专利名称：：鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂用于恢复抗微生物肽的表达的用途的制作方法
技术领域：
：.本发明涉及使用鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)拮抗剂用于例如在特应性皮炎患者的皮肤中恢复抗微生物肽(AMP)的表达水平的方法、SPC拮抗剂在制备用于恢复AMP表达的药物中的用途、以及迎过分析候选化合物恢复AMP的表达水平的能力筛选SPC拮抗剂的方法。
背景技术：
：鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)是溶性鞘脂(lysosphingolipid)家族成员，具有下式的N-脱酰鞘磷脂(N-deacylatedsphingomyeline)形式。化学式1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>SPC是通过SMN-脱酰酶从鞘磷脂(sphingomyelin,SM)生成的一种促分裂原(HiguchiKetal.，历ocAe附./(2000),350,747-756)，并丘已知在C^+从内质网释放中发挥作用，也参与细胞生长、增殖(Desaietal.,Bzoc/ie肌5!'o//z".^饥Co/wwww.(1991),181,361-366)和凋亡(JeonESetal.,Bfoc/wm历o//^4cto.(2005)，1734(1);25-33)。特别地，已证明SPC在各种细胞中影响细胞重建或细胞迁移。例如，化、形态发生和黑素原生成(Be堪eretal.，户roc.JVarf.爿caof.5W.￡/,S.A(1995)，92，5885-5889)。最近一些报道已经显示1)在得自特应性皮炎(AD)忠者的角质层中SPC的表达与健康对照对象相比显著增强(ReikoOkamotoetal.，Jowrwa/0/丄z》W及ejea/r/(2003)，44，93-102)，2)在AD患者的表皮中SM脱酰酶的活性异常地高(HiguchiKetal.,B/ocAe肌/(2000)，350747-756)，和3)—些皮肤屏障功能的病变是通过鞘磷脂酶合成酰胺的水平降低导致的(JunkoHaraetal.，/De/vw。to/.(2000)，115,406-413)。然而，迄今为止没有关于增强的SPC农达导致皮肤病(例如AD)的机制的报道。抗微生物肽(AMP)是具有预防--些病原体(例如细菌、病毒和效-菌)感染的抗微生物活性的小分子量肽(GanzTetal.,C";rQp/"./m/mwo/.(1994)，6，584-589)。已证明AMP诱导血管发生、伤口愈合和趋化性(IzadpanahAetal"^m.y4cadDerwato/.(2005),52，381-390)，并具有带正电和拥有亲水性和疏水性残基的结构特征。近来，已经确认金黄色葡萄球菌(S.在患有AD的患者的炎症皮肤中的异常生长是由已知为AMP的人P-防卫素(HBD-2)和Cathelicidin(LL-37)的表达降低导致的，特别地，HBD-2和LL-37在特应性损伤中的表达水平显著低于在银屑病损伤中的表达水平(OngP.Y.etal.，WJ.Med(2002),347,1151-1160)。人防卫素可根据其结构特征分为a和p防卫素。a防卫素是富含精氨酸的单体多肽，每种多肽由大约30-35个氨基酸组成，并且在人体中已经鉴别了其6种同种型(HNP-1至4、HI>5和HD>6)。在p-防卫素的情形中，每种多肽由大约41-50个氨基酸组成，并且在人血清中已经通过生化手段鉴别了11种同种型(历oc/;e/m'W7am/A/o/ecw/ar历o/ogv;Vewj(2006)，1-7)，迄今为止通过人类基因组项目己经鉴别了28个人P-防卫素基因和43个小鼠p-防卫素基因(B.C.Schutteetal.,尸raceWwgso/决eiVariowa/i4cacfe/w;yo/S"'e"c&s(2002)，99,2129-2133)。在这些已经被报道在AD患者的皮肤中表达被抑制的人P-防卫素(HBD)中，HBD-1主要在肾脏、女性生殖器官、呼吸器官、胰脏、牙龈、舌和鼓膜的上皮细胞中表达；而HBD-2在皮肤、肺、呼吸道、牙龈和鼓膜中表达，但是在泌尿器官(例如肾脏和膀胱)以及唾液腺「l，完全缺乏(J.Harderetal.,A^/MW(1997)，387,861)。另外，HBD-3在皮肤中表达，而HBD-4在男性生殖器官和胃中表达。