分阐明。因为并不是干 扰蛋白质表达的所有siRNA将具有生理上的重要作用，因此本公开内容也提出了 各种生理上相关的分析，用于确定用本发明的siRNAs干扰靶蛋白表达的水平是否 具有临床上相关的意义。本领域普通技术人员将会容易理解，作为遗传密码简并的结果，许多不同 的核苷酸序列可以编码相同的多肽。即，氨基酸可以被几个不同的密码子中的一 个编码，并且本领域的普通技术人员可以容易确定，虽然一个特定的核苷酸序列 可以与另一个不同，但多核苷酸可以实际上编码含有相同氨基酸序列的多肽。因 此，由于密码子使用的不同而不同的多核苷酸是本发明特别考虑的。
所述siRNA的多核苷酸可以利用用于制备特别期望siRNA多核苷酸的各种 技术的任一种制备。例如，多核苷酸可以从用合适的细胞或者组织类型制备的 cDNA扩增。这样的多核苷酸可以通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction)(PCR)扩增。利用这个方法，基于本文提供的序列，设计序列特异性的引 物，也可以购买或者直接合成。使用公知的技术，引物扩增部分可以被用于从合 适的DNA文库中分离全长基因或者其期望部分。利用一个或者多个多核苷酸探针 或者适合用于扩增的引物，筛选文库(cDNA的或者基因组的)。优选地，对所述文 库进行大小选择以包括更大的多核苷酸序列。也可以优选随机引物文库，以鉴定 基因的5'和其它上游区域。为了获得内含子和延伸5'序列，优选基因组文库。本发 明考虑的siRNA多核苷酸也可以选自siRNA多核苷酸序列文库。
对于杂交技术，部分多核苷酸序列可以通过公知的技术被标记(如，通过切
39口平移或者用"P末端标记)。接着通过用标记的探针与含有变性的细菌克隆(或者 含有噬菌斑的菌苔)的滤膜杂交，筛选细菌或者噬菌体文库(见，如Sambrook等人， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y.， 2001)。选择并扩增杂交的克隆或者噬斑，分离DNA用于进一 歩的分析。可选地，本领域已知许多用于从部分cDNA序列获得全长编码序列的扩增 技术。在这些技术中，扩增一般通过PCR进行。 一种这样的技术被称为"cDNA 末端的快速扩增(rapid amplification of cDNA ends )"或者RACE(见，如，Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)。本文包括的实施例、附图和序列表中，提供了多个用于千涉靶多核苷酸表 达的具体siRNA多核苷酸序列。siRNA多核苷酸一般可以通过本领域已知的任何 方法制备，包括例如固相化学合成。利用标准的诱变技术如寡核苷酸定点特异性 诱变，也可以在多核苷酸序列中引入修饰。而且，siRNA可被化学修饰或者与其 它分子偶联以改善其稳定性和/或者释放性质。本发明的一方面包括本文所述的 siRNA，其中一种或者多种核糖己经从中去除。可选地，siRNA多核苷酸分子可以通过体外或者体内转录合适的DNA序列 (如，编码靶多肽的多核苷酸序列或者其期望部分)产生，只要将所述DNA用合适 的RNA聚合酶启动子(如，例如T7、 U6、 HI或者SP6，但是同样可以使用其它的 启动子)整合到载体中。另外，可以给予哺乳动物siRNA多核苷酸，其可以是支持 转录(和任选地，合适的加工步骤)的DNA序列(如，本文提供的重组核酸构建物)， 以使体内产生期望的siRNA"在一个实施方式中，siRNA多核苷酸，其中所述siRNA多核苷酸能够干涉 靶多肽的表达，可以被用于产生沉默的细胞。当与生物源接触一段时间后，导致 靶多肽的表达显著减少的任何siRNA多核苷酸包括在本发明中。相对于在所述 siRNA不存在时检测到的靶多肽的表达水平，优选地所述减少超过大约10%，更 优选地超过大约20%,更优选地超过大约30%，更优选地超过大约40%，大约50%, 大约60%，大约70%,大约75%，大约80%，大约85%，大约90%，大约95%或 大约98%。优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何非期 望的毒害效应，如，细胞凋亡或者细胞死亡，其中凋亡不是RNA干扰的期望效应。
在另一个实施方式中，所述siRNA多核苷酸当与生物源接触一段时间后， 导致耙多肽的表达显著地减少。相对于在所述siRNA不存在时检测到的靶多肽的 表达水平，优选地所述减少为大约10%-20%，更优选地大约20%-30%，更优选地 大约30%-40%，更优选地大约40%-50%，更优选地大约50%-60%，更优选地大约 60%-70%，更优选地大约70%-80%,更优选地大约80%-90%,更优选地大约 90%-95%，更优选地大约95%-98%。优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何非期望的毒害效应。在另一个实施方式中，所述siRNA多核苷酸当与生物源接触一段时问后， 导致靶多肽的表达显著地减少。相对于在所述siRNA不存在时检测到的靶多肽的 表达水平，优选地所述减少为大约10%或以上，更优选地大约20%或以上，更优 选地大约30%或以上，更优选地大约40。/。或以上，更优选地大约50%或以上，更 优选地大约60%或以上，更优选地大约70%或以上，更优选地大约80%或以上， 更优选地大约90%或以上，更优选地大约95%或以上，更优选地大约98%或以上。 优选地，siRNA多核苷酸在细胞中的存在没有产生或者造成任何非期望的毒害效 应。同样地，本发明包括si脂A多核苷酸，如在SEQ ID NOs: 1-3、 21-23和28-57 中示例的siRNA。 SEQ 1D N0s:1-3和21-23分别是鼠和人siRNA的SOCS1候选序 列的序列。SEQIDNOs:28-33、 34-39、 40-45、 46-51和52-57分别是用于PIAS1、 PIAS3、 PIASx、 PIASy和SHP-1的人siRNA候选序列的序列。图30描述了所述 siRNA序列。本发明包括的其它siRNA序列包括小鼠A20 siRNA : 5，-CAAAGCACUUAUUGACAGA-3，， SEQ ID NO:58;小鼠SUMO-1 siRNA: 5，-GAUGUGAUUGAAGUUUAUC-3， ， SEQ ID NO:59;小鼠Foxjl siRNA: 5'-AGAUCACUCUGUCGGCCAU-3'， SEQ ID NO:60;和小鼠Twist-2 siRNA: 5，-GCGACGAGAUGGACAAUAA-3' ， SEQ ID NO: 61 (Twist-2 siRNA 1)禾口 5，-CAAGAAAUCGAGCGAAGAU-3，， SEQ ID NO: 62 (Twist-2 siRNA2)。
在另一个方面，本发明包括靶向期望的负性免疫调节因子的siRNA多核苷 酸。优选地，所述siRNA靶向选白以下的负性免疫调节因子A20、 SUMO (SUMOl， SUM02, SUM03， SUM04)、 Twist-l、 Twist-2、 Foxjl、 Foxo3a和它们的变体。A20、 SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04、 Twist-l 、 Twist-2、 Foxjl和Foxo3a的靶向 序列的例子分别在SEQIDNOs:63-84、 85-92、 93-105、 106-112、 113-128、 129-136、 137-149、 150-161和162-185中进行了示例。这些siRNA靶向序列的序列被描述 在图53中。各种负性免疫调节因子的多核苷酸和多肽的序列可以在本领域普通技术人 员所知的计算机化数据库中发现。 一个这样的数据库是National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept数据库。利用本文公开的技术或 者本领域普通技术人员知道的任何技术(如，Sambrook等人，2001)，这些己知基 因的核酸序列可以被扩增、与本文公开的序列结合(如，连接)和/或者表达。虽 然核酸序列可以在体外表达系统中表达，但是在优选的实施方式中，所述核酸序 列包括用于体内复制和/或者表达的载体。
siRNA的修饰
本发明的所述siRNA多核苷酸产生后，普通技术人员将会理解，所述siRNA 多核苷酸将会具有某些特征，这些特征可以被修饰以改进作为治疗化合物的 siRNA。因此，可以通过将其修饰为包括硫代磷酸酯或者其它的键、甲基膦酸酯、 砜、硫酸酯、羰游基、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯等，进一歩设计所述 siRNA多核苷酸，以抵抗降解(见，如Agrwal等人，1987 Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Stec等人，1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody等人，1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100; Stein, In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed.， Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989))。本发明的任何多核苷酸可以被进一歩修饰以增加其体内稳定性。可能的修 饰包括但不限于，增加5邻域者3'端的侧翼序列；利用骨架上的硫代磷酸或者2' O-甲基而不是磷酸二酯键；和/或者包含非常规碱基如肌苷、Q核苷(queosine)和怀丁 苷等，以及腺嘌呤、胞苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷的乙酰基修饰形式、甲基修 饰形式、硫代修饰形式和其它修饰形式。
载体在其它相关的方面，本发明包括编码抑制因子的分离核酸，其中，所述抑 制因子优选地是siRNA，其抑制负性免疫调节因子，可操作地连接到包括启动子/ 调节序列的核酸上，这样所述核酸优选地能够指导所述核酸编码的蛋白质的表达。 因此，本发明包括用于将外源DNA引入到细胞中的表达载体和方法，在该细胞中 同时表达外源DNA，如Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Old Spring Harbor Laboratory, New York)禾口 Ausubel等人(1997' Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)所述。
在另一个方面，本发明包括包含siRNA多核苷酸的载体。优选地，所述 siRNA多核苷酸能够抑制耙多肽的表达，其中所述靶多肽选自A20、SUMO(SUMO1, SUM02, SUM03禾tl SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l,Twist-2)、 SOCS (SOCSI， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7禾卩CIS)、 PIAS(PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)或者它们任意的结合。将期望的 多核苷酸整合到载体和载体的选择为本领域公知，如Sambrook等人，见上述和 Ausubel等人，见上述所述。 siRNA多核苷酸可以克隆到多种类型的载体中。然而，本发明不应该被解 释为被任何特定的载体所限定。相反，本发明应该被解释为包括大量的、容易获 得和/或者本领域公知的载体。例如，本发明的siRNA多核苷酸可以被克隆到包括 但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒的载体中。特别感兴趣 的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
在具体的实施方式中，所述表达载体选自病毒载体、细菌载体和哺乳动物细胞载体。存在许多表达载体系统包括至少部分或全部上述组合物。基于原核生 物和/或者真核生物载体的系统可以在本发明中使用以产生多核苷酸或者其关联多 肽。许多这样的系统可以从商业上和广泛地获得。而且，所述表达载体可以以病毒载休的形式被提供给细胞。病毒载体技术 为本领域公知并被描述，如在Sambrook等人(2001)和在Ausubel等人(1997)以及在 其它的病毒学和分子生物学手册中。可以用作载体的病毒包括但不限于，逆转录 病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。 一般地，合适的载体包含在至 少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一 个或者多个可选择标记(见，如WO 01/96584; WO 01/29058;和美国专利号 6,326,193)。为了表达所述siRNA，每个启动子中至少有一个组件起着定位RNA合成的 起始位点的作用。其最著名的例子是TATA盒，但在一些缺少TATA盒的启动子中， 如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40基因的启动子，覆盖起始 位点的单独元件本身有助于固定起始位置。附加的启动子元件，即增强子，调节转录起始的频率。通常，这些元件位 于所述起始位点上游30-110 bp区域，但最近也已经显示许多启动子含有位于所述 起始位点下游的功能性元件。启动子元件之间的间距通常是柔性的，这样当元件 相对于另一个反向或者移动时，能够保持启动子的功能。在胸腺嘧啶激酶(tk)启动 子中，启动子元件之间的间距可以增加到50bp，其活性才开始下降。取决于启动 子，各个元件似乎可以协同或者独立地起着激活转录的作用。
启动子可以是一个自然地与基因或者多核苷酸序列相连的启动子，其可以 通过分离位于编码段和/或外显子的上游的5'非编码序列获得。这样的启动子可被 称为"内源的"。同样，增强子可以是一个自然地与多核苷酸序列相连的启动子， 其位于所述序列的上游或者下游。可选地，通过将编码的多核苷酸片段置于受重 组或者异源启动子的控制下，将获得一些益处，重组或者异源启动子指在其自然 环境下通常不与多核苷酸序列相连的启动子。重组或者异源的增强子也指在自然 环境下通常不与多核苷酸序列相连的增强子。这样的启动子或者增强子可以包括 其他基因的启动子或者增强子，和从任何其它原核生物、病毒或者真核细胞分离 的启动子或者增强子，以及非"天然存在的(naturally occurring)"启动子或者增 强子，即，含有不同转录调控区域的不同元件和/或者改变表达的突变。除了合成 产生启动子和增强子的核酸序列外，可以利用重组克隆和/或者包括PCRtm的核酸 扩增技术，与本文公开的组合物结合，产生序列(美国专利4,683,202,美国专利 5,928,906)。而且，也考虑可以使用指导无核细胞器如线粒体、叶绿体和类似物内 的序列转录和/或者表达的调控序列。自然地，利用对所选用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中的DNA片段 的表达进行有效地指引的启动子和/或者增强子是重要的。分子生物学领域的普通
43技术人员一般知道如何使用启动子、增强子和细胞类型的结合，进行蛋白表达， 例如见Sambrook等人(2001)。所利用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、 诱导型的和/或在合适的条件下可用于指导引入的DNA片段高水平表达的，这样 对大规模产生重组蛋白和/或者肽是有利的。所述启动子可以是异源的或者内源的。
在本文提供的实验实例中示例的启动子序列是立即早期巨细胞病毒(CMV) 启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，其能够驱动可操作地与之 连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其它组成型启动子序 列，包括但不限于，猴病毒40(simian virus 40， SV40)早期启动子、鼠乳腺肿瘤病 毒(MMTV) (mouse mammary tumor virus)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR) 启动子、Moloney病毒启动子、禽白血病病毒(avian leukemia virus)启动子、爱泼斯 坦-巴尔病毒立即早期启动子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、 Rous肉 瘤病毒(Rous sarcoma vims)启动子，以及人基因启动子，例如但不限于，肌动蛋白 启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌肉肌酸(musclecreatine)启动子。而 且本发明不应被限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑为本发明的部分。 本发明的诱导型启动子的使用提供了分子开关，当需要这样的表达时，其能够打 开与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者当表达不期望吋，关闭表达。 诱导型启动子的例子包括但不限于，金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质 激素(glucocorticoid)启动子、孕酮(progesterone)启动子和四环素(tetracycline)启动 子。进一步，本发明包括使用只在期望组织中有活性的组织特异性启动子。组织 特异性的启动子为本领域所公知，包括但不限于HER-2启动子和PSA相关的启动 子序列。为了评价所述siRNA的表达，引入到细胞的表达载体也可以含有选择标记 基因或者报告基因或者两者，以利于从试图通过病毒载体转染或者侵染的细胞群 中鉴定和选择表达细胞。在其它的实施方式中，选择标记可以被携带在单独的DNA 片段上并用于共转染程序。选择标记和报告基因可以位于合适的调节序列的侧翼， 以能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记在本领域已知，包括，例如抗生素抗 性基因，如neo和类似物。报告基因被用于鉴定潜在地转染的细胞和评价调节序列的功能性。编码容 易分析的蛋白的报告基因被本领域公知。 一般地，报告基因是在受体生物体或者 组织中不存在或不表达的基因，其编码通过一些容易检测的性质如酶活性显示其 表达的蛋白。在将DNA导入受体细胞后的合适时间，分析报告基因的表达。
合适的报告基因可以包括编码荧光素酶(luciferase)、 /3-半乳糖苷酶 (beta-galactosidase)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase)、分泌型 碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase)的基因，或者绿色荧光蛋白基因(见，如 Ui-Td等人，2000 FEBS Lett. 479:79-82)。合适的表达系统已经公知并且可以利用 公知的技术制备或者商业获得。利用单一的内部限制性位点或者通过非单一限制
44性位点的部分消化，可以产生内部缺失的构建物。接着，将构建物转染到显示高 水平siRNA多核苷酸和/或者多肽表达的细胞中。 一般地，显示报告基因最高表达 水平的含有最小5'侧翼区的构建物被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以被连接 到报告基因上，并用于评价试剂调控启动子驱动的转录的能力。
沉默免疫细胞的产生在一个实施方式中，本发明提供了用于在细胞中表达负性免疫调节因子抑 制因子的细胞基系统。所述细胞基系统指"沉默的细胞"，包括用于表达抑制因子 的细胞和表达载体。然而，本发明不应该被限定为包括表达载体的细胞，相反， 本发明的沉默细胞应该被解释为包括用本发明的任何类型的抑制因子，即化学合 成的siRNA修饰的细胞。在任何情况下，包括所述抑制因子的所述沉默的细胞同 其它未用所述抑制因子如此沉默的相同细胞相比，具有增加的免疫效能。所述沉 默的细胞适合单独或者结合其它治疗给予哺乳动物受体。本发明包括含有负性免疫调节因子抑制因子的细胞。在一方面，所述抑制 因子能够抑制以下的至少一种A20、 SUMO (SUMOl， SUM02, SUM03禾口 SUM04)、 Foxjl 、 Foxo3a、 TWIST(Twist陽l，Twist-2)、 SOCS (S0CS1 ， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6， SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1， PIAS3， PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)等。在一方面，所述细胞可以用包括编码抑制因子的多核苷 酸的载体转染。所述多核苷酸不需要被整合到细胞中。在另一个方面，所述细胞 根本不需要用载体转染，相反，将所述细胞暴露于不是由载体表达的抑制因子中。 这样的抑制因子的一个例子是化学合成的siRNA。在表达载体的情况下，所述载体通过木领域任何已知的方法可以容易她导 入到宿主细胞如哺乳动物、细菌、酵母或者昆虫中。例如，所述表达载体通过物 理的、化学的或者生物学的方法可以被转移到宿主细胞中。容易理解的是，包括 本发明的多核苷酸的表达载体的引入就负性免疫调节因子而言产生了沉默细胞。
将多核苷酸导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀(calcium phosphate precipitation)、月旨质转染(lipofection)、粒子轰击(partiele bombardment)、显微注射 (microinjection^电穿孔(electroporation)和类似方法。产生包括载体和/或者外源核 酸的细胞的方法为本领域公知。例如，见Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)禾口 Ausubel等人(1997， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)。
将感兴趣的多核苷酸导入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载 体。病毒载体尤其是逆转录病毒载体已经成为将基因插入到哺乳动物如人细胞中 的最广泛使用的方法。其它的病毒载体可以来自慢病毒、痘病毒(poxvirus)、疱疹 单纯性病毒I、腺病毒和腺相关病毒和类似物。例如，见美国专利号5，350，674和 5,585,362。
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将多核苷酸导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散体系(colloidal dispersion systems),如大分子复合物、纳米囊、微球体、珠子和脂质基系统，包括水包油乳 状液、微胶粒、混合的微胶粒和脂质体。用作体内和体外输送载体的优选的胶体 系统是脂质体(即，人工膜囊泡)。这样的系统的制备和使用为本领域公知。
不管使用什么方法将外源核酸导入宿主细胞或者以其它方式将细胞暴露于 本发明的抑制因子，为了确定重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种分 析。这样的分析包括，例如本领域普通技术人员公知的"分子生物学"分析，如 DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR;"生物化学"分析，如，例如通过 免疫学方法(ELISAs和蛋白质印迹法)或者本文所述的分析方法，检测具体肽的存 在或者不存在，以确定落入本发明范围内的剂。为了产生沉默的细胞，可以使用任何的DNA载体或者输送载体(delivery vehicle)以将期望的siRNA多核苷酸运输到体内或者体外的免疫细胞中。在使用 非病毒输送系统的情况下，优选的输送载体是脂质体。因此上述的输送系统和方 案可以在Gene Targeting Protocols, 2ed.， pp 1-35 (2002)禾Q Gene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, Murray ed.， pp 81-89 (1991)中发现。
脂质配方的使用被考虑，用于将本发明的负性免疫调节因子的抑制因子导 入宿主细胞(体外、先体外后体内或者体内)。在本发明的具体实施方式
中，所述抑 制因子可以与脂质连接。与脂质连接的抑制因子可以被包在脂质体的水相内部、 被散布在脂质体的脂双层、通过与脂质体和寡核苷酸连接的连接分子结合到脂质 体上、被夹带在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂的溶液中、与脂质混合、 与脂质结合、作为悬液包含在脂质中、包含或复合于微胶粒、或者以其它方式与 脂质连接。本发明的与脂质、脂质/siRNA或者脂质/表达载体相连的组合物不限于 溶液中的任何具体结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为微胶粒或者具 有"枬缩(collapsed)"结构。它们也可以仅仅被散布于溶液中，可能形成大小或 者形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或者合成的脂质。例如，脂质包括
在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及本领域普通技术人员公知的含有长链脂族烃
和它们的衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。磷脂可以用于制备本发明所述的脂质体并且可以携带净正、负或者中性电
荷。可以利用二乙酰磷酸酯将负电荷传递给所述脂质体，并且可以使用硬脂胺将
正电荷传递到所述脂质体上。所述脂质体可以由一种或者多种磷脂构成。带中性电荷的脂质可以包括不带电荷的脂质、基本不带电荷的脂质或者具
有同样数量的正和负电荷的脂质混合物。合适的磷脂包括本领域普通技术人员公
知的磷脂酰胆碱和其它物质。适合于本发明的用途的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻磷脂酰 胆碱(dimyristyl phosphatidylcholine)("DMPC")可以从Sigma, St. Louis, MO ChemicalCo.获得；联十六垸基磷酸酯(dicetyl phosphate) ("DCP")可以从K & K Laboratories (Plainview, NY)获得；胆固醇(cholesterol) ("Chol")可以从Calbiochem-Behring获得； 二肉豆蔻磷脂酰甘油(dimyristyl phosphatidylglycerol)("DMPG")和其它的脂质可以 从Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)获得。在氯仿或者氯仿/甲醇中的脂质 储备溶液可以贮存在大约-20。C。优选地，氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇 更容易挥发。自然来源的磷脂，如鸡蛋或者大豆的磷脂酰胆碱、脑磷脂酸、脑或者植物 的磷脂酰肌醇、心磷脂、和植物或者细菌的磷脂酰乙醇胺优选地不被用作主要的 磷脂，即，构成总磷脂组合物的50%或者更多，因为生成的脂质体不稳定和渗漏。
"脂质体"是总称，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体形成的各种单 层和多层脂质载体。脂质体其特征可以为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结 构。多层脂质体具有通过水介质隔开的多个脂质层。它们在磷脂悬浮于过多的水 溶液中时自发形成。脂质组分在形成封闭的结构前经过自我重排，并且在脂双层 之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat， 1991)。然而，本发明也包括在溶液 中具有同正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以具有微胶粒结构或 者仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。脂质转染胺-核酸复合体也被考虑。
磷脂当分散在水中时，能够形成不同于脂质体的多种结构，这取决于脂质 与水的摩尔比。在低比例时所述脂质体是优选的结构。脂质体的物理特征取决于 pH、离子强度和/或者二价阳离子的存在。脂质体能够对离子和/或极性物质显示低 的渗透性，但是在高温下历经显著改变其渗透性的相变。所述相变涉及从被称为 凝胶状态的紧密堆积有序结构变为被称为流体状态的松散堆积的有序度降低的结 构。这在特征相变温度下发生，并且Z或者导致对离子.糖和Z或药物的渗透性增加-
脂质体通过四个不同的机制与细胞相互作用通过网状内皮系统的吞噬细 胞如巨噬细胞和/或者嗜中性白细胞的胞吞作用；通过非特异性的弱疏水和/或静电 力、和/或通过与细胞表面组分特异性相互作用而吸附到细胞表面；通过将脂质体 的脂双层插入质膜与浆细胞膜融合，同时将脂质体内容物释放到细胞质中；和/或 者通过将脂质体的脂质运输到细胞和/或者亚细胞膜，和/或者反之亦然，而与脂质 体的内容物没有任何关联。改变脂质体的组成可以改变运行机制，尽管一个以上 的机制可同时运行。脂质体介导的寡核苷酸释放和外源DNA的体外表达已经很成功。Wong等 人(1980)显示了在培养的鸡胚胎细胞、Hela细胞和肝癌细胞中进行脂质体介导的外 源DNA释放和表达的可行性。Nicolau等人(1987)在大鼠中成功地完成了静脉注 射后的脂质体介导的基因转移。在本发明的一些实施方式中，所述脂质可以与日本血凝病毒 (hemagglutinating virus) (HVJ)结合。已经表明，这有助于与细胞膜融合并促进脂质 体封闭的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它的实施方式中，脂质可以与非
