专利名称：新颖的蛋白质转导结构域及其应用的制作方法
新颖的蛋白质转导结构域及其应用
交叉引用
本申请要求2005年11月1日提交的美国临时专利申请序列号 60/732, 365的优先权，在此其公开以全文并入本文作为参考。
政府利益的声明
US政府通过国家健康研究所(the National Institute of Health) 为本计划提供财政支持，授权号为R01 HL58027。因此，美国政府可 以拥有本发明的某些权利。
背景技术：
蛋白质转导结构域(PTD)，又名细胞渗透肽，是一类能够渗透哺乳 动物细胞质膜的小肽[6]。有几种公知的PTD:HIV转录因子TAT(SEQ ID NO: 43)、衍生自果錄(Drosophila melanogaster )同源域蛋白的Antp 肽、单纯疱疹病毒蛋白VP22、和精氨酸低聚物[7-9]。已经报告了这 些肽转运许多类型和分子量的化合物穿过哺乳动物细胞，例如缀合的 肽、寡核苷酸、和小颗粒如脂质体[9、 11-13]。因此，PTD代表了药 物递送装置的一个重要类别，并且本领域期望提高另外的PTD用于药 物递送。
发明内容
在第一方面中，本发明提供多肽，包括通式i的氨基酸序列
(XJ^B^BKSEQ ID NO: 1)
其中Xd独立地为任何疏水性氨基酸；
其中Bi、 B2、和B3独立地为任何碱性氨基酸；和其中n为1到10。
在各种优选实施方案中，Bi和Bz、和B3独立地为精氨酸或赖氨酸。 在另一个优选实施方案中，n为l到3。
在第二方面中，本发明各提供组合物，包括与负载物(cargo)结合 的本发明的多肽，所述负载物包括治疗活性的分子或化合物。在各种 实施方案中，多肽和负载物可以共价结合，或者可以是分开的。在优 选实施方案中，组合物包括HSP20组合物。
在第三方面中，本发明提供药物组合物，包括一种或多种的本发 明的多肽和可药用栽体。
在第四方面中，本发明提供编码本发明多肽的分离的核酸序列。 在第五和第六方面中，本发明分别提供包括本发明的核酸序列的重组 表达载体，和用本发明的重组表达载体转染的宿主细胞。
在第七方面中，本发明提供改进的生物医学装置，其中生物医学 装置包括布置在该生物医学装置上或布置在其中的一种或多种本发明 的多肽。在各种实施方案中，这种生物医学装置包括支架、移植物、 旁路、支架移植物、血管成形装置、气囊导管、管状器官、伤口敷料、 和任何可植入的药物递送装置。
在第八方面中，本发明提供用于药物递送的方法，包括制备本发 明的组合物和使用其递送合适的负载物到需要使用负载物治疗的个 体。在这个第八方面的各种实施方案中，本发明提供用于一种或多种 以下治疗用途的方法。
(a)抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移；(b)促进平滑肌松弛；(c)增 加心肌的收缩速率；(d)增加心肌松弛的速率；(e)促进伤口愈合；(f) 减少伤疤形成；(g)破坏粘着斑；(h)调节肌动蛋白聚合；和(i)治疗或 抑制下述的一种或多种内膜增生、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、 平滑肌细胞肿瘤、平滑肌痉挛、心绞痛、Prinzmetal氏心绞痛(冠状 动脉痉挛)、缺血、中风、心动过緩、高血压、肺高血压、哮喘(支气 管痉挛)、妊娠毒血症、早产(pre-term labor)、先兆子痫 (pre-eclampsia)/子痫、雷诺氏病或现象、溶血性尿毒症、非闭塞性肠系膜缺血、肛裂、弛緩不能、阳萎、偏头痛、与平滑肌痉卑相关的
缺血性肌肉损伤、脉管病(vasculopathy)如移植脉管病、过緩性心律 失常、心搏徐緩、充血性心力衰竭、心肌顿抑、肺动脉高血压、和舒 张期功能障碍；
其中该方法包括对有需要这种方法的受试者给予执行一种或多种 治疗用途的有效量的HSP20组合物。
在第九方面中，本发明提供局部或透皮递送活性负载物的方法， 包括将转导结构域和活性负载物组合，其中负载物不与转导结构域共 价结合，并且接触要接受递送活性剂的受试者的皮肤，其中活性负栽 物通过受试者的皮肤递送。
附图简述
图1. (A)PTD或W、未共价结合的)转导(B)在使用lmM W3运送 P20(SEQ ID NO: 9)(未共价结合的)时的皮肤渗透[E+D] 。 (C)缀合于 PTD或Wl或当单独使用W3时，P20(SEQ ID NO : 9)的皮肤渗透。
图2.使用PBS或包含渗透增强剂油酸单甘油酯(MO， 10。/。w/w)或 油酸(0A， 5% w/w)的制剂的SC、 [E+D]中4小时之后的体外肽渗透， 和它们的透皮递送。每个实验组的重复次数为4-8。 *:与丙二醇溶液
相比p< o. 05。 pl :丙二醇，sc :角质层，[e+d]:不含角质层的表皮
加上真皮。
图3.在SC(A-C)， [E+D] (D-F)和完整皮肤(G-I)中在0. 5、 1、 2、 4或8小时之后的体外肽渗透的时间-进程。该图还表示使用肽在完整 皮肤中的渗透计算的皮肤渗透的速率(J-L)。每个实验组的重复次数为 6-8。 SC :角质层，[E+D]:不含角质层的表皮加上真皮。当PW(SEQ ID NO: 9)缀合于YARA(PTD) (SEQ ID NO: 19)和TAT(SEQ ID NO: 43)时, 在研究的所有时间点，其在SC和[E+D]中的渗透都显著地比未缀合的 P20(SEQ ID NO: 9)的渗透更高(p < 0.05)。
图4. WL-P20(SEQ IDN0: IO)松弛平滑肌。大鼠主动脉用KCl(llO mM)预先收缩，然后用1 mM WL-P20(SEQ ID NO: IO)处理。在~60分钟发生了最大松弛(88%)。
图5. TGF P 1处理之后的CTGF和胶原表达。
发明详述
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之 前，应该理解，它们不局限于具体的合成方法或具体的重组生物技术 方法，除非另作说明，或局限于特定的试剂，除非另作说明。还应该 理解，本文中使用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，不意在 为限制性的。
如说明书和附属的权利要求中使用的，单数形式"一"、"一个"、
"该"包括复数的对象，除非上下文明显地限定不是这样。因此，例 如对于"一种药物载体"的描述包括两种或多种这种载体的混合物、等等。
"任选的"或"任选地"是指随后所述的事件或情况可以发生， 并且该描述包括其中所述事件或情况发生的情况和其中所述事件或情
况没有发生的情况。
在本申请中使用了单字母和三字母的氨基酸缩写。如本领域技术
人员公知的，这种单字母命名如下
A为丙氨酸；C为半胱氨酸；D为天冬氨酸；E为谷氨酸；F为苯 丙氨酸；G为甘氨酸；H为组氨酸；I为异亮氨酸；K为赖氨酸；L为 亮氨酸；M为蛋氨酸；N为天冬酰胺；P为脯氨酸；Q为谷氨酰胺；R 为精氨酸；S为丝氨酸；T为苏氨酸；V为缬氨酸；W为色氨酸；和Y 为酪氨酸。
在本申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开以全文并入 本申请作为参考，用于更完全地描述本申请所述技术领域的现有技术 水平。公开的参考还分别地和具体地并入本文作为参考，用于其中包 含的、参考所依赖的语句中讨论的材料。
在第一方面中，本发明提供多肽，包括通式1的氨基酸序列或由 通式1的氨基酸序列组成(XJABJMJ n卿ID NO: 1) 其中X广X4独立地为任何疏水性氨基酸； 其中B,、 B2、和B3独立地为任何碱性氨基酸；和 其中n为1到10。
因此，"n"可以是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、或10。在优选 实施方案中，n为1、 2、或3。
这些多肽已经被证明可用于制备本发明的组合物(见下文)，和/ 或用于提供组合物穿过哺乳动物细胞膜的转运
在这个第一方面的另外的优选实施方案中，Xi-X4独立地为选自以
下的任何疏水性氨基酸Trp、 Tyr、 Leu、 Ile、 Phe、 Val、 Met、 Cys、
Pro、和Ala; 和
Bh B2、和B3独立地为精氨酸、组氨酸、或赖氨酸。 在这个第一方面的各个优选实施方案中，Bi和B2二者都是精氨酸
或赖氨酸，和B3赖氨酸或精氨酸，但是与Bi和B2不同。在最优选的实
施方案中，B,和B2是精氨酸和B3是赖氨酸。
在这个第一方面的另外的优选实施方案中，XrX独立地选自Trp、
Leu、 Ile，和Ala。在本发明第一方面的各个另外的优选实施方案中，
Xi为Trp, Xz为Leu， X;为Ile，或X4为Ala，或其任何组合。
这个通式的多肽在本文中被证明作为蛋白质转导结构域是有效 的，因此用于递送各种治疗剂穿过哺乳动物细胞膜。如本文中另外证 明的，多肽还能够转运治疗部分("负载物")穿过皮肤，无论负载物 与多肽共价连接或是简单地与多肽组合而没有物理连接。
术语"多肽"以其最广泛的意义使用，是指亚单位氨基酸、氨基 酸类似物、或素拟肽的序列。除非另外说明，亚单位通过肽键连接。 本文中描述的多肽可为化学合成的或为重组表达的。重组表达可以使 用本领域的标准方法完成，通常包括将能够指导多肽表达的核酸序列 克隆到表达载体中，其可用于转染或转导宿主细胞，以便提供进行多 肽表达的细胞机构。这种表达载体可以包括细菌或病毒的表达载体， 并且这种宿主细胞可为原核的或真核的。优选地，用于本发明方法的多肽是化学合成的。使用固相、液相、 或肽缩合技术、或其任何组合的公知技术制备的合成多肽可以包括天 然的和非天然的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是例如釆用标准的
脱保护、中和、偶联、和洗涤规程的标准的Boc(Noc-氨基保护的Ncx-叔丁氧基羰基)氨基酸树脂， 或是碱不稳定的Na-氨基保护的9-芴基 甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc N ot -氨基保护的氨基酸二者都 可以得自 Sigma、 Cambridge Research Biochemical、或本领域技术 人员熟知的其它化学公司。另外，可以使用本领域技术人员熟知的其 它Net-保护基合成多肽。
固相肽合成可由本领域技术人员熟知的技术、使用自动合成仪完 成。本发明的多肽可以包括D-氨基酸(其在体内对L-氨基酸特异性蛋 白酶类有抗性)、D-和L-氨基酸的组合、和各种"设计者(designer)" 氨基酸(例如，p-甲基氨基酸、Coc-甲基氨基酸、和Noc-甲基氨基酸 等)以赋予特别的性质。合成的氨基酸类似物包括赖氨酸的类似物乌氨 酸、和亮氨酸或异亮氨酸的类似物正亮氨酸。
另外，多肽可以具有素拟肽键，例如酯键，以制备具有新颖性质 的多肽。例如，可产生包含还原的肽键的肽，即，RrCH2-NH-R2，其中 R,和R2是氨基酸残基或序列。还原的肽键可以作为二肽亚单位引入。 这种多肽可能对蛋白酶活性有抗性，并且可能具有延长的体内半衰期。
本发明的多肽可在氨基末端和羧基末端中的任一个或其二者处包 括另外的氨基酸残基，并且可另外包括额外的基团，例如可检测的标 记，包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素、异硫氰酸荧光素-P-丙 氨酸、丹磺酰甘氨酸、结合于氨基酸的丹磺酰基、连接于乙酰基的荧 光标记；保护基，包括但不限于Fmoc或其它N-末端保护基(例如Boc); 和使多肽衍生化的残基，包括但不限于用于具体的硫醇连接的半胱氨 酸。在另外的实施方案中，多肽或其部分可为环状的。
在最优选的实施方案中，本发明第一方面的多肽包括氨基酸序列 (WLRRIKA)n(SEQ ID N0: 2)或由所述氨基酸序列组成，其中n为l-10。 因此，在这个实施方案中，多肽可以包括WLRRIKA(SEQ IDN0: 3)的1、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、或10个拷贝或由其构成。在这个最优选的 实施方案的优选实施方案中，n为1、 2、或3。这种多肽的非限制性 实例包括
WLRRIKA(SEQ ID NO: 3);
WLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO: 4);和
WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO: 5)。
多肽种类(X^BAXAXJ n (SEQ ID NO: 1)在非限制性实例
WLRRIKA(SEQ ID NO: 3)周围形成。假定碱性氨基酸或碱性氨基酸的重
复需要被一种或多种疏水性氨基酸包围，以提供所述种类内肽的转导 或提高其转导。在WLRRIKA(SEQ ID NO: 3)的实例中，B2、和B3
分别是精氨酸、精氨酸、和赖氨酸。假定转导在当位置B2、和B3 由在生理学相关pH具有净正电荷的任何氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、 和组氨酸)填充时发生。因此，形成了多肽种类，以允许位置B^ B2、 和B3被相同的或不同的碱性氨基酸填充。在WLRRIKA(SEQ ID NO: 3) 的实例中，Xi、 X2、 Xs和X4分别是色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、和丙 氨酸。这些氨基酸中的每一个都是疏水性的，并且假定色氨酸、亮氨
酸、异亮氨酸、和丙氨酸可用于称为Xi、X2、 X3和X4的任何或所有位
置。另外，由于疏水性氨基酸和碱性氨基酸的组合促进或提高转导， 假设了任何疏水性氨基酸都可以用于位置Xi、 X2、 X3、和X"
在第二方面中，本发明提供组合物，包括本发明的多肽和负载物。 如本文中使用的，"负载物"是指任何分子或化合物，包括但不限于 任何长度的肽、多核苷酸、有机分子、抗体、和脂质体。在优选实施 方案中，负栽物选自肽、多核苷酸、和有机分子。如本文中公开的， 本发明的多肽可用于携带负栽物穿过哺乳动物细胞膜以及皮肤。无论 负载物是共价结合或是简单地与本发明的多肽组合而没有直接连接， 都表现出这种活性。因此，这种组合物可用作例如治疗剂。
在这个第二方面的优选实施方案中，负载物共价结合于多肽。示
