专利名称：作为制造卤化蔗糖的中间体的蔗糖-6-酯的酶促生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶促生产蔗糖-6-酯，其是在制造包括1，-6，-二氯-1，-6，-二脱 氧-(3-呋喃果糖-4-氯-4-脱氧-卩比喃半乳糖苷(TGS)以及其前体(TGS-6-酯) 的卤化(氯化)蔗糖时使用的中间体。
背景技术：
现有技术方法生产4,1，，6，三氯半乳蔗糖(TGS)的策略主要包括通过使 用Vilsmeier-Haack试剂来氯化蔗糖-6-酯以形成6-乙酰基-4，l，,6，-三氯半乳蔗 糖，所述Vilsmeier-Haack试剂来源于诸如氯化氧磷、草酰氯、五氯化磷等的 不同氯化试剂和诸如二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺的三级酰胺
(tertiary amide)。所述氯化反应后，使用适宜的钙、钠等的碱性氢氧化物中 和反应物料至pH 7.0 7.5，然后优选地进一步升高pH以使6-乙酰基-4,1，,6，-三氯半乳蔗糖去酯化(deesterify) /去乙酰化而形成4,1，,6，三氯半乳蔗糖
(TGS)。
蔗糖-6-酯通常是利用酯化蔗糖而得到，是TGS的前体，TGS是用于食品 和其它应用中的零热量强力甜味剂或味觉改进剂。然而，蔗糖的酯化必须单 独在6位进行，而这对于其制造是主要的挑战，这是因为该酯化的目的位置 的反应性比其它更高反应性的竞争位置(即，l'和6'位)更低。
为了实现区域选择性的酯化，在制造蔗糖-6-酯的有机合成方式中已经描 述了各种方法，其包括但不限于酯化后由锡介导的加合物生成和蔗糖在嘧啶 中的直接酯化。然而，通过有机合成的方法，即使是选择性方法，也导致各 种副产物的生成并且需要涉及分离步骤以在氯化前纯化蔗糖-6-酯。在实现对 位点特异酯化的更多控制上需要进一步的改进
发明内容
本发明公开了酶促酰化的方法，其中，当蔗糖在新型脂酶或交联脂酶存 在下与适宜的酰基或芳基酯化剂(包括有机酸)反应时，主要产物是6-酰基-蔗糖，该脂酶是在三级酰胺存在或不存在下或游离或固定化的形式，或是在 任何其它适宜的溶剂(其中酶是稳定的)中。根据酯化所用的反应物，引入 到蔗糖分子6位上的酯基可以是烷基、芳基、取代垸基或取代芳基。因此获 得的6-酰基-蔗糖可以用于制备卤化蔗糖。 现有技术
Dordick等(1992)在美国专利no. 5128248中公开了在4，-和6-位中的至 少一个位置上对蔗糖或其衍生物进行酰化的方法，其中特别地，在存在微生 物脂肪酶时，供体酰基酯与蔗糖或其衍生物在非羟基溶剂中反应。所述供体 酯是直链烷酸或苯甲酸的反应性酯。
Bomemann等(1992)在美国专利no. 5141860中公开了制备部分去酰化 的蔗糖酰化产物的方法，该蔗糖酰化产物在每个环中具有至少在2-， 3-和3'-位处的乙酰基以及至少一个游离羟基，其中蔗糖辛酰酯(sucrose octaacylate)用酶或酶的组合处理，该酶或酶的组合能在缓冲至pH 5-7的水 性介质(包括水和高达50%的有机溶剂)中催化所述蔗糖辛酰酯的每个环上 的至少一个酰基的水解，并分离生成的部分去酰化的蔗糖酰化产物，所述酶 选自由胰脂酶、酵母酯酶、真菌、a-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋 白酶和a-半乳糖苷酶组成的组中。
具体实施例方式
酶促路线对其终产物显著特异。它们也是非常底物特异性的。 本发明描述了利用酶生产蔗糖-6-酯的新型方法。其描述了对蔗糖高效且 选择性的酶促酯化。利用新型脂酶或交联酯酶进行区域选择性反应，该酶是 或者在三级酰胺存在或不存在时的游离或固定化形式或者在任何其它适宜的 溶剂(其中酶是稳定的)中。根据酯化所用的反应物，引入到蔗糖分子6位 上的酯基可以是垸基、芳基、取代垸基或取代芳基。因此获得的6-酰基-蔗糖 可以用于制备卤化蔗糖，例如作为强力甜味剂的TGS。
