专利名称：：使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的重组载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的重组载体、通过由该载体转化所得的蛋白水解酶基因表达、分泌亢进的曲霉、通过被转化的曲霉生产蛋白水解酶的方法等。
背景技术：
：米曲霉(A/7erg7'〃MSO，flg)和酱油曲霉(J57^g/〃M51，'"e)曲霉在酱油、酒、豆酱等酿造食品的制造中可工业化应用。并且近年来如对其他生物一样，人们还了解了米曲霉基因组序列(日本特开2005-176602号公报)，对其基因的功能性分析的重要性日益提高。上述曲霉生产、分泌各种酶类(蛋白水解酶、淀粉酶类等)，由于其优异的淀粉糖化能力和蛋白质分解能力等，广泛应用于酿造食品的制造中。目前，如专利文献l-3所述，对控制曲霉基因表达的各种转录因子进行了分析。专利文献1:日本特开2003-240号公报专利文献2:日本特开2003-70484号公报专利文献3:日本特开2003-235584号公报专利文献4:日本特开2005-176602号公报
发明内容本发明的目的在于提供新的使曲霉蛋白水解酶分泌增多的重组载体；以及通过使用该重组载体，在固体培养基培养和液体培养基培养下对所含蛋白质物质的分解效率提高的曲霉。本发明涉及以下各种方案的发明。(1)重组载体，该重组载体含有SEQIDNO.l、2、3或4所示的碱基序列组成的DNA。(2)重组载体，该重组载体含有编码具备使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白质的DNA，上述DNA可与由下述石威基序列组成的DNA在严格条件下杂交，所述的i咸基序列是与SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列组成的DNA互补的石威基序列。(3)重组载体，该重组载体含有编码具备使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白质的DNA，上述DNA由与SEQIDNO.l、2、3或4所示的石威基序列组成的DNA显示80%或以上的序列同源性的碱基序列组成。(4)曲霉，其特征在于该曲霉被上述l、2或3的重组载体转导或转化，与亲抹比较，其蛋白水解酶分泌能力增加。(5)蛋白水解酶的生产方法，其特征在于将上述4的曲霉在固体培养基或液体培养基中培养，使蛋白水解酶分泌到培养基中，然后从培养基中收集蛋白水解酶。(6)蛋白质分解产物的制备方法，其特征在于培养上述4的曲霉，将所得培养物与含有蛋白质的原料混合，分解原料中的蛋白质。(7)调味液的制备方法，其特征在于培养上述4的曲霉，将所得培养物与含明胶的原料混合，分解原料中的明胶。(8)DNA，该DNA为以下(a)、(b)或(c)的DNA:(a)SEQIDNO.l、2、3或4所示碱基序列组成的DNA;(b)编码具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白质的所述的碱基序列是与SEQIDNO.l、2、3或4所示的碱基序列组成的DNA互补的石咸基序列；(c)编码具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能蛋白质的DNA，上述DNA由与(a)的碱基序列的DNA显示80%或以上的序列同源性的石威基序列组成。(9)蛋白质，该蛋白质为以下(a)或(b)的蛋白质(a)由SEQIDNO.l、2、3或4所示碱基序列组成的DNA编码的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)的氨基酸序列中通过使一个或多个氨基酸缺失、置换或附加所得的氨基酸序列组成的、具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白质。发明效果通过使用本发明的重组载体，可以使曲霉的蛋白水解酶分泌增多。