专利名称：E2epf泛素载体蛋白与von hippel-lindau的互作及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及E2EPF UCP-VHL互作及其应用，更具体的讲是一种 通过调控UCP增加或减少VHL活性或水平来抑制肿瘤细胞的增殖或' 转移或者增进血管生成的方法，这里所述UCP抑制剂选自包含小干 扰RNA(RNAi)、反义寡核苷酸、与UCPmRNA互补的多核苷酸、肽、 肽模拟物、与UCP蛋白质结合的抗体、低分子化合物的组，用于抑 制UCP的活性，同时，通过基于减少内源性VHL水平稳定HIFa来 增强VEGF的表达，从而增加血管的生成，其中内源性VHL水平的 减少由介导UCP超表达的基因载体所诱导。
背景技术：
E2EPF-UCP(E2地方性落叶型天疱疮泛素载体蛋白，下称"UCP，，) 首次从人角质化细胞分离得到，经鉴定属于泛素结合酶家族成员。该 蛋白在体外主要作为E3泛素连接酶的E2泛素载体，并且通过诱导 自动泛素化或多泛素化，单独的UCP具有E3泛素连接酶活性(LiuZ. 等，JBC 267, 15829-15835， 1992; Liu Z.等.，JBC 271, 2817-2822， 1996; BaboshinaOV与Haas AL.， JBC 271, 2823-2831， 1996)。另夕卜，众所周 知UCP的核苷酸序列已被作为预测乳腺癌的因素(MutterGL与Baak JPA., J Clin Pathol. 58(1):1-6, 2005;美国专利No. 6703204),其已被证 实在包括卵巢癌组织在内的不同癌组织中，比正常组织具有高5倍的 超表达(Welsh JB等，PNAS USA 98, 1176-81, 2001; Wagner KW, Oncogene 23, 6621-6629， 2004)。然而，底物的特异性，细胞内的功能 以及有关UCP对肿瘤的发生、肿瘤的演进、肿瘤转移以及血管的发 生仍然无法解释。肿瘤抑制基因VHL(von-Hippel-Lindau)的突变与肾癌以及中枢神 经系统和视网膜的成血管细胞瘤的发展紧密相关(Kaelin WG Jr.， Nat Rev Cancer 2， 673-682, 2002; Curr Opi Gen Dev 13, 56-60， 2003; Trends Mol Med 10， 146-149， 2004; Trends Mol Med 10， 466-472, 2004)。癌细 胞中VHL的超表达抑制肿瘤发展(Gene Ther 10, 2081-2089， 2003)。 VHL与Elongin B和C, Rbxl和Cullin 2—起形成复合物，进而表 现出E3泛素连接酶活性(Nat Rev Cancer 2, 673-682, 2002; Curr Opi Gen Dev 13, 56-60， 2003; Trends Mol Med 10, 146-149， 2004; Trends Mol Med 10, 466-472, 2004)。这就是说，VHL的功能是作为由Elongin B和C， Rbxl和Cullin 2组成的E3泛素连接酶复合物的底物识别 组件(Nat Rev Cancer 2, 673-682, 2002; Curr Opi Gen Dev 13， 56-60, 2003; Trends Mol Med 10， 146-149, 2004; Trends Mol Med 10， 466-472, 2004)。有名的VHLE3泛素连接酶底物是HIFla和HIF2a,它们在 有氧条件下被脯氨酸羟化酶羟基化，羟基化的HIFa与VHL结合， 并被VHLE3泛素连接酶泛素化，紧接着被26S蛋白酶体所降解(Nat Rev Cancer 2， 673-682, 2002; Curr Opi Gen Dev 13， 56-60, 2003; Trends Mol Med 10, 146-149， 2004; Trends Mol Med 10, 466-472， 2004)。作为 HIF1或HIF2的转录因子与HIFl(3，HIFla或HIF2a结合来维持氧依 赖型细胞稳态。在缺氧时，HIFla或HIF2a稳定存在，HIFa不被羟 基化，因此不被VHLE3泛素连接酶泛素化。HIF1或HIF2激活诸如 VEGF，血生成素2，红细胞生成素，以及GLUT1基因的转录(Nat Med 9, 677-684, 2003)。血管内皮生长因子(VEGF)是血管发生的关键 因子(Nat 359, 843-845， 1992; Nat 359， 845-848, 1992)。氧气和营养都 是通过血管供给癌细胞。HIF-VEGF通路与肿瘤演进、转移以及血管 的发生紧密相关(PNAS USA 94, 8104-8109, 1997; Can Res 60， 4010-4015, 2000)，事实上HIFa和VEGF是抗癌药物研制的靶分子 (Ophthalmology 109, 1745-1751,2002)。事实上，现在VEGF抑制剂正作为抗癌药物使用(例如Avastin) (Proc Am Soc Clin Oncol 21, 15, 2002)。
在试图研制 一种作为抗癌药物的VEGF抑制剂的同时，正在进行 利用VEGF基因来治疗诸如缺血性疾病的血管紊乱症。缺血性疾病包 括由血流阻滞引起的心血管疾病，诸如心肌的缺血以及外周血管疾 病。为了促使血流流畅，人们尝试利用VEGF基因诱导血管发生来治 疗上述的缺血症(Yla-Her加ala S和Alitalo K. Nat Med. 9(6):694-701， 2003; Khan TA等，Gene Ther. 10(4):285-91, 2003),并且动物模型中 VEGF基因的转运确实诱导了血管的发生(Leung DW等，Science 8; 246(4935): 1306-9, 1989; Dvorak HF等，Am J Pathol. 146(5): 1029-39, 1995)。在缺血心肌以及肌肉模型中检测了编码VEGF的腺病毒载体 (Ad.VEGF)的作用，结果清晰地检测到血管发生(Mkinen K等，Mol. Ther. 6， 127-133, 2002)。尤其是，当VEGF在动物模型中表达4个星 期后，诱导血管的发生并没有消失，甚至在VEGF表达结束后，组织 的功能也得到了改善(Dor Y等，EMBO J. 21, 1939-1947， 2002)。人们 已测定Ad.VEGF载体作为治疗临床1-3期的冠状动脉闭塞以及外周 疾病药物的可能性(Maekimen K等，Mol Ther 6, 127-133， 2002; Stewart DJ等Circulation 106， 23-26, 2002; Rajagopalan S等，J Am Coll Cardil 41, 1604, 2003),并且也已测定编码HIFla的腺病毒载体作为 临床1期的心肌缺血治疗试剂的可能性(Vincent KA等，Circulation 102， 2255-2261, 2000)。尽管这些利用HIF-la或VEGF基因来治疗 缺血性疾病的临床治疗还在进行中，但是由UCP介导的HIF-la稳态 来诱导增加VEGF的表达进而血管发生的潜在机制尚不清楚。
一些专利文献描述了抑制涉及肿瘤发生以及转移相关基因的方 法；公开号为WO 2003/029292的国际申请公开了 一种通过对癌细胞 靶向提供肽或其功能类似物治疗癌症的方法；申请号为WO 1998/18480的国际申请公开了一种通过与VEGF结合来抑制肿瘤生长的核苷酸配体；申请号为WO 98/45331的国际申请公开了通过利 用抗-VEGF抗体来揭示VEGF功能的抑制机制。然而，上面所述的 方法并非非常有效。因此，需要开发一种新的调控肿瘤的有效方法。
发明者任东秀, 郑草录, 黄京善 申请人:韩国生命工学研究院