所使用的酶可以是酯酶、脂酶等。这些酶可以固定在合成的聚合支撑物 之中或之上，该聚合支撑物为例如但不限于聚丙烯酸，或聚苯乙烯或聚丙烯 酰胺，基于尼龙的支撑物；或者像基于多糖的半合成的或天然的有机支撑
物，该多糖为例如但不限于纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂糖、几丁糖、几丁
质等；或者无机支撑物，例如基于碳、硅、氧化锆、氧化铝、磷酸锆的那 扭，等等。
脂酶的来源可以是源于动物、植物或微生物，更优选源于微生物或细
菌，例如5"c/〃m f/2er附ocatow/(3ft^&、尸"W(icw7o"as1 aerwg/was^等，真菌，例
w/vews、 C(3"(i/(i(3 rwgosa、 i /7&o附wcor mz72ez7、 Cawcfe/a awf"W"/ca等或者等效 物。
这一策略在效果上提高了蔗糖-6-酯的产率和纯度，该蔗糖-6-酯本身或在 除去溶剂后用于氯化步骤，以制备氯化蔗糖衍生物，这又提高所生产的氯化 蔗糖的纯度和产率。
在本发明中，蔗糖的酶促转化成蔗糖-6-乙酸酯基本上包括使用蔗糖和乙 酸或适宜的有机酸或适宜的酰基或芳基酯化试作为反应物以直接生产作为主 要产物的蔗糖-6-酯。
下述发明方法是高效区域选择性反应，其中首次利用新型的分离脂酶专 门在6位进行选择性的蔗糖酯化。
在本发明方法中，通过将蔗糖溶解于干燥的DMF中并用脂酶处理来进 行该反应。DMF溶液中的蔗糖浓度从1: l到l: 10w/v变化。乙酸被用作酰 化剂并且被直接加入反应混合物中。可以使用任何其它脂肪酸、取代的脂肪 酸、芳香酸或取代的芳香酸以生成各自的蔗糖-6-酯。反应期间的温度可以是 15。C 60。C中的任意值。酶促酯化反应在1小时 16小时以上完成，并伴随 可忽略量的副产物的产生(若有的话)。当适当保持反应条件，蔗糖向蔗糖-6-酯的转化相当好且对6位特异。该酶可以以诸如粉末或液体的游离形式使 用，也可以是固定化形式。
酶以固定化形式使用时被回收。可以将固定化酶装入柱中并且以设定流 速通过所述反应物以进行反应。或者，在反应器中用固定化酶进行反应并且 反应后，可以通过从反应物料中将酶过滤掉而回收酶。
因此获得的蔗糖-6-酯基本上是纯的并且易于分离和进行氯化来生产卤化 蔗糖。
下面描述的是实施例，其说明了本发明的工作方式而不以任何方式限制 本发明的范围。反应物、所使用的反应物的比例、描述的反应条件的范围仅 仅是说明性的并且本发明的范围延伸至其类似的反应物、反应条件和类似的 通性反应。通常，对氯化蔗糖生产领域技术人员显而易见的任何等效替代包 括在本说明书的范围内。除非文中不允许，所提及的单数被理解为包括其复 数形式，而且包括由该表述所包含的所有等效替代，即，使用"氯化蔗糖"包 括所有氯化蔗糖化合物中的每种以及其混合物或在相关内容中可实现相同功 能的替代的氯化蔗糖化合物。提及用于溶液的"一种有机溶剂"包括一种或多 种有机溶剂连续使用，或其组合作为混合物使用，或能进行与权利要求、说 明书所述或实施例所说明的相同功能的若干替代中的任何一种。在本说明书 中，蔗糖-6-酯和6-酰基-蔗糖为了所有功能性目的而作为等效物互换使用。
实施例l、蔗糖在DMF中的酶促乙酰化反应
将来自A^en^〃w oo^"e的脂酶在聚苯乙烯珠上固定化并与戊二醛交联 以得到固定化脂酶。将200g蔗糖于80。C溶解于800ml的DMF中并冷却至室 温，在反应烧瓶中加入34g所述固定化脂酶并保持搅拌。保持温度为30°C。 向反应烧瓶中滴加13.5g乙酸并持续搅拌。继续搅拌并且用TLC和HPLC监 测乙酰化反应。
在3小时内完成了 70%的乙酰化，过滤反应内含物(reaction content)并 用水冲洗酶且回收。
HPLC确认生成70%的蔗糖-6-乙酸酯，且无副产物生成。
实施例2、蔗糖在异戊醇中的酶促乙酰化反应