例性的负载物包括但不限于放射性核素、荧光标记(包括但不限于绿色荧光蛋白和类似的荧光蛋白)、染料、显影剂、RNA、 DNA、 cDNA;适配 体、反义寡核苷酸、siRNA、病毒核酸序列、病毒多肽、疫苗、和其它 治疗负载物，包括但不限于退热药、镇痛药、和抗炎剂(例如，吲哚美 辛、阿司匹林、双氯芬酸钠、酮洛芬、布洛芬、甲芬那酸、天蓝烃 (azulene)、非那西丁、异丙基安替比林、对乙酰氨基酚、节达酸、保 泰木>、氟芬那酸、水杨酸钠、水杨酰胺、sazapyrine和依托度酸)； 甾体抗炎药(例如，地塞米松、氩化可的松、氢化泼尼松、和曲安西龙； 抗溃疡药(例如，依卡倍特钠、恩前列素、舒必利、盐酸西曲酸酯、吉 法酯、马来酸伊索拉定、西咪替丁、盐酸雷尼替丁、法莫替丁、尼扎 替丁和乙酸盐酸罗沙替丁)；冠状动脉血管扩张剂(例如，硝苯地平、 硝酸异山梨酯、盐酸地尔硫卓、曲匹地尔、双嘧达莫、盐酸地拉齐普、 维拉帕米、尼卡地平、盐酸尼卡地平、和盐酸维拉帕米)；周围血管扩 张药(例如，酒石酸艾芬地尔、马来酸桂哌齐特、环扁桃酯、桂利嗪 (cy謹ridine)和己酮可可碱(pentoxyfylline)h抗生素(例如，氨 苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、琥乙红霉素、盐酸巴氨西林、盐酸米 诺环素、氯霉素、四环素、红霉素、头孢他啶、头孢呋肟钠、阿朴西
林和利替培南酯水合物)；合成的抗微生物药(例如，萘啶酸、吡咯米
酸、吡哌酸三水合物、依诺沙星、西诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、
盐酸环丙沙星、和磺胺甲基异恶唑-曱氧节氨嘧啶)；抗病毒药(例如， 阿昔洛韦和更昔洛韦)；抗惊厥药(例如，溴丙胺太林、硫酸阿托品、 氧托溴铵、噻哌溴铵、丁溴东莨菪碱、曲司氯铵、布托溴铵、N-甲基东 莨菪碱曱基硫酸盐和曱溴辛托品)；镇咳药(例如，海苯酸替培啶 (tipepidine hibenzate)、盐酸甲麻黄碱、磷酸可待因、曲尼司特、 氢溴酸右甲吗喃、磷酸二曱啡烷、盐酸氯苯达诺、盐酸福米诺苯、磷 酸苯丙哌林、盐酸依普拉酮、盐酸氯苯达诺、盐酸麻黄碱、诺斯卡品、 柠檬酸喷托维林、柠檬酸奥昔拉定和柠檬酸异米尼尔(isoaminyl citrate);祛痰药(例如，盐酸溴己新、羧甲半胱氨酸、乙基盐酸半胱 氨酸、和盐酸美司坦)；支气管扩张药(例如，茶碱、氨茶碱、色甘酸 钠、盐酸丙卡特罗、盐酸特美喹诺(trimetoquinol)、 二羟丙茶碱、硫酸沙丁胺醇、盐酸氯丙那林、富马酸福莫特罗、硫酸奥西那林、盐酸
吡布特罗、硫酸海索那林、曱磺酸比托特罗(bitolterol mesilate)、 盐酸克仑特罗、硫酸特布他林、盐酸马布特罗、氢溴酸非诺特罗、和 盐酸甲氧那明、强心剂(例如，盐酸多巴胺、盐酸多巴酴丁胺、多卡巴 胺、地诺帕明、咖啡因、地高辛、洋地黄毒普和泛癸利酮)；利尿剂(例 如，呋塞米、乙酰唑胺、三氯噻噪、甲氯噻溱、氢氯噻唤、氢氟噻嗪、 乙噻嗪、环戊噻溱、螺内酯、氨苯蝶啶、florothiazide、吡咯他尼、 美夫西特、依他尼酸、阿佐寒米和氯非那胺)；肌肉松弛药(例如，氨 基曱酸氯苯甘醚、盐酸托哌酮、盐酸乙哌立松、盐酸替扎尼定、麦酚 生、氯唑沙宗、苯丙氨酯、美索巴莫、氯美扎酮、甲磺酸普立地诺 (pridinol mesilate)、氟喹酮、巴氯芬和丹曲林钠)；脑代谢改良剂(例 如，尼麦角林、盐酸曱氯芬酯和taltireline);弱安定剂(例如，奥 沙唑仑、地西泮、氯噢西泮、美达西泮、替马西泮、氟地西泮、甲丙 氨酯、硝西泮和利眠宁)；强安定药(例如，舒必利、盐酸氯卡帕明、 佐替平、氯丙嗪和氟哌啶醇)；P-阻断剂(例如，富马酸比索洛尔、吲 咮洛尔、盐酸普萘洛尔、盐酸卡替洛尔、酒石酸美托洛尔、盐酸拉贝 洛尔(labetanol hydrochloride)、盐酸醋丁洛尔、盐酸布非洛尔、盐 酸阿普洛尔、盐酸阿罗洛尔(arotinolol hydrochloride)、盐酸氧烯 洛尔、纳多洛尔、盐酸布库洛尔、盐酸茚诺洛尔、马来酸噻吗洛尔、
盐酸苯呋洛尔和盐酸布拉洛尔)；抗心律失常药(例如，盐酸普鲁卡因
酰胺、磷酸丙吡胺、琥珀酸西苯唑啉、阿义马林、硫酸奎尼丁、盐酸
阿普林定、盐酸普罗帕酮、盐酸美西律和盐酸阿齐利特(ajmilide hydrochloride);抗痛风药(例如，别嘌醇、丙碌舒(probenicid)、 多粘菌素E、磺吡酮、苯溴马隆和布可隆)；抗凝血剂(例如，盐酸噻 氯匹定、双香豆素、华法林钾、和(2R，3R)-3-乙酰氧基-5-[2(二曱氨 基)乙基]-2， 3-二氢-8-曱基-2-(4-乙基苯基)-l，5-苯并硫氮杂卓 -4(5H)-酮马来酸盐);溶栓剂(例如，(2E，3Z)-3-亚苄基-4-(3，5-二 甲氧基-ct -曱基亚苄基)-N- (4-甲基哌嗪-l-基)琥珀酸酯盐酸盐)；肝 病药物(例如，(+) -r-5-羟甲基-t-7- (3， 4-二曱氧基苯基)-4-氧代-4， 5， 6， 7-四氢苯并[b]呋喃-c-6-羧酸内g旨)；抗癫痫药(例如，苯妥英、 丙戊酸钠、metalbital和卡马西平)；抗组胺剂(例如，马来酸氯苯那 敏、富马酸氯马斯汀、美喹他嗪、酒石酸阿利马噪、盐酸赛庚啶和苯 磺酸贝托斯汀)；止吐药(例如，盐酸地芬尼多、甲氧氯普胺、多潘立 酮和甲磺酸倍他司汀和马来酸曲美布汀)；抑制剂(例如，二甲氨基乙 基reserpilinate 二盐酸盐、瑞西那明、甲基多巴、盐酸哌唑溱 (prazocin hydrochloride)、盐酸布那喳唤、盐酸可乐宁、布屈噢、 乌拉地尔和N-[6-[2-[(5-溴-2-嘧啶基)氧基]乙氧基]-5-(4-曱基苯 基)-4-嘧啶基]-4- (2-羟基-l， 1-二甲基乙基)苯磺酰胺钠)；高脂血 症药(例如，普伐他汀钠和氟伐他汀钠)；交感神经兴奋药(例如，甲磺 双氢麦角胺和盐酸异丙肾上腺素、盐酸依替福林)；口服糖尿病治疗药 物(例如，格列本脲、曱苯磺丁脲和格列嘧啶钠)；口服制癌剂(例如， 马马司他)；维生素(例如，维生素Bl、维生素B2、维生素B6、维生 素B12、维生素C、和叶酸)；尿频治疗药物(例如，盐酸黄酮哌酯、盐 酸羟丁宁、和terolidine hydrochloride);血管紧张素转化酶抑制 剂(例如，盐酸咪达普利、马来酸依那普利、阿拉普利和盐酸地拉普利)、 HSP20、 TGF-P、丝切蛋白(cofilin)、 14-3-3、 PKA激酶抑制剂、瘦 素、INF-oc、环孢子菌素、杆菌肽、和棕榈酰基-甘氨酰基-组氨酰基-赖氨酸三肽。
在本发明这个第二方面的另外的实施方案中，负载物包括肽治疗 剂。在一个特别优选的实施方案中负载物为HSP20、由其衍生的肽、 或其类似物(统称为"HSP20肽")，并且组合物称为"HSP20组合物"。 在一个实施方案中，HSP20组合物的HSP肽部分包括全长HSP20或由 其组成
Met Glu lie Pro Val Pro Val Gin Pro Ser Trp Leu Arg Arg Ala Ser Ala Pro Leu Pro Gly Leu Ser Ala Pro Gly Arg Leu Phe Asp Gin Arg Phe Gly Glu Gly Leu Leu Glu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Thr Leu Ala Pro Tyr Tyr Leu Arg Ala Pro Ser Val Ala Leu Pro Val Ala Gin Val Pro Thr Asp Pro Gly His Phe Ser Val Leu Uu AspVal LysHisPheSerProGluGlulieAlaValLysValValGlyGlu
His ValGluValHisAlaArgHisGluGluArgProAspGluGly
Phe ValAlaArgGluPheHisArgArgTyrArgLeuProProGlyVal
Asp ProAlaAlaValThrSerAlaLeuSerProGluGlyValLeuSer
lie GinAlaAlaProAlaSerAlaGinAlaProProProAlaAlaAla
Lys (SEQIDNO:6)。
在另一个实施方案中，HSP20组合物的HSP20 肽部分包括式1的氨基酸序列或由其组成 X3-A(X4)APLP-X5(SEQ ID NO: 7)
其中X3为序列WLRR(SEQ ID NO: 8)的0、 1、 2、 3、或4个氨基
酸；
X4选自S、 T、 Y、 D、 E、羟基赖氨酸、羟脯氨酸、磷酸丝氨酸类 似物和磷酸酪氨酸类似物；
X5为种类Zl-Z2-Z3的序列的0、 1、 2、或3个氨基酸， 其中Zl选自G和D; Z2选自L和K;和 Z3选自K、 S和T。
在这个实施方案中更优选X4为S、 T、或Y;更优选X4为S或T， 最优选X4是S。在其中X4为S、 T、或Y的这些实施方案中，最优选 X4被磷酸化。在X4为D或E时，这些残基具有模拟磷酸化状态的负 电荷。在X4被磷酸化时，为磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸模拟物或是磷酸 化氨基酸残基(例如D或E残基)的另一种模拟物时，HSP20肽在本发 明的方法中最有效。磷酸丝氨酸模拟物的实例包括但不限于磺基丝氨 酸、包含亚甲基置换磷酸根氧的氨基酸模拟物、4-膦酰基(二氟甲基) 苯丙氨酸和L-2-氨基-4-(膦酰基)-4， 4-二氟丁酸。其它磷酸丝氨酸模 拟物可由本领域技术人员生产，例如参见0taka等人，Tetrahedron Letters 36: 927-930 (1995)。磷酸酪氨酸模拟物的实例包括但不限于 膦酰基甲基苯丙氨酸、二氟膦酰基甲基苯丙氨酸、氟-0-丙二酰酪氨酸 和0-丙二酰酪氨酸。(参见，例如Akamatsu等人，Bioorg Med Chem 1997Jan; 5 (1) : 157-63)。
在式1的最优选实施方案中，HSP20肽包括WLRRAS,APLPGLK(SEQ ID NO: 9)或由其組成，其中S,表示磷酸化的丝氨酸残基。在这个实 施方案中，优选HSP20组合物包括选自以下的氨基酸序列或由其组成 WLRRIKAWLRRAS*APLPGLK(SEQ ID NO: 10); WLRRIKAWLRRIKAWLRRAS*APLPGLK(SEQ ID NO: 11);和
WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKAWLRRAS*APLPGLK(SEQ ID NO: 12)。
在HSP20组合物的另 一个实施方案中，HSP20肽包括式2的氨基 酸序列或由其组成
X2-X3-RRA-X4-AP(SEQ ID NO: 13)
其中X2为不存在或为W;
X3为不存在或为L ;和
X4选自S、 T、 Y、 D、 E、磷酸丝氨酸类似物和磷酸酪氨酸类似物
(优选实施方案如对于式1所述的)。
在式2的最优选实施方案中，HSP20肽包括RRAS'AP(SEQ ID NO: 14)或由其组成，其中S-表示磷酸化的丝氨酸残基。在这个实施方案 中，优选HSP20组合物包括选自以下的氨基酸序列或由其组成
WLRRIKARRAS*AP(SEQ ID NO: 15);
WLRRIKAWLRRIKARRAS*AP(SEQ ID NO:16);和
WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKARRAS*AP(SEQ ID NO:17)。
多肽和/或组合物可经过常规的药学操作，例如灭菌和/或可以包 含常规的助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、緩沖剂等。
在第三方面中，本发明提供药物组合物，包括本发明的多肽和可 药用载体，或本发明的组合物和可药用栽体。这种药物组合物对于实 施如下所述的本发明的方法特别有用。
对于给药，多肽或组合物通常与一种或多种适合于指定给药途径 的助剂组合。多肽或组合物可与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素 酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、葡聚糖硫酸酯、含 肝素的凝胶、和/或聚乙烯醇混合，并且压片或装入胶嚢，用于常规的 给药。或者，多肽或组合物可溶解于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、 羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉子油、芝麻油、 黄蓍胶、和/或各种緩冲液。其它助剂和给药方式为药学领域中公知的。 载体或稀释剂可以包括时间延迟材料，例如单独或与蜡组合的单硬脂 酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或者本领域中公知的其它材料。多肽或 组合物可连接于其它化合物，以促进体内半衰期的延长，例如连接于 聚乙二醇。如本领域技术人员理解的，这种连接可为共价的或非共价 的。
药物组合物可作为包含常规的可药用载体、助剂、和媒介物的剂 量单位制剂通过任何适合的途径给药，包括口服、、非肠道、通过吸 入喷雾、透皮、跨粘膜、直肠、阴道、或局部途径。本文中使用的术 语非肠道包括皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、胸骨内、腱内、脊柱 内、颅内、胸内、输注技术或腹膜内。给药的优选实施方案随要治疗 的病况而改变。
药物组合物可配制为固体形式(包括颗粒、粉末或栓剂)、软骨、 或液体形式(例如，溶液、悬浮液、或乳剂)。药物组合物可作为各种 溶液施用。本发明使用的适合的溶液为无菌的、溶解充分量的多肽或 组合物，并且对于计划的应用不是有害的。
在第四方面中，本发明提供编码本发明的多肽或组合物的分离的 核酸。对于本领域技术人员来说，基于本文的公开和本领域的一般技 能水平，本发明这个方面的适合的核酸是显而易见的。
在第五方面中，本发明提供表达载体，包括可操作地连接于本发
明第四方面的分离的核酸的DNA控制序列。可操作地连接于本发明的 核酸的"控制序列"是能够影响本发明的核酸的表达的那些核酸。控 制序列无须与核酸连接，只要它们起到指导其表达的功能即可。因此， 例如，可以在启动子序列和核酸序列之间存在间插的未翻译的但是转 录的序列，并且仍可认为启动子序列是"可操作地连接"编码序列。其它这种控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号、和核糖 体结合位点。这种表达栽体可为本领域已知的任何类型，包括但不限 于基于质粒和病毒的表达载体。
在第六方面中，本发明提供包括本发明的表达载体的基因改造的 宿主细胞。这种宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，并且可以是瞬时 或稳定转染的，或者可以是用病毒载体转导的。这种宿主细胞可用于 例如产生大量的本发明的多肽或组合物。
在第七方面中，本发明提供改进的生物医学装置，其中生物医学 装置包括布置在该生物医学装置上或布置在其中的 一种多种本发明的 多肽或组合物。在优选实施方案中，生物医学装置包括上述公开的