47组蛋白的核染色体蛋白(HMG-l)结合进行复合或者利用(Kato等人，1991)。在又进 一步的实施方式中，脂质可以与HVJ和HMG-1结合被复合或者利用。因为这样 的表达载体已经成功地被用于体外和体内的寡核苷酸的转移和表达，那么它们可 以用于本发明。在细菌启动子可以用于DNA构建的情况，也可以期望将合适的细 菌聚合酶包括在脂质体内。本发明所用的脂质体可以通过不同的方法制备。脂质体的大小取决于合成 方法变化。悬浮在水溶液中的脂质体一般为球形小泡状，具有一层或者多层含脂 双层分子的同心层。每层由平行排列的以结构式XY表示的分子构成，其中X是 亲水部分，Y是疏水部分。在水悬浮液中，同心层这样排列，使得亲水部分倾向 保持与水相接触，疏水部分倾向自缔合。例如，当水相在脂质体内和在脂质体外 都存在时，脂质分子可以形成排列XY-YX的双层，称为薄层(lamdla)。当一个 以上脂分子的亲水和疏水部分相互结合时，可以形成脂质聚集体。这些聚集体的 大小和形状取决于许多不同的变量，如溶剂的性质和溶液中其它化合物的存在。
本发明范围内的脂质体可以根据已知的实验技术制备。在一个优选的实施 方式中，脂质体通过在容器如玻璃梨形烧瓶中的溶剂中混合脂质体脂质制备。所 述容器应该具有比预期脂质体悬浮液体积大十倍的体积。使用旋转蒸发器，在大 约40。C和负压下将溶剂除去。所述溶剂通常在大约5分钟到2小时内除去，这取 决于所期望的脂质体体积。组合物可以在真空下干燥器中被进一歩干燥。干燥的 脂质通常大约一周后丢弃，因为其倾向于随时间而被破坏。可以在无菌、无致热原的水中，以大约25-50 mM的磷脂，通过震荡直至所 述脂质膜被重悬浮，水合干燥的脂质。接着将水脂质体分成等份，每份放在小瓶
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i" 'ul六丄i ■々、i ,ih-山工:jo在可选的实施方式中，脂质体可以根据其它已知的实验方法制备Bangham 等人(1965)的方法，其内容通过引用包含于此；如在Drug Carriers in Biology and Medicine, G. Gregoriadis ed. (1979) pp. 287-341所述的Gregoriadis方法，其内容通 过引用包含于此；Deamer和Uster， 1983方法，其内容通过引用包含于此；以及 Szoka和Papahadjopoulos， 1978所述的反相蒸发方法。上述的方法区别在于它们各 自的截留含水物质的能力和各自的含水空间与脂质的比例。上述制备的干燥脂质或者冻干脂质体可以被脱水和在抑制性肽的溶液中重 建，并用合适溶剂如DPBS稀释到合适的浓度。接着将混合物在旋涡混合器上剧 烈振荡。通过在29,000 xg下离心除去未封闭的核酸并洗涤脂质体沉淀。将洗涤的 脂质体重悬浮到合适的总磷脂浓度，如大约50-200 mM。封闭的核酸量可以根据 标准方法确定。
脂质体制剂中包封的核酸量确定后，脂质体可以被稀释到合适的浓度并在使用前 贮存在4°C。活化的(脉冲的)免疫细胞的产生本发明包括已经暴露于抗原或者另外地用抗原"脉冲"并被抗原活化的细 胞。例如，APC可以通过在抗原存在下先体外后体内培养在体外负载Ag，或者通 过暴露于抗原在体内负载Ag。本领域普通技术人员会容易理解，APC可以以这样的方式被"脉冲"—— 将所述APC暴露于抗原一段时间，足以促进该抗原在APC表面的呈递。例如， APC可以被暴露于被称为抗原肽的小肽片段形式的抗原中，所述抗原肽被直接脉 冲到APC的外面(Mehta-Damani等人，994);或者将APCs与全蛋白或者蛋白颗 粒温育，这些蛋白接着被APC摄取。这些全蛋白被APC消化为小的肽段，并且最 后被运输和呈递到APC表面(Cohen等，1994)。肽形式的抗原可以通过本文所述的 标准"脉冲"技术暴露于细胞中。不希望束缚于任何具体的理论，外来或者自身抗原形式的抗原通过本发明 的APC加工，以保留抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原形式意味着通过碎裂加 工抗原，以产生可以被免疫细胞识别并刺激免疫细胞如T细胞的抗原形式。优选 地，这样的外来或者自身抗原是通过APC被加工成肽的蛋白。通过APC产生的相 关肽可以被提取和纯化，以用作免疫原性组合物。通过APC加工的肽也可以被用 于诱导对通过APC加工的蛋白质的耐受性。相信，自身免疫性疾病是由于针对"自身蛋白(self-protein)"的免疫应答， 自身蛋白另外也称为自身抗原，即，个体中存在的或者内源性的自身抗原。在自 身免疫性应答中，这些"自身蛋白"被呈递到T细胞，这导致所述T细胞"自反 应(self-reactive)"。根据本发明所述的方法，用抗原脉冲APC以产生相关的"自
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度多态的并且每个个体的MHC分子可能结合不同的肽片段。然后，所述"自身肽" 和细胞因子信号传导抑制因子的激动剂可以被用来设计竞争性肽或者在需要治疗 的个体中诱导对自身蛋白的耐受性。本发明的抗原活化的APC，另外被称为"脉冲的APC"，通过在体外或者 体内将所述APC暴露于抗原而产生。在APC被体外脉冲的情况下，将所述APC 铺板在培养皿上，并且以足够的量和足够的时间暴露于抗原，以允许抗原与所述 APC结合。实现抗原与APC结合所需要的量和时间可以通过利用本领域己知的或 者本文公开的方法确定。本领域普通技术人员已知的其他方法，例如免疫分析或 者结合分析，可以被用于检测抗原在暴露于所述抗原后的APC上的存在。
在本发明的进一步的实施方式中，可以用允许通过APC表达特定蛋白的载 体转染所述APC。通过APC表达的蛋白接着可以被加工并在MHC受体上呈递在 细胞表面上。转染的APC接着可以被用作免疫原组合物，以对载体编码的蛋白质 产生免疫应答。如本文其它地方所述，可以制备载体以包括编码和表达蛋白质的特定多核
49苷酸，其中对所述蛋白质发生免疫应答是期望的。优选地，逆转录载体被用于侵 染细胞。更优选地，腺病毒载体被用于侵染细胞。在本发明的另一个实施方式中，通过修饰病毒载体以编码被APC上的受体 识别的蛋白或者其部分，载体可以靶向作用于APC，由此载体对APC受体的占有 将引发载体的胞吞作用，以允许加工和呈递通过病毒载体的核酸编码的抗原。病 毒释放的核酸可以是病毒自身的，其当在所述APC表达时编码病毒蛋白，该蛋白 接着在APC的MHC受体上被加工和呈递。如本文其他地方所述，可以使用不同的方法将多核苷酸转染到宿主细胞中。 所述方法包括但不限于磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔、 胶体分散系统(即大分子复合体、纳米囊、微球体、珠子和包括水包油乳状液、微 胶粒、混合的微胶粒和脂质体的脂质基系统)。在另一个方面，编码抗原的多核苷酸可以被克隆到表达载体中，并且所述 载体可以被导入APC，以另外产生活化的APC。本文其它地方论述了将核酸导入 细胞的不同类型的载体和方法。例如，编码抗原的载体可以通过本领域的任何方 法被导入到宿主细胞中。例如，所述表达载体可以通过物理的、化学的或者生物 的方法被转染到宿主细胞中。例如，见Sambrook等人(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)禾口 Ausubel等人(1997， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)。容易理解的 是，导入包括编码抗原的多核苷酸的表达载体产生脉沖的细胞。
本发明包括用于脉冲APCs的不同方法，包括但不限于用蛋白质、cDNA或 者mRNA形式的全抗原负载APC。然而，本发明不应该被解释为限于用于脉冲所
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APC的其他方法。优选地，所述APC用编码确定抗原的mRNA转染。序列已知 的基因产物对应的mRNA可以在体外用合适的引物和反转录酶-聚合酶链反应 (RT-PCR)结合转录反应快速地产生。用mRNA转染APC同其它用于产生脉冲的 APC的抗原负载技术相比提供了优点。例如，从微观量的组织即肿瘤组织扩增RNA 的能力，扩大了 APC的用途以用于对大量的患者接种疫苗。所述抗原可以来自病毒、真菌或者细菌。所述抗原可以是自身抗原或者疾 病相关的抗原，所述疾病选自传染病、癌和自身免疫性疾病。
对于用作疫苗的抗原组合物，所述抗原组合物必须诱导细胞、组织或者哺 乳动物(如人)中所述抗原的免疫应答。如本文所用，"免疫组合物"可以包括抗原 (如，肽或者多肽)、编码抗原的核酸(如，抗原表达载体)、表达或呈递抗原的细胞、 或者细胞组分。在具体实施方式
中，所述抗原组合物包括或编码本文所述的所有 或部分任何抗原，或者其免疫学上的功能等同物。在其它实施方式中，所述抗原 组合物在包括附加免疫刺激剂或者编码这样剂的核酸的混合物中。免疫刺激剂包 括但不限于附加抗原、免疫调节剂、抗原呈递细胞或者佐剂。在其它的实施方式中， 一种或者多种附加剂被共价地结合到任意结合的抗原或者免疫剌激剂上。在 某些实施方式中，所述抗原组合物被偶联到或者包括HLA锚定基序氨基酸。
本发明的疫苗在其核酸组成和/或细胞组分方面可以变化。在非限定性的例 子中，编码抗原的核酸也可以用佐剂配制。当然，可以理解，本文所述的各种组 合物可以进一步包括附加的组分。例如， 一种或者多种疫苗组分可以包括在脂质 或者脂质体中。在另一个非限定性的例子中，疫苗可以包括一种或者多种佐剂。 根据本公开内容，本发明的疫苗和其各种组分，可以通过本文所述的或者本领域 普通技术人员已知的任何方法制备和/或给药。可以理解，本发明的抗原组合物可以通过本领域公知的方法制备，所述方 法包括但不限于，通过固相合成并通过HPLC纯化以与化学反应的其它产物分丌 的化学合成，或者通过在体外翻译系统或者活细胞中表达编码包括本发明抗原的 肽或者多肽的核酸序列(如，DNA序列)的产生。另外，抗原组合物可以包括从生 物样品分离的细胞组分。优选地，分离抗原组合物并充分透析以除去一种或者多 种非期望的小分子量分子和/或者将其冻干以更容易地配制成期望的载体。进一步 理解的是，在疫苗组分中制备的附加的氨基酸、突变体、化学修饰等，如果存在， 它们将会优选地基本不干涉抗体对表位序列的识别。本发明的一种或者多种抗原决定子对应的肽或者多肽一般应该长至少5或 者6个氨基酸残基，并且可以含有多达大约10、大约15、大约20、大约25、大 约30、大约35、大约40、大约45或大约50个残基左右。肽序列可以通过本领域 普通技术人员已知的方法合成，如，例如，用如可以从Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA (Foster City, CA)购买的肽自动合成仪合成肽。更i^的肽或者多肽也可以如通过重组方法制名。在某些实施方式中，编码 抗原组合物和/或者本文所述的组分的核酸可以被用于本发明的各种组合物或者方 法，例如在体外或者体内产生抗原组合物。例如，在某些实施方式中，编码抗原 的核酸被包括在，例如重组细胞的载体中。所述核酸可以被表达产生包括抗原序 列的肽或者多肽。所述肽或者多肽可以从细胞分泌或者作为细胞的部分或者包括 在细胞内。在某些实施方式中，通过用编码抗原的核酸转染或者接种哺乳动物可以促 进免疫应答。包括在靶哺乳动物内的一个或者多个细胞在将所述核酸给予所述哺 乳动物后，接着表达所述核酸编码的序列。疫苗也可以以如编码全部或者部分抗 原肽或者多肽序列的核酸(如，cDNA或者RNA)的形式存在。核酸的体内表达可以 通过如，质粒类型的载体、病毒载体或者病毒/质粒构建载体进行。
在优选的方面，所述核酸包括编码全部或者部分序列的编码区，所述序列 编码合适的抗原或者其免疫功能的等同物。当然，所述核酸可以包括和/或者编码 附加的序列，其包括但不限于包括一种或者多种免疫调节剂或者佐剂的那些。
51肿瘤相关抗原在本发明的上下文下，"肿瘤抗原"或者"过度增生疾病抗原"或者"过度 增生疾病相关抗原"指具体的过度增生疾病共同的抗原。在某些方面，本发明的 过度增生疾病抗原来自于包括但不限于以下的癌症原发性或者转移性黑素瘤、
胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma), 霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺 癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。在一个实施方式中，本发明的肿瘤抗原包括一种或者多种由来源于哺乳动 物癌瘤的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes) (TIL)免疫识别的抗原癌表位。恶性肿瘤表达多种可以充当免疫攻击的耙抗原的蛋白。这些分子包括但不 限于组织特异性抗原如黑素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP i00与前列腺癌中的 前列酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它的靶分子属于转化相关的分 子如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胚胎抗原(onco-fetal antigens)如 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen) (CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性的独 特型免疫球蛋白组成了该个体肿瘤独特的真正肿瘤特异性免疫球蛋白。B细胞分化 抗原如CD19、 CD20和CD37是B细胞淋巴瘤靶抗原的其它候选抗原。这些抗原 的一些(CEA、 HER-2、 CD 19、 CD20、独特型)已经用作单克隆抗体被动免疫治疗 的靶，取得了有限的成功。所述肿瘤抗原和其抗原癌表位可以从天然源如从原发性临床分离物、细胞 系等纯化和分离。所述癌肽和它们的抗原表位也可以通过化学合成或者通过本领 域已知的重组DNA技术获得。化学合成技术在Steward等人(1969)、 Bodansky等 人(1976)、 Meienhofer (1983)和Schroder等人(1965)中有描述。而且如Renkvist等 人(2001)所述，本领域有许多己知的抗原。下表描述了肿瘤抗原编码的T细胞限定 的表位，并且只有那些被T细胞(细胞毒性CD8+或者辅助性CD4+)识别的肿瘤抗 原被列出。尽管没有列出类似物或者人工修饰的表位，但本领域普通技术人员知 道，如何通过本领域的标准方法获得和产生它们。其它的被抗体鉴定和通过Serex 技术(见Sahin等人(1997)和Chen等人(2000))检测的抗原在Ludwig Institute for Cancer Research数据库中被鉴定。
微生物抗原微生物抗原可以是病毒、细菌或者真菌来源的。侵染病毒的例子包括逆 转录病毒科(如人免疫缺陷病毒，如HIV-l(也指HTLV-ni、 LAV或者HTLV-III/LAV 或者HIV-III，和其它的隔离群如HIV-LP)、小RNA病毒科(如脊髓灰质炎病毒、 甲型肝炎病毒、肠道病毒、人科萨奇病毒(humancoxsackieviruses)、鼻病毒、艾柯 病毒(echoviruses))、卡利希病毒科(Calciviridae )(如，导致胃肠炎的菌株)、披膜病毒禾斗(Togaviridae)(如马脑炎病毒(equine encephalitis viruses)、风疹病毒(rubella viruses))、黄病毒科(FIaviridae)(如登革病毒(dengue viruses)、脑炎病毒(encephalitis viruses)、黄热病毒(yellow fever viruses))、冠状病毒科(Coronaviridae)(如冠状病毒 (coronaviruses))、弹状病毒(Rhabdoviridae)(如zK泡性口炎病毒(vesicular stomatitis viruses)、狂犬病病毒(rabies viruses))、线状病毒科(Filoviridae)(如埃博拉病毒(ebola viruses))、畐iJ粘病毒(Paramyxoviridae)(如畐iJ流感病毒(parainfluenza viruses)、月思腺炎 病毒(mumps virus)、麻疹病毒(measles virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒(influenza viruses))、布尼亚病 毒科(Bunyaviridae)(如汉坦病毒(Hantaanviruses)、 bunga病毒、白蛉热病毒和内罗 毕病毒(phleboviruses and Nairo viruses)、沙粒病毒禾斗(Arena viridae)(出血热病毒 (hemorrhagic fever viruses))、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如呼肠孤病毒(reoviruses)、 环状病毒(orbiviruses)禾Q轮状病毒(rotaviruses))、 双RNA病毒科(Bimaviridae)、嗜 肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)、细小病毒科(Parvovirida)(细小病 毒(parvoviruses))、乳多空病毒禾斗(Papovaviridae)(乳头瘤病毒(papilloma viruses)、多 瘤病毒(polyoma viruses))、腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)、疱疹病毒科 (Herpesviridae)(疱疹单纯性病毒(herpes simplex virus (HSV)) 1和2、水痘-带状疱疹 病毒(varicella zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)、疱疹病毒)、痘病 毒禾斗(Poxviridae)沃花病毒(variola viruses)、痘苗病毒(vaccinia viruses)、痘病毒(pox viruses))和虹彩病毒科(Iridoviridae)(如非洲猪瘟病毒(African swine fever viras))与未 分类的病毒(unclassified viruses)(如海绵状脑病(Spongiform encephalopathies)的病 原物、S肝炎的病原物(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星病毒)、非甲型非乙型肝
0< rS/M71z来i_rh T"rJ7i;tiWi,rVi 来，—H卜/+.》:h, iVi /闩n 7 Wil BT'乂 、 二甘'、,:￡*'|4=主"IX廿
久口'j:/hw^i7j、大丄—k、j 口p'i 木口'j ， 大^卜fl夕j堪 |;7沐口'j、"lJ ru生"i i/cj、 ktH八兀7w坤/x升 相关病毒禾口星状病毒(astro viruses))。感染性细菌的例子包括幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体 (Borelia burgdorferi)、 嗜月巿军团菌(Legionella pneumophilia)、 分枝杆菌属 (Mycobacteria sps)((如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、鸟分支杆菌(M. avium)、胞内 分支杆菌(M. intracellulare)、堪萨斯分支杆菌(M. kansasii)、戈登分支杆菌(M. gordonae))、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae"脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A族链球斷Group A Streptococcus))、 无乳纟连球菌(Streptococcus agalactiae)(B 方矣,连球菌(Group B Streptococcus))、 链球菌(Streptococcus)((草绿色菌群(viridans group))、粪链球菌 (Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(厌氧型属)、月市炎链 球菌(Streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲菌属(pathogenic Campylobacter sp.)、 肠球菌属(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、炭疽杆菌 (Bacillus anthracis)、 白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、 棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌 (Clostridium perfringens)、祝i〈另风梭菌(Clostridium tetani)、产气Mi丰T菌(Enterobacter aerogenes)、月市炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、 巴斯德杆菌(Pasturella multocida)、 拟杆菌属(Bacteroides sp.)、 具核梭杆斷Fusobacterium nucleatum)、 念 珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、细弱密螺旋体(Treponema pertenue)、钩 端螺旋体(Leptospira)禾口衣氏方夂线菌(Actinomyces israelli)。感染性真菌的例子包括新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织 胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌 (Blastomyces dermatitidis)、 沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)、 白色念珠菌 (Candida albicans)。其它的传染性生物体(即，原生生物)包括恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)禾口弓形虫(Toxoplasma gondii)。
沉默和脉冲的免疫细胞在另一个实施方式中，可以从培养物、组织、器官或者生物体中分离细胞 并作为细胞疫苗对哺乳动物给药。因此，本发明考虑"细胞疫苗(celluarvaccine)"。 当然，该细胞也可以表达一种或者多种附加疫苗组分，如免疫调节剂或者佐剂。 所述疫苗可以包括细胞的全部或者部分。在优选的实施方式中，本发明的细胞疫 苗包括人APC，在更优选的实施方式中，所述APC是DC。
所述细胞疫苗可以包括本发明所述的已经沉默以提高其免疫效能的APC。 所述沉默的APC接着可以用编码抗原的核酸转染以产生抗原负载细胞。在另一个 方面，沉默的APC可以用包括抗原的免疫剌激性蛋白脉冲以产生抗原负载细胞。 基于本公开内容；使用任何类型的抗原，通过任何方法可以将沉默的APC脉冲使 其负载抗原。另外，在APC用本发明的抑制因子沉默之前、同时或者之后，可通 过任何方法将APC脉冲。如本文其他地方所公开，细胞可以使用各种方法被抗原脉冲。本发明的抗 原含有至少一个表位，其中所述表位能够诱发哺乳动物的免疫应答。在一个实施 方式中，抗原通过表达载体表达。在另一个实施方式中，抗原是分离的多肽。优 选地，所述抗原与选自传染病、癌和自身免疫性疾病有关。用于脉冲本发明的细 胞的许多优选抗原在本文的其它地方被公开。所述抗原可以为下面的一种或者多 种形式肿瘤裂解物、蛋白质、肽、mRNA、 DNA、载体表达物、脂质体等。
已经被负性免疫调节因子抑制因子沉默的APC具有提高的免疫效能并因此 诱发增强的免疫应答，即增强的呈递抗原和激活对抗原免疫应答的能力。本发明 所述的己经被沉默和脉冲的APC，同未被沉默的其它地方相同的APC相比，能够 剌激效应T细胞和诱发对抗原的增强的免疫应答。
治疗应用
本发明包括用于提高免疫细胞如APC的免疫效能的组合物。对APC呈递 的抗原的应答可以利用本领域己知的方法，通过监测溶细胞性T细胞应答、辅助 性T细胞应答和/或者抗体对抗原的应答的诱导而加以测定。
本发明包括增强哺乳动物的免疫应答的方法，其包括用抗原组合物接触一 种或者多种淋巴细胞的步骤，其中所述抗原被免疫细胞如APC呈递。基于本公开 内容，通过暴露于负性免疫调节因子的抑制因子可以沉默APC，由此，暴露于抑 制因子提高了所述APC的免疫效能。在APC暴露于抗原组合物以另外地脉冲APC 之前、同时或者之后，利用本文公开的方法可以沉默APC。增强的免疫应答可以是主动或者被动的免疫应答。所述应答可以是过继性 免疫治疗方法的一部分，在该方法中APCs如树突状细胞、B细胞或者单核细胞/ 巨噬细胞从哺乳动物(如患者)获得，接着用包括抗原组合物的组合物脉冲(在将所 述细胞暴露于负性免疫调节因子的抑制因子以另外沉默所述免疫细胞之前、同时 或者之后)，再接着给予需要的哺乳动APC。所述组合物包括下列至少一种或者多种的任意结合负性免疫调节因子的 抑制因子、抗原、沉默的免疫细胞、脉冲的细胞和也被抗原脉冲的沉默的免疫细 胞。所述组合物可以是用于哺乳动物的先体外后体内免疫和/或者体内治疗的疫苗。 优选地，所述哺乳动物是人。关于先体外后体内的免疫，在将细胞给予哺乳动物前，至少下列的一种在 体外发生i)沉默所述细胞，ii)脉冲所述细胞或者iii)沉默和脉冲所述细胞。应该理 解，在用抗原处理APC以脉冲该免疫细胞之前、同时或者之后，本发明的免疫细 胞(即APC)可以利用本文其它地方公开的方法被沉默。在另一个实施方式中，可以将所述沉默的APC给予需要的患者；无需事先 在体外暴露于抗原。gp，本发明包括将沉默的APC给予患者，其中细胞的脉冲在 患者的体内发生。在另一个实施方式中，可以将所述脉冲的APC给予需要的患者，无需事先 将细胞在体外暴露于负性免疫调节因子的抑制因子。即，本发明包括将脉冲的APC 给予患者，其中细胞的沉默在患者的体内发生。先体外后体内的程序为本领域所公知，并将在下面更充分论述。简而言之， 从哺乳动物(优选地为人)分离细胞，并用表达负性免疫调节因子的抑制因子的载体 或者本文公开的其它形式的负性免疫调节因子(即化学合成的siRNA)将其沉默。可
以将所述沉默的细胞给予哺乳动物受体，以提供治疗益处。所述哺乳动物受体可 以是人，并且这样沉默的细胞对受体来说可以是自身的。可选地，对受体来说， 所述细胞可以是同种异体的、同系基因的或者异种的。美国专利号5，199，942描述了造血干细胞和祖细胞的先体外后体内扩增程 序，其通过引用包含于此，可以被用于本发明的细胞。其它合适的方法为本领域 所知，因此本发明不限于任何具体的细胞先体外后体内扩增的方法。简而言之，
55DCS的先体外后体内培养和扩增包括(l)从哺乳动物的外周血采集物或者骨髓外 植体收集CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)先体外后体内扩增这样的细胞。除了 美国专利号5,199,942描述的细胞生长因子，其它的因子如flt3-L、 IL-1、 IL-3和 c-kit配体也可以被用于培养和扩增所述细胞。已知多种细胞筛选技术被用于从细胞群中鉴定和分离CD34+造血干细胞或 者祖细胞。例如，单克隆抗体(或者其它特异性细胞结合蛋白)可以被用来结合标记 蛋白或者在干细胞或者祖细胞上发现的表面抗原蛋白。造血干细胞的几个这样的 标记或者细胞表面抗原(即，flt-3、 CD34、 My-10和Thy-l)被本领域已知。
收集的CD34+细胞用合适的细胞因子培养。接着使CD34+细胞分化和定向 为树突状谱系细胞。这些细胞接着通过流式细胞术或者相似的方法，利用树突状 细胞的标记特性，如CDla、 HLADR、 CD80和/或者CD86被进一步纯化。分离 培养的DCs后，根据本发明的方法将所述细胞修饰。可选地，所述祖细胞在分化 为DC样细胞前可以被修饰。除了在先体外后体内免疫方面使用基于细胞的疫苗外，本发明也可以提供 了用于体内免疫的组合物和方法，以在患者中诱发针对抗原的免疫应答。
关于体内免疫，本发明提供了使用负性免疫调节因子的抑制因子，作为通 过失活APC的临界调控点而提高疫苗效能的总体方法。因此，用于体内免疫的疫 苗至少包括抑制因子组分，其中所述抑制因子组分能够抑制负性免疫调节因子。 在另一个方面，所述疫苗包括抑制因子组分和抗原组分，其中所述抗原组分能够 诱发哺乳动物的免疫应答。关于体内免疫，从患者获得的细胞在体内被转染或者转导，以另外地产生 沉默的细胞。所述细胞在体内被表达绌胞因子调控因子的抑制因子的载体沉默。 可选地，使用本文公开的、非载体表达的、任何其它形式的负性免疫调节因子的 抑制因子(即化学合成的siRNA)沉默所述细胞。本文其它地方论述了体内产生沉默 细胞的方法。所述疫苗的另外方面包括用于体内脉冲细胞的抗原组分。任何抗原可以与 本发明的负性免疫调节因子的抑制因子结合给药。在用包括抑制因子的疫苗沉默 细胞之前、同时和之后，使用本文其它地方所述的方法可以脉冲细胞。容易理解 的是，在细胞被同时脉冲和沉默的情况下，可以用包括抑制因子和抗原的单个疫 苗免疫哺乳动物。可选地，可以用两个单独的疫苗免疫哺乳动物， 一个包括抑制 因子，第二个疫苗包括抗原。本发明包括对癌和传染性疾病进行体内免疫。在一个实施方式中，紊乱或 者疾病可以通过siRNA单独或者结合抗原进行体内给药以在患者中产生针对抗原 的免疫应答而进行治疗。基于本文的公开内容，负性免疫调节因子的抑制因子(例 如，对于A20、 SUMO (SUMOl, SUM02, SUM03和SUM04)、 Foxjl、 Foxo3a、 TWIST(Twist-l，Twist-2)、 SOCS (SOCS1 ， SOCS2， SOCS3， SOCS4， SOCS5， SOCS6，