通过使用由该重组载体转化的曲霉，可以使在固体培养基培养和液体培养基培养中含有蛋白质的物质的分解效率提高。附图简述图1是表示在本发明的转化体(转化菌)中，转化用质粒插入到转化体的基因组上的niaD基因区的、由Southern分析结果得到的电泳照片。图2表示对麦麸培养基中的野生林和本发明的转化林的蛋白水解酶活性的比较结果。实施发明的最佳方式本发明的重组载体中所含有的SEQIDNO.l、2、3或4所示的碱基序列组成的DNA来自曲霉的基因组，如以下实施例具体所述，根据米曲霉全部基因组信息(日本特开2005-172206号公报)，依据同源性检索、基序检索、以及已知基因的注解或文献信息、基序的种类等信息，推定其为编码转录调节基因的DNA,如实施例所示，通过使用适当引物的PCR，可以由曲霉的基因组DNA等中获得。本发明中的"SEQIDNO.l、2、3或4所示石威基序列组成的DNA，，中也包含只由编码氨基酸区的碱基序列(即只结合有外显子部分的碱基序列)组成的cDNA。上述cDNA可以使用根据本说明书中公开的碱基序列信息制备的适当的引物，以曲霉的mRNA为模板，通过PCR等获得。本发明相关的DNA还可以通过本领域技术人员所公知的任意方法化学合成获得。本发明的重组载体含有编码具备使曲霉蛋白水解酶的分泌增加的功能的蛋白质的DNA,该DNA可以是与由互补于上述DNA的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA,也可以由与上述DNA显示约80%或以上、优选约95%或以上的序列同源性的石威基序列组成的DNA。这里，杂交可才艮才居Molecularcloninngthird.ed.(ColdSpringHaeborLab.Press,2001)所记载的方法等、本领域技术人员所公知的方法或与其类似的方法进行。使用市售的文库时，可按照所附使用说明书的方法进行。杂交可才艮才居CurrentprotocolsinMolecularbiology(editedbyErederickM.Ausubel等人.，1987)所记载的方法等、本领域技术人员所公知的方法或与其类似的方法进行。使用市售的文库时，可按照所附使用说明书的方法进行。本说明书中，"严格条件下"可例举在温度60。C-68。C下、钠浓度150-190mM、优选600-900mM、pH6-8的条件。如含有与该DNA的全部碱基序列的同源性程度总体平均在约80%或以上，优选约95%或以上的碱基序列的DNA等，所述的碱基序列为与含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4表示的》威基序列的DNA互补的碱基序列。碱基序列间的相同性可使用本领域技术人员所熟知的算法、例如Balast确定。因此，本发明涉及编码具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的蛋白质的DNA，该DNA是含有SEQIDNO.l-SEQIDN0.4所示碱基序列的DNA,与互补于该DNA的碱基序列组成的DNA在严格条件下杂交的DNA，也可以是由与上述DNA显示约80%或以上、优选约95%或以上的序列同源性的石咸基序列组成的DNA;本发明还涉及由SEQIDNO.l、2、3或4所示的碱基序列的DNA所编码的氨基酸序列组成的蛋白质，以及与由这些氨基酸序列组成的、具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的活性的蛋白质相关的蛋白质。为了确定两种碱基序列或氨基酸序列的序列同源性，序列在适宜状态下进行前处理。例如，向一种序列中插入缺口(gap)，由此使其与另一序列的比对最佳化。然后对各位点的氨基酸残基或碱基进行比较。第一序列的某一位点与第二序列对应的位点同样地存在某种氨基酸残基或碱基时，该序列在该位点为相同。两种序列的序列同源性是以序列间相同的位点数占总位点(全部氨基酸或全部石咸基)数的百分比表示。