使用微生物生产氨基酸的方法

专利名称：使用微生物生产氨基酸的方法
使用微生物生产氨基酸的方法本申请要求DE 10 2005 043 979. 9的优先权。本发明涉及用于在产氨基酸的微生物中生产氨基酸的方法，在所 述方法中通过发送蛋白(Transmitter-Protein)来降低2-酮戊二酸 脱氢酶的活性。现有技术氨基酸具有巨大的经济利益，其中氨基酸的用途是多种多样的 优选地使用它们来改善基础食物和饲料的品质。因此，它们具有极大 的经济重要性；对于它们的需求日益增加。例如，需要L-赖氨酸以及 L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-色氨酸用作饲料添加剂，需要L-谷氨酸用 作调料添加剂，制药工业中需要L-异亮氨酸和L-酪氨酸，需要L-精 氨酸和L-异亮氨酸用作药物，或者需要L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸用作用于合成精细化学品的起始物质。用于制备这些各不相同的氨基酸的优选方法是通过微生物进行的 生物技术制备，因为这样可直接获得各种氨基酸的生物学活性和旋光 活性形式，并且能够使用简单和便宜的原料。目前，通过微生物生产 超过1.5 X 106吨的氨基酸。已知通过棒状细菌特别是谷氨酸棒杆菌 (CoiT/7e6acfer/咖^7i/"边/'c咖)菌林的发酵来制备氨基酸。由于其 巨大的重要性， 一直进行努力以改进制备方法。方法的改进可以为发 酵技术措施例如搅拌和供氧，或营养培养基的组成例如发酵过程中的 糖浓度，或通过例如离子交换层析逐步形成产物形式，或微生物本身 的内在性能特征。使用诱变、选择和突变体选择的方法来改善所述微生物的性能特征。如此，获得这样的菌林，其对于抗代谢物(例如，赖氨酸类似物S- (2-氨基乙基)半胱氨酸)具有抗性或对于在调控上重要的代谢物为 营养缺陷型的，并且产生L-氨基酸。近些年来，通过扩增单个氨基酸生物合成途径并研究对氨基酸产 量的影响，还将重组DNA技术的方法用于产氨基酸的棒杆菌菌林的菌 林改进。除其他以外，可在Kinoshita ( "Glutamic acid bacteria"， in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain和Solomon (Eds.)， Benjamin C翻ings， London, UK, 1985， 115-143)， Hilliger (BioTec 2， 40-44 (1991))， Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994))， Jetten和Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995))，和Sahm等人(Annals of the New York Academy of Sciences 782， 25-39 (1996))中找到关于该方面的综述。细菌通常只以生长所需的量产生氨基酸，从而不形成和不排出 (aussheiden)过量的氨基酸。其原因是，在所述细胞中以多种方式 控制氨基酸的生物合成。因此，已知许多不同的方法通过关闭控制机 制来增加产物的形成。在这些方法中使用例如氨基酸类似物以终止有 效的生物合成调节。因而，例如，描述了其中使用对于L-酪氨酸类似 物和L-苯丙氨酸类似物具有抗性的棒杆菌菌林的方法(JP 19037/1976 和39517/1978 )。还描述了其中使用对于L-赖氨酸类似物或者还有 L-苏氨酸类似物具有抗性的细菌以克服控制机制的方法(EP 0 205 849， GB 2 152 509 )。此外，还已知通过重组RNA技术构建的微生物，在所述微生物中 同样通过克隆和表达编码不再可被反馈抑制的关键酶的基因来取消生 物合成调节。例如，已知重组的产L-赖氨酸的细菌，其具有由质粒编 码的反馈抗性的天冬氨酸激酶(EP 0 381 527 )。还公开了重组的产 L-苯丙氨酸的细菌，其具有反馈抗性的预苯酸脱氢酶(JP 123475/1986， EP 0 488 424)。此外，还通过过表达不编码反馈敏感性的氨基酸合成的酶的基因 而获得了增加的氨基酸产率。例如，通过二氢吡啶二羧酸合酶的合成增加来改善赖氨酸的形成(EP 0 197 335 )。同样，通过苏氨酸脱水 酶的合成增加来获得改善的异亮氨酸的形成(EP 0 436 886 )。进一步地，在Izumi Y， Yoshida T， Miyazaki SS， Mitsunaga T， 0hshiro T， Shiamo M， Miyata A和Tanabe T (1993) Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 427-432中描述了借助于曱 基营养菌例如生丝微菌属(i^; 力o边/crM/i/迈)的细菌从甲醇和甘氨酸 发酵制备L-丝氨酸。用于增加氨基酸产量的其他努力旨在改善中央代谢的细胞初级代 谢物的供给。在此已知通过重组技术获得的转酮醇酶过表达使得能够 改善L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的产物形成(EP 0 600 463 )。 此外，降低棒杆菌中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性导致改善了芳香族 氨基酸的形成(EP 0 3331 145 )，然而增强棒杆菌中的磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶的活性导致增加了天冬氨酸家族的氨基酸的排出 (Ausscheidimg) (EP 0 358 940 )。还在工业上使用谷氨酸棒杆菌来制备谷氨酸家族的L-氨基酸，特 别是L-谷氨酸。W0 99/18228A2公开了，在由于酶的遗传改变而导致 丙酮酸羧化酶的活性增强后或在丙酮酸羧化酶基因的表达增加后，微 生物对于天冬氨酸和/或谷氨酸家族的氨基酸产生增加。L-谷氨酸是从柠檬酸循环中间体2-酮戊二酸形成的。两个反应竟 争所述2-酮戊二酸将2-酮戊二酸与铵发生反应并还原成L-谷氨酸 的NADPH依赖性L-谷氨酸脱氢酶(GDH),和作为柠檬酸循环的组成 部分使2-酮戊二酸脱羧成琥珀酰-CoA并在该过程中将MD+还原成 NADH的2-酮戊二酸脱氢酶复合物(0DHC)。在谷氨酸棒杆菌中，对于 2-酮戊二酸来说GDH的L-值是5. 7 mM (Shiio和0zaki， J. Biochem (Tokyo) 68: 633-647 (1970))，这是为80 jiM的对于2-酮戊二酸来 说0匿的L-值(Shiio和Ujigawatakeda， Agric. Biol. Chem. 44: 1897-1904 (1980))的大约70倍。更近的研究表明，棒杆菌中的2-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性是对于谷氨酸的产量影响最大的因素 (Shimizu等人，Bioproc. Biosys. Eng. 25: 291-298 (2003))，因为GDH活性的增强不产生有利于谷氨酸合成的偏移。通过文献中的下述提示确认了 ODH复合物的影响该酶的活性在 导致谷氨酸排出的条件(例如生物素限制、添加去污剂或添加青霉素) 下降低(Kawahara 等人，Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 1109-1112 (1997)) 。 