56SOCS7和CIS)、 PIAS (PIAS1, PIAS3, PIASx和PIASy)、 SHP(SHP-1和SHP-2)
或者它们任意的结合，为siRNA)结合抗原配方的给药提高了不使用负性免疫调节 因子的抑制因子、其它方面相同的接种疫苗方案的效能。不希望束缚于任何具体 的理论，可以相信的是，对患者抗原的免疫应答取决于(l)给药的siRNA组合物， (2)给药的持续时间、剂量和频率，(3)患者的总体情况，和如果适合的话，(4)给予 的抗原组合物。在一个实施方式中，哺乳动物具有表达肿瘤特异性抗原的癌类型。根据本 发明，可以制备包括肿瘤特异性抗原序列组分的免疫剌激性蛋白。在这样的情况 下，可以将负性免疫调节因子的抑制因子结合免疫刺激性蛋白给予需要的患者， 提高了患者的治疗效果，显示为例如癌细胞或者表达肿瘤特异性抗原的实体瘤生 长变慢或者缩小，或者癌细胞总数目或者总肿瘤负荷减少。在相关的实施方式中，所述患者已经被诊断患有与特定抗原如病毒抗原的 表达相关的病毒、细菌、真菌或者其它类型的感染。根据本发明，可以制备包括 由抗原如HIV特异性抗原组成的序列组分的免疫刺激性蛋白。在这样的情况下， 将负性免疫调节因子结合所述免疫刺激性蛋白给予需要的患者，对患者产生改进 的治疗效果，显示为患者体内的感染性致病因子生长变慢和/或与特定传染性疾病 通常相关的可检测症状减少、或者消除。在任一情况下，可以通过将负性免疫调节因子的抑制因子结合抗原给予需 要的患者治疗紊乱或者疾病。本发明提供了在患者中针对所述抗原产生保护性DC 诱导的免疫应答的方法。基于本公开内容，本领域普通技术人员将会理解，促炎 细胞因子(即IL-12、 TNFa、 IFNa、 IFNp、 IFNY和类似物)可以被加入到本文公开
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剂量和制剂(药物组合物)本发明通过给药治疗剂如siRNA,预期治疗哺乳动物的疾病，例如，HIV 感染、癌和类似疾病。本发明所述的治疗剂的给药可以是连续的或者间断的，这 取决于例如受体的生理状况、给药的用途是治疗还是预防和熟练从业人员已知的 其它因素。本发明药剂的给药可以在预选的时间内基本连续或者可以是系列的间 隔剂量。局部和系统给药都是被考虑。给药的量将取决于各种因素变化，包括但 不限于所选择的组合物、具体的疾病、所述哺乳动物的重量、身体健康状况和年 龄以及是进行预防还是治疗。通过临床应用动物模型或者本领域公知的其它检测 系统，容易确定这样的因素。 siRNA的给药可以通过给予编码所述siRNA的核酸分子完成(例如，见 Felgner等人，美国专利号5，580，859, Pardoll等人1995; Stevenson等人1995; Moiling 1997; Donnelly等人1995; Yang等人II; Abdallah等人1995)。药物的配方、核 酸的剂量和给药途径一般被公开，例如在Feigner等人，见上述中。57
具有本发明的治疗剂(一种或多种)的一个或者多个合适单位剂型，其如 下所述，可以被任选地配制以用于持续地释放(例如使用微囊包封，见WO 94/07529 和美国专利号4,962,091，其公丌内容通过引用包含于此)，可以通过包括胃肠外的 各种途径给药，包括静脉内和肌肉内途径，以及通过直接注射到发病组织。例如， 治疗剂可以直接被注射到肿瘤中。所述制剂，如果合适，可以方便地以单独的单 位剂型存在并可以通过药剂学公知的任何方法制备。这样的方法可以包括步骤 将所述治疗剂与液体载体、固体基质、半固体载体、细粒固体载体或者它们的结 合缔合，然后，如果需要，将所述产品导入或者成型到期望的输送系统中。
当本发明的治疗剂被制备以用于给药时，它们优选地与药学上可接受的载 体、稀释剂或者赋形剂结合，以形成药物制剂或者单位剂型。在这样的制剂中， 总有效组分按重量计占制剂的0.1%到99.9%。"药学上可接受的"是与所述制剂的 其它组分相容并且不会对其受体有害的载体、稀释剂、赋形剂和/或者盐。给予的 有效成分可以以粉末或者颗粒、溶液、悬浮液或者乳状液存在。
含有本发明的治疗剂的药物制剂可以通过本领域已知的方法，利用公知的 和容易获得的成分制备。本发明的治疗剂也可以配制成适合于胃肠外给药如通过 肌肉内、皮下或者静脉内途径给药的溶液。本发明治疗剂的药物制剂也可以采用水的或者无水的溶液或者分散体的形 式，或者可选地采取乳状液或者悬浮液的形式。因此，可以配制用于胃肠外给药(例如，通过注射，如快速注射或者连续输 注)的治疗剂，并可以单位剂型存在于加有防腐剂的安瓿、预装填的注射器、小体 积的输液容器或者多剂量的容器中。有效成分可以采用如悬浮液、溶液或者油状 载体或水载体中乳状液的形式，并且可以含有如悬浮剂、稳定剂和Z或分散剂的配 制剂。可选地，所述有效成分可以为粉末的形式，其通过灭菌固体的无菌分离或 者通过从溶液冻干获得，在使用前，用合适的载体如灭菌的、无致热源的水配成。
可以理解，包含在每种剂型中的单个气溶胶剂量中的有效成分或者多种有 效成分的单位含量本身未必构成用于治疗特定适应症或者疾病的有效量，因为所 需的有效量可以通过给予多个剂量单位达到。而且，有效量可以用低于剂型中的 剂量单独或者系列给药获得。本发明的药物制剂可以包括作为任选成分的药学上可接受的载体、稀释剂、 增溶剂或者乳化剂和本领域已知类型的盐。本发明药物制剂中使用的载体和/或稀 释剂的具体非限定性的例子包括水和生理上可接受的缓冲盐水溶液，如pH 7.0-8.0 的磷酸缓冲盐溶液。本发明的表达载体、转导细胞、多核苷酸和多肽(有效成分)可以被配制并通 过使有效成分与生物体内的药剂作用部位接触的任何方法给药。它们可以通过可 用于结合药物的任何常规方法，以单独的治疗有效成分或者治疗有效成分的结合 进行给药。虽然它们可以单独给药，但是通常与药物载体一起给药，药物载体基
58于所选择的给药途径和标准的药学实践进行选择。 —般地，水、合适的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)和相关的糖溶液与二醇 类如丙二醇或者聚乙二醇是胃肠外溶液的合适载体。用于胃肠外给药的溶液含有 有效成分、合适的稳定剂和，如果需要，缓冲物质。抗氧化剂如硫酸氢钠、亚硫 酸钠或者抗坏血酸，单独或者结合地是合适的稳定剂。也用柠檬酸及其盐和乙二 胺四乙酸(EDTA)钠。另外，胃肠外溶液可以含有防腐剂如苯扎氯铵、羟苯甲酸甲 酯或者羟苯甲酸丙酯和氯代丁醇。本领域的标准参考手册Remington's Pharmaceutical Sciences描述了合适的药物载体。可以配制本发明的有效成分，使其悬浮在适合用于哺乳动物，尤其是人的 药学上可接受的组分中。这样的配制包括使用佐剂，如美国专利号4,082,735、 4,082,736、 4,101,536、 4,185,089、 4,235,771和4,406,890描述的胞壁酰二肽(MDP) 衍生物或者类似物。其它有用的佐剂包括明矾(Pierce Chemical Co.)、脂质A、海藻 糖二霉菌酸酯和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)、弗洛因德氏佐剂(Freimd's adjuvant)和IL-12。其它的组分可以包括聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(Pluronic⑧)、 非离子表面活性剂和可代谢的油如角鲨烯(美国专利号4,606,918)。
另外，可以使用标准的药学方法控制作用持续时间。这些是本领域公知的， 其包括控释制剂和可以包括合适的大分子，例如，聚合物、聚酯、聚氨基酸、聚 乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或者鱼精蛋白硫 酸盐。可以调整大分子的浓度以及结合方法以控制释放。另外，所述剂可以包含 到高分子材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或者乙烯乙酸乙烯酯共聚物的 颗粒中。除了被包含外，也可以用这些剂截留微囊中的化合物。
因此，本发明的药物组合物可以通过各种途径被输送到哺乳动物体内的不 同部位以获得特定的效应(如见Rosenfeld等人，1991; Rosenfeld等人，1991a;Jaffe 等人，见上述;Berkner，见上述)。本领域普通技术人员会认识到，尽管可以利用一 个以上的途径给药，但特定的途径可以比另一个途径提供更立即和更有效的反应。 通过包括将制剂施用到或者滴注到体腔、将气溶胶吸入或者吹入的给药，或者通 过包括肌肉内、静脉内、腹膜、皮下、皮内引入以及局部给药的非肠道导入，可 以完成局部或者全身性输送。本发明的有效成分可以以单位剂型提供，其中，每个剂量单位如茶匙、片 剂、溶液或者栓剂含有预定量的单独或者与其它活性剂合适地结合的组合物。本 文所用的术语"单位剂型(unit dosage form)"指适合作为用于人和哺乳动物对象 的单一剂量的物理上单独的单位，每个单位含有预定量的单独或者与其它活性剂 结合的本发明组合物，该预定量以足以产生期望效果的量计算，如果合适的话， 与药学上可接受的稀释剂、载体或者媒介结合。本发明的单位剂型的规格取决于 要获得的具体效应和在具体的宿主内与所述药物组合物相关的具体药效动力学。
本文所述的这些方法绝非包含所有情况，适合具体应用的进一步方法对本领域普通技术人员是显而易见的。而且，通过与已知的化合物类比，可以进一步 估计所述组合物的有效量以发挥期望的效应。
基因疗法给药本领域普通技术人员知道，可以使用不同的输送方法将载体给予细胞。例 子包括(l)利用物理的方法，如电穿？L(电力)、基因枪(物理力)或者利用大体积的 液体(压力)；和(2)其中所述载体被复合到另一个实体如脂质体、聚集蛋白或者转运 分子的方法。此外，实际的剂量和方案可以根据所述组合物是否与其它药物组合物结合 给药或者根据药效动力学、药物处置和代谢的个体差异而变化。相似地，体外施 药的量可以根据所用的具体细胞系而变化(如，基于细胞表面存在的载体受体的个 数，或者用于基因转移的具体载体在细胞系中复制的能力)。而且，每个细胞施加 的载体的量可能随插入到载体中的治疗基因的长度和稳定性变化，也随序列的性 质而变化，并且其特别是一个需要根据经验确定的参数，而且可以由于本发明方 法的非固有参数改变(例如，与合成相关的费用)。本领域普通技术人员能够容易地 根据具体情况的迫切性做出任何必要的调整。含有治疗剂的细胞也可以含有自杀基因，即编码能够用于破坏所述细胞的 产物的基因。在许多基因治疗的情况下，期望能够在宿主细胞中表达用于治疗目 的的基因，且可以具有随意破坏该宿主细胞的能力。治疗剂可以连接到自杀基因 上，其表达在不存在活化化合物时不被激活。当期望已经被导入所述剂和自杀基 因的细胞死亡时，将所述活化化合物给予所述细胞，由此激活自杀基因的表达并 杀死细胞。可以使用的白杀基因Z前休药物结合物的例子是疱疹单纯性病毒胸腺激 酶(HSV-tk)和更昔洛韦(ganciclovir)、无环鸟苷(acyclovir);氧化还原酶和环己酰亚 胺(cydoheximide);胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk) 和AZT;和脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。本文所述的方法绝非包含所有，并且适合具体应用的进一步方法对本领域 普通技术人员是显而易见的。而且，通过与已知的化合物类比，可以进一步估计 所述组合物的有效量以发挥期望效应。参考下面的实施例现在描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明本发 明，本发明不局限于这些实施例，相反，本发明包括所有变化，这些变化由于本 文提供的教导，是明显的。进行本文公开的实验，以研究对通过DCs的抗原呈递的调节，以利用DCs 开发针对多种癌和感染剂的有效疫苗。本文公开的结果显示，干涉免疫细胞内的 负免疫调控途径，另外也称为抑制负性免疫调节因子，提高了其免疫刺激能力。抑制负性免疫调节因子以增强细胞的免疫效能的构思可以作为开发更有效疫苗的 新方法。现在描述本文公开的实验所用的材料和方法。 通过siRNA寡聚物的DC转染骨髓DCs用21、 26或者相当的碱基对的siRNA寡核苷酸转染。例如，利 用GenePorter，根据制造商实验方案(Genlantis, San Diego, CA)，用SOCSl-siRNA3 (5'-CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3';SEQIDNO:3)转染DCs。然而，利用本文所 述的方法可以将本文其他地方所述的任何siRNA寡核苷酸转染至DCs。简而言之， 将3 pl的20 jaM寡核苷酸溶液加到3 |i!的GenePorter试剂和94 pl无血清的 RPMI1640中。将该混合物在25°C下温育30 min，然后将100 (al的GenePorter/寡 核苷酸混合物加到每孔的骨髓DCs中并在37。C下温育4h。温育后，将500h1/孔 的添加20% FBS的RPMI1640加到骨髓DCs中。
用慢病毒载体转导骨髓来源的DCs小鼠骨髓来源的DCs用本领域已知的方法制备。简而言之，冲洗来自四肢 的小鼠骨髓，通过尼龙筛网并用氯化铵耗尽红细胞。用RPMI-1640充分洗涤后， 细胞用2.5 ml的添加10% FBS、mGM-CSF/ml (20 ng/ml)和重组小鼠IL-4 (20 ng/ml; PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ)的RPMI-1640培养。在培养的第2禾n 4天，取出上 清液，放在含有20 ng/ml的rmGM-CSF和20 ng/ml的rmlL-4的新鲜培养基中。将 所有的培养物在37°C下、在5%加湿的C02中培养。培养48小时后将非黏附的粒 细胞除去并加入新鲜的培养基。培养7天后，如通过FACS领l.l定，>80°/。的细胞表 达特征的DC特异性标记。小鼠骨髓来源的DCs的转导(培养第5天到7天)在24 孔板上通过加入5 pg/ml 1,5-二甲基-l,5-二氮H^—亚甲基聚甲溴化物(Polybrene) (Sigma, St. Louis, MO)进行。洗涤DCs并植入24孔板上，浓度为2"05细胞/孔， 在400 pl无血清的RPMI 1640中。将细胞以5xl05细胞/ml的细胞密度暴露于具有 不同感染复数(MOIs)的慢病毒载体。8小时转导后，用PBS洗涤细胞并进一步培 养在新鲜的组织培养基中。
细胞因子和蛋白质印迹法利用细胞培养物的上清，用ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)， 根据制造商的说明书，定量各细胞因子的水平。对于蛋白质印迹分析，用表达期 望siRNA包括但不限于SOCSl-siRNA、 A20-siRNA、 Foxjl-siRNA、 SUMO-siRNA 和Twist 2-siRNA或者对照siRNA (如GFP-siRNA)的pSUPER载体和相应的标记表 达载体，共转染293T细胞。例如，用小鼠SOCSl-siRNA或者无关的GFP-siRNA禾Q FLAG标记的
61SOCSl载体以10:1的比例共转染293T细胞。48小时后收集细胞并进行 SDS-PAGE。转移到Hybond-P膜(Amersham, Arlington Heights, IL)之后，通过抗 Flag(Sigma, St. Louis， MO)或者肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA)抗体，通过蛋白质印迹分析样品，接着用ECL-Plus试齐U(Amersham, Arlington Heights, IL)检测。用密度计Densitometer SI扫描膜并用ImageQuant软件(Molecular Dynamics, Piscataway, NJ)定量SOCS-1/肌动蛋白带。将SOCSl带的强度归一化为 /3-肌动蛋白的强度。
SOCSl的定量RT-PCR分析 SOCSl在转染的小鼠BM-DC中的相对表达通过定量实时PCR评价。用 Trizol试齐U(Invitrogen, Carlsbad, CA)从3.5-5xl05 BM-DC提取总RNA。用随机六聚 体引物禾n Superscript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen， Carlsbad, CA)对每个样 品的1.0pg总RNA反转录。实时5'-核酸酶荧光PCR分析在ABI7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)上以20 pi的四个平fi"反 应进行，每个反应用相等的5 ng的起始RNA材料作为模板。用于小鼠SOCSl (6FAM)的预形成的引物/探针组和18S核糖体对照(VIC)购自Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA (SOCSl的引物5'-ACCTTCTTGGTGCGCGAC-3'; SEQ ID NO:12禾卩5'. AAGCCATCTTCACGCTGAGC-3'; SEQ ID NO:13，以及杂交探针， 6FAM-TCGCCAACGGAACTGCTTCTTCG-TAMRA; SEQ ID NO: 14)。 PCR参数如 TaqMan Universal PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)建 议，SOCSl和18S反应在单独的管中进行。SOCSl水平被归一化为18S rRNA。 SOCSl相对于模拟转染(inGck-transfected)和剌激的BM-DCs对照值的表达用 Comparative Ct法(Livak等，2001， Methods 25:402-408)计算。
定量RT-PCR分析A20、 FoxU和SUMOl A20、 Foxjl和SUMOl在转染的小鼠M-DC的相对表达通过定量实时PCR 评价。用Trizol试剂(Invitrogen， Carlsbad, CA)从3.5-5xl05 BM-DC提取总RNA。 用随丰几六聚体引物和Superscript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen， Carlsbad， CA) 对每个样品的1.0吗总RNA进行反转录。在ABI 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Ine.， Foster City, CA)上以20 pi的四个平行反应进行实 时5'-核酸酶荧光PCR分析，每个反应用同等的5ng起始RNA材料为模板。用于 小鼠A20、 Foxjl和SUMOl的预形成的引物/探针组和18S核糖体对照(VIC)购自 Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA (A20 弓l物 ， 5'-GCATCTGCAGTACCTGTTTC，-3， SEQ ID NO: 186; 禾卩 5,-GACAGGAGGCAGGGATA-3，； SEQ ID NO: 187 ;禾B杂交探针 5'-ACTACAGCAGAGCCCAGCTCCAGCC-3，； SEQ ID NO: 188; Foxjl引物，
625，-GCCATGCAAGCCAGCAA-3，； SEQ ID NO: 189 ; 和 5，-GCAGAAGTTGTCCGTGATCCA-3，； SEQ ID NO: 190;和杂交探针 5，-AAGATCACTCTGTCGGCCATCTACAA-3，； SEQ ID NO: 191; SUMOl引物， 5，-GAAGGTCAGAGAATTGCTGATAATCAT-3，； SEQ ID NO: 192 和 5，-CCCCGTTTGTTCCTGATAAACT-3，； SEQ ID NO: 193 ， 和杂交探针 5，-TCCGAAAGAACTGGGAATGGAGGAAGAA-3，； SEQ ID NO: 194)。 PCR参数根 据本文其它地方所述。
OT-I细胞的体外分析从OT-I小鼠收集脾，混合和破裂以获得单细胞悬浮液。用MACS CD8+ T 细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)，通过阴性选择，收集CD8+OT-I T细胞。简而言之，用对CD4 (L3T4)、CD45R (B220)、DX5、CDllb (Mac-l)和Ter-119 特异性的生物素标记的抗体包被细胞。将抗生物素的磁性微珠MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)加到细胞中，其通过连接到MACS磁体的分离柱。 收集没有结合柱的细胞，通过FACS测定，其为〉95% CD8+。将总共5X10"屯化 的CD8+ OT-I T细胞和5xl03未成熟的DCs放在圆底96-孔微量滴定板中的每一孔 中，在200 pl添加10%FCS、 4mML-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青 霉素与链霉素、10 mM HEPES和5 jaM 2-ME的RPMI 1640培养基中。两天后， 通过在每个孔中加入1 pCi [3H] TdR培养最后8小时，测量增殖。进行三个平行测 定，代表三次实验。用ELISA分析所指示的细胞因子(BD Biosciences, San Jose, CA)，确定OT-T/DC共培养物中的细胞因子的分泌。
流式细胞分析预封闭FC、'受体后，将细胞用在含有0.1% NaN3和2% FCS的PBS中的 FITC、 PE、别藻蓝蛋白(APC)或者PerCP-偶联的mAbs染色。对小鼠CD4 (RM4-5)、 CD8 (53-6.7)、 CDllc(HL3)、 CD40 (3/23)、 CD80 (16-10A1)、 CD86 (GLl)特异性 的大鼠mAbs和匹配的同种型对照购自BD Biosciences, San Jose, CA。染色的细胞 在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)流式细胞仪和CELLQuest软件 上分析。
四聚体染色用H2-Kb/卵清蛋白四聚体分析，检测卵清蛋白特异性的008+ T细胞。在 DC免疫后的不同日，将免疫小鼠的脾细胞或者T细胞用抗-CD8a-FITC和H2-Kb/ 卵清蛋白(SIINFEKL)-PE四聚体，SEQ ID NO:ll (Beckman Coulter Immunomics， San Diego, CA)双染色。根据制造商的说明书，在4°C下进行四聚体染色1小时， 每106个细胞用1 ng的抗-CD8a和10 (il的卵清蛋白四聚体。
63酶联免疫斑点法(ELISPOT)用CTL肽剌激CD8+T细胞。也用来自人CD20分子的无关肽作阴性对照。 用MACS CD4 (L3T4)或者MACS CD8 (Ly-2) MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)从脾细胞分离CD8+ T细胞。
CTL和NK分析用测量体外再刺激的脾细胞裂解靶细胞能力的标准铬释放分析法，评价 CD8+ CTL应答。从免疫小鼠混合的脾细胞在含有肽的RPMI-1640中再剌激4-6天。 将靶细胞和对照细胞用51&络酸钠溶液标记90分钟。将不同数目的效应细胞与恒 定数目的靶细胞(l X 104/孔)在96孔V型底部的板(200 pl/孔)中在37°C下温育3小 时。收集三份培养物的上清(IOO pl)。裂解百分比计算为(实验释放-自发释放)/(最 大释放-自发释放)X100。通过用500U/ml的重组鼠IL-2培养1X106细胞/ml，从 小鼠的脾细胞产生NK细胞。将对NK细胞裂解高度敏感的YAC-1细胞在37°C下 与51Cr温育1小时，漂洗并以1()S细胞/ml重悬浮。将NK细胞一式三份加到靶细 胞中，以获得不同的E:T细胞比例。温育后，离心板并用7计数器(Beckman Coulter, Inc., Fullerton， CA)计数上清液的放射性。
DC免疫和肿瘤模型骨髓来源的DCs (第5天的骨髓培养物)用表达期望siRNA的慢病毒转导， 期望siRNA包括但不限于SOCSl-siRNA、 A20-siRNA 、 Foxjl-siRNA 、 Foxo3a-siRNA、 SUMO-siRNA、 Twist-l-siRNA和Twist-2-siRNA。例如，骨髓来源 的DCs用MOI为5的LV-SOCS1-siRNA或者LV-GFP-siRNA转导。接着用卵清蛋 白或者TRP2肽脉冲DCs 8小时，用PBS冲洗三次，用于在培养另外36小时后进 行免疫。对一些实验，用LPS (100 ng/ml, Sigma， St. Louis, MO)刺激抗原脉冲的DCs 24小时，用PBS洗涤，接着将其经爪垫注射入C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory)。 在治疗模型中，将EG7或者B16肿瘤细胞(2.5到5X 1()S)皮下注射(s.c.)到同系基 因C57BL/6小鼠的身体右侧。在肿瘤接种后的不同日，将小鼠随机分组并注射50 ^抗原脉冲的转导DCs或者PBS对照。在一些小鼠中，在接种后的指定日期腹膜 内注射(i.p.)LPS。每周用测径器测量肿瘤体积2或3次。
统计分析对于统计分析，使用"学生"t检验(Student's t test),并且95%的置信限 被认为是显著的，被定义为P〈0.05。结果通常显示为平均士标准误差。
现在描述实施例的实验结果。
实施例1:鉴定和分析鼠SOC-l siRNA
禾IJ用计算机程序选择耙向小鼠 S0CS1: SOCSl-siRNAl (CCTTCCGCTCCCACTCCGA; SEQ ID NO:l) 、 S0CSl-siRNA2 (CAGTCGCCAACGGAACTGC; SEQ ID NO:2) 禾卩 SOCSl-siRNA3 (CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT; SEQ ID NO:3)的siRNA序歹J。所有的耙序列经过 NCBI Blast查询以证实缺乏与其它己知基因的同源性。设计正向和反向寡聚物， 以编码被9nt间隔区分开的有义和反义的19nt耙序列。该核心siRNA序列两侧为 HI RNA转录起始序列和5T终止子序列，并在退火后含有5'BglII和3，HindIII的 相容突出。DNA基的siRNA表达载体pSUPER (Brummelkamp等人，2002， Science 296:550-553)用Hl-RNA启动子，引导siRNAs的从头合成。合成并退火的寡核苷 酸对被克隆到Bglll/Hindlll消化的pSUPER载体。通过限制性消化鉴定阳性克隆， 并通过DNA测序证实。
用于小鼠SOCSl-siRNA的慢病毒载体的形成和产生本研究使用的HIV转移载体是pTRIP AU3 CMV eGFP,其包括内部的巨细 胞病毒(CMV)启动子，并且是自失活的(SIN载体)，在3'长末端重复(LTR)的U3区 有400 bp的缺失，其去掉了转录活性序列。慢病毒转移载体pTRIPAU3 CMV GFP 含有178-bp的片段，其包括在原始pHR'主链的单一 Clal位点上的中央多聚嘌呤 束(cPPT)和中央终止序列(CTS)。修饰pTRIPAU3CMV GFP以从HI RNA启动子 表达siRNA和共表达双顺反子杀稻瘟素抗性/eYFP选择标记。为了适应克隆和去 除自身CMV启动子，用引物(5，-GATCGAATTCACAAATGGC-3，； SEQ IDNO:4和 5，-CTAGGGATCCATCGCCCCAAAGTGG-3，； SEQ ID NO:5) PCR扩增pTRIP载体 的巾央多聚腺嘌呤束Z中央终止序列(cPPTZCTS),以插入5，-EcoRI和3'-BamHI位 点，用于克隆。接着将cPPT-CTS PCR产物用EcoRI/BamHI消化并再插入到 EcoRI/BamHI 消化的 pTRIPAU3CMV GFP 载体。 用弓l物 (5'-GATCCTCGAGGTCGACAATCAACCTCTGGA-3'; SEQ ID NO:6 和 5，-GATCGGTACCCAGGCGGGGAGG-3，； SEQ ID NO:7)从pBS-SK-WPRE PCR扩 增土拨鼠转录后调节元件(wPRE)序列，以加入5'-XhoI/SalI和3'Kpnl位点。接着 用Xhol/Kpnl消化WPRE片段并插入到修饰的pTRIPAU3CMV GFP主链，形成 pTRIP-W。首先在pSUPER主链上组装siRNA和双顺反子选择标记盒，以转移到 pTRIP-W。用引物(5，-CAGTATCGATTTAATTAATCAATATTGGCCATTAG-3，； SEQ ID NO:8禾口 5，-CAGTGTCGACTTAATTAAGTGGCCGCTTTACTTG-3，； SEQ ID NO:9)从质粒PYAP6 PCR扩增双顺反子选择标记CMV-BlastiR-IRES-eYFP (BY), 以包含5'-Clal和3，-SalI位点。将PCR产物用Clal和Sail消化，接着连接到Clal/Sall 消化的pSUPER载体上，以在Hl-RNA启动子和pSUPER MCS的3'端加上BY 标记，形成pSUPER-BY。接着BamHI/Sall消化pSUPER-BY并连接到pTRIP-W 主链以形成pTRIP-Hl-BY-W。
用BstBI和Clal消化随后的含有hrGFP或者SOCS1(3) siRNA发夹序列的 pSUPER载体，用于插入到pTRIP-Hl-BY-W，以产生pTRIP-hrGFP-siRNA-BY-W (GFP陽siRNA)和pTRIP-SOCSl-siRNA-BY -W (SOCSl-siRNA)。最终的390 bp间隔 区片段被插入到最终载体的Clal位点，以从CMV启动子的开始间隔siRNA的终 止序列。所有的载体通过DNA测序(Lone Star Labs, Houston, TX, USA)证实。