根据上述原理，两种碱基序列或氨基酸序列的序列同源性例如通过Karlin和Altschul算法(Proc.麵.Acad.Sci.USA87:2264-2268、1990和Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877、1993)确定。使用上述算法的BLAST程序或FASTA程序主要是对于所给予的序列，从数据库中检索显示高序列同源性的序列来使用。这例如可利用美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的互联网网3占。如上所述，显示上述碱基序列的序列同源性或所编码的氨基酸序列的序列同源性的DNA可以以杂交作为指标，通过本领域研究人员通常采用的方法、例如通过使用上述BLAST软件的检索，从通过基因组碱基序列分析等得到的功能未知的DNA组或公共数据库中容易地发现。并且本发明的基因可通过各种公知的突变导入方法获得。本发明的重组载体可以使用本领域技术人员所公知的适当的基因工程学方法，通过将上述DNA与载体连接来制备。载体只要是将上述DNA插入到要转导或转化的宿主微生物的基因组上适当的位置，结果与亲林相比可以使宿主微生物的蛋白水解酶分泌能力增强，则其结构和种类等没有特别限定。例如可以使用质粒、粘粒、噬菌体、病毒、染色体整合型、人工染色体等载体。公知的任意的标志基因。标志基因例如象URA3、niaD等，可以是与宿主的营养缺陷型互补的基因，或对氨卡青霉素、卡那霉素或寡霉素等药物具有抗性的基因等。重组载体优选含有可在宿主细胞中表达本发明的基因的启动子及其它调控序列(例如增强子序列、终止子序列、聚腺普酸化序列等)，进一步优选含有用于插入目标DNA插入的多克隆。这些重组载体中所含的各要素是本领域技术人员所公知的，例如具体可如实施例所示，有米曲霉的淀粉酶基因启动子、米曲霉的淀粉酶终止子、作为标志基因的米曲霉的niaD基因。转导或转化可通过公知的适当的方法进行。例如可以采用使用原生质体化后使用聚乙二醇和氯化钙的方法(Mol.Gen.Genet.，218，99-104(1989))。转导或转化了本发明的重组载体的曲霉与亲林相比，蛋白水解酶分泌增多。本说明书中，"使蛋白水解酶的分泌增多"或"蛋白水解酶的分泌增加，，其最终结果(现象)是蛋白水解酶分泌到菌体外的分泌量(分泌性能)增大，其原因、机理例如可能是蛋白水解酶的表达量(生产量)本身增加，以及所生产的该酶向菌体外分泌的量(分泌能力)增加等。并且，如以下实施例所述，这里的"增大"是指可以采用用明胶或偶氮酪蛋白作为蛋白质的测定方法，由本发明的重组载体转导或转化的菌体培养基中的蛋白水解酶量(活性)与亲抹相比显著增加。因此如以下实施例所述，该载体所含的各序列所编码的蛋白质可预测为转录调节因子，但并不仅限于具有与蛋白水解酶的转录调节元件结合、促进该蛋白水解酶的表达的功能，在用本发明的重组载体转导或转化的曲霉中，其还可以具有促进表达的蛋白水解酶分泌到菌体外的功能。曲霉是曲霉属的微生物(菌类)的总称，其代表性的例子除上述已述的米曲霉、酱油曲霉(As;e/^7/^sc/ae)之外，还特别有在食品、酿造领域中使用的菌泡盛曲霉G^/7^"'〃M和黑色曲霉04印wg"/wm'gw)等。另外，使用曲霉以外的在食品、酿造、化学、医疗领域中使用的工业上有用的丝菌等，实质上也可以获得同样的效果。这些菌的市售商品是购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)等各种7>共保藏纟几构。"蛋白水解酶"也被称为蛋白酶，是包含主要分解蛋白质的蛋白酶、或内肽酶、分解成小肽链的肽酶等的总称。将与亲林相比蛋白水解酶分泌能力增加的本发明的曲霉按照本发明领域人员所公知的任意方法进行培养，可以生产其所分泌的蛋白水解酶。例如，将本发明的曲霉在固体培养基或液体培养基中培养，使蛋白水解酶分泌到培养基中，然后由培养基中收集蛋白水解酶。上述生产方法中，培养体系、培养基的选择、培养温度、时间等培养条件可以以下实施例等作为参考，由本领域技术人员适当设定。