HBD-1和HBD-3组成型表达；而大多数HBD(包括HBD-2和HBD-4)的表达是诱导型的，仅仅应答特定条件例如感染(J.M.Schroderetal.，/wf./fi/oc/;e附.CW/历o/.(1999)，31,645-651)。在这些诱导型HBD中，已经提示HBD-2的表达被NF-kB通过MEK1/2-ERK1/2信号途径上调(Tsutsumi-IshiiYetal.，/￡ew&c.历o/.(2002)，71,154-162)，并被TNF-ct、IL-la、IL-卩或LPS增强(KWChaetal.,_/Va//.」cadScf.(2000)，97，3016-3021)，因为//5￡>-2基因启动子区域包含NF-icB结合位点。另外，己经报道HBD-4的表达可被微生物(例如肺炎链球菌(S./w//wo"/fle))通过PMA-PKC信号途径诱导(J.R.Garciaetal.，化S五5J(2001),15,1819-1821)，HBD画3的表达水平可应答于TNF-a、IL-ip和IFN-"y而提高。因此，本发明人努力确定特应性皮炎的病理学机制，并且发现SPC显著地降低AMP(特别是HBD-1至-4(属于人防卫素P家族，并且已经报道其表达在AD患者的皮肤中降低)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin)的表达
发明内容技术问题因此，本发明的一个目的是提供一种用于在抗微生物肽(AMP)表达降低的哺乳动物中将AMP的表达恢复至有效水平的方法。本发明的另一个目的是提供鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)拮抗剂在制各用于恢复哺乳动物屮AMP的表达的药物中的用途。本发明的另一个目的是提供一种筛选用于恢复AMP的表达的候选物的有效方法。技术方案根据本发明的一个方面，提供了用于在需要恢复AMP表达的哺乳动物中恢复AMP的表达的方法，包括将SPC拮抗剂以治疗剂量施用给所述哺乳动物的歩骤。根据本发明的另一个方而，提供了SPC拮抗剂在制备用于在需耍恢复AMP表达的哺乳动物中将AMP的表达恢复至正常水平的药物中的用途。根据本发明的另-一个方而，提供了用于筛选SPC拮抗剂的方法，包括步骤I)用SPC或其衍生物处现对象以下调AMP的表达;2)用SPC拮抗剂候选物处现所述对象并分析在所述对象中AMP表达的恢复水平。当与所附附图联系起来时，本发明的上述及其他目的和特征从本发明的如下描述中显而易见，所述附图分别示出图1:RT-PCR分析结果，显示HaCaT细胞中HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表达水平(组成型或被TNF-a诱导)以SPC剂量依赖性方式被抑制；图2:RT-PCR分析结果，显示HaCaT细胞中HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表达水平(组成型或被PMA诱导)以SPC剂量依赖性方式被抑制；图3:RT-PCR分析结果，显示HaCaT细胞中HBD-2和HBD-3的mRNA表达水平(被TNF-a诱导并被SPC抑制)通过给予2-氨基-2-辛基羟甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢复以及图4:免疫组化测定结果，显示ICR小鼠中HBD-1和HBD-2的蛋白质表达水平(被PMA诱导并被SPC抑制)通过给予2-氨基-2-辛基轻甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺恢复至正常水平。具体实施例方式在本发明的方法中使用的用于将AMP的表达恢复至正常水平的SPC拮抗剂可以是任何一种已知能够抑制SPC的活性或拮抗SPC下调AMP表达的机制的SPC拮抗剂。SPC拮抗剂的代表性实例包括与SPC活性位点结合的竞争性抑制剂、与SPC活性位点之外的其他位点结合以使活性位点失活的非竞争性抑制剂、SPC细胞内定位的抑制剂、降解SPC或诱导SPC降解的物质、以及SPC诱导的AMP表达下调途径的阻断剂。在木发明中，所述SPC拮抗剂可以经全身或局部施用给需要恢复AMP表达的对象，例如忠有与AMP表达降低相关的病变(例如特应性皮炎(AD))的哺乳动物，包括人。本发明的方法中的SPC拮抗剂合适的单次剂量可以根据各种相关因素(包括待治疗的疾病、施用途径、患者的年龄和体重、以及患者症状的严重性)确定。进一步地，本发明提供了一种用于筛选可行的SPC拮抗剂的方法，包括步骤I)用SPC或其衍生物处理对象以下调AMP的表达;和2)用SPC拮抗剂候选物处理所述对象并分析所述对象中AMP表达的恢复水平。