通过将三个质粒共转染到293T细胞，形成重组的假型慢病毒载体。HIV 衍生的包装构建体pCMVAR8.9编码HIV-l gag和pol前体以及调节蛋白tat和rev。 从质粒pMD.G表达水泡性口炎病毒(VSV-G)的糖蛋白G。用pCMVAR8.9、 pMD.G 和慢病毒pTRIPsiRNA转移载体，通过瞬时的磷酸钙共转染293T细胞，产生假型 慢病毒载体。转染60到72小时后，通过在50，000Xg， 4。C下超离心2小时，浓 縮上清。病毒沉淀重悬浮在RPMI，并在-80。C冷冻，用于将来的研究。用系列稀 释的浓縮病毒和8 pg/ml的l,5-二甲基-l,5-二氮^^一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene) 温育293T细胞6小时，确定病毒滴度，接着在72到96小时后，通过荧光激活细 胞分选(FACS)分析确定eYFP阳性细胞。载体滴度计算如下滴度FX2XQ/VX D(其中D是病毒稀释因子，V是接种物的体积，F是eYFP阳性的293T细胞的频 率，和Co是接种时的靶细胞的数目)。
实施例2:用SOCS1 siRNA，通过GenePorter对鼠BM-DCs的转染和SOCS1 mRNA 的下调为了研究通过DCs的抗原呈递对SOCS1的调节，首先如下所述鉴定特异 性下调S0CS1的小干扰RNA(siRNA)。在粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)和IL-4存在时，先体外后体内 地，通过GenePorter将合成的siRNA寡聚双链体有效地转染到来自小鼠骨髓细胞 的DCs,转染效率为83%。简而言之，用21碱基对的siRNA寡核苷酸 (5'-CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3'; SEQ IDNO:3)，采用GenePorter，根据制造 商的方案，转染骨髓DCs。将3 pl的20 |_iM寡核苷酸加到3 ^的GenePorter试剂 和94 nl的无血清RPMI1640中，并在25 °C下温育30分钟，然后将100 (il的 GenePorter/寡核苷酸混合物加到骨髓DCs的每个孔中，并在37°C下温育4小时。 温育后，将添加20% FBS的500 pl/孔的RPMI1640加到骨髓DCs中。基于本公开 内容，在生理学上可接受载体的情况下，合成的siRNA寡聚体可以被输送到细胞 中。可接受的载体的例子是脂质体。图1A显示，在用表达SOCSl-siRNA的载体转导的细胞中，S0CS1被下调。 简而言之，用表达小鼠SOCSl-siRNA或者无关的GFP-siRNA的pSUPER(pSUP) 载体和FLAG-标记的mSOCSl表达载体，以10:1的比例，利用GenePorter共转染 293T细胞，并在48小时后，进行蛋白质印迹法。S0CS1带的强度被归一化为/3 肌动蛋白带的强度，并显示了相对强度(比率)。被命名为SOCSl-siRNA的SOCS-siRNA3 (5'-CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT-3'; SEQ ID NO:3)被用在随后的研究中。如通过定量RT-PCR分析所验证，与用不能下调SOCS1的SOCS1 siRNA突变体转染的DCs中的水平相比，在用SOCSl siRNA转染的总DC群中的SOCSlmRNA水平明确地减少了大约60y。(图1B)。另外，观察到，在骨髓DC体外培养过程中和成熟后，SOCSl表达更高。也观察到，用SOCSl siRNA转染的DCs比用siRNA突变体转染的DCs对LPS或者IFN-Y更加应答，显示为刺激后促炎细胞因子如IL-6和TNF-a分泌增加(图2)，和STAT1、 I-kB和JNK磷酸化增加。从三个独立试验中的一个，图B描述了 ，应答LPS (100 ng/ml)或者IFN-y (10 ng/ml)24小时后，siRNA寡聚体转染或者模拟转染的 DCs分泌的细胞因子水平。siRNA 突变体(5'-ACTATCTAAGTTACTACCCCTT-3'; SEQ ID NO:10)含有SOCSl siRNA3序列中的四个突变。这些数据与SOCSl参与JAK/STAT途径和TLR/NF-kB途径的调节报道一致(Hanada等2003， Immunity 19:437-450; Chong等，2003, Immunity 18:475-487)。在IFN-y和LPS刺激前或者后，用SOCSl siRNA转染的DCs比siRNA-DC突变体转染的DCs显示了稍微更成熟的表型。两种转染的DCs都比模拟转染的DCs更加成熟，这反映了 siRNA非特异性激活IFN基因的效应。
实施例3:用病毒载体转染鼠BM-DCs为了评价SOCSl是否体内负调控DC抗原呈递，将SOCSl siRNA或者对照绿色荧光蛋白(GFP) siRNA克隆到能够稳定转导DCs的慢病毒载体(LV)(Rubinson等人，2003' Nat. Genet. 33:401-406; Schroers等人，2004， Methods Mol.Biol. 246:451-459)，这样能够更加可靠地评价SOCSl的沉默效应。根据本文其它地方所述的方法,产生两个构建物LV-SOCS1-siRNA和LV-GFP-siRNA，它们都含有黄色荧光蛋白(YFP)标记(图3)。用LV-SOCS1-siRNA或者LV-GFP-siRNA载体转导骨髓来源的DCs (>80% CDllc+)，通常产生58-63%的YFP阳性的培养细胞。与先前对siRNA寡聚体转染的DCs的观察一致，同LV-GFP-siRNA-DCs相比，LV-SOCSl-siRNA-DCs剌激后，观察到在总转导的DC群中更低的SOCSl mRNA水平和增加的促炎细胞因子分泌。为了确定转导的DCs中的SOCSl mRNA水平，用荧光激活细胞分选(FACS)，分离YFP+转导的DCs,接着通过实时定量PCR确定SOCSl mRNA的相对表达。观察到，同模拟转导的DCs中水平相比，YFP+LV-SOCSl-siRNA-DC群中的SOCSl mRNA水平大约低90%。经或者未经LPS刺激的用LV-SOCS1-siRNA禾Q LV-GFP-siRNA转导的DCs显示了相当的CD86和CD40表达水平。不希望束缚于任何具体的理论，可以相信，LV-GFP-siRNA-DCs比模拟DCs导致更高水平的CD86和CD40的发现可能是由于siRNA和慢病毒转导的非特异性激活的效应。
实施例4:小鼠S0CS1 siRNADCs诱导的OVA特异性的sCTL和抗肿瘤活性
进行下一系列的实验，以检测抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对 DC的刺激是否被SOCS1调节。当用卵清蛋白-I肽(SIINFEKL; SEQ ID NO:ll)脉冲 和与卵清蛋白特异性的TCR T细胞(OT-I)共培养没有被进一步刺激成熟的未成熟 SOSCl-siRNA-DCs或者siRNA突变的DCs时，OT-I细胞在SOCSl-siRNA-DC共 培养物中比在siRNA-DC突变的共培养物中增殖更多(图4A)。与这些数据一致， 在SOCSl-siRNA-DC共培养物中分泌更高水平的促炎细胞因子(图4B)。另外，指 示这些细胞的CTL分析显示，与SOCSl-siRNA-DC共培养后，对卵清蛋白+同系 基因型的EG7细胞具有更强的细胞毒性，显示SOCS1有助于抗原特异性的T细 胞对DC刺激的调节。接着，通过用卵清蛋白脉冲、转导的DCs直接免疫小鼠，在缺乏先体外后 体内成熟时，检测SOCSl沉默的DCs体内引发抗原特异性应答的能力。四聚体染 色显示，在用LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠中，2.3%的总CD8+T细胞对卵清 蛋白四聚体是阳性的，与其相比，用LV-GFP-siRNA-DCs或者模拟DCs分别免疫 的小鼠中只有0.64%和0.43% (图5A)。因为LV-SOCSl-siRNA-DCs或LV-GFP siRNA-DCs之间的表面成熟标志只有小的差异，所以这些数据表明，DC成熟的增 加不是贡献LV-SOCSl-siRNA-DCs功能性效价的唯一因素。用干扰素y (IFNy) ELISPOT分析，进一步评价免疫小鼠中的008+ T细胞的功能状态。用不成熟的 LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠每2xl05个CD8+ T细胞具有68个IFNy+斑点， 与其相比，在用未成熟的模拟DC或者LV-GFP-siRNA-DCs分別免疫的小鼠中，只 有1和18个斑点(图5B)。这些结果与CTL分析结果一致，说明对来自给予未成 熟LV-SOCSl-siRNA-DCs的小鼠的脾细胞的卵清蛋白+靶细胞，具有更强的细胞毒 性(图5C)。用未成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫也诱导可观察到的强抗原特异性 CD4+辅助性T的应答。因此，SOCS1沉默允许未成熟的抗原呈递DCs，以获得 能够引发体内抗原特异性的CD8+ CTL应答的免疫原状态。不希望束缚于任何具体 的理论，可以相信，无需在前成熟的SOCSl沉默的DCs引发了获得性免疫，因此 SOCS1在维持DCs的耐受原状态中发挥调节作用。
SOCS1介导的对成熟DCs的体内调节进行下面的实验，以研究无需在前成熟，SOCS1沉默的DCs对CTL应答 的引发是否是应答内源性环境刺激时DCs的成熟增强的结果。首先，卵清蛋白脉 冲的LV-SOCSl-siRNA-DCs用LPS先体外后体内24小时使其成熟，接着在对小鼠 给药前洗涤三次。用LPS成熟的LV-SOCSl-siRNA-DCs显示了相当于成熟 LV-GFP-siRNA-DCs的成熟表型，并且两种DCs都比缺乏先体外后体内成熟的DCs更加有效地引发CTLs。然而，在诱导抗原特异性的CTLs方面，成熟 LV-SOCSl-siRNA-DCs仍然明显地优于成熟LV-GFP-siRNA-DCs，如通过卵清蛋白 四聚体染色所显示(图5A)。 IFN-yELISPOT分析也表明，在LV-SOCSl-siRNA-DCs 小鼠中增强的卵清蛋白特异性008+ T细胞的应答(图5B)，这表明SOCS1沉默允 许成熟的DCs对导致增强CTL应答的内源性环境刺激具有更强的应答。
在进一步的体内试验中，对早一天被未成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的 小鼠，注射LPS —次。该刺激显著地(P < 0.01)增强了未成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs 小鼠的CTL应答(在CD8+ T细胞中有7.87%卵清蛋白四聚体+)，但在未成熟的 DC-GFP-siRNA小鼠中有效性降低(在CD8+ T细胞中有0.64%卵清蛋白四聚体+)(图 6a)。通过IFN-y ELISPOT分析证实，体内LPS刺激后，在未成熟的 LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠中，增强了卵清蛋白特异性的CTL应答(图6B)。
为了检测应答环境刺激的成熟DCs的信号传导是否在T细胞的引发中发挥 作用，对前一天用先体外后体内成熟的LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠一次或 者重复注射LPS。 LPS注射显著地(P < 0.01)增强了成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs小 鼠中的CTL应答，说明成熟的DCs的信号传导对引发T细胞应答的重要性(图6C 和6D)。而且，在用成熟的LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠中，LPS注射对增 强卵清蛋白特异性的CTL应答更有效。为了直接检测DC-SOCSl-siRNA对重复的LPS剌激的应答，评价了 SOCSl-siRNA-DCs禾n GFP-siRNA-DCs体外发展内毒素耐受性的能力。 SOCSl-siRNA-DCs而不是GFP-siRNA-DCs通过产生高水平的促炎细胞因子，仍 然强烈地应答重复的LPS刺激，这暗示S0CS1沉默的DCs持续地应答刺激。另
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热休克蛋白(HSP)应答的阀值通过SOCS1沉默被降低。综合考虑，这些数据显示沉默DCs中的SOCSl可能降低了DC应答性阀值， 并允许未成熟和成熟的抗原呈递的DCs持续应答内源性剌激，结果增强了抗原特 异性的CTL应答。该机制强调SOCS1在控制通过成熟DCs的抗原呈递的程度和 由此的适应性免疫强度中发挥关键作用。
通过体内刺激增强S0CS1沉默的DC免疫为了研究细胞因子或者Toll样受体(TLR)激动剂的体内刺激是否能够进一 步提高SOCS1沉默的DCs的效能，对用OVA脉冲的DC-LV-SOCSl-siRNA免疫 的小鼠注射LPS (30 ng/鼠)、CpG (60 pg/鼠)、Poly I:C (50 ^g/鼠)、抗-CD40 (100 pg/ 鼠)或者IFN-g(l pg/鼠)，胃肠外注射(i.p.)， 一天一次，连续三天。观察到，这些 刺激优先增强了 DC-LV-SOCSl-siRNA小鼠诱导的CTL应答(图6E)。这些结果表 明，除了 LPS外，许多刺激能够进一步提高S0CS1沉默的DC免疫的效能。通过DCs中的SOCS1沉默增强抗肿瘤免疫观察到的SOCS1在DC抗原呈递中的调节作用促进了研究SOCS1沉默的 DCs是否可能诱导更强的抗原特异性的抗肿瘤免疫性，以导致控制先前形成的肿 瘤生长。在不存在先体外后体内成熟的情况下，卵清蛋白脉冲的 LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫完全阻止了所有试验小鼠中先前形成的卵清蛋白+ EG7 肿瘤的生长，相反，在不存在先体外后体内成熟的情况下，在给予卵清蛋白脉冲 的LV-GFP-siRNA-DCs或者模拟DCs的小鼠中，肿瘤的生长的减少是适中的(图 7A)。体内抗体阻断试验显示，是抗CD8抗体阻断而不是抗CD4，破坏了卵清蛋 白脉冲的LV-SOCSl-siRNA-DCs诱导的抗肿瘤活性(图7B),说明CD8+ CTLs在抗 肿瘤应答中的关键作用。为了检测SOCSl siRNA低聚双链体转染的DCs是否具有增强的抗肿瘤活 性，用SOCS1 siRNA低聚双链体或者对照低聚双链体转染DCs。接着用已经被 OVA或者TC-1肿瘤裂解物脉冲的转染DCs免疫多组小鼠。用脉冲的DCs免疫小 鼠后，用LPS (30 lig/鼠)体内刺激小鼠三次。DC免疫两周后，用OVA+ EG7肿瘤 或者TC-I肿瘤攻击免疫的小鼠。在EG7和TC-1肿瘤模型中观察到增强的抗肿瘤 活性(图7C和7D)。而且，IFNy ELISPOT分析显示，在用经TC-1肿瘤裂解物脉 冲的SOCS1 siRNA寡聚-DCs免疫的小鼠中，肿瘤特异性的CTL应答增强(图7E)。
进一步检验SOCS1沉默的DCs是否能够增强针对自身肿瘤相关抗原的免 疫应答。对这些实验，使用在弱免疫原B16黑素瘤细胞中自然表达的鼠黑素细胞 分化抗原酪氨酸酶相关蛋白(TRP)2。用B16肿瘤细胞接种C57BL/6小鼠，三天后 用TRP2肽脉冲的、用LPS体外剌激的成熟LV-SOCSl-siRNA-DCs或者 LV-GFP-siRNA-DCs,处理一次。成熟的LV-SOCS卜siRNA-DCs有效地阻止了巳形 成B16肿瘤的生长，然而成熟的LV-GFP-siRNA-DCs没有任何抑制效果(图8A)。 增强的抗肿瘤活性与LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠中的强有力的TRP2特异性的 CTL应答相关，如通过IFN-y ELISPOT和CTL分析所检测(图8B和8C)。只在给 予成熟的LV-SOCSl-siRNA-DCs的小鼠中检测到活跃的NK活性。与卵清蛋白+ EG7肿瘤结果相比,用未成熟TRP2脉冲的LV-SOCSl-siRNA-DCs进行的免疫不能 对B16细胞产生显著的(P > 0.05)抑制效果，这暗示DC的完全成熟和成熟后持续 信号传导是产生有效的抗肿瘤免疫所需要的。 一致地，观察到了GFPsiRNA转导 对CTL应答外源抗原(卵清蛋白)的非特异性的剌激作用。然而，非特异性的刺激 作用不足以增强CTL对自身抗原(TRP2)的应答。检测了用LV-SOCSl-siRNA-DCs的免疫诱导的可能不良的自身免疫病理。 观察到在用TRP2脉冲的SOCS1沉默的DCs免疫的小鼠上有色素形成 (epigmentation)(白癜风)。然而在200只以上的用卵清蛋白或者TRP2脉冲的 LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠中，免疫后多达三个月，没有观察到其它明显 的毒性。组织学分析免疫小鼠的所有主要器官和组织，没有观察到病理炎症，免
70疫组织化学染色没有显示在肾中有IgG或者IgM沉积。在LV-SOCSl-siRNA-DCs 和模拟DC小鼠中IgG(IgGl、 IgG2a)和抗dsDNA的水平相当。这些数据表明， LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫不会在小鼠中导致病理炎症。不希望束缚于任何具体 的理论，可以相信，SOCSl沉默的DCs具有显著增加的诱导有效的、抗原特异性 的、抗肿瘤免疫能力，该免疫能够阻止已形成的弱免疫原肿瘤生长。
SOC1的沉默增加通过DCs的抗原呈递和抗原特异性的抗肿瘤免疫此处提供的结果显示，DCs的刺激能力和获得性免疫的强度被DCs中的
SOCS1严格地调控。沉默抗原呈递的DCs中的S0CS1强烈地增加了抗原特异性
的抗肿瘤免疫。SOCS1提供了定量和定性地调控通过DCs的抗原呈递和获得性免
疫的强度的抑制机制。本公开内容显示了 S0CS1在调节通过成熟DCs的抗原呈递的程度中的关 键作用，由此说明了允许DC调控获得性免疫的强度和持续时间的调节机制。本文 例举了SOCSl在维持DC耐受原状态的重要性，其中同野生型DCs相比，SOCS1 沉默的DCs被赋予了在不存在对先体外后体内成熟的需要时，引发T细胞体内应 答的刺激性抗原呈递能力。不希望束缚于任何具体的理论，可以相信，DCs中 SOCS1控制获得性免疫的强度的精确机制涉及在抗原肽呈递、共刺激/共抑制和应 答于用细胞因子、微生物产物和也许还有细胞-细胞接触刺激时的细胞因子产生方 面，调节成熟DCs的信号传导和输出。基于有限数量的研究， 一般相信成熟的DCs是短命的。然而，最近用可靠 的遗传方法的研究显示，成熟抗原呈递DCs的寿命比以前估计的要长得多，在体 内持续2周，这支持了对通过成熟DCs的抗原呈递程度进行调节的必要性和重要 性。本发明涉及沉默DCs中的S0CS1的新原理，其作为通过失活DCs中的关 键制动(brake)以提高肿瘤疫苗效能的总体构思。用SOCS1沉默的DCs接种强 烈地增强了抗原特异性的抗肿瘤免疫，因为SOCS1沉默允许抗原呈递的免疫原 DC持续地体内刺激抗原特异性T细胞。通过增强DC成熟和促炎细胞因子如阻止 调节T细胞抑制的IL-6的产生，SOCSl沉默的DCs能够关闭调节T细胞。
CTLA-4对T细胞的阻断有效地破坏了耐受性和提高了肿瘤疫苗的效能，但 是造成了患者严重的非特异性自身免疫炎症。通过在抗原呈递水平靶向作用DCs 中的SOCSl，能够获得更加抗原特异性的抗肿瘤应答。首先，用充分负载肿瘤相 关抗原的SOCSl沉默的DCs免疫会诱导抗原特异性的免疫，这与CTLA-4对效应 CTLs的靶向作用相反——其为不可避免地对重要的正常组织激活自身反应性T细 胞的方法。其次，利用部分SOCSl沉默的、具有残余SOCSl水平的DCs可能不 造成严重的自身免疫炎症，因为杂合的SOCSl+/—小鼠不显示或者只显示微弱的自 身免疫炎症迹象。另外，在SOCSl一小鼠中可见的严重的自身免疫炎症，要求不但
71在DCs中而且在其它谱系的免疫细胞如T和NKT细胞中完全缺乏SOCS1 。本文 呈现的结果不但提供了对于理解定量和定性地调节抗原呈递和获得性免疫的见 解，而且也提供了对通过提高DCs的刺激性效能而发展针对癌和传染性疾病的有 效疫苗的领悟。
实施例5: TRP2特异性的CTL和小鼠S0CS1 siRNADCs诱导的抗肿瘤活性
本公开内容显示，成熟DCs中表达SOCS1 siRNA减少的S0CS1表达的慢 病毒载体可以增加自身抗原特异性CTL应答的强度。小鼠黑素细胞分化抗原，酪 氨酸酶相关蛋白2(TRP2)被用作本研究的模型自身抗原。用TRP2是因为，它在正 常的黑素细胞和弱免疫原的B16黑素瘤细胞都自然地表达f并且已经鉴定了多个 TRP2中的MHC I类表位(van Elsas等人，2001, J. Exp. Med. 194:481-9)。
现在描述该实施例中提供的实验中所用的材料和方法。
小鼠/动物模型四到六周大的雌性C57BL/6、 CD4KO、 CD8 KO或者p35 (IL-12) KO小鼠 购自Jackson Laboratories (Ben Harbor, Maine, USA)，并根据有关机构的指导，供养 在Baylor College of Medicine (Houston, TX, USA)的无病原的鼠设备中。
肽类 H2-Kb限制性TRP2a(VYDFFVWL; SEQ ID NO:15)和TRP2b (SVYDFFVWL; SEQ ID NO:16)(van Elsas等人，2001, J. Exp. Med. 194:481-9)与对照H2-Kb限制性 OVA-I (SIINFEKL; SEQ ID NO:ll)由Genemed Synthesis Inc. (South San Francisco, CA, USA)合成并通过HPLC纯化到>95%的纯度。所有的肽在最后稀释在无内毒素 的PBS (Sigma, St. Louis, MO)之前溶解在DMSO中。
用慢病毒载体转导BM衍生的DCs根据本文其它地方所述，产生、滴定和使用重组的慢病毒载体 (LV-SOCSl-siRNA和LV陽GFP-siRNA)转导DCs。
细胞因子的ELISA和酶联免疫斑点(ELISPOT)分析利用DC培养物的上清，根据制造商的说明，在指定的时间点和用指定的 刺激物，定量各种促炎细胞因子的水平，以进行ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)。如在Huang等人，2003, Cancer Res. 63:7321-9中所述，对分离 的CD4+或者CD8+ T细胞进行ELISPOT分析。用H2-Kb/TRP2 I类肽对小鼠CD8+ T细胞刺激。也使用来自OVA的无关肽作为阴性对照。用MACS CD8 (Ly-2) MicroBeads (Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA)从脾细胞分离CD8+ T细胞。
72流式细胞术分析用在含有0.1% NaN3和2% FCS的PBS中的FITC或者PE mAbs染色细胞。 对小鼠CD8 (53-6.7)、 CDllc(HL3)、 CD40(3/23)、 CD80 (16-10A1)、 CD86(GL1)、 OX40L (RM134L)或者PDL1 (MIH5)特异性的抗体和匹配的同种型对照购自BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ)或者eBioscience (San Diego, CA)。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, Franklin Lakes, NJ)流式细胞仪上分析染色的细 胞。
四聚体染色利用H2-Kb/TRP2-PE四聚体分析，检测TRP2特异性的小鼠CD8+ T细胞。 TRP2四聚体在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (Houston, TX， USA) 合成。用抗-CD8a-FITC/抗-CD3-PerCP和H2-Kb/TRP2-PE共染免疫小鼠的脾细胞。 根据制造商的教导，每106个细胞用1吗的抗-CD8a-Fitc和1:100稀释的TRP2-PE 四聚体在4°C下进行四聚体染色1 h。
DC免疫和肿瘤小鼠研究如本文其它地方所述，用MOI为5的SOCSl-siRNA或者GFP-siRNA转导 BM衍生的DCs (4-5天的BM培养物)。简而言之，用肽脉冲DCs 20小时，用PBS 洗三次，用LPS (100 ng/ml, Sigma, St. Louis, MO)或者TNFa (500 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)刺激24 hr，用PBS洗三次，接着经后爪垫注射到 C57BL/6、 CD8KO、 CD4 KO或者p35 KO小鼠中。在治疗模型中，B16肿瘤细胞 (2.5xl0"被皮下注射(s.c.)到同系基因型小鼠的身体右侧，以建立肿痫模型。在肿 瘤接种后的第三天，将小鼠随机分组并注射30 pl的肽脉冲的(50 pg/ml)、转导的 DCs (1.5xl0,或者PBS对照。在一些小鼠中，在DC接种后的指定日期，腹膜(i.p.) 给予LPS (30 pg/鼠)或者重组的鼠IL-12蛋白(l ng/鼠，P邻rotech， Rocky Hill， NJ)。 每两天用测径器测量肿瘤的体积，直到实验结束。
CTL分析用测量体外再刺激的脾细胞裂解靶细胞能力的标准铬释放分析，评价CD8+ CTL应答(Huang等人，2003, Cancer Res. 63:7321-9)。将来自于混合的2-3只免疫 小鼠的脾细胞在含有H2-Kb/TRP2肽的RPMI-1640中体外再刺激4-6天。将TRP2+ 靶B16细胞(H2-Kb)和对照EG7细胞(ATCC, Manassas, VA)用"Cr铬酸钠溶液在 37。C下标记卯分钟，同时振荡。在96孔U形底部板(200 pl/孔)中，在37°C下用 恒定数目(5xl0 L)的靶细胞温育不同数目的效应细胞四小时。收集并分析三份培 养物的上清。裂解百分比计算为(实验释放-自发释放y(最大释放-自发释放)X 100。
统计分析
对于统计分析，使用"学生"t检验，95%的置信限被认为是显著的，定义 为P〈0.05 。结果通常显示为平均士标准误差(SE)。
现在描述该实施例的实验结果。
成熟DCs中的信号传导——受S0CS1限制，调控自身抗原特异性CTL应答强度 和耐受性用TRP2肽脉冲的、转导的、先体外后体内用LPS成熟的DCs免疫C57BL/6 小鼠。接着在存在或者不存在LPS时，体内刺激免疫的小鼠一次或者三次，并用 四聚体分析测量TRP2特异性的CTL应答。选择LPS用于体内刺激是由于它诱导 大量的、其中的许多被SOCS1调控的促炎细胞因子，以及文献记载的S0CS1在 直接调控NF-KB(p65)信号传导中的作用(Ryo等人2003,Mo1. Cell. 12:1413-26)。不 存在体内LPS刺激时，在用SOCSl-siRNADC免疫的小鼠中，5.1%的总CD8+T 细胞对TRP2四聚体为阳性，与其相比，在用GFP-siRNADC免疫的小鼠中，只有 3.1% (图9A)。经1次或者3次的体内LPS刺激，在SOCSl-siRNADC免疫的小鼠 中，对TRP2四聚体为阳性的CD8+ T细胞的百分率大大地增加(分别为9.7%和 19.4%)，但在GFP-siRNA DC免疫的小鼠中基本未变化(分别为3.0%和4.0%)(图 9A)。 一致的是，CTL分析(图9C)和干扰素-Y(IFN力ELISPOT显示了相似的结果。 而且，在大多数TRP2肽脉冲的SOCSl-siRNA DC免疫并在免疫三个月后共注射 LPS的小鼠中，白癜风(表皮发亮、褪色和/或者毛发损失)是明显的(图9B)，这说 明破坏了对通常在宿主黑素细胞中表达的TRP2的自体耐受性。相反，没有在任何 的GFP-siRNA DC免疫的小鼠中观察到白癜风，甚至在体内重复LPS给药的小鼠 中也没有观察到，这暗示SOCS1在DCs中维持自体抗原耐受性中的关键作用。这 些结果显示，成熟抗原呈递的DCs中的信号传导调控CTL应答强度和自身耐受性， 和成熟DCs的信号传导受SOCS1的严格限制。
S0CS1限制性信号传导调控DCs破坏自体耐受性和诱导有效的抗肿瘤免疫的能力
肿瘤接种的主要目标是，通过诱导针对优先在肿瘤细胞中表达的自身抗原 的强获得性免疫应答，破坏自体耐受性。观察到的SOCSl在调节自身抗原特异性 的CTL应答强度和自体耐受性中的作用，促进了研究成熟的DCs诱导有效抗肿瘤 免疫的能力是否受SOCSl表达的调控。为了检验这点，对C57BL/6小鼠皮下接种 B16肿瘤细胞并在三天后用经LPS先体外后体内成熟的TRP2脉冲的、转导DCs 免疫一次。图10A表明同用GFP-siRNADC免疫相比，SOCSl-siRNADC单独免 疫能够显著地抑制B16肿瘤的生长(P0.01)。然而，50%的SOCSl-siRNADC免 疫小鼠在肿瘤接种30天后，最终死亡，肿瘤负荷H,500mm3。为了确定通过增强 促炎信号是否改善SOCSl-siRNADC免疫小鼠的存活率，DC免疫后一天，用LPS 对小鼠体内刺激一次。在免疫方案中加入LPS刺激大大地阻止了 SOCS1 -siRNA DC
74免疫小鼠中B16肿瘤的生长(图IOB)。这与GFP-siRNA DC和模拟转导的DC对 照相反，同非LPS刺激的小鼠比较，它们没有显示肿瘤负荷的减少(比较图IOA和 IOB)。 SOCSl-siRNA DC免疫和LPS攻击的结合也使>60天的鼠存活率显著地增 加到100% (图10C)。抗肿瘤活性的增加与SOCSl-siRNA DC免疫的小鼠中强TRP2 特异性CTL活性相关(图10D)。通过用SOCSl-siRNA DCs免疫CD4和CD8敲除 (KO)小鼠，进一步显示，抗肿瘤活性需要CD8+和CD4+细胞，但在免疫的CD4 KO 小鼠中发现了弱抗肿瘤活性(图IOB-IOD)。总之，这些数据指出，在成熟的DCs 中SOCS1限制性信号传导调控它们破坏耐受性和诱导有效抗肿瘤免疫的能力，以 及通常受SOCS1调节的附加促炎信号能够进一歩增加诱导的抗肿瘤免疫应答调控 已形成的肿瘤负荷的能力。
SOCS1限制性信号3在调控自身耐受性和抗肿瘤免疫中的关键作用 SOCS1可能通过调控抗原肽/MHC呈递、共刺激和/或细胞因子信号传导和
分泌，影响成熟DCs的信号转导和产生。提出以下实验以研究这三个信号中的哪