HSP20组合物。如本文中使用的，"生物医学装置"是指为了引起期 望的结果而植入到受试者(例如人)中或与受试者接触的装置。根据本 发明的这个方面特别优选的生物医学装置包括但不限于支架、移植物、 旁路、支架移植物、管状器官、血管成形装置、气嚢导管、可植入的 药物递送装置、伤口敷料例如薄膜(例如，聚氨酯薄膜)、水状胶质(结 合于聚氨酯泡沫的亲水性胶粒)、水凝胶(包含约至少60%水的交联聚 合物)、泡沫(亲水性的或疏水性的)、海藻酸钙(海藻酸钙形成的纤维 的无纺复合物)、玻璃纸、和生物聚合物。
如本文中使用的，术语"移植物"是指天然的和假体的移植物和 植入物。在最优选的实施方案中，移植物为血管移植物。
如本文中使用的，术语"支架"包括支架本身，以及可用于促进 支架放置的任何套管或其它组件。
如本文中使用的，"布置在…上或其中"是指多肽或組合物可以 直接或间接地接触生物医学装置的外表面、内表面、或包埋在生物医 学装置内。"直接"接触是指将多肽或组合物直接布置在装置上或装 置中，包括但不限于将生物医学装置浸渍在包含多肽或组合物的溶液 中、将包含多肽或组合物的溶液旋涂或喷涂在装置上、将递送多肽或 组合物的任何装置植入、和通过导管将多肽或组合物直接给药到任何 器官的表面上或其中。"间接"接触是指多肽或组合物不直接接触生物医学装置。例如， 多肽或组合物可布置在被布置在生物医学装置上的基质如凝胶基质或 粘性流体中。可以制备这种基质，用以例如根据需要改变多肽或组合 物的结合和释放性质。
在第八方面中，本发明提供用于药物递送的方法，包括制备本发 明的组合物和根据需要使用其递送负载物到需要使用负载物治疗的个 体。这种"负载物"可以是任何化合物或分子，如本发明第二方面中 所述的。
在具体的实施方案中，负载物包括HSP20肽，因此，该方法包括 用本文中公开的HSP20组合物治疗个体。本发明人以前已经证明， HSP20和由其衍生的肽有希望作为治疗剂用于以下疾病(a)抑制平滑 肌细胞增殖和/或迁移；(b)促进平滑肌松弛；(c)增加心肌的收缩速率； (d)增加心肌松弛的速率；(e)促进伤口愈合；(f)减少伤疤形成；(g) 破坏粘着斑；(h)调节肌动蛋白聚合；和(i)治疗或抑制以下的一种或 多种内膜增生、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、平滑肌细胞肿瘤、 平滑肌痉挛、心绞痛、Prinzmetal氏心绞痛(冠状动脉痉挛)、缺血、 中风、心动过緩、高血压、肺高血压、哮喘(支气管痉車)、妊娠毒血 症、早产、先兆子痫/子痫、雷诺氏病或现象、溶血性尿毒症、非闭塞 性肠系膜缺血、肛裂、弛緩不能、阳萎、女性性觉醒病症(FSAD)、偏 头痛、与平滑肌痉挛有关的缺血性肌肉损伤、脉管病例如移植脉管病、 过緩性心律失常、心动过緩、充血性心力衰竭、心肌顿抑、肺动脉高 血压、和舒张期功能障碍。(参见，例如2003年3月27日提交的US 20030060399; 2004年3月4日乂〉布的WO2004017912; W004/075914 ; W003/018758; WO05/037236)。
因此，在这个方面的另外的实施方案中，本发明提供用于一种或 多种以下治疗用途的方法
(a)抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移；(b)促进平滑肌松弛；(c)增 加心肌的收缩速率；(d)增加心肌松弛的速率；(e)促进伤口愈合；(f) 减少伤疤形成；(g)破坏粘着斑；(h)调节肌动蛋白聚合；和(i)治疗或抑制以下的一种或多种内膜增生、狭窄、再狹窄、动脉粥样硬化、 平滑肌细胞肿瘤、平滑肌痉車、心绞痛、Prinzmetal氏心绞痛(冠状 动脉痉挛)、缺血、中风、心动过緩、高血压、肺高血压、哞喘(支气 管痉挛)、妊娠毒血症、早产、先兆子痫/子痫、雷诺氏病或现象、溶 血性尿毒症、非闭塞性肠系膜缺血、肛裂、弛緩不能、阳萎、女性性 觉醒病症(FSAD)、偏头痛、与平滑肌痉挛有关的缺血性肌肉损伤、脉 管病例如移植脉管病、过緩性心律失常、心动过緩、充血性心力衰竭、 心肌顿抑、肺动脉高血压、和舒张期功能障碍；
其中该方法包括对有需要的受试者给予进行一种多种治疗用途的 有效量的本发明的HSP20组合物。在优选实施方案中，该方法包括对 个体给予本发明第二方面中公开的优选实施方案之一的HSP20组合物。
在优选实施方案中，个体为哺乳动物；在更优选的实施方案中，
个体为人。在本发明方法所有优选实施方案中，HSP20肽是磷酸化的， 力。上述/^开的。
如本文中使用的，"治疗"或"处理"是指达到以下的一种或多 种(a)降低病症的严重程度；(b)限制或阻止被治疗病症的特征症状 进展；(c)抑制被治疗病症的特征症状；(d)在以前患有该病症的患者 中限制或阻止该病症的复发；和(e)限制或阻止以前有病症症状的患者 中该症状的复发。
如本文中使用的，术语"抑制"是指限制处于形成该病症的风险
中的个体中的该病症。
如本文中使用的，"给药"或"给予"包括体内给药，以及直接 给药到离体组织例如静脉移植物。
内膜增生是引起移植失败的复杂过程，并且是动脉旁路移植失败 的最常见原因。尽管还没有完全理解，但是内膜增生是由一系列事件 介导的，包括内皮细胞损伤和随后的血管平滑肌增殖并且从介质迁移 到内膜。这个过程与平滑肌细胞从收缩到合成表现型的表型调节有关。 "合成"平滑肌细胞分泌细胞外基质蛋白，其引起脉管腔的病理性变窄，引起移植物狹窄症并且最终导致移植失败。这种内皮细胞损伤和 随后的平滑肌细胞增殖和迁移到内膜中特征还在于再狭窄，最常见于 清理阻塞血管的血管成形术之后。
在本发明方法的一些实施方案中，例如涉及抑制平滑肌细胞增殖 和/或迁移，或促进平滑肌松弛的那些，给药可为直接的，通过使被治
疗受试者的血管接触一种或多种本发明的多肽。例如，可以迫使HSP20 组合物的液体制剂通过多孔性导管，或以其它方式注射通过导管到损 伤位置，或者，可以将包含HSP20组合物的凝胶或粘性液体涂敷在损 伤位置上。在这些直接递送的实施方案中，最优选HSP20组合物被送 到损伤或介入位置的平滑肌细胞。这可以通过例如将本发明的重组表 达载体(最优选病毒栽体，例如腺病毒载体)递送到该位置来实现，或 者通过直接将HSP20组合物递送到平滑肌细胞来实现。
在本发明这个方法的各种其它优选实施方案中，特别是涉及抑制 平滑肌细胞增殖和/或迁移的那些方法，对已经进行、正在进行或将要 进行以下操作的的受试者进行该方法血管成形术、血管支架放置、 动脉内膜切除术、旋磨术、旁路手术(例如冠状动脉旁路手术；外周血 管旁路手术)、血管移植术、器官移植、假器官装置植入、微血管重建、 整形手术瓣构建(plastic surgical flap construction)、和导管放 置。
HSP20和由其衍生的多肽已经表现出破坏肌动蛋白应力纤维形成 和粘着斑，肌动蛋白应力纤维形成和粘着斑都与内膜增生有牵连(参见 US 20030060399)。数据另外证明HSP20多肽对内膜增生的直接抑制作 用(参见US 20030060399)。因此，在另一个实施方案中，该方法包括 治疗或抑制选自以下的一种或多种病症内膜增生、狭窄症、再狭窄、 和动脉粥样硬化，包括使有需要的受试者接触治疗或抑制内膜增生、 狭窄症、再狭窄、和/或动脉粥样硬化的有效量的本发明的HSP20组合 物。
在本发明这个方面的另外的实施方案中，该方法用于治疗平滑肌 细胞肺瘤。在优选实施方案中，肿瘤为平滑肌肉瘤，其定义为从肌肉产生的恶性赘生物。因为平滑肌肉瘤可以从小血管和大血管的壁产生， 它们可以在身体内的任何地方发生，但是最常见的是腹膜、子宫、和 胃肠道(特别是食道)的平滑肌肉瘤。或者，平滑肌肿瘤可以是平滑肌 瘤(一种非恶性的平滑肌赘生物)。在另外的实施方案中，该方法可以 与用于平滑肌细胞肿瘤的其它治疗如化疗、放射治疗、和手术联合， 以除去胂瘤。
在另外的实施方案中，本发明的方法用于治疗或抑制平滑肌痉挛， 包括使有需要的受试者或移植物接触抑制平滑肌痉挛的有效量的本发
明的HSP20组合物。
已经表明HSP20和由其衍生的肽在抑制平滑肌痉挛例如血管痉挛 是有效的，并且可以通过促进平滑肌血管舒张和抑制收缩发挥它们的 抗平滑肌痉挛作用(参见2003年3月27日提交的US 20030060399)。
在血管壁、气道、胃肠道、和泌尿生殖道中含有平滑肌。平滑肌 的病理性强直性收缩形成痉享。许多病理学条件与血管平滑肌(衬于血 管内的平滑肌)的痉挛("血管痉挛")有关。这可以引起症状例如心绞 痛和缺血(如果涉及心脏动脉)，或在涉及脑血管时引起中风，如在蛛 网膜下出血诱导血管痉挛的情况中。高血压是由于过度的血管收缩以 及血管壁变厚引起的，特别是在循环系统的较小血管中。
因此，在本发明方法的另外的实施方案中，肌细胞痉挛包括血管 痉挛，并且该方法用于治疗或抑制血管痉挛。该方法的优选实施方案 包括但不限于治疗或抑制心绞痛、冠状动脉痉挛、Prinzmetal氏心绞 痛(心外膜冠状动脉的阵发性病灶性痉挛)、缺血、中风、心动过緩、 和高血压的方法。
在本发明方法的另一个实施方案中，通过用本发明的HSP20组合 物处理移植物例如静脉或动脉移植物抑制平滑肌痉挛。用于外周血管 和冠状动脉重建的一种理想的导管是较大的隐静脉血管。然而，收获 该导管过程中的手术操作经常引起血管痉挛。血管痉挛的确切病因学 是复杂的，并且可能是多因素的。大多数研究显示，血管痉挛或者是 由于血管中层中的血管平滑肌的收缩增强，或者是其松弛减弱。许多缩血管剂例如内皮肽-l和凝血恶烷在手术过程中增加并且引起血管
平滑肌收缩。其它血管收缩剂例如去甲肾上腺素、5-羟色胺、乙酰胆 碱、組胺、血管紧张素II、和去氧肾上腺素已经牵连血管移植痉車。 巽粟碱是已经使用的平滑肌血管扩张剂。在其中即使在罂粟碱的存在 下还发生痉挛的情况中，外科医生使用管腔内机械扩张以破坏痉車。 这引起血管移植物壁损伤，并且随后发生内膜增生。内膜增生是移植 失败的主要原因。
因此，在这个实施方案中，可以在从移植物供体收获过程中、在 收获之后(植入之前)、和/或植入到移植物接受者中的过程中(即，离 体或体内)使移植物接触本发明的HSP20组合物。这可以通过例如将本 发明的重组表达载体(最优选病毒载体，例如腺病毒载体)递送到该位 置，和转染平滑肌细胞，或者通过将HSP20组合物直接递送到平滑肌 中来实现。在移植物植入过程中，优选被治疗的受试者用肝素进行系 统处理，因为肝素已经表现出结合于蛋白质转导结构域并且阻止它们 转导进入细胞。这种方法引起单独的移植物的局部化蛋白质转导，但 是不会进入周围组织。本发明这个实施方案的方法在移植物的收获和/ 或植入过程中抑制血管移植物痉挛，因此改善了短期和长期的移植物 成功。
在本发明的方法的各种其它实施方案中，肌细胞痉挛涉及以下病 症，包括但不限于肺高血压、哮喘(支气管痉挛)、妊娠毒血症、早产、 先兆子痫/子痫、雷诺氏病或现象、溶血性尿毒症、非闭塞性肠系膜缺 血(由到肠的血流不足引起肠缺血)、肛裂(由肛门内括约肌的持续痉享 引起)、弛緩不能(由下食道括约肌的持续痉挛引起)、阳萎(由阴茎中 的血管缺少松弛引起；勃起需要阴茎海绵体(阴茎)血管的血管舒张) 偏头痛(由颅内血管痉挛引起)、于平滑肌痉挛有关的缺血性肌肉损伤、 和脉管病例如移植脉管病(类似于动脉粥样硬化的移植脉管中的反应，
涉及移植血管的收缩性重新塑造和最终消失这是心脏移植失败的主
要原因)。
用于本发明方法的不同实施方案的各种适应症的优选的递送途径不同。对于涉及治疗或抑制血管移植物痉挛、内膜增生、再狭窄、由 于内膜增生引起的假体移植失败、支架、由于内膜增生/收缩性重新塑 造引起的支架移植失败、由血管痉挛引起的微血管移植失败、移植脉 管病、和男性和女性性机能障碍的方法来说，局部给药是优选的。如 文本中使用的，"局部给药"是指将多肽或组合物递送到器官表面上。
对于治疗或抑制中风和蛛网膜下出血诱导的血管痉挛来说，鞘内 给药(定义为将多肽或组合物递送到脑脊髄液中)是优选的递送途径。 对于治疗或抑制非闭塞性肠系膜缺血来说，鞘内给药(定义为将多肽或 组合物递送到腹膜腔中)是优选的递送途径。对于治疗或抑制他緩不能 来说，口服给药是优选的递送途径。对于治疗或抑制高血压和心动过 緩来说，静脉内给药是优选的递送途径。对于治疗或抑制肛裂来说， 通过栓剂给药是优选的。对于治疗或抑制哞喘(即，支气管痉挛)来说， 气雾剂递送是优选的。对于治疗或抑制早产和先兆子痫/子痫来说，子 宫内给药是优选的。
在本发明方法的另一个实施方案中，该方法用于增加心肌的收缩 速率。可以受益于这种治疗酸个体包括相对于该个体的正常心率或相 对于类似情况个体的"正常"心率表现出心率降低的那些。如本文中 使用的，措辞"增加心肌的收缩速率"是指为患者提供治疗利益的收 缩速率的任何增加。这种治疗利益可以通过例如增加收缩速率来实现， 使其更接近该个体的正常收缩速率、类似情况的个体的正常收缩速率、 或其它期望的目标收缩速率。在优选实施方案中，该方法在需要这种
治疗的患者中产生收缩速率增加至少5°/。。在另外的优选实施方案中， 本发明的方法在需要这种治疗的患者中产生收缩速率的至少10%、 15°/。、 20°/。、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、和/或50%的增加。在优选实 施方案中，心肌的收缩速率增加伴随有心肌松驰速率(即，如果肌肉松 弛更快，则它们跳动越快)的增加。在更优选的实施方案中，本发明的 方法在需要这种治疗的患者中产生心肌松弛速率增加至少5%。在另外 的优选实施方案中，本发明的方法在需要这种治疗的患者中产生心肌 +>弛速率的至少10°/。、 15°/。、 20%、 25%、 30%、 35%、 40%、 45%、和/或50%的增加。
在本发明方法的另外的实施方案中，实行该方法以治疗可以受益 于心肌收缩速率增加的一种或多种心脏病症。这种心脏病症包括过緩 性心律失常、心动过緩、充血性心力衰竭、肺动脉高血压、心肌顿抑、 和舒张期功能障碍。如本文中使用的，"过緩性心律失常"是指低于 每分钟60次的心跳速率的异常降低，通常是由于心脏的电脉冲紊乱引 起的。过緩性心律失常的常见原因是冠心病，其引起限制血液流到心 脏组织并且从而使心脏组织受损的动脉粥样化形成。冠状动脉病引起 的过緩性心律失常更经常地在心肌梗塞之后发生。症状包括但不限于 能量损失、虛弱、晕厥、和血压过低。如本文中使用的，"充血性心 力衰竭"是指心脏不能泵送充分的血液供应到整个身体。这种心力衰 竭可以是由于各种病况或病症，包括但不限于高血压、贫血症、甲状 腺机能亢进、心脏瓣膜缺陷(包括但不限于主动脉瓣狭窄、主动脉瓣闭 锁不全、和三尖瓣关闭不全)；先天性心脏缺陷，包括但不限于主动脉 缩窄、间隔缺损、肺动脉口狭窄、和法乐四联症；心律不齐、心肌梗 塞、心肌病、肺动脉高血压、和肺病(包括但不限于慢性支气管炎和肺 气肿)。充血性心力衰竭的症状包括但不限于疲劳、呼吸困难、肺水肿、 和踝和腿的肿胀。
如本文中使用的，"心肌顿抑"是指由于心脏缺血(供应心肌的血 管的血流/氧缺少)引起的心肌不执行功能(泵血/跳动)。