GDH的活性在相同的条件下不被改变。此外， 在诱导温度敏感型谷氨酸棒杆菌菌林形成谷氨酸的情况下，也显示出 降低的0DHC活性(Uy等人，Bioproc. Biosyst, Eng. 27: 153-162 (2005))。此夕卜，Kimura (J. Biosc. Bioeng.，第94巻，No. 6， 545-551， 2002 )描述了，在谷氨酸棒杆菌中dtsRl基因缺失的情况下，ODHC的 活性比亲本菌林中的ODHC的活性低30%(Kimura， J. Bioscience Bioeng. 94: 545-551 (2002) ) 。 dtsRl缺失突变体对于油酸和油酸 酯是营养缺陷型的，并且甚至在生物素过量的情况下也分泌大量的L-谷氨酸(Kimura等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 234: 157-161 (1997))。迄今，只有通过缺失基因gdh( B5rmann等人，Mol. Microbiol. 6: 317-326 (1992); B5rmann-El Kholy 等人，Appl. Environm. Microbiol. 59: 2329-2331 (1993))和odhA (编码0DHC的Elo; Usuda 等人，Microbiology 142: 3347-3354 (1996))或者改变它们的表达 才能获得2-酮戊二酸脱氢酶复合物和谷氨酸脱氢酶的活性的靶向改 变。2-酮戊二酸脱氢酶复合物(0DHC)存在于大多数生物中，其由三 种具有不同酶活性的不同蛋白质即2-酮戊二酸脱氢酶(Elo) 、 二氢 硫辛酰胺-S-琥珀酰转移酶(E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(E3)组成。 棒杆菌的Elo蛋白(由odhA基因编码)具有特殊的结构，因为其在氨 基末端区域中具有与E2亚基的羧基末端区域同源的区域(Usuda等人， Microbiology 142: 3347-3354 (1996))。Cowley等人(Mol. Microbiol. 52: 1691-1702 (2004))显示， 在结核分枝杆菌(妙co6a"er/"迈"6ercw/o"'s) H37Rv中，通过pknG基因的缺失使细胞中的谷氨酸和谷氨酰胺浓度之和增加为相应亲本菌林的2. 64倍。然而，没有描述单种氨基酸谷氨酸和谷氨酰胺的细胞内 浓度。pknG基因编码其细胞功能迄今未曾被描述的丝氨酸/苏氨酸蛋 白激酶。只认识到PknG蛋白对细胞生长的重要性。没有pknG基因的 结核分枝杆菌H37Rv突变体于在Cowley等人(Mol. Microbiol. 52: 1691-1702 (2004))中所指定的生长条件下达到其最大值只有亲本菌 林的细胞密度的一半的细胞密度，这可通过600 nm处的光密度来测定。发明目的本发明的目的是指明增加氨基酸特别是谷氨酸和谷氨酰胺的排出 的进一步的可能性，这更加有效并且不再具有现有技术的缺点。发明描述通过用于在产氨基酸的微生物中生产氨基酸的方法实现了该目 的，在所述方法中通过发送蛋白来降低2-酮戊二酸脱氬酶复合物的活 性。术语"活性，，描述酶将底物转化成产物的能力。可在所谓的"活 性测试"中通过产物的增加、底物(或反应物)的减少或特定辅因子性。根据本发明，2-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性是指将2-酮戊二 酸、辅酶A和NAD+催化转化成琥珀酰-CoA、 C02、 NADH和H+。根据本发明，活性、产量或浓度的增加或减少，原料、产物、反 应物或底物的增加和减少涉及在相同条件下在比较实验中与亲本菌抹 的比较，所述亲本菌林不具有2-酮戊二酸脱氩酶活性的根据本发明的 降低。亲本菌抹是指这样的微生物的菌抹，其用作起始菌株并且经历改变以根据本发明降低2-酮戊二酸脱氢酶的活性。如果ODHC的活性降低，那么底物2-酮戊二酸主要通过谷氨酸脱 氩酶(GDH)与铵、NADOPH和H+反应，从而产生L-谷氨酸和NADP+, 由此增加细胞的谷氨酸含量。因为L-谷氨酸是在从相应的2-酮基化合 物合成L-氨基酸中最重要的氨基供体，因此谷氨酸浓度的增加也增加 了作为后继产物的其他氨基酸的产量。作为实例在此提及谷氨酰胺、 天冬氨酸、鸟氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、曱硫氨酸、半胱氨酸和/或脯氨酸。作为本发明的主题的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦 芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或者从甘油和乙醇产生氨基酸，特别是L-谷氨酸。作为微生物使用棒状细菌，优选革兰氏阳性棒状细菌，棒杆菌科 (Coiy"e6s"eT/aceae)、分枝杆菌科(妙co6a"er/aceae)、 丙酸 杆菌科(尸ro/7/aa/6a"er/flcae)、链霉菌科(^re/^咖/c"aceae) 或乳杆菌科(^c^ 6ac/7/scae)，特别优选棒杆菌科或分枝杆菌科或 链霉菌科的细菌。下列可以是棒状细菌的代表，例如，诺卡氏菌科(^ canf/aceae)、 迪茨氏菌科("/"ziaceae)、戈登氏菌科(Co油/2/aceae)、冢村氏 菌科(7^ir3;z7ure//flcese)、红球菌属()、斯科曼氏菌 属(5^eT7Z/a/ /a) 、 /^'///aiz^/acefle,优选棒杆菌科，特别是棒杆菌属 (a>iT"e&c"r/wz7)的细菌。在棒杆菌属中，可特别提及谷氨酸棒杆 菌和0 iy/2e^crer/wz/ e/Y7c/e/7S类型，所述细菌就其产生L-氨基酸 的能力而言在本领域内是已知的(Eggeling， L.和Bott， M. ， Handbook of Corynebacterium glutamicum， CRC Press, Boca Raton, USA (2005))。棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌类型的合适的菌林例如是已知的野 生型菌林谷氨酸棒杆菌ATCC13032,醋谷棒杆菌(Cor"e^s"er/咖ac"o^7W緒/cw迈)ATCC15806，嗜乙酰乙酸棒杆菌(Coiy/ e6acfer/i;/z7 acefoac/ifo/7A//wz7) ATCC13870,栖糖蜜棒杆菌(Car7fle6s"er/咖/z7e/ssseco7fl ) ATCC17965， 热产氛棒軒菌(Cor/zze6ac^er/wz7 f力er迈( a/z7/i3C^e/7es ) FERM BP-1539,黄色短杆菌(Sre".6fl"eW咖/7歸迈)ATCC14067， 乳发酵短杆菌(A，/^s"er/咖/s"0尸e飾/7f咖)ATCC13869,和扩展短杆菌(Are"'6a"er/咖力Var/c"咖)ATCC14020。 原则上，所有已知用于氨基酸的生物技术工业生产的微生物可用于本发明的方法。