一个(或几个)主要受SOCSl调节，以调控自身抗原特异性CTL应答和抗肿瘤免疫。首先检测SOCS1沉默是否影响共刺激性分子(信号2)的表达。通过流式细 胞术分析， 一致地观察到，LPS诱导成熟前后，在SOCSl-siRNA DCs上的共刺激 性/抑制性分子(B7.1、B7.2、OX40L、CD40或者PDL1)的表面水平，同在GFP-siRNA DCs上的相比，没有可检测的提高或者仅仅是轻微的提高(图IIA)。也在 SOCSl-siRNA DCs和GFP-siRNA DCs上检测到相当的MHC-I和II分子水平。 [G4G8]基于CD8,' T细胞在诱导抗肿瘤免疫中的重要性，进一步研究，MHC-!限 制性肽免疫原性(TCR亲和力)是否在体内SOCS1限制性抗原呈递中发挥重要作 用。因为以前己鉴定出TRP2 CTL肽的高亲和形式(TRP2b)和低亲和形式 (TRP2a)(van Elsas等人，2001, J. Exp. Med. 194:481-9)，所以用两种TRP2肽检测 信号1的强度是否可以影响转导的DCs诱导抗肿瘤免疫应答的能力。图IIB表明， 通过体内LPS刺激，负荷低(TRP2a)或高亲和力(TRP2b)的肽的成熟GFP-siRNA DCs不能诱导B16肿瘤消退，尽管负荷TRP2b肽的GFP-siRNA DCs显示了微小 的抗瘤活性(统计学上不显著)。相反，负荷低或者高亲和力TRP2肽的SOCSl-siRNA DC组都有效地阻断了肿瘤生长。用IF所ELISPOT分析也研究了免疫小鼠中的 TRP2特异性的CTL活性。图11C显示，负荷高亲和力肽的GFP-siRNA DCs比负 荷低亲和力肽的GFP-siRNA DCs诱导更强的IFNy应答。然而，负荷低或者高亲和 力肽的SOCSl-siRNA DC组都比负荷高亲和力肽的GFP-siRNADCs诱导强得多的 IFNy应答(PO.Ol)，这与观察到的抗肿瘤活性一致(图UB)。另夕卜，负荷低或者 高亲和力肽的SOCSl-siRNA DCs诱导相似的IFNy应答(图IIC)。
这些实验的结果说明，SOCS1沉默对共刺激性/抑制性分子(信号2)与
75MHC-I和II分子在成熟或者未成熟DCS上的表达没有显著的影响；并且负荷低或 者高亲和力TRP2肽(信号l)的成熟DCs对诱导强IFNY应答和抗肿瘤免疫不是有效 的，除非SOCSl被沉默。
实施例6: IL-12体内增加小鼠SOCSl siRNADCs诱导的CTL和抗肿瘤活性
尽管通过树突状细胞(DCs)引发细胞毒性T细胞(CTL)的应答已经研究得很 好，但是对维持或者破坏自身耐受性的调节机制仍然阐述地很少。该实施例中， 显示是其细胞因子信号传导抑制因子(SOCS) 1已经被沉默的成熟DCs而不是成熟 野生型DCs，有效地破坏自身耐受性，特别是当用微生物产物或者IL-12体内刺激 时。在此公开的实验显示，抗原呈递的DCs提供的SOCSl限制性信号3(IL-12)， 而不是抗原亲和力(信号l)和共刺激性分子(信号2)的水平关键地调控自身耐受性。 其次，本公开内容显示，SOCSl沉默的DCs诱导针对自身抗原的强免疫应答，阻 止了已经形成的B16肿瘤的生长。而且，人SOCSl沉默的DCs具有充分激活具 有溶解效应功能的自身抗原特异性人CTLs的强大能力，这暗示该SOCSl沉默方 法的翻译效能。 SOCSl限制性信号3在调控自身抗原特异性的CTL激活和耐受性中的可能 重要性促进了对受成熟DCs中的SOCSl调节的关键细胞因子(一个或者多个)的鉴 定。最初用来自用于DC接种的不同基因纯合KO小鼠的DCs，结合SOCSl沉默， 检测已知影响CTL激活的几个候选促炎细胞因子的重要性。当用来自 IL-12(p3 5;)KO小鼠的DCs免疫时，观察到负荷TRP2肽的p35一 SOCS1 -siRNA DCs
不再抑制B16肿瘤的生长(图12A-12B)，这说明SOCSl限制性的和DC产生的IL-12 Bi偷、)a;曰的主ti;争^r田 ^"ryt—法:sft^ tt —i，龙《;r>r<n限法il'Mt r r rfi台&cf3的主
键作用，评价了通过p35-A SOCS1 -siRNA DCs诱导的CTL应答。利用IFNy ELISPOT 和CTL分析，观察到，同野生型SOCS 1-siRNA DCs相比，p3 5; SOCSl-siRNADCs 具有显著减小的诱导TRP2特异性CTL应答的能力(图12C和12D)。另外，如通 过TRP2四聚体分析所测量，LPS体内剌激不能增强p35; SOCSl-siRNA DCs诱导 的CTL应答(图9A)。有趣的是，与抗原呈递的DCs产生的IL-12的基本作用相比， 观察到，用野生型SOCSl-siRNA DCs免疫的IL-12 (p35, KO小鼠也诱导主动的 抗肿瘤免疫和CTL应答，这说明宿主居留细胞产生的IL-12是诱导抗原特异性的 CTL应答所不需要的(图12A-12D)。总之，这些结果说明，抗原呈递的DCs产生 的SOCSl限制性的IL-12对诱导强TRP2特异性CTL应答和B16肿瘤根除是重要 的。
SOCSl沉默的DCs持续和高水平地产生IL-12和IL-12诱导的细胞因子与wt DCs 进行的短暂和低水平产生比较 DCs产生相当数量的IL-12以应答微生物产物如LPS和CD40的结合(Schulz等人，2000， Immunity 13:453-62)。 IL-12通过DCs的产生被严格地限制在诱导成 熟后的短时间(8-16小时)内(Langenkamp等人，2000, Nat. Immunol. 1:311-6)，并且 受S0CS1的调节(Eyles等人，2002， J. Biol. Chem. 277:43735-40)。基于已经鉴定的 SOCSI限制性IL-12在调节获得性免疫中的重要作用，检测了 SOCS1沉默对通过 DCs产生IL-12的强度和持续时间的作用，该作用可以与SOCSl-siRNA DCs破坏 免疫耐受性和诱导有效的抗肿瘤免疫应答TRP2的能力密切相关。
图13A表明，同GFP-siRNA DCs和模拟转导的DCs相比，显著增加的 IL-12(p70)水平是由SOCSl-siRNA DCs产生的，以应答LPS和抗CD40 mAb 72个 小时的持续刺激。然后，通过用LPS/抗-CD40刺激它们24小时，接着将不含LPS 的新鲜培养基中的DCs转移到新的培养板上，检测SOCSl-siRNA DCs维持IL-12 水平的能力，尽管移去了最初的刺激物。图13B表明，刺激后GFP-siRNA DCs和 模拟转导的DCs只短暂地产生IL-12,而尽管移去了刺激物，SOCSl-siRNA DCs 持续地产生显著地更高水平的IL-12。不希望束缚于任何具体的理论，移去LPS/ 抗CD40后，由SOCSl-siRNA DCs延长和增加产生IL-12可能是由于原来的刺激 物和/或者可能的IL-12自分泌/旁分泌的刺激或者其它DC分泌的促炎细胞因子所 诱导的对信号传导途径的延长激活。这些结果指出，SOCSI沉默允许DCs产生持 续的和增加水平的IL-12以应答刺激，这可能与SOCSI沉默的DCs破坏耐受性和 根除己形成的肿瘤的能力有关。因为SOCSI是调节IL-12和其它细胞因子的信号传导的Jak/Stat途径的关 键调节因子(Kubo等人，2003, Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等人，2004, Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)，所以提出下一套实验，以检测DCs中的SOCSI沉默是 否通过在它们自身和可能的其它临近DCs之问形成细胞囚子反馈环而増加细胞因 子的产生。为了说明这点，测量了 SOCSl-siRNA DCs产生的肿瘤坏死因子(TNF)a 和IL-6。检测(TNF)ot和IL-6是因为已知这些细胞因子通过IL-12刺激诱导 (Trinchieri等人，2003, Nat. Rev. Immunol. 3:133-46)图13C表明，在除去最初的刺激物后，SOCSl-siRNA DCs持续地产生更高 水平的TNFa和IL-6，与其相反，GFP-siRNA DCs和模拟转导的DCs仅短暂地产 生低水平的TNFa和IL-6。为了进一步确定IL-12在形成反馈环中的重要性，比较 了通过p35一 SOCSl-siRNA DCs和wt SOCSl-siRNA DCs的TNFa禾卩IL-6产量。图 13D显示,p35: SOCSl-siRNA DCs不再能够产生增加的和延长的TNFa和IL-6量， 这说明IL-12反馈是通过SOCSl-siRNA DCs产生TNFa和IL-6的关键诱导因子。 这些数据表明，SOCSI沉默失活了 DCs中的关键信号传导制动，因此允许它们经 增强的反馈环持续地应答和产生不仅IL-12而且IL-12诱导的促炎细胞因子。此处 公开的结果提供了可能的机制，以解释TRP2负荷的SOCSl-siRNADCs诱导白癜 风和有效的抗肿瘤免疫B16肿瘤细胞的能力。
77SOCS1限制性IL-]2信号传导对调控DCs破坏自身耐受性的能力的重要性
SOCSl-siRNADCs诱导针对自身肿瘤相关抗原的强CTL应答的能力，提出 S0CS1沉默策略的治疗应用。因为LPS作为患者刺激物的临床应用毒性太大，所 以评价了信号传导受SOCS1调节的IL-12是否在提高SOCSl-siRNA DCs的效能中 也是有效的。 C57BL/6小鼠用B16肿瘤细胞接种，三天后用经重组的小鼠TNFa先体外后 体内成熟的、TRP2脉冲的转导DCs免疫小鼠一次。DC免疫后，将受体小鼠用低 剂量的重组小鼠IL-12 (1 pg/鼠)体内刺激三次。图14A显示，有效地阻止了 SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中的B16肿瘤的生长。相反，同PBS对照相比，用IL-12 体内给药的GFP-siRNA DC免疫对肿瘤的生长没有影响。抗肿瘤活性与 SOCSl-siRNA DC免疫小鼠中的增加的TRP2特异性CTL活性相关，如通过IF所 ELISPOT分析所示(图14B)。与前期的观察一致(图IOA),在没有体内IL-12刺激 时，同GFP-siRNA DC对照相比，用TRP2脉冲的、TNFa成熟的SOCSl-siRNA DCs 的免疫也显示了增加的抗肿瘤活性。这些结果说明IL-12的体内给药显著地提高了 SOCS1沉默的DCs的免疫能 力，但野生型DCs没有，这可能是由于增强了 IL-12和IL-12诱导的细胞因子的信 号传导。这些结果进一步暗示，是抗原呈递的DCs中的SOCS1限制性细胞因子信 号传导，而不是细胞因子如IL-12的全身性浓度，对诱导有效的、针对自身肿瘤相 关抗原的抗肿瘤免疫是重要的。在用LPS或者IL-12共注射、用TRP2脉冲的SOCSl-siRNA-DC小鼠中， 免疫后长达六个月，除了白癜风，没有观察到明显的毒性。对免疫小鼠的所有主 要器官和组织的组织学分析没有发现病理学炎症。在SOCSl-siRNA-DC和模拟DC 小鼠中的IgG和抗dsDNA的水平相当。这些数据说明，TRP2脉冲的 SOCSl-siRNA-DC免疫没有在小鼠中造成病理学炎症。
SOCS1限制性信号3的强度调控CTL激活、耐受性和抗肿瘤免疫
此处公开的结果提供了对通过成熟的DCs调节CTL应答的新见解，这对于 发展肿瘤疫苗应该具有深远的意义。已知的是，成熟是DC从不成熟的耐受原状态 过渡到成熟的免疫原状态的控制点(Banchereau等人，1998, Nature 392:245-52; Steinman等人，2003， Annu. Rev, Immunol. 21:685-711)。人们相信，抗原呈递DC 和T细胞之间的起始接触强度(信号1和2)决定了 CTL应答的强度和命运，因为基 于有限数量的研究，成熟的DCs被认为是短命的(Porgador等人，1998, Journal of Experimental Medicine 188:1075-82; Ingulli等人，1997, J. Exp. Med. 185:2133-41; Ruedl等人，2000, J. Immunol. 165:4910-6)。然而，利用可靠的遗传方法的最近研 究显示，成熟抗原呈递的DCs的寿命比以前估计的长得多，体内持续两周(Garg 等人，2003, Nat. Immunol. 4:907-12)，这说明成熟的DCs在与T细胞起始结合后的可能的调节作用。本结果显示，受SOCSl严格限制的成熟DCs中的促炎信号传导，严格控 制自身抗原特异性的CTL应答的强度。这说明DCs在至少两个水平上控制CTL 应答起始CTL应答所需要的DC成熟和用它们本身和CTLs进行的成熟DCs的 细胞因子信号传导，其强度受SOCSl表达的调节。本结果进一步暗示DCs与它们 周边环境的各种免疫细胞以及细胞因子和微生物产物的组成/浓度之间的动力学相 互作用，这共同决定了自身耐受性的维持或破坏以及因此决定自身抗原特异性 CTL应答的命运。此处公开的结果揭示了对维持或者破坏自身耐受性进行调节的新机制。发 现是DCs提供的SOCSl限制性信号3 (IL-12),不是肽亲和力和共刺激性分子的水 平严格地控制自身耐受性。许多自身免疫疾病的研究(Banchereau等人，2004, Immunity 20:539陽50)和其它模型(Curtsinger等人，2003, J. Exp. Med. 197:1141-51; Valenzuela等人，2002, J. Immunol. 169:6842-9)已经暗示了细胞因子在DC介导的T 细胞激活或者过度激活中的重要性。刺激后，wtDCs产生细胞因子如IL-12是短暂的并受SOCSl抑制，如此处 和他人的研究所示(Langenkamp等人，2000, Nat. Immunol. 1:311-6)。观察到，与 wtDCs相反，在失活Jak/Stat信号传导途径中的可诱导反馈抑制因子后，通过形成 复杂的贯通DCs中的该Jak/Stat信号传导途径的自分泌(以及可能的旁分泌)信号传 导环，SOCSl沉默的DCs能够持续地产生显著增加的IL-12和IL-12诱导的细胞 因子水平，以应答起始刺激。 一致的是，发现用低剂量的IL-12体内给药有效地提 高了 SOCSl沉默的DC而不是wtDC破坏自身耐受性的能力。 L0424j总之，这些结果说明，持续和增加的IL-12和IL-12诱导的细胞因了的产生 和信号传导，其由SOCSl沉默的DCs产生，可能在破坏自身耐受性和增强抗肿瘤 CTL应答中发挥关键作用。该结果进一步说明，通过对DCs中SOCSl的剌激性信 号传导的细胞内抑制有助于维持自身耐受性。尽管发现SOCSl通过靶向p65蛋白 直接阻断NF-kB信号传导，用于通过其SOCSBox区域进行泛素介导的蛋白酶解 (Ryo等人，2003， Mol. Cell. 12:1413-26)，但Gingras等人报道，SOCSl通过抑制I 型IFN的信号传导，间接地调节巨噬细胞中的TLR信号传导以获得LPS诱导的毒 性(Gingras等人，2004， J. Biol. Chem. 279:54702-7)。与通过I型IFN信号传导的 LPS诱导的毒性不同，此处的结果显示，SOCSl沉默的DCs诱导的CTL应答主 要受IL-12介导。此处的结果也显示了 SOCSl沉默的DCs增加了各种细胞因子如 TNF-a、 IL-6和IL-12的产生，以应答LPS。该研究显示了沉默DCs中的SOCSl对诱导有效的、针对自身肿瘤相关抗 原的抗肿瘤免疫的必要性。DC疫苗已经被视为用于肿瘤接种的最有前途的策略之 一，这在最近的几年中，在98个公开的涉及1000多个患者的DC疫苗临床试验中 得到了证实(Rosenberg等人，2004, Nat. Med. 10:909-15)。这些尝试主要旨在通过各种方法促进DCs抗原呈递和成熟，由于很低的客观临床应答率，大部分是失望 的(Rosenberg等人，2004， Nat. Med. 10:909-15)。此处的数据显示，负荷高亲和力 肽的wtDCs即使在用LPS或者IL-12体内刺激后仍然不能打破自身耐受性。因此， 此处的结果可以解释目前描述的肿瘤疫苗为什么通常无效(Rosenberg等人，2004， Nat. Med. 10:909-15)，并提供了通过沉默关键的信号传导抑制因子如SOCS1 ，结 合目前促进DC抗原呈递和成熟的策略(Gilboa, 2004, Nat. Rev. Cancer 4:401-11; You等人，2000, J. Immunol. 165:4581-4592; Soiffer等人，2003, J. Clin. Oncol. 21:3343-50; Pardoll, 2002, Nat. Rev. Immunol. 2:227-38),而开发更有效的肿瘤疫苗 的方法。本SOCSi沉默方法，具有特异性地提高通过抗原负荷的DCs诱导的抗原 特异性免疫应答的能力，其也会比系统性阻断效应T细胞上的CTLA4的方法更具 吸引性，因为该方法不区分地过度激活包括针对重要组织和器官的自身反应性T 细胞(Hodi等人，2003, Proc. Natl. Acad. Sd. USA 100:4712-7; Phan等人，2003, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 100:8372-7)。总之，鉴于增加肿瘤疫苗的大量努力已经集中 在改善抗原亲和力/剂量和共刺激上，在本研究发现的调节自身耐受性和提高 SOCSl沉默的DCs免疫刺激性能力的新机制，应该提供一般可应用的、新接种策 略，以破坏针对肿瘤的自身耐受性限制。
实施例7:小鼠SOCS1 siRNADCs诱导的HIV特异性的抗体和CTL应答
本实施例显示了通过抑制宿主的天然免疫抑制因子诱导抗HIV免疫应答的 可选策略。本研究显示，DCs中的JAK/STAT途径的负免疫调节因子SOCSl不但 控制HIV特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，而且控制抗体的应答。SOCS1沉 默的DCs对HIV包膜介导的抑制具有抗性，并且有效地诱导小鼠中平衡的、记忆 HIV包膜特异性的抗体和CTL应答。本公开内容提出了通过抑制宿主的免疫抑制 因子，引发HIV特异性的抗体和CTL应答的首次尝试。
现在描述该实施例的实验所用的材料和方法。
用慢病毒载体转导BM衍生的DCs产生、滴定和使用重组的慢病毒载体LV-SOCSl-siRNA和LV-GFP-siRNA 转导DCs，如本文其他地方所述。
细胞因子和抗体ELISA分析通过ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)，根据制造商的说明，定 量细胞培养物上清中的细胞因子水平。为了确定gpl20特异性的抗体和亚类的滴 度，4°C时过夜包被gpl20蛋白(在碳酸盐缓冲液中，5 pg/ml [pH9.6])，向孔中加 入12倍的在PBS-5。/。FBS中的血清系列稀释液，室温放置l小时。八次漂洗后，向孔中加入生物素化的抗小鼠抗体(抗小鼠IgM、 IgG、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b或者 IgG3)，室温放置l小时。用链霉亲和素-HRP作为过氧化物酶底物。加入50pl的 2 M H2S04终止反应。在Bio Assay Reader上在450 nm读取光密度。结果表示为终 点滴度的倒数，其从y轴为光密度(OD)值和x轴为稀释-l的散点图上确定，其中， 该图的x轴是对数刻度。将数据作图后，对每个单独的稀释系列进行对数曲线拟 合，确定曲线拟合与正负截断值(cut-off value)的交点。每种抗体同种型的截断 值计算为对照小鼠血清的所有稀释的平均值(+3SD)。同时对每个实验检测的所 有样品进行分析。
T细胞酶联免疫斑点(ELISPOT)分析根据本文其它地方所述，进行ELISPOT分析分离的004+或者〔08+ T细胞。
B细胞分离和产gpl20抗体的B细胞ELISPOT分析在完全RPMI 1640培养基中从脾制备的单细胞悬浮液在塑料培养皿上在 37。C下和5% C02中铺板1 hr，以除去黏附的巨噬细胞。非黏附细胞用抗-Thy1.2 和兔补体在37°C下处理45分钟以溶解T细胞。残余B细胞的纯度通常超过90%。 通过以前所述的改良方法进行B细胞ELISPOT分析(Le Bon等人，2001， Immunity 14:461-7023)。简而言之，用在PBS中的gpl20过夜包被96孔硝酸纤维素板 (Millipore Multiscreen PI)。用PBS洗涤所述板六次并用含有10% FBS的RPMI1640 在37°C下封闭2小时。将分离的B细胞种到孔中(5xl()S细胞/ L)并在5% C02中 在37°C温育20小时。接着通过用PBS 0.5% T，,veen 20 (Sigma, St. Louis, MO)洗涤 六次除去细胞。加入用含有0.5% FBS的PBS稀释到1 /xg/ml的生物素化抗小鼠IgG (BD Pharmgen)，将该混合物在37°C下温育2小时。加入亲和素:生物素化酶复合 体(ABC， Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA)，放置另外的1小时。与AEC (3-氨基-9-乙基咔唑；Sigma, St. Louis, MO)反应4分钟后检测抗-gp120 IgG。由ZellNet Consulting Inc. (New York, NY)用自动ELISPOT读出器系统(Carl Zeiss, Inc. Thornwood NY)，使用KS ELISPOT 4.3软件对结果进行评价。
定量RT-PCR分析BAFF和APRIL通过定量实时PCR评价了转染的小鼠BM-DCs中的SOCS1相对表达。使 用Trizol试齐(J(Invitrogen， Carlsbad， CA)，从DC提取总RNA，且对于每个样品， 使用随机六聚体引物和Superscript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)对1.0 的总RNA进行反转录。在ABI 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA)上进行实时5'核酸酶荧光PCR分析，采用 的四个平行反应，每个反应用相同的5 ng起始RNA材料做模板。BAFF和APRIL
81采用以下引物BAFF，有义5，-TGCTATGGGTCATGTCATCCA-3，(SEQIDNO:17) 和反义5，-GGCAGTGTTTTGGGCATATTC-3， (SEQ ID N0:18); APRIL,有义 5，-TCACAATGGGTCAGGTGGTATC-3， (SEQ ID NO: 19) 禾H 反 义 5，-TGTAAATGAAAGACACCTGCACTGT-3， (SEQ ID NO:20)。 18S的TaqMan探针、 正向引物和反向引物得自Taqman Rodent 18S对照试剂(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)。 PCR参数为TaqMan Universal PCR Master Mix kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)推荐的参数，在单独的管中进行BAFF、 APRIL和 18S反应。将BAFF和APRIL水平归一化到18S rRNA，同时用Comparative Ct方 法(Livak等人，2001, Methods 25:402-8)计算BAFF或者APRIL的表达(相对于模 拟转染的、刺激DCs的对照值)。
CTX分析用本文其他地方所述的标准的铬释放分析，评价CD8+CTL应答，该方法 测量体外再刺激的脾细胞溶解靶细胞的能力。将来自于混合的免疫小鼠脾细胞在 含有gpl20蛋白(20 /xg/ml)的RPMI-1640中体外再刺激4-6天。将用20 pg/ml的 gpl20蛋白过夜脉冲的靶细胞用"Cr铬酸钠溶液标记90分钟。将不同数目的效应 细胞与恒定数目的靶细胞(lxlO"孔)在37。C下，在96孔V形底部的板(200 pl/孔) 中温育3小时。平行收集三份培养物的上清(100pl)。细胞溶解的百分率计算为(实
验释放-自发释放y(最大释放-自发释放)X 100。
T和B细胞增殖分析根据本文其他地方所述，将分离的CD4+或者CD8+ T细胞(每孔1xl0"和B 细胞(每孔lxl05)， 一式三份培养在存在或者不存在各种刺激物的96孔板中的完全 培养基中。在培养的第四天，用l^Ci [3司-胸苷脉冲孔16小时。接着收集板并用 MicroBeta闪烁计数仪(TopCountNXT, Packard)测量掺入的[3H]-胸苷。
DC免疫根据本文其他地方所述，用MOI为5的LV-SOCSl-siRNA或者 LV-GFP-siRNA转导骨髓来源的DCs (在BM培养第5天)。
现在描述该实施例中的实验结果。
沉默DCs中的S0CS1增强HIV Env特异性的抗体应答首先研究了 SOCS1沉默对DCs诱导抗-HIV抗体应答的能力的影响。本研 究使用HIVEnv，因为它能够诱导细胞抗体和中和抗体的应答。根据本文其他地方 所述，产生重组的慢病毒载体(LV-SOCSl-siRNA)——该载体表达具有下调转染细
胞中大约90%—SOCS1 mRNA能力的SOCS1 siRNA--和对照载体
(LV-GFP-siRNA)。用LV-SOCSl-siRNA或者LV-GFP-siRNA转导小鼠骨髓(BM)源
82DCs,并负荷重组的HIV gpl20蛋白和用LPS先体外后体内成熟。接着用转导的 DCs间隔一周免疫多组小鼠两次，然后在每次DC免疫后进行体内LPS刺激。利 用体内剌激是基于观察其能够进一步增强SOCSl沉默的DCs诱导的CTL针对 肿瘤相关抗原的应答，如本文其他地方所公开。图15A显示，LV-SOCSl-siRNA-DCs 比对照LV-GFP-siRNA-DCs引发显著地更强的gpl20特异性的IgM和IgG应答。
其分布代表不同免疫学状态的不同抗体亚类的产生依赖于CD4+ T辅助性 (Th)l-和Th2-极化的细胞因子和Th细胞功能(Allen等人，1997, Immunol. Today 18:387-92)。图15B显示，同LV-GFP siRNA-DC小鼠中相应的亚类相比，在 LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫的小鼠中，所有IgG亚类的HIV Env特异性抗体的滴 度显著增加。Env特异性抗体亚类分布显示了 IgGl、 Th2应答的产物和与Thl应 答相关的亚类IgG2a的混合应答，这说明Thl-和Th2-依赖性免疫应答都通过 LV-SOCSl-siRNA-DCs诱导。重复实验获得了相似的结果。没有进行中和分析， 因为小鼠不是可靠的检测HIV中和活性的合适种类(Burton等人，2004， Nat. Immunol. 5:233-6)。进一步观察到，SOCSl沉默增强了对其它菌株HIV Env蛋白 和抗原如卵清蛋白(OVA)的抗体应答。这些结果显示，沉默DCs中的SOCSl显著 地增强了包括所有IgG亚类的HIVEnv特异性抗体应答，这暗示DCs中的SOCSl 在控制抗原特异性的抗体应答中的关键作用。
沉默DCs中的SOCSl增强了 HlVgpl20特异性的CTL应答
进行以下实验以评价SOCSl沉默是否能增强HIV Env特异性的CTL应答。 用IFNyELISPOT、细胞内细胞因子染色和CTL分析检测免疫小鼠中的CD8+T细 胞的功能状态。针对LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的gpl20脉冲的靶细胞的CTL 活性显著地强于LV-GFP-siRNA-DC小鼠(PO.Ol)(图15C)。这些分析中检测的CTL 活性是gpl20特异性的，因为LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的脾细胞缺乏任何明显 的针对非gpl20脉冲的靶细胞的CTL活性。一致的是，分别在LV-SOCSl-siRNA-DC 免疫小鼠中检测到每5xl05个CD8+ T细胞有363个IFNy+斑点，与其相比，在 LV-GFP-siRNA-DC小鼠中检测到191个斑点(图15D)。用IFN-Y细胞内染色脾细胞 也显示了 LV-SOCS-siRNA-DC小鼠中存在更高百分率的IFN-Y+T细胞。综合考虑， 这些结果显示，在SOCSl沉默的DCs免疫小鼠中针对HIV Env的平衡和增强的抗 体与CTL应答，说明DCs中的SOCSl关键地调节体液免疫和细胞免疫。
混合的、增强的SOCSl沉默DCs诱导的Thl和Th2应答不希望束缚于任何具体的理论，基于细胞因子在程序控制TM相对于Th2 应答中的作用(MacDonald等人，2002, J. Immunol. 168:3127-30; Gor等人，2003, Nat. Immunol. 4:503-5)，相信通过DC调节细胞因子的产生，SOCSl沉默可以影响CTL 和抗体的应答。图16A显示，LPS刺激后，同GFP-siRNA-DCs相比，
83LV-SOCSl-siRNA-DCs产生的IL-12、 IFN-y禾卩TNFa水平显著增加，这促进了 Thl 极化应答。有趣的是，也在S0CS1沉默的DCs中观察到IL-4、 IL-6和IL-10显著 地增加，促进了 Th2极化的应答(PO.Ol)。 Thl-和Th2-促进了 SOCS1沉默的DCs 更高水平地产生细胞因子可以解释SOCSl沉默的DCs提高了诱导HIV Env特异性 的CTL和抗体应答的能力。基于本结果，DCs中的SOCS1沉默明显地促进了抗体和CTL应答。以下 实验陈述了紧密参与抗体和CTL应答诱导的HIV Env特异性CD4+Th应答是否也 被S0CS1沉默增强。利用CD4+微珠从免疫小鼠中分离CD4+ T细胞并用各种分 析方法分析。如图16B所示，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的gpl20特异性CD4+ T细胞的频率显著地高于LV-GFP-siRNA-DC小鼠中。&-胸苷掺入分析法表明， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的CD4+ T细胞增殖比LV-GFP-siRNA-DC小鼠中的 更活跃，以应答gpl20脉冲的DCs的剌激(图16C)。从经gpl20脉冲的DCs刺激 后的LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠分离CD4+ T细胞，对该CD4+ T细胞产生的细 胞因子的分布进行分析，揭示，Thl极化的(IFN-y、IL-2和TNFa)和Th2极化的(IL-4 和IL-10)细胞因子的水平都增加(图16D)。这些结果说明，SOCS1沉默的DCs诱 导了增加的、混合Thl和Th2针对HIV Env的应答，这与图15B中混合的gpl20 特异性IgG亚类分布一致。