如本文中使用的，"舒张期功能障碍"是指在心脏舒张期(心脏收 缩的其余时期)过程中心脏不能充满血液。这种病况通常在左心室肥大 的情况中发生。心肌变得增大和生硬，使得其不能充分充满。舒张期 功能障碍可以引起心力衰竭和心脏执行功能不充分。
如本文中使用的，"肺动脉高血压，，是指其中供应肺的动脉中血 压异常高的病症。其原因包括但不限于对肺的氧供应不足，例如在慢 性支气管炎和肺气肿中；肺栓塞、和内部的肺纤维化。肺动脉高血压 的症状和征兆经常是细微的和非特异性的。在晚期阶段，肺动脉高血 压引起与肝脏增大有关的右心衰竭、颈血管扩大和泛化水肿(generalized edema)。
在本发明方法的另外的实施方案中，该方法用于治疗心肌病症， 包括对患有过緩性心率失常、心动过緩、充血性心力衰竭、心肌顿抑、 肺动脉高血压、和舒张期功能障碍中的一种或多种的个体给予增加心 肌收缩速率的有效量的本发明的HSP20组合物。
治疗过緩性心率失常包括以下的一种或多种(a)改进心跳速率， 使其更接近该个体的正常水平、更接近期望的速率、或增加到至少超 过每分钟60次；(b)在患有过緩性心率失常及其症状的患者中限制能 量损失、虛弱、晕厥、和血压过低中的一种或多种的出现；(c)在患有 过緩性心率失常及其症状的患者中抑制能量损失、虚弱、晕厥、和血 压过低中的一种或多种的恶化；(d)在以前患有过緩性心率失常的患者 中限制过緩性心率失常的复发；和(e)在以前患有过緩性心率失常的患 者中限制能量损失、虚弱、晕厥、和血压过低中的一种或多种的复发。
类似地，治疗充血性心力衰竭包括以下的一种或多种(a)改善心 脏泵送充分的血液供应到整个身体的能力，以便更接近该个体的正常 水平；(b)在患有充血性心力衰竭的患者中限制疲劳、呼吸困难、肺水 肿、和踝和腿肿胀中的一种或多种的进展；(c)在患有充血性心力衰竭 及其症状的患者中抑制疲劳、呼吸困难、肺水肿、和踝和腿肿胀中的 一种或多种的恶化；(d)在以前患有充血性心力衰竭的患者中限制充血 性心力衰竭的复发；和(e)在以前患有充血性心力衰竭的患者中限制疲 劳、呼吸困难、肺水肿、和踝和腿肿胀中的一种或多种的复发。
治疗心肌顿抑是指以下的一种或多种(a)通过改善缺血性肌肉的 氧化或通过降低心肌细胞对氧的需要来改善心肌泵血能力和(b)在以 前患有心肌顿抑的患者中限制心肌顿抑的复发。
类似地，治疗舒张期功能障碍包括以下的一种或多种(a)通过允 许心脏更完全地松弛和充满限制心力衰竭和/或心脏执行功能不充分； (b)在以前患有舒张期功能障碍的患者中限制舒张期功能障碍的复发； 和(c)在以前患有舒张期功能障碍的患者中限制心力衰竭和/或和/或 心脏执行功能不充的的复发。治疗肺动脉高血压包括以下的 一种或多种(a)降低供应肺的动脉 中的血压，以便更接近该个体的正常水平，或者更接近期望的压力； (b)在患有肺动脉高血压的患者限制颈血管扩大、肝肿大、和泛化水肿 中的一种或多种的出现；(c)在患有肺动脉高血压及其症状的患者中抑 制颈血管扩大、肝肿大、和泛化水肺中的一种或多种的恶化；(d)在以 前患有肺动脉高血压的患者中限制肺动脉高血压的复发；和(e)在以前 患有肺动脉高血压的患者中限制颈血管扩大、肝肿大、和泛化水肿中 的一种或多种的复发。
在另外的方面中，本发明提供抑制心肌病症的方法，包括对处于 形成过緩性心率失常、心动过緩、充血性心力衰竭、心肌顿抑、肺动 脉高血压、和舒张期功能障碍的危险中的个体给予增加心肌收缩速率 的有效量的本发明的HSP20組合物。
例如，抑制充血性心力衰竭的方法涉及对患有以下一种或多种疾 病的受试者给予本发明的HSP20组合物，所述疾病包括但不限于高血 压、贫血症、甲状腺机能尤进、心脏瓣膜缺陷(包括但不限于主动脉瓣 狭窄、主动脉瓣闭锁不全、和三尖瓣关闭不全)；先天性心脏缺陷，包 括但不限于主动脉缩窄、间隔缺损、肺动脉口狭窄、和法乐四联症； 心律不齐、心肌梗塞、心肌病、肺动脉高血压、和肺病(包括但不限于 慢性支气管炎和肺气肿)。
类似地，抑制过緩性心率失常的方法涉及对患有冠心病、和动脉 粥样化形成中的一种或多种的受试者或以前患有心肌梗塞或传导病症 的受试者给予本发明的HSP20组合物。
类似地，抑制肺动脉高血压的方法涉及对患有慢性支气管炎、肺 气肿、肺栓塞、和内部肺纤维化中的一种或多种的受试者给予本发明 的HSP20组合物。
抑制心肌顿抑涉及对患有心脏缺血的受试者给予本发明的HSP20 组合物。
治疗舒张期功能障碍涉及对患有左心室肥大的受试者给予本发明 的HSP20组合物。在本发明的方法另外的实施方案中，该方法用于促进伤口愈合和/ 或减少伤疤形成。在这些实施方案中，"有需要的个体"是指患有或 即将(例如通过外科手术操作)患有可以引起伤疤形成的伤口的个体或 已经引起伤疤形成的个体。如本文中使用的，术语"伤口"广泛地涉
及对皮肤和皮下组织的损伤。这种伤口包括但不限于裂伤；烧伤；刺 伤；褥齊(pressure sores) 5 褥疳(bed sores) 溃烂伤；夕卜伤、咬 伤；瘘；溃疡；由感染引起的损害；牙周伤；牙髓伤；灼伤口综合症 (burning mouth syndrome);剖腹手术伤；夕卜科手术伤；切口伤；烧 伤之后的挛缩；组织纤维化，包括但不限于特发性肺纤维化、肝纤维 化、肾纤维化、腹膜后纤维化、囊性纤维化、血管纤维化、心脏组织 纤维化；和由美容外科手术操作引起的伤。如本文中使用的，措辞"减 少伤疤形成"是指为患者提供治疗学或美容利益的任何伤疤形成减少。 这种治疗学或美容利益可以通过例如相对于没有用本发明的方法处理 时的伤疤形成减小伤疤的大小和/或深度、或减小已有伤疤的大小来实 现。如本文中使用的，这种伤疤包括但不限于瘢痕瘤；肥厚性瘢痕； 和器官表面之间的粘附形成，包括但不限于作为手术的结果出现的那 些。减少伤疤形成的这种方法对于治疗所有类型的伤口以减少伤疤形 成是临床上有用的，无论禾减少最初的伤疤形成还是现有伤疤的治疗 (即，在伤疤形成之后将其切掉、用本发明的化合物治疗、和使伤疤更 緩慢地愈合)。这种伤口如上所述。如本文中使用的，措辞"促进伤疤 愈合，，是指为患者提供治疗学或美容利益的任何伤口愈合增加。这种 治疗利益可以通过例如相对于未经处理的个体增加伤口愈合速率和/ 或增加伤口愈合程度中的一种或多种来实现。这种伤口如上所述。
在这个实施方案中，优选HSP20组合物布置在伤口敷料上或其中 或以其它方式局部给药。这种伤口敷料可以是本领域中使用的任一种， 包括但不限于薄膜(例如，聚氨酯薄膜)、水状胶质(结合于聚氨酯泡沫 的亲水性胶粒)、水凝胶(包含约至少60%水的交联聚合物)、泡沫(亲 水性的或疏水性的)、海藻酸钾(海藻酸钙形成的纤维的无纺复合物)、 玻璃纸、和生物聚合物，例如在2003年10月9日公布的美国专利申请公开20030190364中描述的那些。
如本文中对于所有本发明方法使用的，"有效量，，的HSP20组合 物是足以提供预定的治疗利益的量。可以使用的HSP20组合物的有效 量通常为约0. 01 ji g/kg体重到约10 mg/kg体重，优选为约0. 05 p g/kg 体重到约5 mg/kg体重。然而，剂量水平基于各种因素，包括损伤的 类型、个体的年龄、体重、性别、医学状况、病况的严重程度、给药 途径、和使用的具体化合物。因此，给药方案可以广泛地不同，但是 可以有医生使用标准方法决定。
由于角质层的高度功能化的结构，高分子例如肽穿过皮肤屏障的 递送是困难的。已经有几种化合物和技术被用于增加负载物(高分子， 包括药物和肽)通过皮肤屏障的转运。这些化合物和技术包括渗透增强 剂例如油酸、药物递送系统例如transferosomes、和物理^支术例如电 穿孔法和离子电渗疗法，并且已知产生协同作用。尽管有这些技术和 系统的益处，但是治疗剂中负载物的局部和透皮递送仍是困难的。这 些困难与化学增强剂在高浓度的皮肤毒性、在家使用电学装置的不方 便、和复杂的药物递送系统的高成本有关。在涉及高分子量负栽物肽 的PTD中诱导皮肤和经皮渗透有困难。直到最近，这种负载物也只是 共价结合于PTD。因此，期望具有能够共价或非共价连接广泛分子量 的负栽物的PTD，其将增进所述负载物的皮肤渗透和经皮递送。
因此，在第九方面中，本发明提供局部或透皮递送活性负载物的 方法，包括将转导结构域和活性负载物组合，并且接触要接受递送活 性剂的受试者的皮肤，其中活性负载物通过受试者的皮肤递送。在优 选实施方案中，负载物不与转导结构域共价结合。示例性的负栽物如 上述公开的。关于这个方面的细节在以下的实施例中提供。可用于本 发明的方法的转导结构域的实例包括但不限于本发明的多肽，以及包 括以下一种或多种的多肽
(R)H(SEQ ID NO: 40) ; GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 18); YARAAARQARA(SEQ IDN0: 19); DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEQ ID NO: 20); GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO: 21);PLSSIFSRIGDP(SEQ ID NO: 22); AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO: 23); AAVLLPVLLAAP(SEQ ID NO: 24); VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO: 25); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP(SEQ ID NO: 26); GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKK IL(SEQ ID NO: 27); KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 28); KETWWETWWT EWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 29); KAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO: 30); KAFAKLAARLYRAAGC (SEQ ID NO: 31); AAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO: 32 ; KAFAALAARLYRKAGC(SEQ ID NO: 33); KAFAKLAAQLYRKAGC (SEQ ID NO: 34); GGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 35);和YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 36)。
参考随后的实施例可以更好地理解本发明，所述实施例意在只是 说明性的，不应解释为限制如随后权利要求限定的本发明的范围。
实施例
4吏用基于Fmoc的固相肽合成方法以0.2 mmol的规才莫合成 FITC-(b)AWLRRIKA(SEQ ID NO: 37) (WLRRIKA (SEQ ID NO: 3)单体)、 FITC-(b)AWLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO: 38) (WLRRIKA (SEQ ID NO: 3) 二聚体)、和 FITC-(b)AWLRRIUWLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO: 39) (WLRRIKA(SEQ ID NO: 3)三聚体)。将肽溶解于水中，产生3 mM 的储备溶液。将Dulbeccc/s改进的Eagle培养基(DMEM)中培养的3T3 成纤维细胞以50， 000细胞每孔(l ml的50， 000细胞/ ml)接种在4 — 孔小室载玻片(chambered slide)中(使用4个栽玻片)，所述培养基具 有2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素抗生素、和100/。胎牛血清(FBS)。将 载玻片在37C在5%002的加湿孵育箱中培养4小时，以允许细胞粘附 于载玻片。在4小时之后，将每个孔用磷酸盐緩沖盐水(PBS)洗涤3 次。将50 pl的每种肽的3 mM原液以及3 mM的荧光素在水中的原液 加入到包含具有2 mM的谷氨酰胺、抗生素、和10% FBS的3 ml DMEM的15 ml管中，和加入到包含具有2 mM谷氨酰胺和抗生素的3 ml无 血清DMEM的15 ml管中。对于包含血清和不含血清的DMEM—式两份 进行处理。在每个载玻片系统上，每个孔接受具有荧光素、WLRRIKA (SEQ ID NO: 3)单体、WLRRIKA (SEQ ID NO: 3)二聚体、或WLRRIKA (SEQ ID NO: 3)三聚体的培养基(有或者没有血清)。在所有情况中，最终的肽 或荧光素浓度为每个孔50^M。 一旦加入处理，将载玻片在3710在5% 0)2的加湿孵育箱中培养1小时。然后，将每个孔用PBS洗涤3次。在 PBS洗涂之后，向每个孔加入0. 2 ml胰蛋白酶，以消化结合于外部细 胞膜的残余的肽，并且将载玻片在371C培养10分钟。为了使胰蛋白 酶灭活，将具有血清的1 ml DMEM加入到每个孔，并将栽玻片培养4 小时，以允许细胞再附着载玻片。在4小时之后，将细胞在PBS中洗 涤3次，并且将具有血清的1 ml DMEM加入到每个孔中。然后，试验 40x物镜使栽玻片成像。使用75 ms的曝光时间获得位相和荧光影像 (phase and fluorescent images)。对于其中用荧光素处理的细胞的 任何状况都没有观察到荧光信号。因此，荧光素处理起到阴性对照的 作用。无论培养基是否包含血清，用WLRRIKA (SEQ ID NO : 3)单体处 理的细胞都没有荧光，显示出WLRRIKA (SEQ ID NO:"单体本身不能 渗透细胞。WLRRIKA (SEQ ID NO: 3) 二聚体和WLRRIKA (SEQ ID NO: 3) 三聚体处理引起细胞内的明亮的荧光，与在有或没有血清的存在下培 养细胞无关。
姿滋斧〃
设计了肽以检验它们携带分子穿过细胞膜和皮肤的能力。肽 W3(WLRRIKAWLRRIKAWLRRIKA) (SEQ ID NO: 5)为肽WLRRIKA (SEQ ID NO: 3)的三聚体。选择的被携带穿过皮肤的分子("负载物")为结合于荧 光探针(异硫氰酸荧光素，FITC)的HSP20(WLRRApSAPLPGLK，其中pS 为磷酸丝氨酸)(SEQ ID NO: 9)的片段。对照为已知的蛋白质转导结构 域，TAT (YGRKKRRQRRR) (SEQ ID NO: 36)和PTD (YARAAARQARA) (SEQ ID NO: 19)。使用自动肽合成仪(Apex 396， Advanced ChemTech， Louisville, KY)和固相技术在亚利桑那州大学(ASU)合成肽。通过将FITC连接于初〔 加入到肽的N -末端的p-丙氨酸获得FITC-标记的肽。肽通过使用反 相柱的 FPLC(Akta Explorer, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway， NJ)纯化，并且通过MADI-T0F或ESI-MS (Waters Corporation, Milford， MA)确认。