将20g蔗糖于80。C部分溶解于400ml异戊醇中并冷却至室温。在反应烧 瓶中加入34g如实施例1所述方法制备的来自o^yzae的固定化脂 酶并保持搅拌。保持温度为30。C。向反应烧瓶中滴加3.5g乙酸并持续搅拌。 继续搅拌并且用TLC和HPLC监测乙酰化反应。
在3小时内完成了 70%的乙酰化并且过滤反应内含物，用水冲洗酶并回 收。HPLC确认生成70。/。的蔗糖-6-乙酸酯，且无副产物生成。
实施例3、利用苯酐将蔗糖在DMF中酶促酰化
将10g蔗糖于50°C部分溶解于100ml的DMF中并冷却至25°C。加入 26g分离自Aw^ wo"a w.的脂酶并充分搅拌。温度再次升至50°C。加入 0.59ml的苯酐并且持续反应6.0h。用TLC和HPLC监测酰化反应。
在6小时内实现高达48%的苯甲酰化，且无副产物生成。
实施例4、利用月桂酸将蔗糖在DMSO中酶促酰化
将10g蔗糖于60°C溶解于100ml的DMSO (二甲亚砜)中并冷却至 25°C。加入26g分离自Rhizopus w.的脂酶并充分搅拌。温度再次升至 50°C。加入11.69g月桂酸并且持续反应8.0h。用TLC和HPLC监测酰化反 应。
HPLC确认在8小时内实现高达42%的酰化，且无副产物生成。
实施例5、利用p-硝基苯甲酸将蔗糖在DMSO中酶促酰化
将10g蔗糖于60°C溶解于100ml的DMSO中并保持在35°C。加入26g 分离自戸e^fo附o"os w.的脂酶并充分搅拌。温度再次升至60°C。加入4.89g 的p-硝基苯甲酸并且持续反应8.0h。用TLC和HPLC监测苯甲酰化反应。 HPLC确认在8小时内实现高达32。/。的苯甲酰化，且无副产物生成。
实施例6、酶促乙酰化和氯化反应以制备TGS
在一个实验中，将200g蔗糖于80°C溶解于2000ml的DMF中并冷却至 室温。在反应烧瓶中加入34g如实施例1所述方法制备的来自J^^h^7/w 00^"e的固定化脂酶并保持搅拌。保持温度为50°C。向反应烧瓶中滴加 13.8ml乙酸酐并持续搅拌。继续搅拌并且用TLC和HPLC监测乙酰化反应。
在6小时内完成了高达68%的乙酰化，过滤反应内含物并用水冲洗酶且 回收。然后将DMF溶液用于氯化。
将432g的PCls于35°C加入至2L的DMF中并且允许形成Vilsmeier Haack试剂。由该反应产生的POCl3与反应物料中可用的DMF形成第二 Vilsmeier,并且充分搅拌该反应物料60min。然后将该反应物料冷却至0°C 且在搅拌下缓慢加入由酶促反应获得的DMF中的6-酰基蔗糖。加入6-酰基
蔗糖后，将该反应物料加热至35°C并保持搅拌60min。然后加热反应物料至 85°C，保持60min，再次加热至100°C，保持6h，然后进一步加热至114°C 并保持1.5h，然后冷却至65。C。
然后利用氢氧化钙浆水中和反应物料至pH7.0，然后过滤。然后，将过 滤物提取至l: 3倍v/v的乙酸乙酯中，并浓縮至其原始体积的50%。然后用 1: 0.1倍v/V的饱和氯化钠溶液冲洗该提取物。重复该氯化钠冲洗12次，并 且将乙酸乙酯提取物中的DMF含量减小至< 0.1%。然后，彻底除去乙酸乙 酯，并且将该浆液在硅化硅胶上进行色谱分析。使用的流动相是pH 10.5 ll.O的缓冲液。
收集由色谱纯化获得的纯馏分，然后使用氢氧化钠溶液调节pH至9.0。 允许完成去乙酰化并由TLC确认。
去乙酰化后，通过利用RO膜的分子分离浓縮该馏分。将RO浓縮后的 浓縮物提取入1: 3.5倍v/v的乙酸乙酯中并且分离各层。将乙酸乙酯提取物 浓縮至最大值，并且所获得的晶体重新在甲醇中溶解。然后过滤甲醇溶液以 除去任何杂质并将其浓縮和结晶。
HPLC测定，获得的纯度为98.5%，并且由6-酰基蔗糖输入获得的总产 率是35%。
实施例7、利用酯酶在t-丁醇中的酶促酞酰化反应