S0CS1沉默的DCs增强gpl20特异性B细胞的激活已经表明，DCs通过产生TNF超家族的成员APRIL (增殖诱导配体)和BAFF (B-淋巴细胞刺激因子，也称为BLyS)，直接促发B细胞增殖、成熟和类别转换重 组(Baiazs等人，2002， Iimn皿ity 17:341-52; Litinskiy等人，2002, Nat. Immunol. 3:822-9; MacLennan等人，2002， Immunity 17:235-8)。因此，利用实时RT-PCR评 价了 SOCS1沉默对DCs产生APRIL禾口 BAFF的影响。LPS刺激后， LV-SOCSl-siRNA-DCs比LV-GFP-siRNA-DCs表达更高水平的APRIL禾卩BAFF mRNA(图17A)，这与在SOCSl+DCs中BAFF和APRIL的表达增加一致(Hanada 等人，2003, Immunity 19:437-50)。为了检测SOCS1沉默的DCs增强激活gpl20特异性B细胞——一种抗 gpl20 IgG特异性B细胞的能力，用Elispot分析直接检测免疫小鼠中的产抗-gp120 IgG的B细胞的频率。在LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的产抗-gp120 IgG的B细胞 的频率显著高于LV-GFP-siRNA-DCs小鼠(PO.O])(图17B)。同LV-GFP-siRNA-DC 小鼠的B细胞相比，LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠中更高百分比的B细胞表现出激 活的表型，其特征在于高水平的CD69、 CD40和CD86。另外，纯化和用各种刺激 物刺激来自免疫小鼠脾的B细胞。图17C说明，当用抗-CD40和IL-4刺激时， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B细胞比LV-GFP-siRNA-DC小鼠的B细胞增殖更加 强烈。有趣的是，LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠的B细胞，但不是LV-GFP-siRNA-DC
84小鼠的B细胞，只强烈地应答IL-4或者抗-CD40 ，这说明通过用 LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫己经体内激活了更多的B细胞。也观察到， LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠中的B细胞产生更高水平的各种细胞因子，包括IL-6、 IL-2和TNF-a，以应答不同的刺激物(图17D)。总之，这些结果说明，SOCS1沉 默的DCs产生增加水平的B淋巴细胞刺激因子(BAFF和APRIL)和Th2极化的细 胞因子，导致更有效地激活HIVEnv特异性的B细胞和Th细胞。
SOCS1沉默的DCs诱导的长期HIV Env特异性CTL和抗体应答
已经表明，DCs中的SOCSl沉默增强了原发性HIV Env特异性的CTL和 抗体应答，因此进一步评价SOCS1沉默的DCs是否会诱导记忆性HIV特异性的 CTL和抗体应答。图18A表明，LV-GFP-siRNA-DCs免疫的小鼠在免疫后六个月 具有很低水平的gpl20特异性的抗体，然而LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠在它们的血 清中仍然保留相当滴度的gpl20特异性的IgGl和lgG2抗体。加强免疫后一周， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠显示了强回忆抗体应答(strong recall antibody response), 抗-gpl20 IgGl平均滴度为2xl05，抗-gpl20 IgG2的平均滴度为口105,而 LV-GFP-siRNA-DC小鼠显示了弱回忆抗体应答，IgGl的平均滴度为3X103， IgG2 的平均滴度为4xl02。这些数据表明，同GFP-siRNA-DCs相比，S0CS1沉默的DCs 显示了使IgGl和IgG2a抗体的滴度分别增加了大约64和255倍。
通过用IFN-y ELISPOT分析对gpl20特异性的CD8+和CD4+ T应答进行检 测，评价对记忆性HIV特异性的CTLs和Th的维持。图18B表明，免疫后6个月， 在LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中，但没有在LV-GFP-siRNA-DC小鼠中检测到强 gpl20特异性的CTL应答(在LV-SOCSLsiRNA-DC小鼠中，每5 X 105个CD8+ T 细胞具有249个IFNy斑点，而LV-GFP-siRNA-DC小鼠中为3个IFN7斑点)。加 强免疫快速地诱导LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中的强烈的gpl20特异性CTL应答， 而LV-GFP-siRNA-DC小鼠中没有(加强免疫后的第7天，在LV-SOCSl-siRNA-DC 小鼠中每5x 105个CD8+ T细胞具有446个IFN7斑点，而LV-GFP-siRNA-DC小 鼠中为16个IFN7斑点)(图18B)。在免疫后6个月，同LV-GFP siRNA-DC小鼠相 比，共染细胞内IFN-y和CD8+ T细胞的表面CD44记忆标记也显示， LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中更高百分比的0044出和正^^+ CD8+T细胞(图18C)。 相似地，在免疫后6个月，在LV-SOCSl-siRNA-DCs小鼠中，gpl20特异性的CD4+ Th应答被维持和快速地诱导(加强后的第7天，在LV-SOCSl-siRNA-DC小鼠中每 5x 105个CD4+ T细胞具有391个IFN7斑点，LV-GFP-siRNA-DC小鼠中为37个 IFN7斑点)(图18D)。因此，用SOCS1沉默的DCs免疫有效地诱导了长期HIVEnv 特异性的CTL、 Th和抗体应答。在用gpl20脉冲的LV-SOCSl-siRNA-DCs免疫小鼠中，免疫后多达几个月， 没有观察到明显的毒性。组织学分析免疫鼠的所有主要器官和组织没有显示病理
85学炎症。DC-LV-SOCSl-siRNA和模拟DC小鼠中的IgG和抗dsDNA的水平相当。 这些数据表明，gpl20脉冲的LV-SOCSl-siRNA-DC免疫没有在小鼠中造成病理学 炎症。
SOCS1沉默的DCs对HIV Env介导的免疫抑制的抗性包括gpl20蛋白的HIV病毒能够抑制DCs产生促炎细胞因子和刺激T细胞 的能力(Fantuzzi等人，2004， J. Virol. 78:9763-72; Granelli-Piperno等人，2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101:7669-74; Barron等人，2003， J. Infect. Dis. 187:26-37; Pacanowski等人，2001, Blood 98:3016-21)。提出以下实验以评价，SOCSl沉默对 DCs激活的增强是否可以克服gpl20蛋白对细胞因子的产生和DCs的免疫刺激能 力的抑制作用。选择IL-12作为这些实验的代表性细胞因子，因为发现DC来源的 IL-12发挥双重作用驱动Thl发育以及直接信号传导B细胞以形成体液应答 (Dubois等人，1998, J. Immunol. 161:2223-31; Dubois等人，1997， J. Exp. Med. 185:941-51; Skok等人，1999， J. Immunol. 163:4284-91)。如图19A所示，在gpl20蛋白存在时，LV-SOCS1 siRNA-DCs保持应答LPS 的能力。相反，LV-GFP-siRNA-DCs对LPS刺激的应答被gpl20蛋白的存在严重 地损害。进一步体内研究SOCSl沉默的DCs对gpl20介导的抑制的敏感性。用 OVA脉冲的转导DCs对小鼠进行免疫，经或者不经gpl20蛋白先体外后体内预处 理。预暴露于gpl20蛋白对LV-SOCS1-siRNA-DCs诱导OVA特异性抗体应答的能 力没有明显的影响(图19B和19C)，其也没有损害LV-SOCS1-siRNA-DCs诱导的 OVA特异性的CD8+ CTL和CD4+ Th应答(P〉0.05)(图19D和19E)。然而，这样 的预处理显著地降低了 LV-GFP-siRNA-DCs诱导OVA特异性抗体和CTL应答的 能力(PO,05)(图19B到19E)。这些结果说明，SOCSl沉默使DCs抵抗HIV gpl20 介导的抑制，可能是由于增加了细胞因子的产量和SOCSl沉默的DCs的机能亢进 状态(Hanada等人，2003, Immunity 19:437-50)。
实施例8:体内DNA接种以增强HIV特异性抗体和CTL应答
本实施例显示，用SOCSl siRNA表达子DNA共免疫，显著地提高了 HIV DNA接种的效能。本研究提出了通过抑制宿主的免疫抑制因子而引发HIV特异性 的抗体和CTL应答的第一次尝试，这提供了开发更有效的HIV疫苗的新方法。
现在描述该实施例的实验中所用的材料和方法。
DNA接种如本文其他地方前述，形成pSuper-SOCSl-siRNA表达载体。为了产生HIV Env逆抗原(retrogen)表达载体，通过去掉gpl20/gp41切割位点和HlVgpl60的 gp41的融合结构域(密码子用途优化的JRFL)以利于HIV Env的分泌，首先构建
86gpl40CF质粒。最终的pCMV/R-gpl40CF-Fc逆抗原(retrogen)载体含有融合到 IgG Fc片段的gpl40CF基因，其受CMV启动子的调控。重组gpl20 (JFRL)蛋白 从CHO细胞产生，由NIH AIDS Research and Reference Program提供。用Qiagen Kit 制备无内毒素的DNA，并将其重悬浮于无内毒素的PBS (Sigma, St. Louis, MO-Aldrich Corp., St. Louis, MO)中，终浓度为1 |ag/nl，在用于注射前，贮存在 -20°C 。在预定的接种日期，将50 |ig的gp 140CF-Fc DNA或者200吗的gp 140CF-Fc DNA (50吗)和pSuper-SOCSl-siRNA表达子DNA (150 pg)的混合物肌肉内注射到 每只小鼠的股四头肌(Hauser等人，2004, Gene Then 11:924-32; You等人，2001, Cancer Research 61:3704-11)。接着，在各DNA免疫后的第1、 3禾卩5天，用LPS (30 pg/鼠)(腹膜内注射)处理所述免疫小鼠三次。
现在描述该实施例中的实验结果。
通过用SOC1 siRNADNA共免疫提高HIV DNA疫苗的效能
SOCS1沉默的DCs增强HIV Env特异性的CTL和抗体应答的能力说明， 本SOCS1沉默方法可以用于提高HIV DNA接种的效能。根据Hauser等人,2004, Gene Then 11:924-32和You等人2001, Cancer Research 61:3704-11所述，使用了"逆 抗原(retrogen)"免疫策略，该策略使用受体介导的胞吞作用增强DC靶向作用和 抗原的MHC呈递。简而言之，通过将IgG Fc片段符合读框地融合到gpl40CF基 因，产生gpl40CF逆抗原(retrogen)，其中去掉了 gpl20/gp41切割位点和gp41 融合结构域。形成的gpl40CF-Fc融合蛋白被表达并从gpl40CF-Fc载体转染的细 胞中分泌。
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或者用gpl40CF-Fc DNA和pSuper-SOCSl-siRNA表达子DNA的混合物注射小鼠， 连续三周，接着在一周后监测小鼠的HIV Erw特异性免疫应答。在用 pSuper-SOCSl-siRNADNA共免疫的小鼠中，HIV Env特异性的抗体滴度增加明显 (图20A)。如CTL和ELISPOT分析显示，pSuper-SOCSl-siRNA DNA的共注射显 著地增强了 HIV Env特异性的CTL应答(图20B和20C)。而且，共注射 SOCSl-siRNA DNA增强了 HIV Env特异性的CD4+ Th应答(图20 D)。使用细胞 因子的细胞内染色也表明，pSuper-SOCSl siRNADNA共免疫小鼠中的gpl20特异 性的CD4+T细胞应答增强。这些结果说明，pSuper-SOCSl siRNADNA共免疫提 高了 HIVDNA接种的效能，这是由于提高了免疫小鼠中的共转染抗原呈递细胞的 免疫刺激性能力。因此，此处所述的SOCS1沉默策略适用于先体外后体内基于 DC的接种安排和体内接种安排。
基于抑制DCs中的天然免疫抑制因子的、可选的和有效的HIV接种疫苗方法
本公开内容显示，沉默DCs中的负信号传导调节因子SOCSl导致小鼠HIV
87Env特异性的抗体和CTL应答显著地增强。观察到，SOCSl沉默的DCs诱导的 HIVEnv特异性的抗体和CTL应答都是持久的。另外，结果显示，用SOCSl siRNA DNA共免疫显著地提高了HIVDNA接种疫苗的效能。因此，针对HIV的平衡的、 记忆性的体液和细胞应答可以用SOCSl沉默的DCs诱导，并且该SOCSl沉默策 略适用于治疗性和预防性HIV接种设置。传统上认为，DCs在诱导体液应答中的作用是CD4+Th引发T细胞和B细 胞之间的同种相互作用的结果。然而，DCs在刺激体液应答中的体外和体内关键 作用已被评述(Dubois等人，1997, J. Exp. Med. 1S5:941-513S; Inaba等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA S0:6041-5)。特别是，发现DCs强烈地增加了 CD40激活的B 细胞的增殖和抗体的产生(Dubois等人，1997, J. Exp. Med. 185:941-51)。用装载抗 原的DCs免疫能诱导保护性体液应答(Flamand等人，1994， Eur. J. Immunol. 24:605-10)。此处的结果显示，SOCSl沉默的DCs增加了 Th2极化的细胞因子以 及B淋巴细胞刺激性细胞因子(BAFF和APRIL)的产生，其可能与在SOCSl沉默 的DC免疫小鼠中所观察到的Th和B细胞激活的增强有关。本发现得到了以前的 报道——SOCSl7— DCs诱导B细胞的异常扩增和自身反应性抗体的产生(Hanada等 人，2003, Immunity 19:437-50)——的支持。因此，本研究显示了 DCs中的SOCSl 在控制HIV特异性抗体应答中的关键作用，并暗示通常可以使用SOCSl的沉默， 以增强针对除了 HIVEnv以外的抗原的抗体应答。本研究的重要发现是，SOCSl沉默的DCs诱导平衡的、记忆性HIV-Env 特异性的抗体和CTL应答，这可能是阻止或者控制HIV转染所期望的(Burton等 人，2004, Nat. Immunol. 5:233-6; McMichael等人，2003， Nat. Med. 9:874-80; Nabd， 2001， Nature 410:1002-7; Letvin等人，2002， Ar纖Rev. ImnuinGl. 20:73-99; Zolla-Pazner， 2004, Nat Rev. Immunol. 4:199-210; Imami等人，2002， J. Virol. 76:9011-23; Letvin等人，2003, Nat. Med. 9:861-6)。不希望束缚于任何具体的理论， SOCSl沉默诱导了平衡的、记忆性的体液和细胞应答的机制可能涉及SOCSl沉 默的DCs和gpl20特异性的CD4+T细胞产生混合型的Thl-和Th2-极化的细胞因 子。这些结果与针对许多病原如病毒天然产生的混合的抗体和CTL应答一致(Allen 等人，1997， Immunol. Today 18:387-92)，这说明Thl和Th2极化不相互排斥(Gor 等人，2003， Nat. Immunol. 4:503陽5; Colonna, 2001， Nat. Immunol. 2:899-900)。
SOCSl作为多种细胞因子使用的JAK/STAT信号传导途径的反馈抑制因子 发挥作用，并直接或者间接地参与调节TLR信号传导途径(Baetz等人，2004, J. Biol. Chem. 279:54708-15; Gingras等人，2004, J. Biol. Chem. 279:54702-7)。此处的结果 一致地说明，SOCSl沉默的DCs增加了各种细胞因子如TNF-a、 IL-6和IL-12的 产生以应答LPS。LPS-TLR信号传导激活了大量的包括许多促炎细胞因子的NF-KB 应答基因，这些细胞因子能以自分泌和旁分泌的方式发挥功能(Baetz等人，2004， J. Biol. Chem. 279:54708-15; Grohmann等人，1998， Immunity 9:315-23; Pan等人，
882004, Immunol. Lett. 94:141-51)。基于SOCS1间接地参与衰减TLR信号传导的事 实，JAK/STAT途径关键制动的失活应该允许细胞因子形成自分泌或/和旁分泌刺 激环，以造成增加而不是减少细胞因子的产生。此处公开的结果涉及利用细胞因 子和细胞因子受体敲除小鼠，说明自分泌细胞因子刺激环有助于SOCS1沉默的 DCs过量产生细胞因子。在HIV感染的个体中，DCs的功能缺陷和损耗是常见的，这可能促进渐进 性免疫缺陷。HIV gpl20蛋白能抑制DCs产生促炎细胞因子和刺激T细胞的能力 (Fantuzzi等人，2004, J, Virol. 78:9763-72; Carbonneil等人，2004， J. Immunol. 172:7832-40)。显示SOCS1沉默的DCs抵抗HIV gpl20介导的抑制，这是因为增 加了促炎细胞因子的产生和SOCSl沉默的DCs的机能亢进状态(Hanada等人，2003， Immunity 19:437-50)。该发现与开发治疗性HIV疫苗尤其相关，该疫苗将被用于免 疫抑制性HIV感染的个体(Lu等人，2004， Nat. Med. 10:1359-1365)。
此处所述的接种策略是通过抑制宿主DCs中的免疫抑制因子，增强抗HIV 免疫应答的首次努力。因为天然免疫不能有效地控制HIV-1感染，所以失活宿主 的免疫抑制因子可能对产生有效的抗HIV免疫应答是关键的。然而，仅仅增强HIV 特异性的免疫应答可能不会导致保护性的HIV抗体和CTL应答的诱导。在这方面， 本发明方法提供了将免疫与目前可获得的疫苗结合的机会，如DNA疫苗和SOCS1 siRNADNA共免疫所说明。当使用改良的HIV免疫原和释放系统时(Burton等人， 2004， Nat. Immunol. 5:233-6; Yang等人，2002， J. Virol. 76:4634-42)，该接种疫苗方 法可以提供了新的途径，以增强弱保护性免疫应答或者产生更广和更强的应答， 不仅针对优势表位，而且针对弱免疫原性或者隐蔽性以及保护性的表位。总之， 本公开内容显示了抑制宿主DCs中的信号传导抑制因子以增强HIV特异性的抗体
和CTL应答的原理，提出进一步研究，以确定是否能够通过该策略在猴子和最终 在人中诱导保护性的抗HIV应答。另外，可以使用该SOCSl沉默策略以增强针对 其它病原的免疫应答。
实施例9:鉴定和分析人SOCS1 siRNA使用计算机程序选择靶向人SOCS1的siRNA序列 hSOCSl-siRNAl(CACGCACUUCCGCACAUUC.dT.dT; SEQ ID NO:21)， hSOCSl-siRNA2 (UUCCGUUCGCACGCCGAUU.dT.dT; SEQ ID NO:22)和hSOCSl- s腦A3 (GAGCUUCGACUGCCUCUUC.dT.dT; SEQ ID NO:23)。对所有的耙序列进行NCBI Blast查询，以证实同其它已知的基因缺少同源性。名称"dT.dT"指所述siRNA靶 序列紧接下游的多dT序列。
实施例10:用GenePorter转染人单核细胞DCs为了研究人SOCS1在调节人DCs中的作用，首先鉴定具有特异性下调人SOCS1能力的小干扰RNA (siRNA)。使用计算机程序选择靶向人S0CS1和293T 细胞的siRNA序列。接着将每条合成的人SOCS-l-siRNA寡核苷酸双链体与flag 标记的人S0CS1以10:1的表达比例，利用GenePorter转染试剂共转染到293T细 胞。共转染后48小时，收集细胞并如本文其他地方所述，通过蛋白质印迹法分析。
图21A显示人SOCS1 siRNAl有效地下调了人S0CS1表达。siRNA对人 SOCS1 mRNA下调的特异性通过合成siRNAl寡核苷酸双链体不能下调S0CS1 mRNA得到证实。因此选择人S0CS1 siRNAl用于进一步的研究。用GenePorter 将合成的siRNA双链体转染到来源于人单核细胞的DCs中，转染效率为85.5% (图 21B)。如定量RT-PCR分析所验证，同模拟转染的DCs中的水平相比，hSOCSl siRNAl双链体转染的总DC群中的hSOCSl mRNA水平明显地减少了大约60% (图21C， pO.Ol)。所述siRNA的效率和SOCS1 RNA的减少与使用合成的siRNA 双链体耙向全体小鼠骨髓来源的DC群中小鼠SOCSl的实验中观察到的结果相似。
通过定量实时RT-PCR，如本文其他地方所述，评价了人DCs中的人SOCS1 的相对表达。使用来自Applied Biosystems， Inc., Foster City, CA的用于人SOCS1 的预形成的引物/探针套装(引物，5'-TTTTTCGCCCTTAGCGGGAA-3'; SEQ ID NO:24和 5'陽CTGCCATCCAGGTGAAAGC-3，； SEQ ID NO:25，与探针， 6FAM-ATGGCCTCGGGACCCACGAG-TAMRA; SEQ ID NO:26)。
表征人SOCS-1沉默的DCs进行下一组实验，通过流式细胞术分析，以评价人SOCSl是否调节在DCs 上的共剌激分子的表达。流式细胞术分析人SOCS1是根据本文其他地方所述的在 评价鼠SOCS1中所使用的方法进行的。观察到在LPS诱导成熟之前和之后， hSOCS卜siRNA转染的DCs和对照hSOCSl-siRNA突变体转染的DCs在它们的代 表性共刺激分子的表达方面只显示轻微的差异(图22A)，这与在鼠DCs中的观察 一致。在hSOCSl-siRNA DCs和突变体-siRNA DCs中也检测到相当的MHC-I和 II分子水平。相反，观察到hSOCSl siRNA转染的DCs比siRNA突变体转染的人 DCs更加应答LPS刺激，其显示为显著增加了促炎细胞因子如IL-12、IL-6和TNF-a 的分泌(图22B和22C)。
表达人SOCS1 siRNA的重组腺病毒载体的产生用AdEasy系统(缺少El和E3的Ad(5); Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto,CA)，构建和产生复制缺陷性腺病毒。通过将Hl-人SOCSl-siRNADNA片段 插入到AdEasy载体，构建穿梭载体Ad-hSOCSl-siRNA(图28)。通过DNA测序， 证实人SOCSl-siRNA的插入。根据制造商的说明书(Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto, CA)，随后产生重组的腺病毒Ad-hSOCSl-siRNA。根据制造商的说明书 (Quantum Biotechnologies Inc., Palo Alto, CA)，在293细胞中产生了重组的腺病毒
90并对其进行滴定。观察到重组的Ad(5)病毒能够转染人单核细胞来源的DCs。
实施例11:人S0CS1 siRNADCs引发的MAGE3特异性的CTL应答
提出下面的实验以研究人S0CS1在调节人DCs的免疫刺激能力中的作用。 该实施例提供的结果显示，人S0CS1沉默的DCs对微生物产物的刺激是亢进的， 并且具有增加的刺激能力，以引发自身抗原特异性的人细胞毒性的T淋巴细胞 (CTLs)。重要的是，是人SOCS1沉默的DCs而不是野生型的DCs能充分激活对 天然抗原表达的人肿瘤细胞具有活跃溶解活性的CTLs。也可以相信的是，人 SOCSl沉默的DCs引发CTLs的能力可能受到SOCSl对IL-12产生和信号传导的 限制的控制。这些结果说明，人SOCSl在负调控人DCs中的关键作用，并暗示该 SOCSl沉默方法在开发更有效的人患者肿瘤疫苗上的翻译效能(translaticmal potential )。现在描述此处公开的实验所用的材料和方法。 胜由Genemed Synthesis Inc. (South San Francisco, CA, USA),合成并通过 HPLC纯化HLA-A2限制性的MAGE3 CTL肽(FLWGPRALV; SEQ ID NO:27) (van der Bruggen等人，1994, European Journal of Immunology 24:3038-43)和对照H-2Kb 限制性的OVA-I(SIINFEKL;SEQIDNO:ll)，至>95%的纯度。在最后稀释在无内 毒素的PBS (Sigma, St. Louis, MO)前，将肽溶解在DMSO中。
蛋A质印迹法分析人SOCSl表达用合成的人SOCS-l-siRNA寡核苷酸双链体(21 bp)或者无关的低聚双链体 和flag标记的人SOCSl表达载体(pCMV-hSOCSl)以10:1的比例，用GenePorter 试剂，如本文其他地方所述，共转染293T细胞。转染后48小时，收集细胞并进 行SDS-PAGE。转移到Hybond-P膜(Amersham, Arlington Heights, IL)后，用抗-Flag (Sigma, St. Louis, MO)或者肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA) 抗体，通过蛋白质印迹法分析样品，接着用ECL-Plus试齐U(Amersham, Arlington Heights, IL)检测。用Densitometer SI扫描膜和用ImageQuant软件(Molecular Dynamics, Piscataway, NJ )定量SOCS-1/肌动蛋白带。将SOCSl带的强度归一化为 /3-肌动蛋白带的强度。
定量RT-PCR分析人SOCSl表达根据本文其他地方所述，通过定量实时RT-PCR，评价了人SOCSl在人DCs 的相对表达。
人单核细胞来源的DCs的转染和人T细胞的体外引发
根据Schroers等人，2003, Clinical Can. Res. 9:4743-4755和Schroers等人 2004, Methods Mol. Biol. 246:451-9所述，产生并培养来自PBMCs的人DCs。从 HLA-A2+健康的志愿者收集肝素化血液。通过基于PCR-SSP-DNA的方法(The Methodist Hospital, Houston, Texas)进行HLA分型。将PBMCs重悬浮在无血清的 DC培养基(CellGenix，Antioch, 1!)中并在37°<:下在加湿的5%032.中培养。在含 有1000 IU/ml重组人GM-CSF (rhGM-CSF; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN )和 1000 IU/ml rhIL-4 (R&D Systems Inc., Minneapolis,画)的无血清DC培养基中，培 养粘附于塑料的细胞部分。在第5或者6天，用120 nM siRNA寡核苷酸，使用 GenePorter，根据制造商的说明书，转染单核细胞来源的DCs。接着用MAGE3肽 (20 fag/mi)过夜脉冲转染的DCs。总共24孔板的每孔1 X I06个人T细胞与5X 104 个MAGE3脉冲的转染DC (20:1)共培养在0.5 ml补充有5% AB人血清、rWL-2 (50 U/ml)禾卩TNFa (10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN )的RPMI-1640中。在 共培养的第7天，用自身MAGE3脉冲的转染DCs再刺激一次该共培养的T细胞。 对一些实验，每三天向DCs和T细胞的共培养物中加入抗-人IL-12 (p70)抗体(20 pg/ml， R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)。共培养两周后，用T细胞进行免疫分 析。
细胞因子ELISA和酶联免疫斑点(ELISPOT)分析利用DC培养物的上清，根据制造商的说明书，在指定的时间点和用指定 的刺激物，通过ELISA分析(BD Biosciences, Lincoln Park, NJ)定量各种促炎细胞因 子的水平。根据本文其他地方所述，进行人外周淋巴细胞的ELISPOT分析。
流式细胞术分析用在含有0.1% NaN3和2% FCS的PBS中的FITC或者PE mAbs染色细胞。 对人CD40、CD80和CD86特异性的抗体和匹配的同种型对照购自BD Biosciences, San Jose， CA。在FACSCalibur (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ)流式细胞仪上分 析染色的细胞。
四聚体染色人MAGE3/HLA-A2四聚体在Baylor College of Medicine Tetramer Core Facility (Houston, TX， USA)合成。用抗-hCD8a-FITC/抗-hCD3-PerCP和MAGE3-PE 四聚体，共染共培养物中的人外周血淋巴细胞或者淋巴细胞。根据制造商的说明， 在4°C下每106个细胞用1 的抗-CD8a和1:100稀释的MAGE3-PE四聚体进行 四聚体染色1 h。
DC免疫HLA-A2转基因小鼠