根据本发明可培养曲霉，将所得培养物与含有蛋白质的原料混合，分解原料中的蛋白质，由此可制备蛋白质分解产物。在该方法中使用的原料所含的蛋白质的种类没有特别限定，例如有明胶、胶原和麦谷蛋白等。例如含有明胶、胶原和麦谷蛋白等的原料的蛋白质分解产物可用作调味液。特征在于通过重组载体转导或转化，与亲抹相比，蛋白水解酶分泌能力增加的本发明的曲霉的具体例子是COO1、C002、C003和C004，于2005年9月9日保藏在邮政编码305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，保藏号分别为FERMP-20659、FERMP-20660、FERMP-20661、FERMP-20662,然后于2006年8月30日根据国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约转移保藏，保藏号分别为FERMBP-10668、FERMBP-10669、FERMBP-10670、FERMBP-1067L以下根据实施例进一步说明本发明，本发明的技术范围并不限于此。实施例1(转录调节因子基因的推定和提取)按照以下方法，由米曲霉的全基因组信息(参照日本特开2005-176602号公报)，提取推定为编码转录调节因子基因的序列。该步骤无需进行详细的探讨，具有转录调节因子可能性的均作为基本的提取对象。(1)提取根据同源性检索推定为转录调节因子基因的序列将根据基因自动预测软件推定为基因序列的DNA序列从米曲霉的全部基因组信息中全部提取，将这些DNA序列作为自动预测基因序列(以下称为"自动预测基因序列")。测基因产物序列"、)作工为基础序列，使工用同源性检索软件BLAST对已知蛋白质的公共数据库(NCBI的非重复蛋白质数据库nr)进行同源性检索。对同源性检索得到的序列的功能相关信息进行整理，对这些序列相关的基因功能信息进行关键词检索，选择含有转录调节因子相关的关键词的自动预测基因序列。(2)编码氨基酸序列的DNA序列的^r索(该氨基酸序列被推定为转录调节因子结构相关的基序)对于自动预测基因产物序列，使用基序检索软件(HMMER)进行基序检索(Pfam)，选择编码被推定包含转录调节因子相关基序的氨基酸序列的自动预测基因序列。(3)与已知转录调节因子序列具有同源性的DNA序列的检索以曲霉或曲霉以外的丝状菌相关的已知的转录调节因子的氨基酸序列作为问询序列，使用同源性检索软件BLAST对本实验得到的自动预测基因产物序列进行同源性检索。使用同样的问询序列，使用BLAST(tblast)对曲霉的基因组重叠群序列进行同源性检索，由此可以对通过自动预测未预测到的基因、或者在自动预测中以使DNA结合区等保守性高的区域有缺损的形式进行预测的基因进行检索。由这些方法，从自动预测基因序列中提取了共667个候选基因(以下称为"候选基因")。(候选基因的缩小范围检索和基因区的计算机分析)对于上述提取的被认为是转录调节因子基因的候选基因，依次进行基因区域的推定。在推定之前，根据相同的已知基因的注解或文献信息、基序的种类等信息，研究是否适合作为强制表达的分析对象，将只有通过杂合复合物才能发挥功能的基因等不适合的基因排除。基因区域的推定主要是通过与相同的已知基因比较来进行。与相同的已知基因进行的比较是使用BLAST、FASTA和ALN(Bioinfomatics200016:190-202)进行。如果与已知基因的同源性受限于无法推定5，端，为了进行5，RACE,要准备同源部分的比对信息。如果预测的3，末端比原本基因区域短，则是转录调节因子的C末端一侧被截短，预测过长时，则可以认为翻译在原本C末端终止。因此，无法预测3，末端时，可以根据同源部分的距离、或相邻基因的位置关系等，将自原本的3，末端至足够的下游的部分作为掺入到强制表达载体中的区域。通过上述方法，由在前项提取时与已知基因的同源性高的依次进行基因区域的推定。对于全长均为计算机推定的基因和部分通过5，RACE使5，末端明确的基因共300个基因，得到了的用于制备强制表达抹的预测序列。