棒状细菌的其他菌林也是合适的，例如产氨性短杆菌 (AreF/6fl"er/'i/迈膝/z2(^e/7es )、 扩展短杆菌、产氨短杆菌 (Are7/6a"eW咖緒迈o/z/age/zes)、 黄色短杆菌(5re「/6a"er/咖 /7肝咖)、乳发酵短杆菌、玫瑰色短杆菌("re"'6fl"eW咖，e咖)、 解糖短杆菌(Are"'6a"eW咖^<3^力3_^//〃<7//迈)、AreF/6s"er/咖 /迈顶ai"/o/7力/7wz7、 嗜乙酰乙酸棒杆菌、百合棒杆菌(Cor7"/7e6sc^er/w/B 、美棒杆菌(Cor7ne6a"eW咖cfl//w/2<2e)和力士棒杆菌 (Cor/z7e6a"er/咖Aercw/is)。 在"Handbook of Corynebacterium glutamicum，， ， L. Eggeling和M. Bott (eds.)， CRC Press, Boca Raton, USA (2005)，第2. 4章中指出了本发明可使用的其他细菌， 例如无枝菌酸棒杆菌(fl边/co/s^边)、irro/7/7e/L^^/〃/、非典 型棒杆菌(a077/c咖)、耳炎苏黎世菌(77/r/ce"a 0〃〃力'iO 、 美棒杆菌、C e/77c/e/7s、产氨棒杆菌(C.炎棒杆菌(C. c"〃"V")、多毛棒杆菌(C. J3270S咖)、产氨棒杆 菌、无枝菌酸棒杆菌、干燥棒杆菌(C. "r^/s)、模仿棒杆菌(C. // /"/75)、假白喉棒杆菌(/^ei/^^//;7/^Aer/〃ci//zO 、科寸尹尔棒 杆菌(C. 、紋带棒杆菌(C. s"/W咖)、苛求棒杆菌(C.尸a"/ /os咖)、产粘棒杆菌(C.銜c/尸ac/e/7s)、接近棒杆菌(Cpro/72./7《uu迈)、易混棒杆菌(C. co/2尸"s咖)、C su/7"Fa//e/7se、 C. f力o釘se力//、灰绿棒杆菌(C. ^7ayc咖)、C, 7//70/7力"o/7amz7、 类真菌棒杆菌(C町c"o/^)、阑尾炎棒杆菌(C. fl/7/7e/2f/ec/s)、 模仿棒杆菌、美棒杆菌、C. e/77"'e/2S、 C, /7cesce/2S、解脲棒杆菌(C. urea7/〃c咖)、杰氏棒杆菌(C. /e/le/w迈)、C. 尸"se/7/7、 牛棒杆菌(C, ^r/s)、变异棒杆菌(C. KaWaW/")、白喉杆菌(C. d/p/^力er/ae) 、 C. F/faeri//!7//72 、库氏棒軒菌(C. iri/fsc力er/')、 解葡萄糖苷棒杆菌(C. ^wc"ro/7o/y〃c"边)、牛肾盂炎棒杆菌(C. re"a/e)、乳腺炎棒杆菌(C /zws〃7/f//s)、坚初棒杆菌(C. ^/r"/z )、 ,^>色棒軒菌(C. nigricans)、极"、棒軒菌/ss/zzzw/z )、 模拟棒杆菌(C. s/范w/s/7《)、C. "r/7e/zo"6A/wz 、假结核棒杆菌(C. 卿油励e彻7o《/s)、假白喉棒杆菌、科伊尔棒杆菌。为了产生氨基酸，可以连续地或不连续地在分批法(批量法)或 补料分批法(进料法)或重复的补料分批法中培养根据本发明制备的 微生物。在Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1. Einftlhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag， Stuttgart, 1991))中或者在Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag， Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) 中描述了关于已知的培养方法的综述。待使用的培养基必须以合适的方式满足各自菌林的要求。美国细 菌学学会的手册"Manual of Methods for General Bacteriology"(Washington D.C.， USA, 1981)中包括了关于不同微生物的培养基 的描述。作为碳源可以使用糖类和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳 糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪例如大豆油、葵 花籽油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇 类例如甘油和乙醇，以及有机酸例如醋酸。作为氮源可以使用含氮有 机化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉骨、麦芽汁、玉米浆、大豆粉 和尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝 酸铵。可以单独地或以混合物的形式使用氮源。作为磷源可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。培养基应当进一步 包含生长所需的金属盐例如硫酸镁或硫酸亚铁。最后，除了上述物质 外，还可使用必需生长物质例如氨基酸和维生素。此外，可向培养基 中加入合适的前体。可以将所述的添加料以单次添加的形式加入培养 物中或者在培养过程中以合适的方式加料入培养物中。通过以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物例如磷酸或硫酸来控制培养物的pH。可以使用 消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来控制泡沫形成。为了保持质粒的稳定 性，可以向培养基中加入合适的起选择作用的物质例如抗生素。通过 向培养物中导入氧气或含氧气体混合物例如空气来维持需氧条件。培养温度通常为2ox:至45X:，优选25匸至40X:。继续培养直至产生氨基酸优选谷氨酸的最大量。当培养上面所列的微生物时，可通过本领域技术人员已知的方法 例如生物素限制、添加青霉素或其他抗生素、添加去污剂例如Tween-40和Tween-60、添加乙胺丁醇、消除(ausschal ten)基因和其他脂肪酸生物合成基因的作用或增加温度来诱导谷氨酸的排出。谷氨酸形成的诱导是指与在条件无上述改变的情况下的微生物培 养相比，谷氨酸的排出增加。可通过在用邻苯二醛衍生化后进行反相高压液相色谱，通过荧光 检观'J来分析L-谷氨酸，如在Lindroth和Mopper (Anal. Chem. 51: 1667-1674 (1979))中所述。优选地，在本发明的方法中增加氨基酸的L-异构体的产量。以其质子化形式命名的氨基酸名称例如谷氨酸(glutamic acid )、 以其脱质子化形式命名的氨基酸名称例如谷氨酸根和以其盐形式命名 的氨基酸名称例如谷氨酸钠或天冬氨酸钠是等价的。在本发明的一个实施方案中，氨基酸的产量增加为至少1. 1、 1. 2、 1.3、 1.4、 1.5、 2.0、 3. 0倍，优选4. 0、 5. 0倍，特别优选10. 0倍 或更多倍。本发明方法的本质特征是通过发送蛋白来降低2-酮戊二酸脱氢 酶复合物的活性。发送蛋白是指这样的蛋白质，其抑制2-酮戊二酸脱氢酶复合物的 活性但不影响编码2-酮戊二酸脱氬酶复合物的基因的表达。本发明还涉及由包括下列核酸序列的核酸序列编码的发送蛋白a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 1具有至少50%同 一性的核酸序列。 优选地，核酸序列c)与SEQ ID NO: 1具有至少60%、 65%、 70%、75%、 80%,特别优选85%、 90%,特别地91%、 92°/。