四到六周大的雌HLA-A2.1转基因小鼠购自Jackson Laboratory (Maine, USA),并根据机构指导书，供养在Baylor College of Medicine (Houston, TX, USA) 的无病原的鼠设备中。从HLA-A2.1转基因小鼠制备小鼠BM来源的DCs并用 MOI为5的、重组的慢病毒载体LV-SOCSl-siRNA或者LV-GFP-siRNA转导，如 本文其他地方所述。接着用MAGE3肽脉冲DCs 20 hr，用PBS洗三次，用TNFa (500 ng/ml， R&D Systems Inc., Minneapolis, MN )刺激24 hr。接着将DCs经后爪垫注射 到HLA-A2转基因小鼠。在一些小鼠中，在DC接种后，在指定的R期，腹膜内 给药(i.p.) LPS (30吗/鼠)或者重组的鼠IL-12 (1昭/鼠,PeproTech, Inc., Rocky Hill, NJ)。
CTL分析用标准的铬释放分析技术评价008+CTL应答，该技术测量体外再刺激的 脾细胞溶解靶细胞的能力，如本文其他地方所述(Huang等人，2003, Cancer Res. 63:7321-9)。 2-3只免疫小鼠混合的脾细胞在含有MAGE3肽的RPMI-1640中体外 再刺激4-6天。用51Cr铬酸钠溶液在37°C标记人MAGE3+、 HLA-A2+黑素瘤细 胞(SK-Md-37)和对照人MAGE3+、 HLA-A2'黑素瘤细胞(NA-6-Mel) 90分钟。在 37°C下在96孔U形底部的板(200 pl/孔)中，温育不同数目的效应细胞与恒定数目 的靶细胞(5><104个/孔)4 h。收集和分析一式三份培养物的上清。溶解百分比计算 为(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)X 100。
现在描述该实施例中提供的实验结果。
提高人SOCS1沉默的DCs引发抗原特异性的CTL应答的免疫剌激性效能
提出下一组实验，以评价沉默的人SOCS1是否能够提高人DCs引发自身 抗原特异性的CTLs的刺激性效能。用来自人MAGE3的HLA-A2限制性肽作为模 型人自身抗原，其为已知的在成人睾丸和黑素肿瘤细胞中表达的胚性肿瘤抗原(van der Bruggen等人，1994， European Journal of Immunology 24:3038-43)。用hSOCSl siRNA寡核苷酸转染HLA-A2+健康志愿者的人单核细胞来源的DCs,接着用 MAGE3肽(20 pg/ml)脉冲过夜。在TNFa (成熟刺激物)(10 ng/ml, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN )存在的情况下，共培养每孔共1 X 106个的自身人T细胞与5X 104个MAGE3脉冲的转染DC (20:1)。在共培养的第7天，用自身MAGE3脉冲 的转染DCs再剌激共培养的T细胞一次。共培养两周后，用T细胞进行免疫分析。 在与hSOCS siRNA转染的、用MAGE3肽脉冲的DCs的共培养物中，13.9%的 CD8+ T细胞对MAGE3四聚体是阳性的，与其相比，在与MAGE3脉冲的突变 siRNA DCs或者模拟DCs的共培养物中，分别只有5.4%和4.3% (图23A)。来自相 同供体的幼稚(未刺激的)初级人淋巴细胞的四聚体染色显示了低水平的阳性 MAGE3四聚体染色(0.5%的CD8+ T细胞)。 一致的是，细胞内IFNy染色(國23B)
93表明，同MAGE3肽脉冲的mut-siRNADC (6.9%的IFNY+ CD8+ T细胞)或者模拟 DCs (5.7% IFNy+ CD8+ T细胞)相比，hSOCSl-siRNA DCs大大地提高了 MAGE3 特异性的CTL应答(11.18%的IFNy+ CD8+ T细胞)。而且，IF所ELISPOT分析(图 23C)表明，hSOCSl-siRNA DCs激活了更多的MAGE3特异性的CTLs。 HLA-A2+
供体的重复实验显示了相似的结果。用未经抗原脉冲的DCs共培养两周后，大多 数初级人T细胞死亡。总之，这些结果说明，人SOCSl沉默的DCs具有增加的引 发自身抗原特异性CTLs的免疫刺激性能力。
SOCS1限制性IL-12在CTL引发中的关键作用因为SOCS1沉默的DCs在应答微生物产物刺激时，产生更多的激活CTL 应答中的关键细胞因子IL-12 (Trinchieri, 2003, Nat. Rev. Immunol. 3:133-46)，并因 为IL-12信号传导受SOCSl的限制(Eyles等人，2002, J. Biol. Chem. 277:43735-40), 所以检测了 IL-12在通过人SOCSl沉默的DCs引发CTLs中的作用。因此，每3 天将抗-人IL-12抗体加入到T细胞和MAGE3脉冲的转染DCs的共培养物中。图 23A到23C表明，使用抗-IL12 (p70)抗体抑制IL-12,抑制了 hSOCSl-siRNA DCs 增加的刺激MAGE3特异性CTLs的能力，如四聚体染色、细胞内IFN-y染色和 ELISPOT分析所示。使用人源化的HLA-A2.1转基因小鼠，以进一步检测IL-12在增强SOCSl 沉默的DCs诱导的CTL应答中的作用。用表达小鼠SOCSl siRNA (LV-mSOCSl siRNA)的重组慢病毒载体或者对照载体LV-GFP siRNA转导并用A2限制性 MAGE3肽脉冲HLA-A2.1转基因小鼠BM来源的DCs。用TNFa成熟后，将转导 的DCs经爪垫给予到HLA-A2.1转基因小鼠，两次，间隔一周。每次DC免疫后， 用LPS或者低剂量的重组IL-12细胞因子，体内刺激小鼠三次。使用LPS是因为 它诱导大量的促炎细胞因子，其中的许多受SOCSl的调节，并因为SOCSl在调 节NF-kB (p65)信号传导中可能的直接作用(Ryo等人，2003, Mol. Cell 12:1413-26)。 经体内IL-12刺激，在用MAGE3脉冲的SOCSl-siRNA DCs免疫小鼠中每2x105 个T细胞检测到239个IFN，斑点，与其相比，在用MAGE3脉冲的GFP-siRNA DCs免疫的小鼠中，每2><105个T细胞只有10个IFNy+斑点(图24)。体内LPS 刺激也优先增强SOCS1 -siRNA DCs诱导的CTL应答(在SOCS1 -siRNA-DC小鼠中， 每2xl()5个T细胞63个IFNy+斑点，而在GFP-siRNA-DC小鼠中，每2xl()5个T 细胞24个IFN"斑点)(图24)。然而，IL-12刺激比LPS刺激在增强 SOCSl-siRNA-DC免疫小鼠中的MAGE3特异性的CTL应答上更加有效(PO.Ol)。 IL-12的该优异刺激能力可能是由于SOCSl通过Jak/Stat途径直接调节IL-12剌激 的能力，以及SOCSl-siRNADC免疫小鼠中已被激活的IL-12对CTLs的直接作用 (Trinchieri, 2003, Nat. Rev. Immunol. 3:133-46)。综上所述，这些结果提供了在抗原 呈递细胞中SOCSl限制IL-12信号传导的进一步证据。这些结果也强调了细胞因子信号传导在决定基于细胞因子的肿瘤疗法的疗效的重要性。
人S0CS1沉默的DCs但不是野生型的DCs激活的人CTLs具有肿瘤溶解效应器功 篮为了确定对自身肿瘤相关抗原MAGE3特异性的活化T细胞是否具有肿瘤 溶解效应器功能，用天然的MAGE3+人肿瘤细胞作为耙细胞，进行CTL分析。 MAGE3脉冲的SOCSl-siRNA DCs或者mut-siRNA DC激活的人T细胞容易杀死 MAGE3肽脉冲的MAGE3+HLA-A2+黑素瘤细胞(SK-Mel-37)。然而，MAGE3脉 冲的mut-siRNA DCs激活的人T细胞对未用MAGE3脉冲的天然SK-Mel-37细胞 只显示了弱溶细胞活性(图25)。相反，MAGE3脉冲的SOCSl-siRNA DCs激活的 那些T细胞仍然对未用MAGE3脉冲的天然SK-Mel-37细胞具有强溶细胞活性(图 25)。与hSOCSl-siRNA DCs的共培养物中的T细胞的肿瘤溶解活性显著地被抗 -hIL-12抗体处理损害。CTLs特异性地调节所述肿瘤溶解活性，因为MAGE3脉冲 的SOCSl-siRNA DCs激活的人T细胞只具有针对HLA-A2阴性的、MAGE3+黑 素瘤细胞(NA-6-Mel)的本底溶细胞活性。不同供体的重复实验显示了相似的结果。
为了证实上述观察，检测了 MAGE3脉冲的SOCSl-siRNA DCs或者 GFP-siRNADCs免疫的HLA-A2.1转基因小鼠的T细胞肿瘤溶解活性。图26显示， MAGE3脉冲的、mSOCSl siRNADCs免疫的转基因小鼠的T细胞对天然MAGE3+ HLA-A2阳性黑素瘤细胞SK-Mel-37具有活跃的细胞溶解活性。相反，MAGE3 脉冲的、GFP-siRNA DCs免疫的转基因小鼠的T细胞对天然的黑素瘤细胞只有弱 的细胞溶解活性，这与图25所示的结果一致。而且，观察到低剂量的重组IL-12 的体内刺激显著地增强了由SOCSl siRNA DCs但不是GFP-siRNA DCs诱，的 CTL应答(图26)。综上所述，此处的结果表明，人SOCSl沉默的DCs具有充分激 活对天然肿瘤细胞具有活跃溶解效应功能的CTLs的独特能力，这可能是由于抗原 呈递细胞增加了 IL-12的产生和信号传导。
人SOCS沉默的DCs对自身抗原特异性的人CTLs的完全激活
本公开内容显示了人SOCSl对人DCs的调节作用，并提供通过沉默 JAK/STAT信号传导途径的抑制因子而增强人DCs的免疫刺激性效能的可选策略。 此处公开的结果显示了人SOCSl在负调节人DCs引发抗原特异性CTLs的免疫刺 激能力中的关键作用。人SOCSl沉默的DCs具有充分激活对天然的抗原表达肿瘤 细胞具有强溶解能力的人CTLs的独特能力。人SOCSl沉默的DCs弓l发CTLs的 能力可能受SOCSl对IL-12产生和信号传导的限制的控制。因此，本公开内容显 示了该通常可应用的、SOCSl沉默方法在开发更有效的肿瘤疫苗中的翻译效能。
本发明的SOCSl沉默方法具有增强负荷肿瘤相关抗原的DCs诱导的抗原 特异性免疫应答的能力。在最近十年，在肿瘤免疫学上主要的进步是鉴定和确认了大量的人肿瘤特异性的或者相关的抗原(Van den Eynde等人，1997, Current Opinion in Immunology 9:684-93)。因此，用负荷肿瘤相关抗原的SOCSl沉默的DCs 接种比阻断CTLs上的CTLA4在诱导抗原特异性的抗肿瘤应答上更有吸引力。利 用SOCSl沉默的DC免疫提供了附加的治疗益处，因为杂合的SOCS广-小鼠不显 示或者只显示微弱的自身免疫性炎症症状，所以SOCSl沉默的DC不会导致严重 的自身免疫性炎症。而且，在SOCS1+小鼠中所观察到的严重的自身免疫性炎症 需要不仅DCs中的、而且其它谱系的免疫细胞例如T和NKT细胞中的SOCSl完 全缺失(Kubo等人，2003, Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等人，2004, Annu. Rev. Immunol. 22:503-29; Metoalf等人，2003， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8436-41; Chong等人，2003, Immunity 18:475-87; Hanada等人，2003, Immunity 19:437-50; Kinjyo等人，2002， Immunity 17:583-91)。
〖0487]提高肿瘤疫苗效能的广泛努力已经集中在提高肿瘤相关抗原的亲和力/剂 量(信号l)和共刺激分子介导的信号2的水平上(Gilboa, 2004， Nat. Rev. Cancer 4:401-11; Rosenberg等人，2004， Nat. Med. 10:909-15)。本公开内容表明，人SOCSl 沉默的DCs引发抗原特异性的CTLs的优异能力可能是由于加强了 IL-12 (信号3) 的产生和信号传导。该结论是基于以下观察l)人SOCSl沉默的DCs产生了提高 水平的IL-12以应答微生物产物的刺激；2) IL-12的抗体阻断抑制了人SOCSl沉默 的DCs的免疫刺激性能；和3)体内低剂量的IL-12给药显著地提高了 SOCSl沉 默的DCs而不是野生型的DCs诱导的抗原特异性CTL应答。这些结果得到了Eyks， J. L等人的鼠SOCSl调节IL-12信号传导的发现(Eyles等人，2002, J. Biol. Chem. 277:43735-40)和本文其他地方所公开的结果的支持。已经提出将细胞因子作为DCs提供的激活CTLs的第三个信弓(Curisinger 等人，2003, J. Exp. Med. 197:1141-51)。细胞因子的产生和信号传导受到严格地调 节，以激活针对外源抗原的免疫应答，同时限制过度的自身免疫激活(Darnell等人， 1994， Science 264:1415-21)。细胞因子通常激活JAKs,其接着磷酸化细胞因子受体 的胞质结构域，产生信号转导及转录激活蛋白(STAT)成员的停靠位点(Alexander等 人，2004， Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)。细胞因子也上调作为反馈抑制因子的 SOCSl的表达，其接着通过DCs关闭促炎细胞因子的产生和信号传导，因此衰减 正在进行的免疫应答和维持自身耐受性(Alexander等人，2004, Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)。 SOCSl通过经其SH2结构域特异性地结合到作为假底物抑制因子的 JAK激活环，并耙向JAK2以进行泛素依赖的蛋白降解而抑制STAT(Kubo等人， 2003, Nat. Immunol. 4:1169-76; Alexander等人，2004, Annu. Rev. Immunol. 22:503-29)。总之，此处公开的结果表明了抗原递呈细胞中SOCSl限制的IL-12的 产生和信号传导在决定CTL应答强度中的重要作用。本研究的重要发现是，人SOCSl沉默的DCs具有独特的能力充分激活具 有活跃溶解效应器功能的自身反应性T细胞。在临床和实验研究中经常观察到，
96自身抗原特异性的T细胞能够被DC接种或者体外致敏而激活，如通过各种免疫 分析如四聚体染色和ELISPOT分析所确定。然而，尽管这样活化的T细胞可以有 效地杀死人工抗原脉冲的肿瘤细胞或者基因修饰以表达自身抗原的肿瘤细胞，但 是它们通常显示对天然肿瘤细胞的弱溶细胞活性，这被认为是目前肿瘤疫苗功效 弱的主要原因(Zaks等人，1998, Cancer Research 58:4902-8; Yu等人，2002, J. Clin. Invest 110:289-94)。此处公开的结果说明，可能需要SOCSl沉默的DCs提供的持 续和增加的抗原呈递/剌激，以充分激活自身反应性的、低亲和力T细胞并赋予它 们针对天然肿瘤细胞的活跃溶解效应器功能。
实施例12: SOCSl siRNA低聚双链体增强蛋白免疫为了检测用SOCSl siRNA低聚双链体体内免疫是否能够增强蛋白免疫，比 较了 1)含有BCG的OVA蛋白免疫诱导的CTL应答与2) SOCSl siRNA低聚双链 体-脂质体和含有BCG的OVA蛋白共免疫诱导的CTL应答。多组小鼠用OVA蛋 白和BCG混合物、SOCSl siRNA低聚双链体-脂质体和OVA蛋白与BCG的混合 物免疫，或者OVA蛋白和BCG与SOCSl siRNA低聚双链体-脂质体的混合物经 足垫共注射两次，间隔一周。观察到，在第二次免疫后的两周，胞内细胞因子染 色和ELISPOT分析(IFNy)表明，在用SOCSl siRNA低聚双链体共免疫的小鼠中诱 导了更强的OVA特异性的CTL应答(图27A和27B)。
实施例13: SOCSl沉默的CTLs具有增加的细胞溶解活性为了研究T细胞中的SOCSl是否在调节CTL活性中发挥作用，用SOCSl 或者突变siRNA寡聚体通过GenePorter，转染从OT-I转基闵小鼠分离的、具有 OVA表位特异性的转基因TCR的CD8+ OT-I细胞(Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine)。用转染的OT-I细胞未经进一步刺激进行CTL分析。观察到，同突变的 siRNA-寡聚体转染的OT-I细胞相比，SOCSl-siRNA寡聚体转染的OT-I具有对同 系基因型OVA阳性的EG7细胞增加的细胞溶解活性(图29)。这个结果表明T细胞 中SOCSl沉默提高了其溶解细胞的活性。
实施例14:通过调节A20提高免疫细胞的免疫效能 A20是许多细胞类型表达的锌指蛋白。A20由TLR4配体和TNF快速诱导。 A20在调节关键性地参与NF-kB信号传导的信号传导蛋白的泛素化和去泛素化中 具有双重功能。A20通过蛋白中发现的去泛素化酶结构域参与去泛素化。该结构 域能够从受体相互作用蛋白(RIP)去除K63连接的泛素链，该RIP蛋白是TNF受体 复合体的重要组分。A20去除RIP上的K63连接的泛素链造成了RIP的降解。而 且，A20羧基端的锌指通过将RIP和K48连接的泛素链连接，充当泛素连接酶， 以进行蛋白酶体降解。因此，从RIP除去K63泛素链并通过A20加入K48连接的泛素链，导致了RIP的降解。另外，A20也去泛素化TRAF6中的K63连接的泛素链，这导致TRAF6的 降解。基于TRAF6是所有TLR家族成员共有的普通信号组分的事实，A20是唯一 的能够抑制MyD88依赖的和MyD88非依赖的TLR信号传导途径的负性免疫调节 因子。下组实验和结果表明，调节免疫细胞中的A20影响了免疫细胞的免疫效能。
用A20 siRNA寡聚体通过GenePorter下调小鼠BM-DCs的A20 mRNA为了研究DCs的抗原呈递的A20调节，首先如下所述，鉴定了特异性下调
A20的小千扰RNA (siRNA)。在存在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4时，通过 GenePorter，先体外后体内将合成的siRNA低聚双链体转染到来源于小鼠骨髓细胞 的DCs中，转染效率为大约83%。简而言之，根据制造商的说明，用21个碱基对 的siRNA寡核苷酸，通过GenePorter, 转染骨髓DCs。将3 pl的20 pM寡核苷 酸加到3 pi的GenePorter试剂和94 pl的无血清的RPMI1640中，并在25°C下温 育30分钟，然后将100 pl的GenePorter/寡核苷酸混合物加入到骨髓-DC中的每个 孔中，并在37°C下温育四个小时。温育后，将添加20% FBS的500 pl/孔的 RPMI1640加到骨髓-DCs中。基于本公开内容，合成的siRNA寡聚体能够以生理 学可接受的载体的形式释放到细胞中。可接受的载体的例子是脂质体。
图31显示，在A20-siRNA寡聚体转导的骨髓DCs中，A20被下调。如定 量RT-PCR分析测定，同不能下调A20的A20 siRNA突变体转染的骨髓DCs中的 水平相比，A20 siRNA-2寡聚体转染的总DC群中的A20 mRNA的水平减少了大 约70%。小鼠A20 siRNA序列为5，-CAAAGCACUUAUUGACAGA-3，； SEQ ID NO:58。
增强小鼠A20 siRNA寡聚体DCs诱导的抗原特异性T细胞应答
进行系列实验以检测抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)和CD4+ T 辅助性细胞的DC刺激是否受A20的调节。为了检测A20 siRNA低聚双链体转染 的DCs是否具有增强的诱导抗原特异性的T细胞应答的效能，用A20 siRNA-2低 聚双链体或者对照低聚双链体转染DCs。接着用已被OVA脉冲的转染的DCs免疫 多组小鼠。用脉冲的DCs免疫小鼠后，用或者不用PolyI:C (50 pg/鼠)体内刺激小 鼠三次。DC免疫后两周，检测了免疫小鼠的免疫应答。四聚体染色和IFNy ELISPOT 分析显示增强了用经或者未经PolyI:C体内刺激的A20 siRNA低聚-DCs免疫小鼠 中OVA特异性的CD8+和CD4+ T细胞应答(见图32-34)。 一致的是，IFNy ELISPOT 分析显示增强了经或者未经PolyI:C体内剌激的A20 siRNA低聚DCs免疫小鼠中 的TRP2特异性的CD8 + T细胞应答(图35)。
98增强小鼠A20 siRNA低聚DCs诱导的抗肿瘤应答为了在其诱导抗肿瘤免疫性的能力方面检测抑制DCs中A20的效果，用 A20 siRNA-2低聚双链体或者对照低聚双链体转染DCs。用己被OVA抗原脉冲的 转染DCs免疫多组小鼠。用脉冲的DCs免疫小鼠后，用或者不用CpG(50pg/鼠)， 体内刺激小鼠三次。DC免疫后两周，用OVA+EG7肿瘤攻击免疫小鼠。观察到了 经或者未经体内刺激的免疫小鼠中增加的抗肿瘤活性(图36和37)。观察到用siA20 寡聚体转染的DC进行免疫体内根除了已形成的EG.7肿瘤。
增强了小鼠A20 siRNA低聚DCs诱导的抗体应答设计以下实验以检测A20 siRNA低聚双链体转染的DCs是否具有增强的诱 导抗原特异性抗体应答的效能。简而言之，用A20 siRNA-2低聚双链体或者对照 低聚双链体转染DCs。接着用经OVA脉冲的转染DCs免疫多组小鼠。用脉冲的 DCs免疫小鼠后，用Polyl:C(50ng/鼠)体内刺激小鼠三次。DC免疫后两周，检测 免疫小鼠中的抗体应答。ELISA分析显示了 A20 siRNA低聚DCs免疫小鼠中的增 强的OVA特异性的抗体应答(图38)。此外，SUMOl siRNA低聚DCs和Foxjl siRNA低聚DCs也显示了免疫小鼠中增强的诱导OVA特异性抗体应答的效能(图 38)。
增强病毒载体转导的鼠BM-DCs的免疫刺激效能设计以下实验以评价A20是否体内负性免疫调控DC抗原呈递。简而言之， 将A20 siRNA或者对照绿色荧光蛋白(GFP) siRNA克隆到慢病毒载体(LV)。选择 慢病毒载体是因为它们能够稳定地转导DCs (Rubinson等人，2003， Nat. Genet. 33:401-406; Schroers等人，2004, Methods Mol. Biol. 246:451-459),这样能够更加 可靠地评价A20沉默的作用。根据本文其他地方所述的方法，产生了两个构建物， LV-A20-siRNA和LV-GFP-siRNA,两者都含有黄色荧光蛋白(YFP)标记(图33)。用 LV-A20-siRNA或者LV-GFP-siRNA载体转导骨髓来源的DCs (>80% CDllc+)通常 产生大约58-63%的YFP阳性的培养细胞。同经LV-GFP-siRNA-DCs刺激相比，经 LV-A20-siRNA-DCs剌激后，观察到了总转导DC群中的更低水平的A20 mRNA 和增加的促炎细胞因子的分泌。设计下组实验以检测LV-A20-siRNA-DCs是否具有增强的诱导免疫应答的 能力。用已被OVA或者TRP2脉冲的LV-A20-siRNA-DCs免疫多组小鼠。用脉冲 的DCs免疫小鼠后，在不存在体内剌激时刺激小鼠。DC免疫后两周，检测免疫小 鼠的免疫应答。胞内IFNy染色显示了 LV-A20-siRNA-DCs免疫小鼠中增强的TRP2 特异性的CD8+ T细胞或者OVA特异性的CD4+ T细胞应答(图39和40)。
为了检测LV-A20-siRNA-DCs诱导抗肿瘤应答的能力，用B16-OVA肿瘤细胞接种C57BL/6小鼠。三天后，用经LPS先体外后体内刺激的OVA脉冲的成熟 LV-A20-siRNA-DCs 或者 LV-GFP-siRNA-DCs 处理 一 次。观察到， LV-A20-siRNA-DCs有效地阻止了己形成的B16-OVA肿瘤的生长(图41和42)。也 观察到LV-Foxjl-siRNA-DCs有效地诱导了抗肿瘤应答。
增强LV-A20-siRNADCs诱导的HIV特异性T细胞应答设计以下实验以检测A20 siRNA低聚双链体转染的DCs是否具有增强的诱 导HIV免疫应答的效能。简而言之，用LV-A20 siRNA-2或者对照转染DCs。接着 用经HIV gpl20脉冲的转导DCs免疫小鼠群。用脉冲的DCs免疫小鼠后，用PolyI:C (50yg/鼠)体内刺激小鼠三次。DC免疫后两周，检测免疫小鼠中的抗体应答。胞内 IFNy染色显示增强了 A20 siRNA低聚DCs免疫小鼠中的HIV gpl20特异性的CD8+ T细胞应答(图43)。
实施例15:增强的FoxU沉默DCs的免疫刺激性效能不希望束缚于任何具体的理论，相信IicB表达的诱导调节DCs的免疫刺激 效能。IicB的表达受到动态的控制；即使没有激活信号，lKB经历稳定的周转并通 过合成新的IicB分子得到不断的补充，以保证NF-kB不被激活。Foxo3a和Foxjl 是最近被鉴定为IkB转录激活因子的叉头转录因子家族的成员。Foxjl和Foxo3a 积极地参与NF-kB的负调控。/ox//基因的剔除导致子宫内的早期死亡。发现，具 有i^(T^背景的/o々7一淋巴系统的嵌合动物显示多器官全身性炎症、增加了 TH1 细胞因子的产生和T细胞的过度增殖。相信，这促成了NF-KB信号传导途径的调 节不良。IkB的一个主要同种型，IkB(3，不存在于/oxj7缺失的T细胞中，这解释了 静息/o々卢—T细胞中NF-kB的过度激活和那些细胞对TCR刺激的超敏性。Foxo3a 缺失的T细胞具有高基础水平的NF-kB活性，这是由于缺少两个IkB同种型如在 /oxy厂一 T细胞中的IkBj3、和lKBs的表达，这表明静息T细胞中的IkB的产生需要 Foxo3a，如同Foxjl。 Foxo3a缺失的T细胞显示了 TCR信号传导后TH1细胞因 子和TH2细胞因子都过度增殖和大大增加。Foxjl和Foxo3a似乎具有重叠的但不 是完全丰余的功能。iKBa的存在对/ay7一和/oxo3f ^小鼠中的NF-,:B的上调没有 明显的影响，表明在控制基础水平的NF-icB活性上，三个IkB蛋白中缺乏功能性 丰余。设计下组实验以检测Foxjl在调节抗原呈递中的作用。图44显示在Foxjl siRNA寡聚体(5'-AGAUCACUCUGUCGGCCAU-3，； SEQ ID NO:60)转染的细胞中 Foxjl被下调。简而言之，用Foxjl siRNA寡聚体和FLAG标记的mFoxjl表达载 体以10:1的比例，通过GenePorte，共转染293T细胞。转染后48小时，加工细胞 和对相应的细胞裂解物进行蛋白质印迹法。蛋白质印迹法显示了归一化到/3-肌动
100蛋白条带的Foxjl条带的强度。观察到，同用siRNA突变体转染的DCs相比，用 Foxjl-siRNA2 (在随后的研究中命名为Foxjl-siRNA)寡聚体转染的DCs更加应答 LPS，其显示为增加的促炎细胞因子如IL-6的分泌(图45)。基于Foxjl-siRNA寡聚体有效地增加IL-6分泌的事实，产生重组的 LV-Foxjl-siRNA以评价LV-Foxj 1-siRNA提高转导DCs的免疫剌激效能的能力。用 LV-Foxjl-siRNA或者LV-GFP-siRNA载体转导DCs(>80% CDllc+)通常产生60%的 YFP阳性的培养细胞。利用转导的DC检测LV-A20-siRNA-DCs是否具有增加的诱 导免疫应答的能力。接着，用已被期望抗原如TRP2或者HIV gpl20脉冲的LV-Foxj 1-siRNA-DCs
免疫小鼠群。用脉冲的DCs免疫小鼠后，对未经体内剌激的小鼠进行刺激。DC 免疫后两周，检测免疫小鼠的免疫应答。胞内IFNY染色显示了增强的 LV-Foxjl-siRNA-DCs免疫小鼠中TRP2特异性的CD8+T细胞应答(图46)。而且， 胞内IFN"/染色显示了 LV-Foxjl-siRNA-DCs免疫小鼠中增强的HIVgpl20特异性的 CD8+禾口 CD4+T细胞应答(图47)。
实施例16:增强的Twist 2沉默DCs的免疫刺激效能不希望束缚于任何具体的理论，相信NF-kB靶向基因表达的抑制影响了 DC的免疫刺激性效能。Twist是NF-kB信号传导的负性免疫调控因子。哺乳动物 有两个twist蛋白，Twist-1和Twist-2，它们在广范围的出生后组织中低水平地表 达。基因的缺失导致多个组织中促炎细胞因子表达的增加，造成恶病质和 不能茁壮成长。该表型在rwi'sf-J和^^-2化合物杂合子中重演，反映了这些基因 在抑制细胞因子表达中的丰余性和剂量依赖性。-2 KO小鼠的表型似乎反映了 负反馈环的失去，在该反馈环中Twist通常与NF-kB的p65关联并抑制细胞因子 的启动子。Twist结合细胞因子启动子的E框并抑制结合到邻近NF-kB位点的 NF-kB的活性。通过与p65的蛋白-蛋白接触，Twist也能够抑制NF-kB介导的独 立于DNA结合的靶启动子的激活。设计下组实验以检测Twist2在调节抗原呈递中的作用。图48显示在Twist 2siRNA寡聚体转染的细胞中Twist2被下调。简而言之，用Twist 2 siRNA寡聚体 和FLAG标记的Twist 2表达载体以10:1的比例，通过GenePorte共转染293T细 胞。转染后48小时，加工细胞和对相应的细胞裂解物进行蛋白质印迹法。Twist2 带的强度被归一化到/3-肌动蛋白带的强度并显示相对强度(比值)(图48)。 Twist的 表达受Twist-2 siRNA寡聚体(5，-GCGACGAGAUGGACAAUAA-3，； SEQ ID NO:61 和5，-CAAGAAAUCGAGCGAAGAU-3，； SEQ ID NO:62)的下调。
为了检测Twist2siRNA寡聚体双链体转染的DCs是否具有增强的诱导抗原 特异性T细胞应答的效能，用Twist 2 siRNA-2低聚双链体或者对照低聚双链体转 染DCs。接着用已被OVA脉冲的转染的DCs免疫多组小鼠。用脉冲的DCs免疫
101小鼠后，用Polyl:C(50pg/鼠)体内刺激小鼠三次。DC免疫后两周，检测免疫小鼠 的免疫应答。四聚体染色和IFNY ELISPOT分析显示增强了用经PolyI:C体内刺激 的Twist 2 siRNA低聚-DCs免疫小鼠中OVA特异性的CD8+ T细胞应答(图49和 50)。