实施例2(表达用质粒的制备)作为用于使转录调节因子基因在曲霉内表达的表达质粒，构建了质粒pAPTLN。质粒pAPTLN中，含有米曲霉淀粉酶基因启动子和构巢曲霉淀粉酶基因终止子、用于插入转录调节因子基因的多克隆位点作为表达单元，此外还含有米曲霉niaD基因的质粒作为标志基因。挖取5x105个在琼脂平板培养基上生长的构巢曲霉IAM2130抹孢子，使其悬浮于300ial加入到无菌樣i量管中的NucleiLysisSolution緩冲液(Promega制备)。向悬浮孢子的纟敖量管中加入1g玻璃珠BZ-06(7X7》林式会社制备)，使用TissueLyser(QIAGEN制备)，以25次/秒处理3分钟，重复2次。在65。C下加温15分钟后，在室温下》文置5分钟。加入1.5ia1RNA酶溶液(IOmg/ml)，在37°C下加温1小时。加入100ial蛋白沉淀溶液，剧烈振荡20秒，然后以13,500rpm离心5分钟。将离心后的上清转移到另外的微量管中，加入350jul异丙醇，颠倒混合。然后以12,000rpm离心3分钟。将所得沉淀用70%乙醇洗涤和干燥处理，然后悬浮于100nl的TE緩沖液[10mMTris-HCl(pH7.5),lmMEDTA]，得到基因组DNA溶液。以所得基因组DNA为模板，使用下述引物进行PCR，进行构巢曲霉淀粉酶基因终止子区域的扩增。5，一gggtagtcgtacccgatgatgaaac—3，(SEQIDNO.5)5，一agcctaggccgctgcaggcag—3，(SEQIDNO.6)PCR反应是使用TaKaRaLATaq(夕力，」4才抹式会社制造)，使用PTC-200(MJResearch制备)进行。反应液的组成如下。(试剂使用量终浓度)TaKaRaLATaq:0.5|u110xLAPCR緩冲液II:5|lU:1x25mMMgCl2:5ja1:2.5mMdNTP混合液8各0.4mM模板DNA(0.5|Lig):1ja1引物1lalx2种类各0.2jnM无菌水28.5Ml合计液量50|nl将50jal上述反应液在0.2ml反应管中混合，设置于PPC-200中，通过设定以下温度进行PCR。95°C、2分钟1个循环95。C30秒、58。C30秒、72。C2分钟30个循环72°C3分钟1个循环将反应液用乙醇沉淀处理，然后将沉淀悬浮于20julTE緩沖液中。再用Pstl消化，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，切取目标扩增产物。切出的扩增产物用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)进行纯化，得到构巢曲霉淀粉酶基因终止子。将质粒pUC19用Smal和Pstl处理，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)回收约2.7kb的DNA片段，将回收的DNA片段与构巢曲霉淀粉酶基因终止子连接，然后转化大肠杆菌JM109,得到质粒pAT,该质粒pAT是在pUC19的位于多克隆位点内的Smal-Pstl位点插入构巢曲霉淀粉酶基因终止子得到的。将pAT用Smal和HindIII进行消化，用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)，回收含有构巢曲霉淀粉酶基因终止子的DNA片段。将质粒pMAR5(Biosci，Biotech.Biochem.,56(10)，1674-1675，1992)用Smal和HindIII消化，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)回收除去了argB基因和米曲霉淀粉酶基因终止子的DNA片段。将来自pAT和pMAR5的两种DNA片段连接，然后转化大肠杆菌JM109,得到含有米曲霉淀粉酶基因启动子和构巢曲霉淀粉酶基因终止子的质粒pAPT。将100Ml含有下述两种合成DNA(各100iuM)的TE緩冲液煮沸5分钟，然后緩慢冷却至室温，制成多克隆位点接头。