、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99°/。的同一性。术语"同源的"或"同源性"也可用作术语"同一性"的等同术语。基于Smith, T. F.和Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981))的算法，通过借助于BESTFIT程序进行的比较来计 算两个核酸序列或多肽序列之间的同 一性，对于氨基酸设置下列参数缺口产生罚分8缺口延伸罚分2， 和对于核酸设置下列参数缺口产生罚分50缺口延伸罚分3。 优选地，通过在各自总序列长度上的核酸序列/多肽序列的同 一性 来定义两个核酸序列或多肽序列之间的同一性，如基于Needleman， S. B.和Wunsch， C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453))的算法通过借 助于GAP程序进行的比较来计算的，对于氨基酸设置下列参数缺口产生罚分8缺口延伸罚分2, 和对于核酸设置下列参数缺口产生罚分50 缺口延伸罚分3。 本发明的目标为SEQ ID NO: 1的其他同源物或功能等价物，所述 同源物或功能等价物在严紧条件下与该核酸序列杂交。在此处，"功能等价物"原则上描述了这样的核酸序列，其在标 准条件下与核酸序列或核酸序列的一部分杂交，并且能够在细胞或生 物体中导致表达具有与谷氨酸棒杆菌的发送蛋白0dhl相同的性质的 蛋白质。为了进行杂交，有利地使用具有例如保守区域或其他区域的大约 10-50 bp,优选15-40 bp的长度的短寡核苷酸，所述区域可以以本领 域技术人员已知的方法通过与其他相关基因的比较来确定。然而，长 度为100-500 bp的本发明核酸的更长片段或完整的序列也可用于杂 交。依赖于所使用的核酸/寡核苷酸、片段或完整序列的长度，或者依 赖于用于杂交的核酸的类型(即DNA或RNA)，这些标准条件可变化。 例如，DNA:DNA杂交体的解链温度比相同长度的DM: RNA杂交体的解 链温度低大约10匸。标准杂交条件是指例如，依赖于核酸，在具有0. 1至5xSSC (1 xSSC = 0. 15 M NaCl， 15 mM柠檬酸钠，pH 7.2)的浓度的水性緩沖 液中或者额外地在50%甲酰胺存在的情况下于42。C和58。C之间的温 度，例如在5xSSC、 50%甲酰胺的情况下42匸。有利地，用于DNA:DNA 杂交体的杂交条件是0. 1 xSSC和大约20X:至65T的温度，优选大约 30。C至45r的温度。有利地，用于DNA:RNA杂交体的杂交条件是O. 1 xSSC和大约30。C至65。C的温度，优选大约45。C至55。C的温度。这 些所给出的杂交温度是在甲酰胺不存在的情况下对于具有大约100个 核苷酸的长度和50。/。的G+C含量的核酸示例性地计算出的解链温度值。 用于DNA杂交的实验条件描述于有关的遗传学教科书例如Sambrook 等人，"Molecular Cloning" ， Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 中，并且可以例如依照核酸长度、杂交体的类型或G+C含量，根据本领 域技术人员已知的公式来进行计算。本领域技术人员可在下列教科书中荻得关于杂交的其他信息Ausubel等人(eds) ， 1985， "Current Protocols in Molecular Biology" ， John Wiley & Sons, New York; Hames和Higgins (eds)， 1985， "Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach" ， IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991， Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 0xf ord。此外，功能等价物还指这样的核酸序列，其与特定核酸序列("原 始核酸序列")具有高至指定百分数的同源性或同一性，并且具有与所 述原始核酸序列相同的活性，此外特别地还具有所述核酸序列的天然 或人工的突变。0dhl的氨基酸序列基元Glu-Thr-Thr-Ser是发送蛋白Odhl的功 能所必需的。本发明的目标为Odhl的其他功能等价物，所述功能等价 物包含氨基酸序列基元Glu-Thr-Thr-Ser。本发明的发送蛋白Odhl抑制处于非磷酸化状态的2-酮戊二酸脱 氢酶复合物的活性。优选地，所述发送蛋白在位置14和/或15，优选 位置14处的苏氨酸残基上不被磷酸化。在该实施方案中，根据本发明，活性、产量或浓度的增加或减少， 原料、产物、反应物或底物的增加和减少涉及在比较实验中与亲本菌 株的比较，所述亲本菌株具有被至少部分磷酸化的发送蛋白Odhl。在本发明的该实施方案中，氨基酸的产量增加为至少1.1、 1.2、 1.3、 1.4、 1.5、 2.0、 3. G倍，优选4. 0、 5. 0倍，特别优选IO. 0倍 或更多倍。在本发明的一个实施方案中，通过使蛋白激酶PknG失活来阻止 0dhl的磷酸化。优选地，发送蛋白不被由包括下列核酸序列的核酸序列所编码的 蛋白激酶PknG磷酸化a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够才艮据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 4中所示氨基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c)与SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。 在本发明方法的一个优选实施方案中，降低蛋白激酶PknG的活性。根据本发明，可通过在转录、翻译和/或翻译后水平上的改变来使 蛋白激酶PknG的活性降低。所述改变例如是指改变调控元件例如启动 子活性，所形成的mRNA或蛋白质对于核酸酶或蛋白酶降解的稳定性， 或者由核糖体结合导致的翻译起始或催化酶活性本身的降低或通过改还包括由于转录调节物或RNA聚合酶亚基的失活或修饰而导致的表达 的改变。此外，还考虑了由于pknG基因的失活而导致的蛋白激酶PknG的 活性低或完全丧失，根据本发明这是优选的。这可通过本身已知的各 种基因技术方案来实现，所述基因技术方案例如为插入或缺失诱变或 者使用诱变剂对细胞进行化学处理。优选的是pknG缺失突变体。上述 方法在此只用于举例说明本发明而不是限定性的。特别优选地，通过缺失包括下述核酸序列的核酸序列来降低蛋白 激酶PknG的活性a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。 优选地，核酸序列c)与SEQ ID NO: 1具有至少60%、 65%、 70%、75%、 80%,特別优选85%、 90%，特别地91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的同一性。术语"同源的，，或"同源性"也可用作术语"同一性"的等同术语。基于Smith, T. F.和Waterman, M. S (Adv. Appl. Math. 2: 482-489 (1981))的算法，通过借助于BESTFIT程序进行的比较来计算两个核酸序列或多肽序列之间的同 一性，对于氨基酸设置下列参数:缺口产生罚分8缺口延伸罚分2， 和对于核酸设置下列参数缺口产生罚分50缺口延伸罚分3。 