用于评价穿过细胞膜的转导的体外模型为原代大鼠星形细胞。细 胞如(Innocenti等人，J. Neurosci. 20:1800-1808， 2000)所述分离， 以-3xl(T细胞/ cm2接种，并且在完全的血清(含10% FBS的ct-MEM) 中培养过夜。在用转导肽处理之前，通过在0.5% FBS中培养1 - 24 小时使一 些细胞血清饥饿(serum starve)。 细胞用 50 ju M W3(WLRRIKA(SEQ ID NO: 3)三聚体)处理1小时，以证明持续至少24 小时的有效转导。使用拟-二聚体WLRRIKA-WLRRApSAPLPGLK(SEQ ID NO: 10) (WL-P20)的转导具有剂量依赖性，在50jaM为有效转导，在 25pM为微微降低的转导，和在lpM没有转导。作为对照，将拟-单 体WLRRIKA-(WL-scrP20) (SEQ ID NO: 3)以50、 25、和lpM的浓度
试验，但是没有观察到转导。
对于拟-二聚体(WL-P20) (SEQ ID NO: 10)，在大约20分钟发生最
大的转导，使用W3得到相似的结果。
选择用于皮肤转导研究的离体模型为新切取的猪耳。在从当地屠 宰场得到耳之后，如前所述小心地从耳外表面剖解皮肤(确保最大限度 地除去皮下脂肪)。将清洁的猪耳皮肤立即安装在Franz扩散池(扩散 面积1 cm2; Laboratory Glass Apparatus, Inc， Berkeley, CA)中, 角质层面对供体室(其中施用制剂)，而真皮面对其中填充PBS (3 mL) 的受体室。将系统保持在37X:和恒定搅拌下。将PBS溶液或肽的丙二 醇制剂(70jnl)施加到扩散池的供体室中，直到8小时。
在实验结束时，将皮肤表面用蒸馏水充分洗涤，以除去过量的制 剂。为了从剩余的表皮(E)和真皮(D)分离角质层(SC)，使皮肤片经过 带剥离(tape stripping)。将皮肤用15片胶带剥离，并将包含SC的胶带超入3 mL的水曱醇(1: 1 v/v)溶液中，涡旋2分钟并且浴超声处 理30分钟。将残余物[E+D]切成小块，在2 mL的水甲醇(l:l v/v) 溶液中涡旋2分钟，并且使用组织匀浆器均化1分钟，并且浴超声处 理30分钟。然后将得到的混合物离心1分钟。在受体相中测定渗透穿 过皮肤的肽的量；抽出1.5mL的受体相，冻干并将残余物悬浮于150 HL水中。
使用Gemini SpectraMaxT"读板器(Molecular Devices, Sunnyvale CA)用分光荧光法测定渗透进入SC和[E+D]、和渗透穿过皮肤的FITC -标记的肽的量，激发波长为495nm和发射波长为518 nm。肽的标准曲 线用作基准。
100 uM浓度的PTD或W3(未共价结合的)没有携带P20(SEQ ID NO: 9)穿过皮肤(图1， A图)。然而，在使用lmM W3携带P20(SEQ ID NO: 9)时，有显著的皮肤渗透[E+D](图1， B图)。在P20(SEQ ID NO: 9) 结合于PTD或Wl或单独使用W3时，皮肤渗透显著增强，表明缀合的 转导结构域引起增强的皮肤渗透(100uM，图1, C图)。这是我们知道 蛋白质转导结构域(W3)可以携带非共价连接的分子进入皮肤的第一个 证据。这些数据对于将生物学活性分子递送到皮肤中用于治疗目的有 显著的意义。
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方法通过Fmoc化学合成YARA (定义为YARAAARQARA (SED ID NO: 19)、 TAT(SEQ ID NO: 43)、 YKAc(定义为YKALRISRKLAK (SEQ ID NO: 41))、 P20(定义为WLRRASAPLPGLK (SEQ ID NO: 9))、 YARA-P20(定义 为YARAAARQARAWLRRASAPLPGLK (SEQ ID NO: 42)、和TAT-P20(定义为 YGRKKRRQRRRWLRRASAPLPGLK (SEQ ID NO: 43)。使用安装在Franz扩 散池中的猪耳评价在有或者没有脂质渗透增强剂(油酸单甘油酯或油 酸)的存在下荧光标记的肽的局部和透皮递送.通过分光荧光法评价皮 肤(局部递送)中和受体相(透皮递送)中的肽浓度。使用荧光显微术使 不同皮肤层中的肽显像。结果YARA(SEQ ID NO: 19)和TAT (SEQ ID NO: 43)充分渗透皮 肤并且适度地渗透穿过这种组织，但是不包括YKAc(SEQ ID NO: 41)。 油酸单甘油酯和油酸没有增强TAT (SEQ ID NO: 43)或YARA(SEQ ID NO: 19)的局部和透皮递送，但是增强YKAc(SEQ ID NO: 41)的局部递送。 重要的是，YARA(SEQ ID NO: 19)和TAT (SEQ ID NO: 43)携带缀合的 肽P20(SEQ ID NO: 9)进入皮肤，但是透皮递送4艮少。荧光显微术证 实，游离的和缀合的PTD达到皮肤的活层。
结论YARA(SEQ ID NO: 19)和TAT(SEQ ID NO: 43)在体外渗透 进入猪耳，并且携带缀合型肽P20(SEQ ID NO : 9)。因此，使用PTD 可能是增加用于治疗皮肤疾病的肽的局部递送的有用策略。
本研究的第一个目的是评价YARA(SEQ ID NO: 19)在体外渗透皮 肤的能力。将YARA(SEQ ID NO: 19)的渗透与公知的转导结构域TAT (SEQ ID NO: 43)和非转导结构域YKALRISRKLAK (SEQ ID NO: 41) (YKAc)的 渗透相比；所有的肽都具有类似的分子量。
我们的第二目标是考查化学渗透增强剂(油酸单甘油酯和油酸)对 YARA(SEQ ID NO: 19)、 TAT(SEQIDNO: 43)、和YKAc (SEQ ID NO: 41) 的局部和透皮递送的影响。我们的第三目标是验证YARA(SEQ ID NO: 19) 和TAT (SEQ ID NO: 43)增加缀合型肽P20(SEQ ID NO: 9)的皮肤渗透 和经皮递送的能力。这种肽是亲水性的并且具有高的分子量(2005 Da)。具有类似特征的许多肽具有用于治疗皮肤病的治疗学潜力 (6， 31)，并且它们的皮肤渗透已经被证明是非常差的(32)。
材料和方法
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C力e边rec力"oi7/s"'7/e, 鹏入 j/7aspec/ose， C」， 、
"/ew, 做"。荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC'异构体r)购自
Molecular Probes (Eugene, OR, USA)。
油酸单甘油酉旨得自Quest (Naarden， The Netherlands)，油酸得自Sigma (St. Louis, M0， USA)。所有的溶剂和化学品都是分析级。新切取的猪耳得自当地的屠 宰场(Southwest meat processing, Queen Creek, AZ， USA)。
农合4 .' 使用 Automated Peptide Synthesizer (Apex 396， Advanced ChemTech， Louisville, KY， USA)和固相寺支术合成异石危氰 酸荧光素(FITC)-标记的肽，包括YARA (YARAAARQARA， MW: 1668) (SEQ ID NO: 19)、 TAT (YGRKKRRQRRR， MW: 2020)卿ID NO: 36)、 YKAc(YKALRISRKLAK， MW: 1907) (SEQ ID NO: 41) 、 P20 (WLRRASAPLPGLK， MW: 2005) (SEQ ID NO: 9) 、 YARA-P20 (YARAAARQARAWLRRASAPLPGLK， MW: 3111) (SEQ ID NO: 42)、和TAT-P20 (YGRKKRRQRRRWLRRASAPLPGLK， MW: 3466) (SEQ ID NO: 43)。使FITC与加入到肽的N -末端的&-丙氨酸 残基连接。肽通过l吏用反相柱的 Fast Protein Liquid Chromatogrphy (FPLC， Akta Explorer, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ， USA)纯化，并且通过基质辅助激光解吸电离飞行时 间质傳法 (Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry ， MALDI-TOF-MS， Applied Biosystems， Foster City, CA， USA)或电喷射离子化质镨法 (Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS， Waters Corporation, Milford， MA， USA)鉴定。
除了涉及化学渗透增强剂的实验之外，将FITC -标记的 肽溶解于磷酸緩冲盐水(PBS lOmM， pH 7, 2)中；肽浓度为100jLiM。在 涉及渗透增强剂的实验中，因为油酸单甘油酯和油酸的亲脂性质，不 能使用PBS作为溶剂。使用丙二醇作为溶剂，因为其溶解脂质和肽。 在包含10% (w/w)油酸单甘油酯、5% (w/w)油酸或不含这些渗透增强剂 的丙二醇中制备FITC-TAT(SEQ ID NO: 43)、 FITC-YARA (SEQ ID NO: 19)、和FITC-YKAc (SEQ ID NO: 41) (IO(VM)的制剂。通过将油酸单甘 油酯或油酸、与丙二醇混合并且其后立即向系统中加入肽制备制剂。
体,A乂庚渗遽.'^7^斧應时^命和邊发遽送，我//7摔^/7^-标 记^ Z47Y卿殿"；、Z4釘卿M.肌,疏卿M'4"、潛卿// 服"、f扁-，卿/"服幼、减，-"^卿
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猪耳皮肤用作体外皮肤渗透研究的皮肤模型，是由于其与人类皮 肤相似，特别是在组织和生物化学性质以及对药物的渗透性(33)。新 切取的猪耳得自当地的屠宰场。小心地将耳外表面的皮肤剖解，确保 最大限度地除去皮下脂肪(34)。采取最大限度的谨慎以保持皮肤的完 整性，其通过组织学确认。将清洁的猪耳皮肤立即安装在Franz扩散 池(扩散面积l cm2; Laboratory Glass Apparatus, Inc， Berkeley, CA， USA)中，角质层面对供体室(其中施加制剂)，而真皮面对其中填 充PBS (100 mM， pH 7.2， 3 mL)的受体室。将受体相保持在37C和恒 定搅拌下。为了实现更高的可再现性，在施加任何制剂之前使皮肤样 品对扩散池条件平衡30分钟。
将肽的PBS溶液或丙二醇制剂(分别为70 jnL)施加给皮肤表面 (供体室)。在施加后4小时测定皮肤(局部递送的指示)和受体相(透皮 递送的指示)中的FITC-YARA(SEQ ID NO: 19)， FITC-TAT(SEQ ID NO: 43)，和FITC-YKAc(SEQ ID NO: 41)的浓度。在施加后的0.5、 1、 2、 4、和8小时测定皮肤和受体相中的FITC-P20(SEQ ID NO: 9)、 FITC-YARA-P20(SEQ ID NO: 42)、和FITC-TAT-P20 (SEQ ID NO: 43) 的浓度。
在实验结束时，将皮肤表面用蒸馏水充分洗涤，以除去过量的制 剂并且用棉纸(t issue paper)小心地擦拭。为了从剩余的表皮(E)和真 皮(D)分离角质层(SC)，使皮肤块经过窄带剥离(tape stripping),将 皮肤用15块胶带(3M， St. Paul, MN， USA)剥离，并将包含SC的胶 带浸入3mL的水甲醇(l:l v/v)溶液中，涡旋2分钟，并且浴浸声处 理30分钟。将残余物[E+D]切成小块，在2 mL的水甲醇(l:l v/v) 溶液中涡旋2分钟，并且使用组织研磨器均化l分钟，并且浴浸声处 理30分钟。将得到的混合物离心1分钟。如下将存在于受体相中的肽 浓缩(10X)。将受体相的样品(2 mL)冻干24小时，并将残余物溶解于200 p L的水醇(20°/。的乙醇)溶液。
所有的溶液经过使用Gemini SpectraMax 读板器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA， USA)的荧光测定法分析激发波长495 nm， 发射波长518 nm。该方法在研究的浓度范围(0. 05 - 2. OjuM)内是线 性的。为了评价抽提操作中从皮肤回收的肽，将组织切片(1 cm2)与 20 ju L的0. 2和0. 5 mM肽溶液稀释(spiked)。如上所述使用组织研磨 器、涡旋混合器、和浴浸声波仪将皮肤部分均化。取决于肽，肽的回 收率为83 - 90%。我们说明这种回收率百分比为肽的定量。
邀欢# .'在施加FITC-标记的YARA(SEQ ID NO: 19)、 TAT(SEQ ID NO: 36)、 YKAc(SEQ ID NO: 41)、 P20(SEQ ID NO: 9)、 YARA-P20(SEQ ID NO: 42)，和TAT-P20(SEQ ID NO: 43)之后的4小时，使用异戊烷 将皮肤样品的扩散区在-30X:冷冻，包埋在Tissue-Tek OCT化合物 (Pelco International, Redding, CA， USA)中并且使用低温恒温切 片机(Leica， Wetzlar， Germany)切片。将皮肤切片(8 ju m)安装在载 玻片上。不用任何额外的染色或处理通过20X物镜使栽玻片显像，使 用安装有FITC过滤器的Zeiss显微镜(Carl Zeiss, Thornwood， NY， USA)和AxioVision软件。
鍵^为、V^f .'结果报告为平均土SD。通过非参数的克鲁斯凯-沃利斯 检验，随后通过Dunn事后检验统计分析数据(6)。显著性水平设置为 p < 0. 05。
结果
77 ^^命斧邊发迷送我们的第一 目标是评价PTD渗透到皮肤