将pAPT用EcoRI和Smal消化，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，使用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)，回收除去了多克隆位点的DNA片段。将多克隆位点接头与回收的DNA片段连接，然后转化大肠杆菌JM109,得到质粒pAPTL。将质粒pST14[(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)用HindIII消化，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)回收含有米曲霉niaD基因的DNA片段。将回收的含有niaD基因的DNA片段插入到pAPTL的HindIII位点，得到了转录调节因子基因表达用的质粒pAPTLN。(转录调节因子基因表达用重组载体的制备)根据预测为转录调节因子基因的DNA序列，通过PCR获得各转录调节因子基因。首先制备米曲霉RIB40的基因组DNA。接着以制备的基因组DNA为模板，参考预测基因的起始密码子上游100bp的DNA序列和终止密码子附近的DNA序列制备两种引物，通过PCR获得各转录调节因子基因。参考起始密码子上游的DNA序列制备引物时，导入限制酶识别序列，该限制酶识别序列位于pAPTLN的多克隆位点上，且要扩增的转录调节因子基因序列内不存在识别序列。扩增的转录调节因子基因用在制备的引物中导入了识别序列的限制酶进行处理，然后插入到pAPTLN的多克隆位点(导入的限制酶位点和Saml位点之间)，制成用于各转录调节因子基因表达的重组质粒载体。以下给出转录调节因子基因表达用质粒载体的一个制备例子。采用上述方法，以由米曲霉RIB40菌林制备的基因组DNA为模板，使用下述引物进行PCR，得到转录调节因子基因C001(SEQIDNO.l)。5，一atacaggcattctatcgataaaatgtttcc—3，(SEQIDNO.7)5,—gggctacatctgctgttgtagaagttgc—3，(SEQIDNO.8)PCR反应是使用TOYOBOKOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO制备)，使用PPC-200(MJResearch制备)进行。反应液的组成如下。(试剂使用量终浓度)KOD誦Plus-DNA聚合酶1jli1KOD-Plus-的10xPCR緩沖液5|i1:1x25mMMgCl2:2ja1:1mM2mMdNTP混合液5|a1:各0.2mM模板DNA(0.2jug):1ju1引物1julx2种类各0.3|aM无菌水34ilU合计液量50jul将50jul上述反应液在0.2ml反应管中混合，装于PPC-200中，通过设定以下温度进行PCR。94°C、2分钟1个循环94。C15秒、58。C30秒、68。C4分钟30个循环68°C3分钟1个循环将反应液进行乙醇沉淀处理，然后将沉淀悬浮于20ial的TE緩冲液[IOmMTris-HCl(pH7.5),1mMEDTA]。再用Clal消化，然后用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，切取目标扩增产物。切取的扩增产物用凝胶纯化试剂盒(QIAGEN制备)纯化，然后插入到pAPTLN的多克隆位点上的Clal-Smal位点，得到转录调节因子基因C001表达用质粒pCOOl。采用同样方法得到转录调节因子基因C002表达用质粒pC002、转录调节因子基因C003表达用质粒pC003、转录调节因子基因C004表达用质粒pC004。扩增转录调节因子基因C002(SEQIDNO.2)时，使用导入了Nhel识别序列代替Clal的下述两种引物进行扩增、纯化，然后插入到pAPTLN的多克隆位点上的Clal-Smal位点。