优选地，通过在各自总序列长度上的核酸序列/多肽序列的同 一性 来定义两个核酸序列或多肽序列之间的同一性，如基于Needleman， S. B.和Wunsch， C. D. (J. Mol. Biol. 48: 443-453))的算法通过借 助于GAP程序进行的比较来计算的，对于氨基酸设置下列参数缺口产生罚分8缺口延伸罚分2， 和对于核酸设置下列参数缺口产生罚分50缺口延伸罚分3。 Niebisch和Bott在Arch. Microbiol 175， 282-294 (2001)中 描迷了用于缺失基因的方法，其也可用于根据本发明来缺失pknG基 因。在另一个本发明的优选实施方案中，通过本领域技术人员已知的 方法例如RNA干扰、反义技术或基因沉默来使pknG基因失活。此外，可通过突变对于Odhl蛋白的磷酸化来说所必需的在PknG 中的那些氨基酸残基来使pknG基因失活。在本发明的另一个优选实施方案中，通过突变Odhl蛋白中的苏氨 酸残基14和/或15并在棒杆菌中表达所述经突变的蛋白质来荻得 Odhl介导的对于ODHC活性的抑制。在本发明的另一个优选实施方案中，通过在谷氨酸棒杆菌中只表 达Odhl蛋白的部分来获得Odhl介导的对于ODHC活性的抑制，所述 Odhl蛋白的部分包含序列基元ETTS,但不包含对于与蛋白激酶相互作 用来说所必需的羧基末端Fha结构域。本发明方法的优点在于与各自的亲本菌林相比，氨基酸优选谷 氨酸的产量明显增加。特别地，增加了比生产率，即每单位时间和细 胞质量的情况下排出至培养基中的氨基酸的量。此外，本发明的方法也导致更高的生产率(空间-时间产率)。 在下面，将参考实施例来更详细地举例说明本发明。实施例1.谷氨酸棒杆菌中pknG和/或odhl基因的缺失将在Niebisch和Bott(Arch. Microbiol. 175: 282-294 (2001)) 中描述的方法用于缺失谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的基因。为了扩增pknG基因的5，-和3，-侧翼区域，分别使用寡核苷酸对 DpknG-l (SEQ ID N0 5 )和DpknG-2 ( SEQ ID NO 6 ) (5'-区域)以及DpknG-3 ( SEQ ID NO 7 )和DpknG-4 ( SEQ ID NO 8 ) ( 3，-区域)DpknG-1: 5'画GACGTCGACGATCACCGACGAACGCGC-3'; SEQ ID NO 5DpknG-2: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACAATCTTCATTATCCTTCATCGTTTTC-3';SEQ ID NO 6DpknG-3: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGCGAATGCCGTGCGGCCACT-3' ; SEQ ID NO 7DpknG4: S'-GATTCTAGAGTrAGCTATCGCTAGGTACG-S' ; SEQ ID NO 8使用寡核苷酸DpknG-5 (SEQ ID NO 9)和DpknG-6 (SEQ ID NO 10) 通过PCR来监控pknG基因的成功缺失DpknG-5: 5'-GCTGCGCGGTTTTGAAGTGG-3' ; SEQ ID NO 9 DpknG-6: 5'~GATCGATCCAGAGCGTAACGC-3' SEQ ID NO 10获得在成功缺失的情况下所预期的1364 bp DM片段，而非在野 生型情况下所预期的3. 76 kb DM片段。jt匕夕卜，通过Southern-卩迹分才斤法(Southern, E. M. ， J， Mol. Biol. 98: 503-517 (1975))来检查pknG基因的成功缺失，其中使用经洋地黄毒苷标记的交叉PCR (cross-over PCR )产物作为探针。如所预期的，在经HindIII消化的谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032的染色体DNA中检测到6. 5 kb和2. 4 kb的杂交DNA片段，然而在经HindIII消化的pknG突变体的染色体DNA中只检测到6. 5 kb的DNA片段。为了缺失谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的odhl基因，分别使用寡核苷酸对Dodhl-l ( SEQ ID NO 11 )和Dodhl-2 ( SEQ ID NO 12 ) ( 5，-区域)以及Dodhl-3 (SEQ ID NO 13)和DodhI-4 (SEQ ID NO 14)(3'-区域)来扩增odhl基因的5，-和3，-侧翼区域Dodhl-1GACAAGCTTGATCAGTCCGTGAGGGAAC ; SEQ ID NO "Dodh卜2 CCCATCCACTAAACTTAAACAGCCGTTGTTGTCGCTCATTAAAC ; SEQID NO 12Dodhl-3 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGAAGTTCCGCCTGGTTTTCCTCG ; SEQ ID NO 13Dodh卜4 GTCGGATCCGAGGAGGMCCAAGGATG ; SEQ ID NO 14通过Southern印迹分析法(Southern, E. M, ， J. Mol. Biol. 98: 503-517 (1975))来检查odhl基因的成功缺失，其中使用经洋地黄毒 苷标记的交叉PCR产物作为探针。如所预期的，在经Sphl消化的野生 型的染色体DNA中检测到2.6 kb的杂交DNA片段，然而在经Sphl消 化的odhl突变体的染色体DNA中只检测到2. 3 kb的DNA片段。如所 预期的，在经Pstl消化的野生型的染色体DNA中检测到0. 7 kb和1. 5 kb的杂交片段，然而在经Pstl消化的odhl突变体的染色体DNA中只 检测到1. 8 kb的片段。2.谷氨酸棒杆菌ATCC13032中pknG的缺失对于内部谷氨酸和谷氨酰 胺浓度的影响首先在3(TC下在具有卡那霉素(25 mg/1)的脑心浸液琼脂上温 育下列菌抹24小时用质粒pEKEx2(Eikmanns等人，Gene 102: 93-98 (1991))转化的谷氨酸棒杆菌ATCC13032、用质粒pEKEx2转化的谷氨 酸棒杆菌ApknG和用质粒pEKEx2-pknG (包含处于存在于pEKEx2上的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)-诱导型启动子的控制之下的谷氨酸棒 杆菌pknG基因，所述基因包含其自身的核糖体结合位点)转化的谷氨 酸棒杆菌厶pknG。从该琼脂平板培养物开始，接种预培养物(试管中 的5 ml的具有2% (w/v)葡萄糖、25 mg/1卡那霉素和1 mM IPTG的 脑心浸液培养基)。在30'C和170 rpm下在摇动器上温育这些预培养 物16小时。用这些预培养物接种主培养物，以使起始ODe。。为1。对于 主培养物，使用经修饰的CGXII基本培养基(Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993))，该培养基不含尿素和疏酸铵 并且含有5mM葡萄糖和lOOmML-谷氨酰胺分别作为碳源和碳和氮源。 