中和渗透穿过这个组织的能力，以便它们可用作局部和/或透皮递送肽 的载体(结果如图2中所示)。在这个实验中，PBS用作媒介物。在施 加后4小时，我们测定了在SC和[E+D]中的FITC-YARA (SEQ ID NO: 19)、 FITC-TAT(SEQ ID NO: 43)，和FITC-YKAc (SEQ ID NO: 41)的渗透以及 它们的透皮递送。对照，非转导性肽FITC-YKAc(SEQ ID NO:")在SC 和[E+D]中的渗透都非常小，在受体相中没有发现肽(表明没有透皮递送)。另一方面，FITC-YARA(SEQ ID NO: 19)和FITC-TAT (SEQ ID NO: 43)在SC和[E+D]中的渗透比在对照肽中高8-10倍。在施加后4小时， FITC-YARA(SEQ ID NO: 19)和FITC-TAT (SEQ ID NO: 43)的透皮递送 很小，在受体相中检测到的FITC - YARA(SEQ ID NO : 19)的量与 FITC-TAT(SEQ ID NO: 43)相比没有显著差异。在受体相中发现只有 0.053 ± 0.009 nmol的FITC-YARA (SEQ ID NO: 19)和0. 058 ± 0. 008 nmol的FITC-TAT (SEQ ID NO: 43)，这意味着渗透进入皮肤(SC+[E+D]) 的YARA(SEQ ID NO: 19)和TAT (SEQ ID NO: 43)的量分别比渗透穿过 皮肤的量高34和30倍。
渗遽，资浙^" 77 ^肩举遂送^彩喊.'我们接下来评价了油酸单 甘油酯和油酸对FITC标记的YARA(SEQ ID NO: 19)、 TAT(SEQ ID NO: 43)、和YKAc(SEQ ID NO: 41)的局部和透皮递送的影响(结果如图2 中所示)。在这个实验中，将渗透增强剂和肽溶解于丙二醇。与PBS 相比，在施加后4小时，丙二醇不影响YKAc(SEQ ID NO: 41) 、 YARA (SEQ ID NO: 19)，和TAT (SEQ ID NO: 43)的局部递送。值得注意的是，向 制剂加入油酸单甘油酯或油酸显著地(P<0. 05)增加(~ 2. 5倍)非转导 肽FITC-YKAc卿ID NO: 41)在[E+D]中的渗透。然而，相同的渗透 增强剂没能进一步增加已经很高的TAT (SEQ ID NO: 43)和YARA (SEQ ID NO: 19)的局部或透皮递送。
由户7Y 脊适凝合^农户"0邵WO :"迷入和^过发炎；已经 证明了 FITC-YARA(SEQ ID NO: 19)以与FITC-TAT (SEQ ID NO: 43)类
似的程度渗透皮肤，我们评价了其增加缀合的肽的渗透的能力。我们 使P20(SEQ ID NO: 9)连接于FITC-YARA (SEQ ID NO: 19)和 FITC-TAT(SEQ ID NO: 43)并且评价它们作为时间函数的局部和透皮递 送。研究的PTD能够携带缀合的P20(SEQIDNO: 9)进入SC和[E+D](图 3)。当P20 (SEQ ID NO: 9)缀合于YARA (PTD) (SEQ ID NO: 19)和TAT (SEQ ID NO: 43)时，在研究的所有时间点，其在SC和[E+D]中的渗透都显 著地比未缀合的P20(SEQ ID NO: 9)的渗透显著更高(p < 0. 05)(图 3A-F)。在施加后的0. 5到4小时，[E+D]中的YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和TAT-P20 (SEQ ID NO: 43)的浓度逐渐提高(p < 0. 05)(图3E和3F)， 但是在4到8小时没有发现进一步提高。在施加后的4和8小时，PTD -P20缀合物在皮肤的活层([E+D])中的浓度比未缀合的P20 (SEQ ID NO: 9)的浓度高5到7倍。在施加后的1小时实现完整皮肤(SC +[E+D]) 中YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和TAT-P20 (SEQ ID NO: 43)渗透的最大 速率(图3K-L)。 FITC-YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和FITC-TAT-P20 (SEQ ID NO: 43)的透皮递送非常小(FITC-YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和 FITC-TAT-P20(SEQ ID NO: 43)分别为0. 031 ± 0. Oil nmol和0. 027 ± 0.009 nmol);在施加后8小时只在受体相中检测到肽。FITC-P20 根本没有渗透穿过皮肤。
炎^炎>^1凝^炎农#发浪渗邊產汆.'如所期望的，用PBS处理 的皮肤提供非常弱的自发荧光(特别是SC)。用FITC-YARA(SEQIDNO: 19)和FITCXTAT(SEQ ID NO: 43)处理皮肤引起SC和活表皮的强烈的 荧光染色。还可以在真皮中观察到一些荧光，证明这些PTD能够跨越 SC并且到达皮肤的活层。另一方面，FITC-YKAc(SEQ ID NO: 41)主要 集中在SC中，并且在表皮中只观察到非常弱的荧光。在将皮肤用 FITC-标记的YARA(SEQ ID NO: 19)或与P20(SEQ ID NO: 9)缀合的 TAT(SEQIDNO: 43)处理皮肤时，我们也观察在SC和活表皮中强烈荧 光的存在。在皮肤用FITC-P20(SEQ ID NO: 9)处理时，只在SC中发 现荧光。
讨论
在本研究中，我们证明了 PTD YARA(SEQ ID NO: 19)在体外渗透 猪耳皮肤的能力。尽管以前已经证明YARA(SEQ ID NO: 19)在体外和 体内比TAT(SEQ ID NO: 43)更有效地转导进入细胞(28),但是我们发 现这两种肽渗透进入皮肤的能力没有显著差异。另一方面，具有类似 分子量的非转导肽YKAc(SEQ ID NO: 41)的在SC和[E+D]中的皮肤渗
透都是很少量的，这是所期望的，因为这种肽为亲水性的并且具有高 的分子量(1907 Da)。使用包含油酸单甘油酯和油酸的丙二醇制剂评价了化学增强剂对 肽的皮肤渗透的影响。使用丙二醇作为溶剂对所研究的肽的局部和透 皮递送没有影响。包含油酸单甘油酯或油酸的制剂确实显著地增强对
照，非转导肽YKAc(SEQ ID NO: 41)在皮肤中的渗透。这个观察结果 与油酸单甘油酯和油酸通过几种机理起作用以增加SC对药物(包括肽) 的渗透性相符合(36， 37)。这些机理包括脂质结构域的改变和从SC提 取脂质(IO、 36 一 38)。另一方面，油酸单甘油酯和油酸都不影响 YARA(SEQ ID NO: 19)或TAT (SEQ ID NO: 43)的局部和透皮递送。该 结果表明，研究的化学渗透增强剂可用于提高肽的皮肤渗透，但是只 是在这些肽本身没有转导能力并且不能以高的程度渗透皮肤时。
YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和TAT-P20(SEQ ID NO: 43)的皮肤渗 透非常快，并且缀合物能够以与单独的P20(SEQ ID NO: 9)相比更高 的程度渗透SC和[E+D]。荧光显微分析证实，YARA-P20 (SEQ ID NO: 42) 和TAT-P20(SEQ ID NO: 43)有效地跨越SC屏障，并且显示这些相对 大的分子在活表皮中均匀分布。已经表明PTD -肽的缀合物可以非常 快地渗透小鼠皮肤，在施加后的1小时实现高浓度(39，40)。 Robbins 等人(39)观察到，在施加后0，5到1小时，七精氨酸(heptarginine)-血球凝集素抗原表位的皮肤渗透只有轻微的差异。在本研究中，我们 观察到缀合物的皮肤渗透最大速率发生在施加后的1小时，但是它们 在皮肤中的浓度逐渐增加，直到施加后的4小时(p < 0.05)。与肽缀 合的蛋白质转导结构域的皮肤渗透可以取决于PTD和使用的皮肤实验 模型而不同，因为渗透的机制可以随不同的化合物而不同，并且皮肤 的性质和特征可以随不同的动物而不同(20， 33)。
尽管皮肤中的代谢活性小于在其它组织(例如粘膜)中的活性，但 是肽在皮肤中的稳定性是重要的问题(41)。几位作者已经证明了 FITC 标记的大分子在生物学组织中提供好的稳定性，包括皮肤。通过HPLC 和质i普法证明了扩散池的受体相中的FITC-聚赖氨酸的完整性，即使 在化合物暴露于电流或超声之后(42、 43)。不同分子量的FITC标记的 右旋糖酐在透皮递送之后保持了它们的结构完整性，如通过大小排阻色镨法证明的(44)。最后但非最不重要的是，通过蛋白质印迹证明了 皮肤中FITC-寡核苷酸的完整性(45)。与生物组织接触在371C培养几 个小时之前和之后证明了用于这个研究的PTD的稳定性。(The stability of the PTDs used in this study has also been demonstrated before after incubation at 37"C for several hours in contact with biological tissues)。在将缀合物YARA-P20(SEQ ID NO: 42)在37X:与血管段培养2天之后，其药理学活性得到保存(29)。
因此，PTD -肽的缀合物的局部给药可能具有用于局部皮肤病的治 疗潜力。由于肽用于治疗皮肤病和用于改善皮肤性质(在化妆品的情况 中)的重要性，这些化合物的局部递送已经越来越多地得到研究。几种 肽的局部给药将是有吸引力的，包括TGF-e、瘦素(都是用于伤口愈 合)、INF - oc (抗病毒药)、环孢菌素(用于治疗自免疫疾病)、杆菌肽(用 于皮肤感染)、和棕榈酰基-甘氨酰基-组氨酰基-赖氨酸三肽(用于刺激 胶原合成)，以及其它许多(6，11，25，31， 46 - 48)。另外，已经使几种 肽应用于皮肤并且作为抗原研究，用于开发局部疫苗(49)。在这种情 况下，PTD的应用可用于成功地增加肽到皮肤的递送，这是可以带来 与避免全身副作用和患者顺应性有关的治疗利益的重大成果。
尽管已经在文献中报道了不同PTD的皮肤渗透(25 - 27, 39)，但 是确切的作用机理仍是未知的。角质层的细胞间脂质结构域不仅在脂 质组成方面与细胞膜不同，而且在水含量和脂质/蛋白质比率方面与细 胞膜不同(50)。另外，皮肤的最外层由非活细胞组成，认为没有内吞 作用。因此，PTD在皮肤中的渗透机制可能不同于它们跨越细胞膜的 机制。Rothbard等人(25)提出，SC是代谢活性的环境(尽管它不是由 活细胞构成)，其可以有助于PTD的转运。此外，公知的是几种PTD 能够与脂质相互作用(51)，这对于它们转运穿过SC可能是重要的。实 际上，证明了聚L-精氨酸增加鼻上皮的紧密连接的渗透性(52)和右旋 糖酐的转运。这种效果是由聚精氨酸与细胞的带负电荷的脂质的相互 作用引起的(53)。已经证明了皮肤中紧密连接的存在(54)，并且这些 结构被研究的PTD拆开对于它们渗透进入皮肤的生活层可能是重要的。此外，PTD可以渗透皮肤的不同层，产生的梯度可能是PTD在皮 肤中渗透的驱动力(25)。
尽管YARA-P20(SEQ ID NO: 42)和TAT-P20 (SEQ ID NO: 43)的局 部递送很高，但是我们发现它们的透皮递送很小，并且略有些緩慢地 发生，至少在体外是这样的。然而，在体内，这些化合物的透皮递送 可能更显著和更快，因为活的皮肤比用于这些实验的离体皮肤更有活 力。需要进一步的研究以评价局部给药的PTD - P20是否可以在更深 的组织中产生影响。这可能是具有特别的意义，是由于最近证明的 P20(SEQ ID NO: 9)引起血管舒张的能力(29， 30)。这种影响可用于例 如男性和/或女性的性机能障碍的局部治疗。
结论
我们得出结论，PTD YARA(SEQ ID NO: 19)、 TAT(SEQ ID NO: 43) 和它们与肽P20(SEQ ID NO: 9)的缀合物在体外以高的程度迅速渗透 猪的皮肤。这些结果提示，PTD可用作载体分子，用以将具有治疗利 益的肽递送到皮肤。我们还作出结论，YARA(SEQ IDNO: 19)和TAT(SEQ ID NO: 43)的皮肤渗透没有被包含化学渗透增强剂油酸单甘油酯或油 酸的制剂进一 步改善，尽管相同的渗透增强剂改善了大的但是非转导 的肽的局部递送。
参考文献
1. M. R. Prausnitz， S. Mitragotri， R. Langer， Current status和future potential of transdermal drug delivery. jV". 紐■，. 3: 115-124 (2004).
2， K. C. Madison. Barrier function of the skin: "LaRaison d'etre" of the epidermis. /. /oye". /7ei7z/"o/, 121:231-241 (2003).
3. B. Barry. Breaching the skin's barrier to drugs. _/V". A/o&c力/3oA 22: 165-167 (2004).4. P. Karande， A. Jain, S. Mitragotri， Discovery of transdermal penetration enhancers by high—throughput screening
22:192-197 (2004).
5. G. Cevc， A. Schatzlein， G. Blume. Transdermal drug carriers: basic properties, optimizations 和 transfer efficiency in the case of epicutaneously applied peptides. /, Co/7"o厶M 36: 3-16 (1995).
6. B. Godin， E. Touitou. Mechanism of bacitracin permeation enhancement through the skin和eellular membranes from an ethosomal carrier. /. Co/^ro/. 94:365-379 (2004).
7. 0. Pillai， V. Nair， R. Panchagnula. Transdermal iontophoresis of insulin: IV. Influence of chemical enhancers, /力f /.户力ar瓜269: 109-120 (2004).