5，一tcatacaagctagcaaaatggcggaga—3，(SEQIDNO.9)S'—gggctcgataacttmactcccgtgata—S'(SEQIDNO,10)扩增转录调节因子基因C003(SEQIDN0.3)时，使用导入了Clal和Spel识别序列的下述两种引物进行扩增、纯化，然后插入到pAPTLN的多克隆位点上的Clal-Spel位点。5,—ccatcgataatattagtatgctgaatga—3,(SEQIDNO.11)5,—ggactagttcaggtctttcgaatgtcagga—3'(SEQIDNO.12)扩增转录调节因子基因C004(SEQIDNO,4)时，使用导入了Clal和Spel识别序列的下述两种引物进行扩增、纯化，然后插入到pAPTLN的多克隆位点上的Clal-Spel位点。5，一ccatcgataagtaaaaggatgttattagat—3，(SEQIDNO.13)5，—ggactagtttaatccgttctcatggccgaa—3，(SEQIDNO.14)实施例3(转录调节因子基因强制表达曲霉的获得)将按照Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104记载的方法由RIB326菌抹获得的niaD缺损菌林用转录调节因子基因表达用质粒pCOOl、pC002、pC003、pC004转化。转化方法是通过在原生质体化后使用聚乙二醇和氯化钓的方法(Mol.Gen.Genet(1989)218:99-104)进行。使用各5Mg质粒进行转化，在极限培养基中选择转化体，各得到约200个集落。其中，对于每种质粒，对15个集落在极限培养基中反复进行单一分生孢子分离，使转化稳定。接着，将各转录调节因子基因的成熟区域作为探针，进行DNA分析，由各转化体中选择以下的菌株转化中使用的质粒插入到了转化体的基因组上的niaD基因区域。将各选择株命名为C001、C002、C003、C004。DNA分析的结果如图1所示。实施例4(曲霉的培养方法和菌体外酶活性的测定)(1)明胶培养基中曲霉的培养方法和与明胶分解相关的蛋白水解酶活性的测定将各转化体在含有明胶的液体培养基中振荡培养，确认明胶分解能力。各转化体的明胶分解能力的评价是与明胶分解产生的培养基中的谷氨酸浓度作为对照比较进行。在琼脂极限培养基上生长的各转化体的孢子用3ml的无菌水挖取，接种于装入到150ml容量三角烧瓶中的40ml明胶培养基(2%明胶、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4、0.05%KC1、0.001%FeS047H20、0.3%NaCO3、3%麦芽糖，pH6.0)(1x107个孢子/40ml明胶培养基)。在30。C下以150rpm振荡培养115小时，然后使用弋7廿L-谷氨酸测定试剂盒(Y^廿酱油抹式会社制备)测定培养上清中的谷氨酸量。另外，以上述明胶分解能力为指标，测定培养上清中蛋白质分解酶活性。作为对照，在每个实验时将RIB326菌林niaD缺损林用pAPTLN转化，培养所得的niaD+菌抹。在转化体中，被认为明胶分解能力最高的C004培养上清中的谷氨酸量和蛋白水解酶活性以相对于对照的相对值表示。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)与麦麸培养基中曲霉野生菌抹在培养方法和本发明的转化体蛋白水解酶活性方面的比较麦麸将去离子水以5:4的比例混合，在室温下放置30分钟，然后以5g分别分注到150ml容量的三角烧瓶中，高压釜灭菌15分钟。接着，将预先用血细胞计测定了孢子数的野生米曲霉RIB326菌林或强制表达林的孢子悬浮液接种于麦麸培养基中，1g麦麸培养基中接种5x105个孢子。在30。C下培养4天。培养开始后第24小时和第48小时进行混合，然后静置至培养终止。酶液如下获得。向培养结束后的麦麸培养基中加入50ml去离子水和500jil甲苯，在室温下振荡2小时，将悬浮液用No.2滤纸过滤(7卜"、':^^7夕制造)，得到滤液，以此作为酶液。如以下计算式表示，蛋白水解酶活性是以野生林的酶活性为1时按照比率进行比较。