此外，向该培养基中加入25 mg/l卡那霉素和l mM IPTG。在30匸和 150 rpm下在摇动器上温育主培养物12小时。在这之后，培养物在600 nm处的光密度(OD,)已达到4. 0至5. 6。才艮据由Wittmann等人(Anal. Biochem， 327: 135-139 (2004))所描述的过滤方法来测定细胞内的 谷氨酸和谷氨酰胺浓度，其中不破坏(quenchen)细胞。为此，借助于 真空通过玻璃纤维过滤器(Millipore APFC02500 )快速过滤出包含 0. 5至1 mg干生物质的培养物体积，并用0. 9% NaCl溶液(室温)洗 涤与过滤器结合的细胞4次。为了提取内部代谢物，将具有结合至其 上的细胞的过滤器于95。C在1. 3 ml 50 pM的鸟氨酸溶液中温育15分 钟。在离心后，如上所述通过HPLC对上清液(细胞提取物)中的氨基 酸进行定量。为了计算细胞内浓度，使用1.5ml/g干细胞的细胞体积 (Kilmer等人，Eur. J. Biochem. 194: 929-935 (1990))。图l描 绘了本实验的结果。从三个独立的培养中计算标准差。从

图1中可以看出，菌林谷氨酸棒杆菌ApknG/pEKEx2 (图1中的 ApknG)具有比比较菌林谷氨酸棒杆菌/pEKEx2 (图1中的Wt)的内 部谷氨酸浓度高94%的内部谷氨酸浓度。通过具有质粒pEKEx2-pknG 的菌林谷氨酸棒杆菌△ pknG (图1中的△ pknG/pknG )的补充作用，再 次逆转了内部谷氨酸浓度的增加。在谷氨酰胺的情况下，菌林谷氨酸 棒杆菌ApknG中的内部浓度比亲本菌林高27%。3. 在500 mg/1作为诱导剂的乙胺丁醇存在的情况下，谷氨酸棒杆菌 ATCC13032中pknG的缺失对于生长和谷氨酸形成的影响首先在30X:下在脑心浸液琼脂上温育下列菌林24小时谷氨酸 棒杆菌ATCC13032 (图2中的Wt )和谷氨酸棒杆菌ApknG (图2中的 DpknG)。从该琼脂平板培养物开始，接种预培养物(试管中的5 ml 的脑心浸液培养基)，并在301C和170 rpm下在摇动器上温育6小时。 在100 ml锥形瓶中用这些预培养物接种第二系列的预培养物并在30 。C和150rpm下在摇动器上温育16小时，所述第二系列的预培养物具 有20 ml的含5% (w/v)葡萄糖的CGXII基本培养基。然后，从这些预 培养物开始，在500 ml锥形瓶中接种主培养物直至OD,为1，并在 30。C和150 rpm下在摇动器上温育指定的时间。对于主培养物，使用 含有作为碳源的5% (w/v)葡萄糖的50 ml CGXII基本培养基 (Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993))，并将 该培养基与500 mg/1乙胺丁醇混合。在指定的时间点取出样品用于测 定OD鋼以及培养基中的谷氨酸浓度。该实施例证明，pknG缺失突变体 中谷氨酸形成速率和谷氨酸终浓度与亲本菌林相比显著增加。相反地， 在突变体中细胞收获量减少。4. 用于在谷氨酸棒杆菌中表达未突变的和突变的Odhl蛋白的质粒的 构建为了在谷氨酸棒杆菌中表达未突变的Odhl蛋白，从谷氨酸棒杆菌 ATCC13032的染色体DNA开始，使用寡核苷酸odhl-for-2和 odhl-rev-2通过PCR扩增出谷氨酸棒杆菌的odhl基因。在此，通过 寡核苷酸odhl-rev-2在odhl基因的终止密码子之前导入编码 StrepTag—II的序歹寸(Skerra， A.和Schmidt, T. G. M. ， Methods Enzymol. 326: 271-304 )。通过用寡核苷酸odhl-for-2和odhl-rev-2 引入的BamHI切割位点，将所述PCR产物克隆入大肠杆菌(^c力er/c力/aco//)-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pJCl (Cremer， J.等人，Mol. Gen. Genet. 220: 478-480 (1990))中，其中使用大肠杆菌DH5a (Invitrogen)作为宿主细菌。odh卜for-2: 5'-GACGGATCCTGAGAACTATGAAATTCC-3'; SEQ ID NO 15 odhl-rev-2: 5'-GAGGATCC丌AC丌CTCGAACTGTGGGTGGGACCACTCAGCAGGGCCTGCG-3'; SEQ ID NO 16 e通过DNA序列分析来研究重组质粒(pJCl-odhl)的编码0dhl的 序列，由此证明，除了编码StrepTag-II的序列外，其与在谷氨酸棒 杆菌ATCC13032基因组中的编码0dhl的序列同一 (Kalinowski， J. 等人，J. Biotechnol. l(M: 5-25 )。然后，通过电穿孔将质粒 pJCl-odhl转移入所希望的谷氨酸棒杆菌菌林中，并在含有25 mg/1 卡那霉素的培养基中培养相应的菌林。为了在谷氨酸棒杆菌中表达突变的0dhl蛋白(其中将谷氨酸棒杆菌0dhl蛋白的位置14处的苏氨酸残基的ACC密码子替换为编码丙氨酸的GCC密码子)，首先使用寡核苷酸对odhl-for-2和T14A-rev以及T14A-for和odhl-rev-2和谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DM来制备PCR产物。然后，通过交叉PCR将获得的两种PCR产物与寡核苷酸odhl-for-2和odhl-rev-2融合，并通过经最后所述两种寡核苷酸而引入的BamHI切割位点将其克隆入载体pJCl中。在此，再次^f吏用大肠杆菌DH5a作为宿主生物。T14A-for GCCACAGGTCGAGGCCACCTCAGTATTCC ; SEQ ID NO 17 T14A-rev GGAATACTGAGGTGGCCTCGACCTGTGGC ; SEQ ID NO化通过DNA序列分析来研究重组质粒(pJCl-odhl-T14A)的编码0dhl 的序列，由此证明，除了 0dhl-密码子14的所希望的突变(GCC，替 代ACC )和编码StrepTag-II的序列外，其与在谷氨酸棒杆菌ATCC13032 基因组中的编码0dhl的序列同一 (Kalinowski, J.等人，J. Biotechnol. 104: 5-25 )。然后，通过电穿孔将质粒pJCl-odhl-T14A 转移入所希望的谷氨酸棒杆菌菌林中，并在含有25 mg/l卡那霉素的 培养基中培养相应的菌株。5.具有苏氨酸-14至丙氨酸的置换的Odhl蛋白对于生长(0D6。。)和 谷氨酸形成的影响用质粒pJCl-odhl-T14A转化其中已通过上述方法(Niebisch和 Bott， Arch. Microbiol. 175: 282-294 (2001))缺失了染色体odhl 基因的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的菌林。该质粒携带有处于在栽体 pJCl (Cremer等人，Mol. Gen. Genet. 220: 478-480 (1990))中的 其天然启动子和其天然核糖体结合位点控制之下的谷氨酸棒杆菌 odhl基因。由于位置14处的苏氨酸残基至丙氨酸的突变，该质粒所 编码的Odhl-T14A蛋白可以不再被蛋白激酶PknG磷酸化。