实施例17:增强的SUMOl沉默DCs的免疫刺激效能 SUMO蛋白通过改变它们的转运、定位和稳定性(有时称为类泛素化修饰)， 负调节它们的结合配体。在脊椎动物种中，SUMO有四个成员SUMOl、 SUM02、 SUM03和SUM04。 SUMOl通过类泛素化修饰K21上的IkBcx——能够通过泛素 连接酶与K48连接的泛素链结合的位点，负调节NF-kB信号传导。SUMO对IkBoc 的修饰保护lKBoc免受泛素介导的降解并最终抑制NF-KB的激活。此外，发现其中 保守的蛋氨酸(Met55)被缬氨酸残基取代(M55V)的SUM04的功能变体降低了 SUM04对NF-kB激活的抑制效果，并与I型糖尿病相关。设计下组实验以检测SUMOl在调节抗原呈递中的作用。为了检测SUMOl siRNA低聚双链体转染的Cs是否具有增强的诱导抗原特异性T细胞应答的效能， 用期望的SUMOl siRNA低聚双链体(5'-GAUGUGAUUGAAGUUUAUC-3，； SEQ ID NO:59)转染DCs。接着用已被OVA脉冲的转染DCs免疫小鼠群。用脉冲的 DCs免疫小鼠后，用LPS (30 lug/鼠)体内刺激小鼠三次。DC免疫后两周，检测免 疫小鼠的免疫应答。IFNy ELISPOT分析显示，经体内PolyI:C刺激，增强了 SUMOl siRNA寡聚体(2和3)-DCs免疫小鼠中OVA特异性的CD8+ T细胞应答(图51)。另 外，经100 ng/ml LPS剌激后，明显增加了 SUMOl siRNA寡聚体(3)转染的DCs 中的IKpa的磷酸化(图52》
实施例18:抑制与调节分子稳定性相关的基因各种负免疫调控因子经常使用的策略是通过泛素化/去泛素化调节关键信 号传导分子的稳定性，和通过类泛素化修饰和其它的机制增加信号传导分子复合 体抑制组分的稳定性。这些负免疫调控因子中的许多如TRIAD3A、 Cyld、 SUMO、 Clb和A20是泛素化修饰的酶，其修饰靶Toll样受体(TLRs)和信号传导分子，并 促进它们的降解以衰减TLR和肿瘤坏死因子(TNFR)信号转导。
TRIAD3A是TRIAD3家族的RING指E3泛素连接酶。TRIAD3A能够结合 并泛素化TLR4和TLR9胞质结构域，这导致它们的降解。TRIAD3A的过度表达 减少了 TLR4-和TLR9-介导的NF-kB的激活以应答LPS和CpG DNA。因此，基 于本公开内容，利用此处公开的方法，下调TRIAD3A的表达水平能够造成增强的 TLR表达和增加的体外LPS和CpG的应答。因此，本发明包括通过抑制TRIAD3A 提高免疫细胞的免疫效能。参与调节蛋白稳定性的另一个基因是CYLD。 CYLD是肿瘤抑制基因，其编码含有956个氨基酸的蛋白。已经在一种与无数良性皮肤附件肿瘤相关的疾病 ——圆柱瘤中发现CTZi)基因的突变，包括提前终止或者移码改变。在NF-kB信 号传导级联中，TRAF2和IKKy与赖氨酸63 (K63)-连接的多聚遍在蛋白链 (polyubiquitin chain)偶联。与通常用K48多聚遍在蛋白链的蛋白泛素化以进行 蛋白酶体降解不同，需要TRAF2、 IKKy和在一些情况下TRAF6的K63泛素化， 以组装和激活IKK复合体。CYLD能够去泛素化TRAF2和IKKy上的K63多聚遍 在蛋白链，造成IKK复合体的解体和抑制NF-kB的激活。突变CYLD的去泛素 化活性的损失与NF-rcB的持续激活相关。因此，利用本文所述的方法抑制免疫细 胞中的CYLD提高细胞的免疫效能。参与分子稳定性的另一个基因是Cbl (对Casitas B淋巴瘤)。Cbl蛋白家族 有三个成员Cbl、 Cbl-b和Cbl-c。 Cbl蛋白家族的特征基序是两个高度保守的N 端结构域酪氨酸激酶结合(TKB)结构域和与泛素偶联的酶(E2s)相互作用的RING 指结构域。这两个结构域一起限定了针对活化的酪氨酸激酶的泛素连接酶——Cbl 蛋白的基本功能单元。基于此处提供的公开内容，抑制Cbl起到阻止活化的酪氨 酸激酶，优选为与增强免疫应答相关的酪氨酸激酶被降解的作用。因此，用本文 公开的方法抑制免疫细胞中的Cbl增强免疫细胞的免疫效能。
抑制蛋白家族是与调节分子稳定性相关的另一蛋白质家族。抑制蛋白家族 包括四个成员P-抑制蛋白1、 (3-抑制蛋白2、 x-抑制蛋白和s-抑制蛋白。(3-抑制 蛋白1和P-抑制蛋白2的一个功能是脱敏(52-肾上腺素能受体介导的第二信使信号 传导。相信由于对lKBa磷酸化/降解的作用，p-抑制蛋白l和P-抑制蛋白2的另一 个功能是抑制信号诱导的NF-kB的激活。p-抑制蛋白与lKBa羧基端结合，这使 得IKK不能进入IkBcx的PEST结构域，造成lKBa蛋白的稳定，因为PEST结构域 的磷酸化促进了 lKBa的降解。因此，利用本文所述的方法抑制免疫细胞中抑制蛋 白家族成员，提高细胞的免疫效能。 TOLLIP (Toll相互作用蛋白)有利于IRAKI的泛素化和随后的降解。TOLLIP 与IRAKI相互作用，并且在存在TOLLIP时，降低了 IRAKI自身磷酸化的水平。 TOLLIP的过度表达造成TLR2-和TLR4-介导的NF-kB激活的抑制。基于本文提 供的本公开内容，使用本文所述的方法抑制免疫细胞中的TOOLIP提高细胞的免 疫效能。
实施例19:通过它们的非功能性同源物抑制信号传导分子调节Toll样受体(TLR)和肿瘤坏死因子受体(TNFR)信号传导的另一个策略 是通过它们的不具有刺激活性的非功能性同源物或者同工型竞争性地抑制关键的 信号传导分子。用负性免疫调节因子如RP105、 ST2、 SIGIRR、 IRAK-2、 IRAK-M、 sMyD88和sTLR举例说明该策略。可溶性诱饵TLRs (sTLR)抑制TLRs与微生物产物的相互作用。可溶性TLR2能够与TLR2竞争与微生物配体的相互作用。可溶性TLR4能够与MD2相 互作用并抑制MD2-TLR4复合体的形成，由此通过TLR4阻断了 LPS介导的信号 传导。不希望束缚于任何具体的理论，相信利用此处公开的的方法抑制免疫细胞 中负免疫调控因子如RP105、 ST2、 SIGIRR、 IRAK-2、 1RAK-M、 sMyD88和sTLR
提高细胞的免疫效能。
非功能性TIR同源物提高免疫细胞的免疫刺激效能的另一个策略是抑制与膜结合的非功能性 TIR同源物相关的蛋白质，其含有TIR结构域并且没有剌激活性，如SIGIRR、 ST2 和RP105。这些蛋白质能够抑制TLR信号传导。RP105是TLR4的同源物并且在 APCs上表达。RP105与MD-1形成复合体，其与TLR4-MD-2直接相互作用并且 抑制TLR4-MD-2复合体结合LPS。 RP105是初级树突状细胞中TLR4信号传导的 生理调节因子并且是对内毒素进行体内应答的生理调节因子。
发现SIGIRR缺失小鼠对LPS诱导的内毒性休克高度敏感。SIGIRR通过与 TLR4竞争以与信号传导分子相互作用而衰减TLR4信号传导。同样地，ST2缺失 小鼠显示增加的促炎细胞因子产生以应答LPS和LPS耐受性的缺陷性诱导。相信 ST2的过度表达抑制了 NF-kB的激活，因为ST2与MyD88和TIRAP相关并隔离 MyD88禾口 TIRAP。
信号传导分子同工型
「0526]已经发现，关键信号传导分子的几个非功能同丁型如MyD88和IRAK抑制 TLR信号传导。MyD88s——缺少中间结构域的MyD88的可选剪接的短变体，当 用LPS剌激时在单核细胞中被诱导。MyD88s抑制LPS诱导的NF-kB的激活，这 是由于其不能结合IRAK4并促进IRAKI的磷酸化。 IRAK-M缺少激酶活性，并且作为APCs中TLR信号传导的全局负免疫调 控因子发挥功能。激酶的IRAK家族包括四个成员IRAK1、 IRAK2、 IRAK4和 IRAKM。不像其它的IRAKs被普遍地表达，非刺激性IRAK-M的表达受到单核 细胞和巨噬细胞的限制，并且经TLR配体刺激后可诱导性地表达。IRAK-M-缺失 型小鼠显示增加了促炎细胞因子的产生以应答TLR配体和LPS耐受性的缺陷性诱 导。IRAK-M通过抑制IRAKI和IRAK4的磷酸化或者通过稳定 TLR—MyD88—IRAK4复合体，阻止IRAKI—IRAK4复合体从MyD88的解离，由此 阻止IRAK1-TRAF6复合体的形成。在小鼠中IRAK2具有四个剪接变体IRAK2a、IRAK2b、IRAK2c和IRAK2d。 IRAK2c和IRAK2d缺少在全长IRAK2和在IRAK2a与IRAK2b同工型中发现的 死亡结构域，并且经LPS刺激后可在巨噬细胞中被诱导性表达。显示IRAK2c和
104IRAK2d的过度表达以剂量依赖性的方式抑制LPS诱导的NF-kB的激活，暗示负 反馈对TLR信号传导的作用。转录因子的IFN调节因子(IRF)家族的两个成员，IRF-5和IRF-7，与MyD88 相互作用并分别诱导促炎细胞因子和I型IFNs。然而，IRF-4也与MyD88相互作 用并作为TLR信号传导的负免疫调控因子发挥作用。IRF-4 mRNA受TLR激活的 诱导，并且IRF-4与IRF-5竞争与MyD88相互作用。在来自众/4基因缺失小鼠的 腹膜巨噬细胞中，促炎细胞因子的TLR依赖性诱导被显著地提高，然而，该诱导 被巨噬细胞系中IRF-4的异位表达所抑制。//^-缺失小鼠显示了对DNA诱导的休 克的超敏性，表现为血清促炎细胞因子水平升高，该发现强调了TLR体内信号传 导中IRF-4的关键功能。 FLN29是新的干扰素-和LPS-诱导基因，其含有TRAF6相关的锌指基序和 TANK (TRAF家族成员相关的NF-kappa B激活因子)相关序列。尽管小干扰RNA 对FLN29表达的减少部分抵消了对LPS信号传导的下调，但是巨噬细胞样RAW 细胞中的FLN29的表达导致对TLR介导的NF-kappaB和MAP激酶激活的抑制。 而且，己经显示，FLN29的共表达削弱了 TRAF6和TAB2诱导的NF-kappaB激活， 这说明FLN29可以调节TRAF6的下游。相信，FLN29是TLR信号传导的负免 疫调节因子。
信号传导分子复合体的负组分在细胞质中，与包括iKBa、IicB(3和IkBs的IkB蛋白结合的结果是，NF-kB 蛋白以失活的形式被掩蔽。IkB蛋白通过掩蔽NF-kB亚基上的核定位序列(NLSs) 或者通过在核与胞质之间比核输入过程更有效地促进核输出过程；使NF-kB保留 在细胞质中。lKBa调节短暂的NF-kB激活和IKB(3维持持续的NF-kB激活。由于 在它的启动子中存在NF-kB应答元件，lKBa很快地被降解以应答剌激物并快速地 被重新合成。比较而言，iKB(3比lKBa对刺激物诱导的降解更不敏感。遗传研究己 经显示了lKBa、 IkB卩和lKBs控制NF-KB激活的不同功能和丰余功能。缺少IkB(x 导致造血组织中NF-kB活性的升高。 NF-kB激活中的决定性事件是IkBs的磷酸化，其由IKK复合体介导。IKK 复合体是包括TLR配体和TNF的各种刺激物激活NF-KB的交汇点。IicB激酶(IKK) 复合体含有两个催化亚基，IKKa和IKK(3，并且控制NF-kB转录因子的激活。IKKp 介导NF-KB的激活以应答促炎细胞因子和微生物产物。己经显示IKKa参与控制NF-KB激活中的负免疫调控作用。IKKa通过加快 NF-kB亚基RelA和c-Rel的降解和从促炎细胞因子基因启动子中除去RelA与 c-Rel，促成了 NF-kB活性的抑制。小鼠IKKa的失活提高了炎症和细菌的清除率 (Lawrence等人，2005 Nature 434:1138)。不希望束缚于任何具体的理论，抑制此处所述的任何基因或者它们的结合，作为抑制所述抑制因子的方法。基于本公开内容，抑制免疫细胞中的负免疫调控 因子能够提高细胞的免疫效能。
实施例20:信号传导分子磷酸化的调节对MAPK途径通过MAPK磷酸酶(MKPs)进行反馈抑制。MAPK途径激活 后，诱导了MKPs。已经显示，MKPs、 MKP5和MKP6中的两者通过抑制它们各 自的MAPK靶的活性，负调节T细胞的激活。 MKP5最初表征为磷酸酶，其优先作用于JNK和p38。 jW&5剔除动物显示 了对JNK活性的上调和最终地下调天然免疫和获得性免疫的应答。MKP6被鉴定 为与CD28共同受体的胞质尾区相互作用的蛋白质。当CD28共剌激初级人T细胞时，MKP6被诱导。逆转录病毒驱动的显性 阴性形式的MKP6的异位表达增加了 IL-2的表达以应答TCR禾B CD28的共刺激。 增加IL-2的产生也可以通过利用不再与MKP6相互作用的突变CD28共同受体获 得。总之，这些观察显示，MKP6参与了 MAPK途径的负调节，以应答CD28的
共剌激。不希望束缚于任何具体的理论，抑制细胞中的磷酸酶——其中所述磷酸酶 与抑制参与免疫应答信号转导途径的激酶相关，作为提高细胞免疫效能的方法。
实施例21:其它的调节因子机制 Dok-l禾Q Dok隱2 Dok-l和Dok-2，最初被鉴定为许多蛋白质酪氨酸激酶(PTKs)的底物 (Shinohara等人，2005 J Exp Med. 3:333-339)。 Dok-l和Dok-2是负调节PTKs的 Ras-Erk信号传导下游的衔接蛋白。LPS快速地诱导酪氨酸磷酸化和Dok-l和Dok-2 的衔接子功能。用来自缺乏Dok-l或者Dok-2的小鼠的巨噬细胞的LPS刺激诱导 了增加的Erk激活，但其它的MAP激酶或者NF-kB不这样，这造成了 TNF-a和 氧化氮的高产。而且，突变小鼠显示了 TNF-a的高产和对LPS的超敏性。巨噬细 胞中的Dok-l或者Dok-2的强制表达抑制了LPS诱导的Erk激活和TNF-a的产生。 因此，Dok-l和Dok-2被认为是TLR4信号传导的负性免疫调控因子。
NOD2 NOD2是核苷酸结合寡聚化结构域家族的成员，其能够识别细菌产物胞壁酰 二肽(MDP)。来自NOD2缺失型小鼠的脾细胞发展了增加的TH1细胞应答，以应 答暴露于TLR2激动剂，但不应答其它的TLR配体。因此，NOD2被认为是TLR2 信号传导的负免疫调控因子。与此一致，克罗恩病的患者携带iVO"2基因的富含 亮氨酸的重复区域中的突变体，这导致削弱的MDP识别。而且，TLR2刺激物刺 激单核细胞后，缺陷性NOD2功能造成了对促炎细胞因子的偏爱。
PI3K是由p85调节亚基和pllO催化链构成的异源二聚体。PI3K被大多数 细胞组成型表达并作为许多细胞事件的早期信号发挥功能。p85缺失型小鼠显示了 增加的TLR信号传导和显性的TH1细胞应答。由来自PI3K缺失型小鼠的树突状 细胞合成的IL-12显著地增加以分别应答TLR4、 TLR2和TLR9配体LPS、肽聚糖 和CpG DNA。在体内，高度敏感的BALB/c背景的PI3K缺失型小鼠比野生型小 鼠更加抵抗利什曼原虫(Z^;y/raa7"》mq/w)的感染，这是原生的TH2介导的寄生疾 病。这些结果表明，PI3K是有效的TLR信号传导的负免疫调控因子，这导致抑 制IL-12的合成和阻止Th1应答的过度表达。不希望束缚于任何具体的理论，相信 PI3K抑制TLR信号传导的机制涉及对p38、 JNK、 ERK1/ERK2和NF-kB的抑制。
前列腺素 CyPG15-脱氧-A12'14-前列腺素J2 (15d-PGJ2)是天然的配体和环戊烯酮前列腺 素的激动剂。15d-PGJ2来自环加氧酶代谢物前列腺素D2的脱水和异构化。过氧化 物酶体增殖物激活受体y (PPARy)的激活能够拮抗NF-kB的转录活性。15d-PGJ2 通过抑制IKK(3的激酶活性抑制IB(x磷酸化和降解。15d-PGJ2和其代谢物的特征结 构是含有亲电的反应性a, f3不饱和羰基的环戊烯酮环。15d-PGJ2环戊烯酮环结构也 能解释p50和p65亚单位中半胱氨酸残基的共价修饰，其削弱了 NF-kB的DNA 结合活性。
TRAIL-R TRAIL的受体，TRAIL-R没有TIR结构域，但属于TNF超家族。TRAIL 缺失型和TRAILR缺失型小鼠显示提高的对小鼠巨细胞病毒感染的清除能力，这 与IL-12、 IFN-P和IFN-y水平的增加相关。而且，TLR2、 TLR3和TLR4配体对巨 噬细胞的刺激造成了更高水平的TRAIL上调和TRAILR缺失型细胞中细胞因子产 生的增加。这些结果表明TRAILR信号传导是选择性的TLRs的负性免疫调控因 子。
Roquin (Rc3hl) Roquin是RING型E3泛素连接酶蛋白家族的高度保守成员。Roquin蛋白特 征在于存在RNA结合蛋白中发现的CCCH锌指和其定位于胞质RNA颗粒。Roquin 被认为参与调节信使RNA的翻译和稳定性。不希望束缚于具体的理论，相信成熟 T细胞内的Roquin基因的突变(或者抑制Roquin)，导致形成了过多的滤泡辅助性T 细胞和生发中心。基于本公开内容，抑制Roquin能够起到增加免疫细胞的免疫效 能的作用。此处引用的各种和每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用其全
107部内容由此包含于本文。尽管本发明通过参照具体的实施方式已经被公开，但显而易见的是，本领 域技术人员在不偏离本发明的真正精神和范围的情况下，可以设计本发明的其它 实施方式和变化情况。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等 同的变化。
权利要求
1. 提高免疫细胞的免疫效能的组合物，所述组合物包括负性免疫调节因子的抑制剂，其中，所述抑制剂干扰所述细胞中的所述负性免疫调节因子，以及其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质，和诱导NFκB的抑制因子表达或者抑制NFκB靶向基因转录的转录因子，或者它们的任意结合。
2. 权利要求1所述的组合物，其屮所述参与分子稳定的蛋白质选自A20、SUMO(SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)和它们的任何变体。
3. 权利要求l所述的组合物，其中所述抑制NFKB靶向基因转录，或者诱导NFkB的抑制因子表达的转录因子选自Twist-l、 Twist-2、 Foxjl、 Foxo3a和它们的任何变体。
4. 权利要求l所述的组合物，其屮所述抑制剂选自小千扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。
5. 权利要求l所述的组合物，其'f'所述抑制剂足siRNA。
6. 权利要求5所述的组合物，其中所述siRNA选自双链寡核苷酸、单链寡核二":而台T-nifei:女:'.ViKJW FPC'I '■' 二z 1~1 A入o
7. 权利要求5所述的组合物，其中所述siRNA为化学合成的。
8. 权利要求l所述的组合物，进一步包括生理学上可接受的载体。
9. 权利要求8所述的组合物，其中所述生理学上可接受的载体是脂质体。
10. 权利要求1所述的组合物，其屮所述抑制剂山克隆到表达载体的分离多核苷酸编码。
11. 权利要求10所述的组合物，其中所述表达载体选自质粒DNA、病毒载体、细菌载休和咄乳动物载体。
12. 权利要求10所述的组合物，其中所述表达载体进一歩包括促进所述分离多核苷酸整合到宿主细胞基因组的整合信号序列。
13. 权利要求1所述的组合物，进一歩包括具有至少一个表位的抗原，其屮所述表位能够诱发喃乳动物的免疫应答。
14. 权利要求13所述的组合物，其屮所述抗原山农达载体表达。
15. 权利耍求13所述的组合物，其'l'所述抗原是分离的多肽。
16. 权利要求13所述的组合物，其中所述至少-个表位诱导哺乳动物中的CD4+T-细胞应答。
17. 权利要求13所述的组合物，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物中的CD8+T-细胞应答。
18. 权利要求13所述的组合物，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物中的B细胞应答。
19. 权利耍求13所述的组合物，其中所述抗原与疾病相关。
20. 权利要求19所述的组合物，其中所述疾病选自传染病、癌和自身免疫性疾病。
21.<formula>formula see original document page 3</formula>
22. 权利要求21所述的组合物，其中所述传染病山选自病毒、细菌、真菌和原生动物的病原微生物引起。
23. 权利要求13所述的组合物，其中所述抗原由病毒基因编码。
24. 权利要求23所述的组合物，其中所述病毒基因来自选自乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、乳头瘤病毒和疱疹病毒的病毒。
25. 权利要求23所述的组合物，其中所述抗原由选自乙型肝炎病毒e抗原基因、乙型肝炎病毒表面抗原基因和乙型肝炎病毒核心抗原基因的病毒基因编码。
26. 权利要求23所述的组合物，其'l'所述抗原〖ll选A人免疫缺陷病毒Envgpl60基因、Gag基因、Pol基因、Rev基因、Tat基沐J、 Vif基因和Nef基因的病毒基因编码。
27. 权利要求23所述的组合物，其中所述抗原山选自乳头瘤病毒E7基因和乳头瘤病毒E6的病毒基因编码。
28. 权利要求23所述的组合物，其屮所述抗原山来向选自单纯性抱疹病瑶1型、单纯性抱疹病毒2型、爱泼斯坦-巴尔病蹄、细胞巨化病难、人抱疹病〗每6、人疱疹病毒7和人疱瘆病毒8的疱疹病毒的病毒基因编码。
29. 权利要求13所述的组合物，其屮所述抗原'5癌有关。
30. 权利耍求29所述的组合物，.jt中所述癌选ft乳腺癌、宫颈癌、黑素瘤、肾癌和前列腺癌。
31. 权利耍求29所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原，选自与过度表达肿瘤相关的抗原、睾丸肿瘤抗原、与突变肿瘤相关的抗原、与分化肿瘤相关的抗原酪氨酸酶、MART、 trp、 MAGE-1、 MAGE-2、 MAGE-3、 gp100、 HER-2、Ras和PSA。
32. 权利要求31.所述的组合物，其中所述肿瘤相关抗原选自BCR-ABL、CASP、 CDK、 Ras、 p53、 HER-2/neu、 CEA、 MUC、 TW1、 PAP、存活蛋白、端粒酶、EGFR、 PSMA、 PSA、 PSCA、酪氨酸酶、MART、 TRP、 gp100、 MART、MAGE、 BAGE、 GAGE、 LAGE/NY-ESO、 RAGE、 SSX-2、 CD19和CD20。
33. 权利要求13所述的组合物，其中所述疾病选H类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣和克罗恩病。
34. 权利要求13所述的组合物，进一歩包括细胞因子。
35. 权利要求34所述的组合物，其中所述细胞因子选自IL-12、 TNFa、 IFNa、IFN(3、 IFNy、 IL-7、 IL-1、 IL陽2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
36. 权利要求13所述的组合物，进一歩包括Toll样受体(TLR)激动剂。
37. 权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂抑制对抗原受体信号传导的抑制。
38. 提高细胞免疫效能的组合物，所述组合物包括载体，该载体包括编码抑制剂的第一多核苷酸，其屮所述抑制剂在所述细胞中千扰负性免疫调节因了，并且其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它们的任意结合，和编码具有至少一个表位的抗原的第二多核苷酸，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物中的免疫应答。
39. 权利要求38所述的组合物，其中所述参与分子稳定的蛋白质选自A20、SUMO(SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)和它们的任何变体。
40. 权利要求38所述的组合物，其中所述抑制NFkB靶向基因转录或者诱导NFkB的抑制因子表达的转录因子选fl T\vist-1、 1Vist-2、 Foxjl、 Foxo3a和它们的任何变体。
41. 权利要求40所述的组合物，其屮所述抑制剂选自小千扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。
42. 权利要求40所述的组合物，其中所述载体选自质粒DNA、病毒载体、细菌载体和哺乳动物载体。
43. 提高细胞免疫效能的组合物，所述组合物包括载体，该载体包括编码抑制剂的第一多核苷酸和编码至少细胞因子或者Toll样受体(TLR)激动剂的第二多核苷酸，其中所述抑制剂在所述细胞中千扰负性免疫调节因子，并且其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB耙向基因转录的转录因子或者它们的任意结合。
44. 权利要求43所述的组合物，其屮所述参与分子稳定的蛋白质选fi A20和SUMO(SUMOl、 SUM02、 S固03、 SUM04)。
45. 权利要求43所述的组合物，其中所述抑制NFKB靶向基因转录或者诱导NFkB的抑制因子表达的转录因子选自Twist-l、 Twist-2、 Foxjl和Foxo3a。
46. 权利要求43所述的组合物，其中所述抑制剂选自小干扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。
47. 权利要求43所述的组合物，其中所述编码细胞因子的第二多核苷酸选自IL陽12、 TNFa、 IFNa、 IFN(B、 IFNy、 IL-7、 IL-1、 IL-2、 IL-6、 IL-15、 IL-21和IL-23。
48. 包括负性免疫调节因子抑制剂的细胞，其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它们的任意结合。
49. 权利要求48所述的细胞，其中所述参与分子稳定的蛋白质选自A20、SUMO(SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)和它们的任何变体。
50. 权利要求48所述的细胞，其'f'所述抑制NFkB靶向基因转录或者诱导NFkB的抑制因子表达的转录因f选flTwist-1、 Twist-2、 Foxjl、 Foxo3a和它们的任何变体。
51. 权利耍求48所述的细胞，其中所述抑制剂选fi小千扰RNA (siRNA)、微RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和小分子。
52. 权利要求48所述的细胞，其中所述细胞是选自APC、树突状细胞、单核细胞/巨噬细胞、T细胞和B细胞的免疫细胞。
53. 权利要求52所述的细胞，其中所述T细胞是细胞毒性T细胞、辅助性T细胞和调节性T细胞。
54. 权利要求48所述的细胞，进一歩包括具有至少一个表位的抗原，其中所述表位能够诱发哺乳动物的免疫应答。
55. 权利耍求48所述的细胞，进一歩包括含有编码细胞因子的多核苷酸的表达载体。
56. 产生沉默细胞的方法，所述方法包括将细胞4负性免疫调节因子的抑制剂接触，其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它们的任意结合。
57. 权利要求56所述的方法，其中所述参与分子稳定的蛋白质选自A20、SUMO(SUMOl、 SUM02、 SUM03、 SUM04)和它们的任何变体。
58. 权利要求56所述的方法，其中所述诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFKB耙向基因转录的转录因子选自Twist-l、 Twist-2、 Foxjl、 Foxo3a和它们的任何变体。
59. 权利要求56所述的方法，其中所述抑制剂选自小干扰RNA (siRNA)、微 RNA、反义核酸、核酶、编码反式显性负突变体的表达载体、细胞内抗体、肽和 小分子。
60. 产生沉默和脉冲致敏细胞的方法，所述方法包括i)将细胞与负性免疫调 节因子的抑制剂接触，其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳定的蛋白质， 和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它 们的任意结合，和ii)进一歩将所述细胞与具有至少一个表位的抗原接触，其中所 述表位能够诱发哺乳动物的免疫应答。
61. 诱发哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括将包括负性免疫调节因子抑 制剂的组合物给予需耍的哺乳动物，其中所述负性免疫调节因子选自参与分子稳 定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转录的转录 因子或者它们的任意结合。
62. 诱发哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括将包括负性免疫调节因子抑 制剂的组合物施用到所述哺乳动物的肿瘤中，其中所述负性免疫调节因子选自参 与分子稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB靶向基因转 录的转录因子或者它们的任意结合。
63. 诱发哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括给予包括载体的组合物，该 载体包括编码负性免疫调节因子抑制剂的第一多核苷酸，其中所述负性免疫调节 因子选自参与分子稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达或者抑制NFkB 靶向基因转录的转录因子或者它们的任意结合，和编码具有至少一个表位的抗原 的第二多核苷酸，其中所述至少一个表位诱导哺乳动物中的免疫应答。
64. 诱发哺乳动物免疫应答的方法，所述方法包括将包括沉默细胞的组合物给 予需耍的哺乳动物，其中所述沉默细胞包括负性免疫调节因子的抑制剂，其中所 述负性免疫调节因子选自参与分了稳定的蛋白质，和诱导NFkB的抑制因子表达 或者抑制NFkB靶向基因转录的转录因子，或者它们的任意结合。
65. 权利要求64所述的方法，其中在给予需要的哺乳动物所述沉默细胞前， 将所述沉默细胞与抗原在体外接触。
66.权利要求64所述的方法，其中在给予需要的哺乳动物所述沉默细胞后， 将所述沉默细胞与抗原在体内接触。
全文摘要
本发明包括，通过抑制细胞的负性免疫调节因子而提高免疫细胞免疫功能的组合物和方法。本发明提供疫苗和疗法，其中通过抑制负性免疫调节因子增强抗原呈递。本发明也提供了依赖于自体肿瘤抗原呈递的肿瘤接种方法中破坏自体耐受性的机制。
文档编号C07H21/04GK101501055SQ200680030689
公开日2009年8月5日 申请日期2006年1月19日 优先权日2005年6月23日
发明者A·沙拉比, K·C·埃弗尔-卡布勒, S-Y·陈, X·F·黄, X·宋 申请人:贝勒医学院