8. Y.N. Kalia， A. Naik， J. Garrison, R. H. Guy. lontophoretic drug delivery. Jdr. "e//>. Aer. 56: 619-658 (2004).
9. S. Mitragotri. Synergistic effect of enhancers for transdermal drug delivery.户力sr瓜17: 1354-1359 (2000).
10. H. D. C. Smyth, G. Becket， S. Mehta. Effect of permeation enhancer pretreatment on the iontophoresis of luteinizing hormone releasing hormone (LHRH)through human epidermal membrane (HEM). /.Sc/. 9: 11296-1307 (2002).
11. R. R. Boinpally， S丄Zhou, G. Devraj， P丄 Arine， S. Poondru， B.R. Jasti， Iontophoresis of lecithin vesicles of clyclosporin A. /"L /.户力ar瓜274: 185-190 (2004).
12. M. Lindgren， M. Hallbrink, A. Prochiantz， U. Langel. Cel l-penetrat ing peptides. 7>e/7^y 户/ flr迈sco/. iW. 21: 99-103 (2000).
13. S. R. Schwarze, S. F. Dowdy. //2 ">o protein transduction:intracellular delivery of biologically active proteins, compounds和DNA. 7ye/2&户力ar鹏c0/. 5W. 21:45-48 (2000).
14. M. Lundberg， S. Wikstrom， M. Johansson. Cell surface adherence和endocytosis of protein transduction domains. 7T er等8: 143-150 (2003).
15. E丄 Snyder， S. F. Dowdy. Cell penetrating peptides in drug delivery.21: 389-393 (2004).
16. J. Zaro， W. C. Shen. Quantitative comparison of membrane transduction和endocytosis of oligopeptides. A/亂 A/o/7力".
C纖307:241-247 (2003).
17. S. R. Schwarze, A. Ho， A. Vocero Akbani， S. F. Dowdy. //2 protein transduction: delivery of a biologically active
protein into the mouse. 5W歸e 285: 1569-1572 (1999).
18. C丄Flynn， P. Komalavilas， D. Trssier， J. Thresher, E. E. Niederkof ler， C. M. Dreiza， R. W. Nelson, A. Panitch， L. Joshi， C. M. Brophy. Transduct ion of biological ly act ive mot if s of the small heat shock related protein HSP20 leads to relaxation of vascular smooth muscle. Fase6 / 17: 1358-1360 (2003).
19， V. P. Torchilin， T. S. Levchenko. TAT-liposomes: a novel intracellular drug carrier. Cwr 户rot. 尸ept. Sc/. 4: 133-140 (2003)
20. S. Console, C. Marty, C. Garcia-Escheverria， R. Schwendener， K. Ballmer-Hefer. Antennapedia 和 HIV transactivator(TAT) "protein transaction domains" promote endocytosis of high molecular weight cargo upon binding to cell surface glycosaminoglycans. /. 278: 35109-35114 (2003).
21. D. Derossi， S. Calvet， A. Trembleau， A. Brunissen, G.Chassaing， A. Prochiantz. Cell internalization of the third helix of Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. "/o厶C力e迈.271:18188-18193 (1996).
22. E. Vives， P. Brodin， B. Ubleu. A truncated HIV-l Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane和accumulates in the cell nucleus. /. _5/(7/.
272: 16010-16017 (1997).
23. J. P. Richard, K. Melikov， E. Vives, C. Ramos, B. Verbeure， M.J. Gait, L. V. Chernomordik， B. Lebleu， Cell penetrating peptides: a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. /. S/o/. 278: 585-590 (2003).
24. P. E.G. Thoren， D. Persson， P. Isakson， M. Goksor， A. 0nfelt， B. Norden. Uptake of analogs of penetratin， TAT(48-60) 和ol igoarginine in live cells. A/oc力e瓜 A/o/;力;^.Co咖w/7. 307: 100-107 (2003).
25. J-B. Rothbard， S. Garlington， Q. Lin， T. Kirschberg， E. Kreider， P丄Mcgrane, P.A. Wender， P.A. Khavari. Conjugation of arginine oligomers to cyclosporin A facilitates topical delivery和inhibitionofinflammation. iV"ure
6: 1253-1257 (2000).
26. J.M. Lim， M. Y. Chang, S. G. Park, N. G. Kang， Y. S. Song， Y. H. Lee， Y. C. Yoo， W. G. Cho， S. Y. Choi, S. H. Kang. Penetration enhancement in mouse skin和lipolysis in adipocytes by TAT-GKH， a new cosmetic ingredient. /, Co^s". Sc/. 54:483-491 (2003).
27. M. P. M. Schutze-Redelmeier， S. Kong, M. B. Bally, J. P. Dutz. Antennapedia transduction sequence promotes anti tumor immunity to epicutaneously administered CTL epitopes. F"flcc2./2e 22: 1985-1991 (2004).
28. A. Ho， S. R. Schwarze， S.J. Mermelstein, G. Waksman， S.Dowdy.Synthetic protein transduction domains: enhanced transduction potential //2 "7ro 和 //7 卩/>0. Cfl/zcer 61: 474-477 (2001).
29. D. J. Tessier， P. Komalavilas, B. Uu， C丄Kent, J. S. Thresher, C. M. Dreiza， A. Panitch， L. Joshi， E. Furnish, W. Stone, R. Fowl, C. M. Brophy. Transduction of peptides analogs of the small heat shock-related protein HSP20 inhibits intimal hyperplasia. /. Fissc. to^. ， 40:106-114 (2004).
30. D.J. Tessier, P. Komalavilas, E. McLemore, J. Thresher, C.M. Brophy. Sildenafil-induced vasorelaxation is associated with increases in the phosphorylation of the heat shock-related protein 20(HSP20). /. ^/rg. Aes. 118: 21-5 (2004).
31. M. Foldvari， M. E. Baca-Estrada， Z. ， He, J. Hu， S. Attah-Poku， M. King. Dermal和transdermal delivery of protein pharmaceuticals: lipid-based delivery systems for interferon— a. ^7/7/. "/oc力e瓜30: 129—137 (1999).
32. J. D. Bos， M.M.H.M. Meinardi. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds 和 drugs. 加.Z erzz "o/. 9:165-169 (2000).
33. K. Moser， K. Kriwet， A. Naik， Y, N. Kalia， R, H. Guy-Passive skin penetration enhancement和its quantification W"o. fwr. /.户力aivz7.》//7力ar瓜52:103-112 (2001).
34. R. F. V. Upez， M.V丄B. Bent ley, M. B. Delgado-Charro， R. H. Guy. Iontophoretic del ivery of 5-aminolevul inic acid (ALA): effect of pH. "a復18:311-315 (2001).
35. R. Alvarez-Romdn， A. Naik， Y.N. Kalia， H. Fessi， R. H. Guy. Visualization of skin penetration using confocal laser scanning microscopy, fwr. /, 》i'o/7力ar瓜 58: 301-316 (2004).36. A. C. Williams, B. W. Barry. Penetrat ion enhancers. "，"eh>.她56:603-618 (2004).
37. T. 0giso， M. Ywaki， T. Paku. Effect of various enhancers on transdermal penetration of indomethacin 和 urea 和 relationship between penetration parameters 和 enhancement factors. /.户力ar瓜84:482-488 (1995).
38. M. G. Carr， J. Corish， 0. I. Corrigan. Drug del ivery f rom a liquid crystalline base across Visking 和 human stratum corne認，M /.户力flr瓜157:35-42 (1997).
39. P. B. Robbins， S. F. Oliver, S. M. Sheu， P. Good麵gh， P. Wender， P.A.Khavari.Peptide delivery to tissues via reversibly linked protein transduction sequences. A/c^ec力i《wes 33: 190-194 (2002).
40. J. Park, J. Ryu， L H. Jin， J. H. Bahn， J. A. Kim， C. S. Yoon, D.W. Kim， K. H. Han， W. S. Bum, H. Y. Kwon， T. C. Kang， M. H. Won, LH. Kang， S. W. Cho， S. Y. Choi. 9-polylysine protein transduction domain:enhanced penetration efficiency of superoxide dismutase into mammalian cells和skin. #。入 tW/s. 13: 202-208 (2002).
41. V. H丄 Lee， Enzymatic barriers to peptide和protein absorption. Cr". Mer. (7arr/er 5: 69-97 (1988).
42. N. G. Turner, Ferry, M. Price, C. Cullander， R. H. Guy. Iontophoresis of L-poly-lysines: the role of molecular weight 户力織14:1322-1331 (1997).