作为比较菌 林使用用质粒pJCl转化的野生型菌林谷氨酸棒杆菌ATCC13032。首先在30X:下在含有25 mg/1卡那霉素的脑心浸液琼脂上温育下 列菌林24小时谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pJCl (图3中的Wt)和谷 氨酸棒杆菌Aodhl/pJC1-odhl-T14A。从该琼脂平板培养物开始，接种 预培养物(100 ml锥形瓶中的20 ml含有2% (w/v)葡萄糖和25 mg/1 卡那霉素的LB培养基)，并在30X:和150 rpm下在摇动器上温育16 小时。然后，从这些预培养物开始，在500 ml锥形瓶中接种主培养物 直至OD鋼为l，并在30X:和15() rpm下在摇动器上温育指定的时间。 对于主培养物，使用50ml含有作为碳源的5% (w/v)葡萄糖和25mg/l 卡那霉素的CGXII基本培养基(Keilhauer等人，J. Bacteriol. 175: 5595-5603 (1993)),并将该培养基与500 mg/1乙胺丁醇混合。在指 定的时间点取出样品用于测定0D6。。以及培养基中的谷氨酸浓度。在各 情况下，分析两种菌林的两个独立的培养物。菌林谷氨酸棒杆菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A生长非常緩慢，从0. 5 的最初OD,至大约2的0D6Q。。然而，在该时段内，其形成的谷氨酸大 约为在本实验中生长至16- 19的0D6。。的菌林谷氨酸棒杆菌/pJCl的2 倍。由此可计算出，菌林谷氨酸棒杆菌pJCl形成平均每克干细胞2. 3 mmol的谷氨酸，然而菌林谷氨酸棒杆菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A形成平均每克干细胞37.63 mmol的谷氨酸。1的0D,相应于每升0.25 g 干细胞。6. 蛋白激酶G在苏氨酸残基14上对0dhl蛋白的磷酸化为了证明Odhl蛋白被蛋白激酶G磷酸化，借助于质粒pAN3K-odhl 在大肠杆菌DH5a中过量产生经羧基末端StrepTag-II(Skerra， A. and Schmidt, T. G. M. ， Methods Enzymol. 326: 271-304 )修饰的Odhl 蛋白5然后按照厂商说明书(IBA GmbH， G5ttingen， Germany)在 StrepTactin-Sepharose上通过亲和层析纯化至外观均质。同样地， 纯化两种突变的Odhl蛋白，即在其中位置14处的苏氨酸残基已被替 换成丙氨酸的0dhl-T14A和在其中位置15处的苏氨酸残基已被替换成 丙氨酸的0dhl-T15A。借助于质粒pEKEx2-pknGst在谷氨酸棒杆菌 ATCC13032中过量产生经羧基末端StrepTag-II修饰的PknG蛋白，然 后按照厂商说明书 (IBA GmbH， G5ttingen， Ger顏y )在 StrepTactin-Sepharose上通过亲和层析纯化至夕卜观均质。将纯化的蛋白质0dhl、 0dhl-T14A和0dhl-T15A (各l pg )与纯 化的PknG蛋白(0. 5 jug )和[y-32P]-ATP —起在37C下温育30分钟。 此外，在不存在纯化的PknG蛋白的情况下将纯化的0dhl蛋白(1 jag) 与[Y-"P]-ATP—起在37X:下温育30分钟。然后通过SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳来分离所述蛋白质，干燥凝胶，并使用磷光成像仪 (Phosphorimager)进行分析。结果描绘于图4中。证明了蛋白质0dhl 和0dhl-T15A^皮PknG磷酸化，而蛋白质0dhl-T14A不^皮PknG磷酸化。 此外，还证明0dhl蛋白不具有自身磷酸化活性。7. 磷酸化的和未磷酸化的0dhl蛋白对于2-酮戊二酸脱氩酶复合物的 活性的影响为了检测2-酮戊二酸脱氢酶复合物被0dhl蛋白抑制，从菌林谷氨酸棒杆菌ApknG Aodhl的细胞中制备了无细胞提取物，在所述菌 林中，蛋白激酶G和0dhl蛋白的基因被缺失。因而，在这些细胞提取 物中既不包含PknG蛋白也不包含OdhI蛋白。在PD-10柱(Amersham Pharmacia )上对所述无细胞提取物进行层析，从而从所述细胞提取物的低分子量组分中分离出所述蛋白质。依据在340 nm处的吸收增加，在30。C下在含有50 mM TES 7.7、 3 mM L-半胱氨酸、10 mM MgCh、 0.9 mM二磷酸疏胺素、0.2 mM辅酶 A、 2 mM NAD+和1. 5 mM 2-酮戊二酸的测试緩沖液中通过分光光度法来 测量2-酮戊二酸脱氢酶的活性。为了计算比活性，使用6.3 mM-1 cnf1 的NADH在340 nm处的消光系数。1 U的活性相应于每分钟形成1 pmol 的励Ho在0dhl不存在的情况下，细胞提取物具有大约35mU/mg蛋白(35 nmol分钟—1 (mg蛋白)—"的2-酮戊二酸脱氢酶复合物活性。通过加 入纯化的、未磷酸化的0dhl蛋白，抑制了 2-酮戊二酸脱氢酶复合物 的活性，并且依赖于Odhl的浓度(图5 )。在关于Odhl蛋白对于2-酮戊二酸脱氢酶复合物活性的影响的进 一步实验中，从谷氨酸棒杆菌菌林(谷氨酸棒杆菌odhAst)中富集所 述复合物，在所述菌抹中作为ODHC的El亚基的OdhA蛋白包含羧基末 端StrepTag-II。按照厂商说明书(IBA GmbH， G5ttingen )在 StrepTactin-Sepharose上通过亲和层析来富集2-酮戊二酸脱氢酶复 合物。富集的复合物具有2.5 U/mg蛋白的2-酮戊二酸脱氢酶活性。 将2 富集的0DHC复合物在无其他添加物的情况下(反应混合物1 )， 或者与0. 2 pg未磷酸化的Odhl蛋白和2 mM ATP —起(反应混合物2 )， 或者与0. 2 |ng未磷酸化的0dhl蛋白、2. 2 pg PknG蛋白和2 mM ATP 一起(反应混合物3)在30TC下温育60分钟，然后测定2-酮戊二酸 脱氢酶的活性。如图6中所描述的，加入未磷酸化的Odhl蛋白导致 2-酮戊二酸脱氢酶活性的抑制，然而加入0dhl、 PknG和ATP不导致抑 制。8. o必/基因缺失对于由谷氨酸棒杆菌进行的谷氨酸产生的影响从甘油培养物开始，将菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032 (野生型)和谷氨酸棒杆菌△ m力/在脑心浸液琼脂平板上划线，并在3o x:下温育过夜。对于每种主培养物，制备预培养物，为此用来自板的单个菌落 接种30 ral的脑心浸液液体培养基。在301C和150 rpm下温育预培养 物15-18小时，然后通过离心收获细胞，用0. 9% NaCl洗涤一次，然 后重悬浮于5-10 ml的0. 9% NaCl中。测定这些悬浮液在600認处的 光密度(0D6。。)。如果通过加入Tween-40 (图x， A和B )或乙胺丁醇(图x， C和 D)触发谷氨酸的产生，那么用所述悬浮液接种主培养物至0. 5-0.9的 0D6。。。在500 ml的具有两个折流板(Schikane)的锥形瓶中，主培养 物包含60ml具有4% (w/v)的CGXII基本培养基，并在301C和150 rpm 下进行温育。为了触发谷氨酸的形成，在6或7小时后向培养物中加 入2 g/1 Tween-40或在接种后立即加入500 mg/1乙胺丁醇。