将25g蔗糖于60。C部分溶解于100ml的t-丁醇中并冷却至25°C。加入 45g分离自c朋d油平的脂酶并充分搅拌。将温度再次升至60。C。加入4.89g 苯二甲酸并且持续反应16.0h。用TLC和HPLC监测酞酰化反应。
HPLC确认在16小时内实现高达26°/。的酞酰化，且无副产物生成。
实施例8、利用封装于柱中的固定化脂酶的酶促酰化反应
将25g蔗糖于80°C部分溶解于100ml的DMF中并冷却至25。C。将15g
在聚苯乙烯支撑物上的来自尸"M^W20"^ w.的固定化脂酶装入玻璃柱。柱的
入口通过蠕动泵连接到DMF中的蔗糖溶液。出口也连接到蔗糖溶液。在 25°C持续搅拌溶液。将4.0ml乙酸加入到蔗糖溶液中并且通过蠕动泵以20ml/h的流速泵入玻璃柱。继续再循环12h。用TLC周期性地监测乙酰化反应。
HPLC确认在12小时内实现高达59%的乙酰化，且无副产物生成。
权利要求
1、一种主要在6-位上酰化蔗糖以制备6-酰基-蔗糖的方法，其中，使用酶，当包括直链烷酸或芳基羧酸的有机酸，或酰化剂与蔗糖在溶剂中反应时，该酶能在蔗糖分子的6位上催化选择性酰化；所述溶剂是所述酶在其中稳定的溶剂。
2、 权利要求l所述的方法，其特征在于，a、 所述包括直链烷酸或芳基羧酸的有机酸进一步包括乙酸、丙酸、丁 酸、六烯酸、苯甲酸、苯二甲酸等，b、 所述酰化剂包括乙酸酐、丙酸酐、月桂酸酐、丁酸酐、苯甲酸酐、苯 二甲酸酐等，c、 所述酶包括脂酶或酯酶，其为可溶或固定化形式，并且源于动物、植 物或微生物，d、 所述酶在其中是稳定的所述溶剂包括二甲基甲酰胺、异戊醇、辛醇、 己烷、环己烷、甲苯、t-丁醇、二甲基亚砜等。
3、 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括下述步骤a、 将蔗糖溶解于溶剂中以产生溶液，优选在无水溶剂中且所述溶剂是所 述酶在其中稳定的溶剂，b、 向所述溶液中加入脂酶或酯酶，c、 向前述步骤中的反应混合物中加入乙酸或另一种有机酸或酰化剂，d、 允许反应在促进酶作用的温度下进行，优选15 6(TC，持续足以得 到蔗糖向6-乙酰基-蔗糖的实际最大转化的一段时间，优选约1 16h。
4、 权利要求l或2所述的方法，其特征在于，蔗糖的酰化包括反应器， 其中，在一定温度下，在足以使大多数蔗糖酰化为6-酰基-蔗糖的一段时间 内，所述酶以固定化形式在反应器中与含有蔗糖和有机酸或酰化剂的循环溶 液相互接触。
5、 权利要求4所述的方法，其特征在于，a、蔗糖在一定温度，优选约80。C下溶解于溶剂中，优选部分溶解于 DMF，并冷却至一温度，优选大约25。C， b、 将在优选的聚苯乙烯支撑物上固定的提取自p"^/owoww ^的优选的 脂酶封装入玻璃柱，c、 将该柱的入口通过泵，优选蠕动泵连接到DMF中的蔗糖溶液，d、 将该柱的出口连接到本权利要求的a中所指的所述蔗糖溶液，e、 优选在大约25。C持续搅拌该溶液，f、 将有机酸，优选乙酸加入蔗糖溶液并通过蠕动泵以一定流速，优选约 20ml/h泵入玻璃柱中，持续进行再循环一段时间，优选大约12h，以使相当 部分的蔗糖转变成6-酰基-蔗糖，以及g、 可选择的使用因此获得的6-酰基-蔗糖，以制备氯化蔗糖。
6、权利要求1所述的方法，其特征在于，将所得到的含有6-酰基-蔗糖 的反应液流进行氯化和去乙酰化反应，以产生氯化蔗糖，包括强力甜味剂 4，1，，6，三氯半乳蔗糖(TGS)。
全文摘要
本发明描述了一种用于生产6-酰基蔗糖的新方法，包括利用包括有机酸的酯化试剂将蔗糖在脂酶或酯酶的存在下在溶剂中(所用酶在其中是稳定的)酶促酰化。通过对利用本发明的方法制备的6-酰基蔗糖氯化和去乙酰化可以制备氯化蔗糖，强力甜味剂三氯半乳蔗糖。
文档编号C07H1/00GK101341165SQ200680046221
公开日2009年1月7日 申请日期2006年11月28日 优先权日2005年12月9日
发明者巴楚·强德拉塞卡, 彭巴巴斯·萨伯拉姆尼亚姆, 拉克什·拉南 申请人:V.B.医疗保险私人有限公司