酶活性比率=强制表达抹(试样的吸光度-空白的吸光度)/野生抹)(试样的吸光度-空白的吸光度)。蛋白水解酶活性测定如下进行。求出试样和空白的吸光度。向预先加温至30。C的2ml底物液(P/。偶氮酪氨酸、0.05M磷酸緩沖液pH7.0)中加入20jlU酵液，混合。接着将其在30°C下反应20分钟，然后加入21111反应中止液(10%三氯乙酸)，中止反应。在30°C下放置20分钟，将生成的沉淀用No.5C滤纸过滤，测定滤纸的吸光度(410nm)。空白是在添加酶液之前添加反应中止液，进行同样的揭:作。对野生株与强制表达抹的蛋白水解酶活性进行比较，结果可以确认，C002、COOl、C003显示为野生抹的3倍的蛋白水解酶活性(图2)。对于C004,显示为野生抹的2.2倍的蛋白水解酶活性。由以上结果表明，用含有COOl、C002、C003、C004的各DNA序列的本发明的重组载体转化的曲霉相对于曲霉原林，蛋白水解酶分泌显著增加。在液体培养基的明胶培养基、固体培养基的麦麸培养基中，蛋白水解酶活性分别增大，产业实用性高。其中，本发明的COOl、C002、C003、C004的DNA序列如序列表1-4所示(从序列表最初至第101号表示起始密码子的先头碱基，由结束至第101号表示终止密码子的最终碱基)。C001具有C2H2型锌指基序，与构巢曲霉的steA基因在氨基酸水平显示81%相同的同源性。有报道称steA基因在构巢曲霉中是作为有性生殖所必须的基因(Vallim等人，MolMicrobiol.36(2):290曙301)。C002具有Zn2-Cys6(霉菌双核锌集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的锌指基序，与烟曲霉的编码推定的C6指状结构域蛋白的、功能未知的基因在氨基酸水平显示67%相同的同源性。与C002显示同源性的基因中，在已经报导了其功能并显示最高同源性的是血红丛赤壳(A^"n'a/aem^ococca)的与角质酶基因的转录相关的naf基因，其同源性在氨基酸水平不过只有31%相同。C003是Zn2-Cys6(霉菌双核锌集群(Fungalzincbinuclearcluster))型的zincfinger基序，与烟曲霉的编码推定的C6指状结构域蛋白的功能未知的基因(与上述C002中显示最高同源性的基因为不同的基因)在氨基酸水平显示55%相同的同源性。在与C002显示同源性的基因中，在已经报导了其功能并显示最高同源性的是构巢曲霉的与硝酸同化相关基因的转录有关的nirA基因，其同源性在氨基酸水平上不过只有22%(以上的同源性是根据BLAST(blastp)，以NCBI的nr数据库为对象显示同源性检索结果)。C004具有C2H2型的锌指基序，与构巢曲霉的amdX基因在氨基酸水平显示73%相同的同源性。有报道称，amdX基因在构巢曲霉作为编码乙酰淀粉酶的amdS基因的转录活化因子(Murphy等人、MolMicrobiol.23(3):591-602，(1997))。因此，这些以往公知的基因中，根据其基因序列和同源基因的功能，并未显示通过强制表达可以使蛋白水解酶活性增大。产业实用性本发明在调味品的食品制造或消化剂等药品制造、洗涤剂用的蛋白水解酶生产等工业中极为有用。权利要求1.重组载体，该重组载体含有SEQIDNO.1、2、3或4所示的碱基序列组成的DNA。全文摘要在调味品的食品制造或消化剂等药品制造、洗涤剂用的蛋白水解酶生产等中，可以使固体培养基和液体培养基培养下的曲霉的蛋白水解酶活性提高。本发明提供具有使曲霉蛋白水解酶的分泌增多的功能的重组载体，由该载体转化的使蛋白水解酶基因表达、分泌亢进的曲霉，通过转化的曲霉生产蛋白水解酶的方法等。文档编号C07K14/38GK101273129SQ200680035259公开日2008年9月24日申请日期2006年9月19日优先权日2005年9月26日发明者伊藤享,佐野元昭,内川知美,冈千寿,前田浩,增田力,松岛健一朗,海附玄龙,田中昭光,田井中均,町田雅之,畑本修申请人:财团法人野田产业科学研究所;龟甲万株式会社