43. L.J.Weimann，J.Wu.Transdermaldelivery of L一poly-lysine by sonomacroporation.W"s0w3d #ed. A/o/， 28: 1173-1180 (2002).
44. J.Y. Fang, W. R. Lee， S. C. Shen， H. Y. Wang， C丄Fang， C. H. Hu. Transdermal delivery of macromolecules by erbium: YAG<formula>formula see original document page 49</formula>epithelium //7 20:153-160 (2003).
53. K. 0htake， T. Maeno， H. Ueda， M. 0gihara， A. Natsume， Y. Morimoto. Poly-L一arginine enhances paracellular permeability via serine/threonine phosphorylation of Z0-1和 tyrosine dephosphorilation of occludin in rabbit nasal epithelium.Aes. 20: 1838-1845 (2003).
54. K. Morita， Y. Myachi. Tight junctions in the skin. /. / e/7zw Sc/. 31: 81—89 (2003).
共滋辨心 粘膜递送
4吏用荧光标记的WL-P20(SEQ ID NO: 10) (1 mM，在K-Y Jelly 中，FITC-bA-WLRRIKAWLRRApSAPLPGLK(SEQ ID NO: 44)，其中bA为 13-丙氨酸，和pS为磷酸丝氨酸)考查粘膜递送。使用涂药器将肽施加 到阴道和肛管并且允许渗透4小时。将组织切除并且包埋在冷冻组织 包埋介质(Hi s toPrep)中用于低温切割。将切片安装在抗褪色试剂上并 且使用荧光显微术(Zeiss Axiovert)检查。在阴道中实现了粘膜渗透， 但是在肛管中只观察到最小的荧光。这些结果表明，在阴道粘膜中的 WL-P20(SEQ ID NO: 10)转导比在直肠粘膜中更有效。
实施例5 :血管舒张
分离大鼠的主动脉并且剖解为包含结締组织和脂肪组织。切取宽
度为3. 0mm的横向的环并且系在丝缝线上。将组织悬浮在包含碳酸氬 盐緩冲液(120 mM NaCl、 4. 7 mM KC1、 1. 0 mM MgS04、 1. 0 mM NaH2P04、 10mM葡萄糖、1. 5mMCaCl2、和25 mM Na2HC03， pH 7. 4)的肌肉浴中 并且在37C用95% 02/5% C02平衡。将环固定在不锈钢丝的一端并且 连接于肌肉灌注系统(Radnotti)的测力传感器。然后使环逐渐地伸长， 并且测定响应110 mM KCl(在碳酸氢盐緩沖液中的NaCl等摩尔置换) 产生的等长收缩力，直到产生稳定的最大的力。向浴液中直接加入激 动剂和肽。用 110 mM氯化钾(KC1)、随后用 1. 0 mM WL -P20(WLRRIKAWLRRApSAPLPGLK， pS为磷酸丝氨酸)(SEQ ID NO : 10) 预先收缩的组织与未经处理的对照(在10分钟为13%松弛，在30分钟 为50°/。松弛，和在 60分钟为最大的88%松弛，图4)相比进行松弛。 相对于用KC1产生的最大的力计算百分比松弛。这些数据表明， WL-P20(SEQ ID NO: IO)在比YARAAARQARAWLRRApSAPLPGLK (SEQ ID NO: 42)(在5-10分钟内实现最大松弛)更长的时程使组织松弛。这种差异 可能是由于不同的渗透机制和/或胞内定位引起的。
义滋W^抗纤维化活性
作为HSP20肽的抗纤维化活性的关键标记物，我们以前考查了在 用转化生长因于& l(TGFp l)刺激之后结締组织生长因子(CTGF)在人 类瘢痕瘤成纤维细胞中的表达水平。使细胞在10 ci^皿中在37r和 10% 0)2下在具有10。/。胎牛血清(FBS)和额外的青霉素和链霉素(l。/。)的 DMEM中生长到70%铺满。在实验之前使细胞在包含0. 5% FBS的DMEM 中血清饥饿48小时。细胞^1未经处理的(对照)或在有或者没有 WL-P20(SEQ ID NO: 10)磷肽(WLRRIKAWLRRApSAPLPGLK，其中pS为磷 酸丝氨酸)(10或50nM)的存在下用TGFP 1(2. 5 ng/mL)处理24小时。 在实验结束时，将细胞用PBS漂洗，并且使用尿素-二疏苏糖醇-chaps(UDC)緩冲液均化。将裂解物混合，离心(600t) x g)20分钟，并 将上清液用于蛋白表达的测定。将样品(20 ng蛋白)加载在15% SDS-PAGE凝胶上，并将蛋白质电泳转移到Immobilon膜。使用CTGF 抗体的免疫印迹与近红外检测抗体结合以测定CTGF表达(Odyssey Li-Cor， Lincoln, NE)。将负载差异通过归一化校正GAPDH表达。
与使用不同转导结构域(YARAAARQARA (SEQ ID NO: 19)与 WLRRApSAPLPGLK) (SEQ ID NO: 9)的前述实验相似，WL-P20(SEQ ID NO: IO)还抑制TGFpl-诱导的CTGF和胶原表达(图5)。使人类瘢痕瘤成 纤维细胞在包含0. 5% FBS的DMEM培养基中血清饥饿48小时，并且用 2. 5 ng/mL的TGF - p 1处理24小时，并且同时用WL-20(SEQ ID NO: 10) (10或50pM)处理24小时。通过密度测定法将蛋白质印迹量化，并且使CTGF和胶原表达与GAPDH表达相关，以校正负载差异。将对照 细胞中的CTGF和胶原的表达设置为1，用于不同印迹的比较。
事实上，WL-P20(SEQ ID NO: 10)看来似乎更强烈地抑制纤维化响 应。例如，与TGFP1相比，50pMWL-P20使CTGF表达降低"％，而 50jiM的WLRRApSAPLPGLK (SEQ ID NO : 9)剂量产生相对于TGF P 1处 理为30%降低的最大效果。
权利要求
1. 分离的多肽，包括通式I的氨基酸序列(X1X2B1B2X3B3X4)n(SEQ ID NO1)其中X1-X4独立地为任何疏水性氨基酸；其中B1、B2和B3独立地为任何碱性氨基酸；和其中n为1到10。
2. 权利要求1的分离的多肽，其中X广X4独立地为选自以下的任 何疏7K性氨基酸Trp、 Tyr、 Leu、 Ile、 Phe、 Val、 Met、 Cys、 Pro， 和Ala;和其中Bi、 B2、和83独立地为精氨酸、组氨酸、或赖氨酸。
3. 权利要求2的分离的多肽，其中Bi和B2二者都是精氨酸或赖 氨酸，且B3是赖氨酸或精氨酸，但是与B!和B2不同。
4. 权利要求2的分离的多肽，其中Bi和B2是精氨酸且B3是赖氨酸。
5. 权利要求3的分离的多肽，其中X广X4独立地选自Trp、 Leu、 Ile、 和Ala。
6. 权利要求4的分离的多肽，其中Xi为Trp， t为Leu， 乂3为 lie,或X4为Ala，或其4壬何组合。
7. 权利要求1-6中任一项的分离的多肽，其中n为1、 2或3。
8. 分离的组合物，包括(a) 权利要求l - 7中任一项的分离的多肽；和(b) 负载物。
9. 权利要求8的分离的组合物，其中负载物与分离的多肽共价 结合。
10. 权利要求8或9的分离的组合物，其中负载物包括选自治疗 剂、诊断剂、预后剂和显影剂的药剂。
11. 权利要求8-10中任一项的分离的组合物，其中负载物包括 选自多肽、多核苷酸、抗体和有机分子的分子。
12. 权利要求8-11中任一项的分离的组合物，其中负载物包括选自以下的分子退热药、镇痛药、甾体抗炎药、冠状动脉血管扩张 剂、周围血管扩张药、抗生素、合成抗微生物药、抗病毒药、抗惊厥 药、镇咳药、祛痰药、支气管扩张药、利尿剂、肌肉松弛药、脑代谢 改良剂、镇静剂、P-阻断剂、抗心律失常药、抗痛风药、抗凝血剂、 肝病药物、抗癫痫药、抗组胺剂、止吐药、抑制剂、高脂血症药物、 交感神经兴奋药、口服糖尿病治疗药物、口服制癌剂、维生素、鸦片 样物质、和血管紧张素转化酶抑制剂。
13. 权利要求8或9的分离的组合物，其中负载物包括HSP20肽。
14. 权利要求13的分离的组合物，其中HSP20肽包括式1的氨基 酸序列<formula>formula see original document page 3</formula>其中X3为序列WLRR(SEQ IDNO: 8)的0、 1、 2、 3或4个氨基酸； X4选自S、 T、 Y、 D、 E、羟基赖氨酸、羟脯氨酸、磷酸丝氨酸类 似物和磷酸酪氨酸类似物；X5为种序列Zl-Z2-Z3的0、 1、 2或3个氨基酸， 其中Zl选自G和D; Z2选自L和K ;和 Z3选自K、 S和T。
15. 权利要求13的分离的组合物，其中HSP20肽包括SEQIDNO: 9的氨基酸序列。
16. 权利要求13的分离的组合物，其中HSP20肽包括式2的氨基 酸序列X2-X3-RRA-X4-AP卿ID NO: 13) 其中X2为不存在或为W; X3为不存在或为L ;和X4选自S、 T、 Y、 D、 E，磷酸丝氨酸类似物和磷酸酪氨酸类似物。
17. 权利要求13 - 16中任一项的分离的组合物，其中分离的多 肽包括SEQ ID NO : 3的氨基酸序列。
18. 权利要求17的分离的组合物，其中n为l、 2或3。
19. 药物组合物，包括权利要求l - 7中任一项的分离的多肽或 权利要求8 - 18中任一项的分离的组合物。
20. 编码权利要求1 - 7中任一项的多肽的分离的核酸。
21. 编码权利要求13 - 18中任一项的组合物的分离的核酸。
22. 表达载体，包括与权利要求21或22的分离的核酸可操作地 连接的DNA控制序列。
23. 包括权利要求22的表达栽体的重组宿主细胞。
24. 改进的生物医学装置，其中该生物医学装置包括权利要求8-18中任一项的分离的组合物或权利要求19的药物组合物。
25. 体内递送活性剂的方法，包括对其有需要的受试者给予权利 要求8 — 18中任一项的分离的组合物或权利要求19的药物组合物。
26. 用于以下一种或多种治疗应用的方法 (a)抑制平滑肌细胞增殖和/或迁移；(b)促进平滑肌松弛；(c)增加心肌的收缩速率；(d)增加心肌松弛的速率；(e)促进伤口愈合；(f) 减少伤疱形成；(g)破坏粘着斑；(h)调节肌动蛋白聚合；和(i)治疗或 抑制以下的一种或多种内膜增生、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、 平滑肌细胞肿瘤、平滑肌痉挛、心绞痛、Prinzmetal氏心绞痛(冠状 动脉痉挛)、缺血、中风、心动过緩、高血压、肺高血压、哮喘(支气 管痉挛)、妊娠毒血症、早产、先兆子痫/子痫、雷诺氏病或现象、溶 血性尿毒症、非闭塞性肠系膜缺血、肛裂、弛緩不能、阳萎、偏头痛、 与平滑肌痉車有关的缺血性肌肉损伤、脉管病例如移植脉管病、过緩 性心率失常、心动过緩、充血性心力衰竭、心肌顿抑、肺动脉高血压、 和舒张期功能障碍；其中该方法包括对其有需要的个体给予执行一种或多种治疗用途 的有效量的权利要求13 - 18中任一项的分离的组合物。
27. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括治疗或抑制内膜增生。
28. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括促进平滑肌松弛。
29. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括促进伤疤愈合。
30. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括减少伤疤形成。
31. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括治疗或抑制血管痉挛。
32. 权利要求31的方法，其中血管痉車选自心绞痛、冠状动脉痉 挛、Prinzmetal氏心绞痛、缺血、中风、心动过緩和高血压。
33. 权利要求26的方法，其中治疗应用包括治疗或抑制选自以下 的心脏病症过緩性心律失常、心动过緩、充血性心力衰竭、肺动脉 高血压、心肌顿抑和舒张期功能障碍。
34. 用于局部或透皮递送负栽物的方法，包括将转导结构域和负 载物组合，并且接触要接受递送活性剂的受试者的皮肤，其中活性负 载物通过受试者的皮肤递送。
35. 权利要求34的方法，其中负载物没有与转导结构域共价结合。
36. 权利要求34或35的方法，其中转导结构域包括权利要求1-7 中任一项的分离的多肽。
37. 权利要求34或35的方法，其中转导结构域包括选自以下的 多肽(R)4-,(SEQ ID NO: 40); GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO: 18); YARAAARQARA(SEQ IDNO: 19); DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (SEQ ID NO: 20); GWTLNSAGYLLGLINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 21); PLSSIFSRIGDP(SEQ ID NO:22); AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 23); AAVLLPVLLAAP (SEQ ID NO: 24); VTVLALGALAGVGVG (SEQ ID NO: 25); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQP(SEQ ID NO: 26); GWTLNSAGYLLGLINLKALAA LAKKIL(SEQ ID NO: 27); KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 28); KETWWETWWTEWSQPKKKRKV(SEQ ID NO: 29); KAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO: 30); KAFAKLAARLYRAAGC(SEQ ID NO: 31); AAFAKLAARLYRKAGC (SEQ ID NO: 32); KAFAALAARLYRKAGC(SEQ ID NO: 33); KAFAKLAAQLYRK AGC(SEQIDNO: 34); GGGGYGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 35);和YGRKKRR QRRR(SEQ ID NO: 36)。
全文摘要
本发明提供新颖的转导结构域、包括这种转导结构域的组合物、和它们用于体内分子递送的用途。
文档编号C07K7/00GK101426808SQ200680045133
公开日2009年5月6日 申请日期2006年10月30日 优先权日2005年11月1日
发明者A·潘尼茨, B·希尔, C·布洛菲, E·弗尼什 申请人:亚利桑那董事会,代表亚利桑那州立大学行事的法人团体