如果通 过生物素限制来触发谷氨酸的产生(图x， E和F)，那么用所述悬浮 液接种在含有4%葡萄糖但只有2. 5 ng/ml生物素(常规CGXII基本培 养基含有300 ng/1的生物素)的CGXII基本培养基中的进一步预培 养物。将这些预培养物在30匸和150 rpm下温育正好24小时，然后 离心出细胞，洗涤细胞并重悬浮于0. 9% NaCl中。然后，将这些悬浮 液接种主培养物至0. 5 - 0. 9的OD6。。。对于主培养物，使用含有4%葡 萄糖和1 jig/1生物素的CGXII基本培养基。在第0小时、第4小时、 第6小时、第7小时、第24小时和第30小时这些时间点上从主培养 物中取出1 ml的样品，并测定OD,以及在无细胞上清液中的谷氨酸 浓度。在图7中描绘了上述主培养物的生长和谷氨酸形成。所述值是至 少4个独立培养物的平均值。很明显，在Tween-40存在的情况下(图 7A和7B)和在乙胺丁醇存在的情况下(图7C和7D)以及生物素限制 的情况下(图7E和7F)，与野生型相比，菌林谷氨酸棒杆菌Ao必/不形成或只形成非常低的谷氨酸浓度。这些结果确认，Odhl蛋白对于 有效的谷氨酸形成是至关重要的。附图描述图1,在菌林谷氨酸棒杆菌/pEKEx2 (Wt)、谷氨酸棒杆菌A pknG/pEKEx2 ( △ pknG )和谷氨酸棒杆菌△ pknG/pEKEx2-pknG ( △ pknG/pknG)中谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)的细胞内部浓度。同 样地标明三个独立的培养的标准差。图2.由谷氨酸棒杆菌ATCC13032 ( Wt)和谷氨酸棒杆菌ApknG 突变体(ApknG)产生的生长(0D6。。)和谷氨酸形成。所述值是三个 独立培养的平均值，标准差小于20%。图3.由谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pJCl (野生型/pJCl)和谷氨 酸棒杆菌Aodhl/pJCl-odhl-T14A ( △ o必J/pJC1-o必/-T14A )产生的 生长(0D6。。)和谷氨酸形成。显示了各情况下两个独立的培养的值。图4.蛋白质0dhl和0dhl-T15A被蛋白激酶G磷酸化的检测。将 蛋白质Odhl和PknG (泳道1) 、 Odhl (泳道2 ) 、 0dhl-T14A和PknG (泳道3 )以及0dhl-T15A和PknG (泳道4 )与[y -32P] -ATP —起在 37"C下温育30分钟，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。使用 磷光成像仪分析经干燥的SDS凝胶。图5.纯化的、未磷酸化的Odhl蛋白对于在菌林谷氨酸棒杆菌A pknG Aodhl的细胞提取物中的2-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性的抑 制。图6.在添加物不存在的情况下(第1号)、在未磷酸化的Odhl 蛋白存在的情况下(第2号)以及在Odhl、 PknG和ATP存在的情况下 (第3号)，富集的2-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性。在PknG和ATP 存在的情况下，Odhl被磷酸化并且不抑制ODHC的活性，但未磷酸化 的Odhl蛋白具有抑制作用。图7.在加入2 g/1 Tween-40的情况下(A和B )、在加入0, 5 g/1 乙胺丁醇的情况下(C和D)和在生物素限制(1 pg/1)的情况下(E 和F)，由菌林谷氨酸棒杆菌ATCC13032 (野生型)和谷氨酸棒杆菌 o必/产生的生长(A、 C、 E)和谷氨酸形成(B、 D、 F)的比较。将所 述菌林在30C和150 rpm下在含有4% (w/v)的葡萄糖的CGXII基本培 养基中培养。基于在600 nm处的光密度(0D,)来测定生长，通过HPLC 分析来测定培养物上清液中的谷氨酸浓度。
权利要求
1. 用于在产氨基酸的微生物中生产氨基酸的方法，在所述方法中通过发送蛋白来降低2-酮戊二酸脱氢酶复合物的活性。
2. 权利要求l的方法，其特征在于，所述微生物是棒状细菌，优 选革兰氏阳性棒状细菌，特别优选棒杆菌科或分枝杆菌科或链霉菌科 的棒状细菌。
3. 权利要求l的方法，其特征在于，所述微生物来自棒杆菌属。
4. 权利要求1的方法，其特征在于，所迷微生物是谷氨酸棒杆菌
5. 权利要求1的方法，其特征在于，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨 酸、鸟氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸、甲硫氨酸、半胱氨酸和/或脯氨酸，优选谷氨酸和/或谷氨酰胺， 特别优选谷氨酸的产量增加。
6. 权利要求1的方法，其特征在于，氨基酸的L-异构体的产量 增力口。
7. 权利要求1的方法，其特征在于，所述发送蛋白由包括下列核 酸序列的核酸序列编码a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 1具有至少50°/ 同一性的核酸序列。
8. 权利要求l的方法，其特征在于，所述发送蛋白不被磷酸化。
9. 权利要求1的方法，其特征在于，所述发送蛋白在位置14和/ 或15，优选位置14处的苏氨酸上不被磷酸化。
10. 权利要求l的方法，其特征在于，所述发送蛋白不被蛋白激 酶PknG磷酸化。
11. 权利要求l的方法，其特征在于，所述发送蛋白不被由包括 下列核酸序列的核酸序列所编码的蛋白激酶PknG磷酸化a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。
12. 权利要求1的方法，其特征在于，降低蛋白激酶PknG的活性。
13. 权利要求l的方法，其特征在于，通过缺失包括下列核酸序 列的核酸序列来降低蛋白激酶PknG的活性a) 具有SEQU. ID No. 3中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 4中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 3具有至少50%同 一性的核酸序列。
14. 权利要求l的方法，其特征在于，在通过缺乏生物素、添加 去污剂或青霉素、添加乙胺丁醇、消除dtsRl基因或其他脂肪酸生物 合成基因的作用或增加温度而导致诱导谷氨酸过量产生的条件下培养 所述微生物。
15. 由包括下列核酸序列的核酸序列所编码的发送蛋白a) 具有SEQU. ID No. 1中所示核酸序列的核酸序列；或b) 能够根据简并的遗传密码而通过从SEQU. ID No. 2中所示氨 基酸序列倒译来推导出的核酸序列；或c) 与SEQ ID NO: 1具有至少50%同一性的核酸序列。
16. 权利要求15的发送蛋白用于控制微生物中2-酮戊二酸脱氬 酶复合物的活性的用途。
全文摘要
本发明涉及用于在产氨基酸的微生物中生产氨基酸的方法，在所述方法中通过发送蛋白来降低2-酮戊二酸脱氢酶的活性。
文档编号C07K14/34GK101268191SQ200680034103
公开日2008年9月17日 申请日期2006年9月11日 优先权日2005年9月15日
发明者A·尼比施, M·伯特 申请人:于利希研究中心有限公司