在本发明的方法中，所述对象可以是受试细胞或哺乳动物。所述受试细胞可以是任何一种表达AMP或能够针对诱导性物质应答性表达AMP的已知细胞，优选角质形成细胞；所述哺乳动物可以是啮齿动物例如小鼠、大鼠或旱獭，优选无毛小鼠。根据本发明的一个实施方式，在步骤1中，可以将SPC或其衍生物以从大约lnM至大约40mM(从大约0.002°/。(w/w)至大约2%(w/w))的浓度范围施用给对象。当浓度低于nM时，无法实现所希望的对AMP表达的抑制当浓度高于40mM时，受试细胞可能发生形态改变，或在哺乳动物中可能出现副作用。进一步地，当AMP显示诱导型表达时，例如在本发明的方法的分析中使用HBD-2和HBD-4吋，可以进一步包括在步骤1的SPC处理之前或同吋用AMP表达的诱导性物质处理对象。所述AMP表达的诱导性物质可选自由Ca2+、TNF-a、IL-ip、IFN"T和佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)组成的组，优选TNF-a和PMA。在步骤2中，可用SPC拮抗剂候选物处理在步骤1中进行AMP表达下调的对象，并分析AMP表达的恢复水平。可以使用一种已知用于测量基因或蛋白质表达的方法分析AMP的表达水平。例如，可通过RT-PCR或印迹分析(例如RNA印迹)并使用它们的基因或其片段作为探针分析AMP的基因表达；可以使用抗AMP的抗体通过进行酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(R1A)、三明治测定(sandwichassay)、蛋白质印迹、免疫印迹或免疫组化染色法分析AMP的蛋白质表达。SPC显著降低已有报道在特应性皮炎忠者体内被抑制的人|3-防卫素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表达。因此，SPC拮抗剂可用于预防和治疗与AMP的表达降低相关的病变例如特应性皮炎，并且可以通过分析AMP基因或蛋白质表达的恢复水平而有效地筛选可行的SPC拮抗剂。以下实施例用于进一步阐明本发明而不限制其范围。进一步地，以下给出的固体在固体混合物中的百分比、液体在液体中的百分比、以及固体在液体中的百分比分别是基于wt/wt、vol/vol和wt/vol表示的；并且所有反应均在室温进行，除非另外特别说明。参考实施例AMP的表达水平的分析在如下实施例中，通过进行多于3次的RT-PCR((94。C，1min;51~60°C，lmin:72。C，2min)50次循环；引物浓度5pmoI/反应，模板含量50ng/反应)分析受试细胞和对照细胞中AMP的mRNA表达模式，所述RT-PCR使用特异于人防卫素家族(HBD-1至-4)、Cathelicidin(hCAP-18/LL-37)、Dermcidin(DCD)的基因的引物，GAPDH作为对照。所使用的引物序列列于表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>通过扫描所得的RT-PCR照片估计各个条带密度并使用student'st检验检验估计的密度值，检测AMP的mRNA表达水平。只有当受试组和对照组的估计p值小于0.05吋才认为受试细胞和对照细胞之间的差异是显著的。实施例l:SPC降低AMP表达的分析(1)受试细胞中的分析将人角质形成细胞系HaCaT(Dr.N.E.Fusenig，DuetschesKrebsforschungszentrum，Heidelberg,Germany)以1乂105个细胞/孔的量接种于6孔平板，并于37。C和5。/dC02的条件下，在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素-链霉素，Gibco，USA)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，GibcoBRL)中培养24小时。将一些培养的细胞用20ngTNF-a或者40或80nM佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)处理以诱导呈现诱导型表达的AMP的表达，同吋加入0、1、10或20pMSPC。一些培养的细胞不进行处理(对照细胞)。与参考实施例的方法一样，对受试细胞和对照细胞进行RT-PCR，以分析其AMP的mRNA表达水平，作为SPC处理浓度的函数。结果示于图1和2。如图1和2所示，HBD-1至-4、hCAP-18/LL-37和DCD的mRNA表达水平在HaCaT细胞中以SPC剂量依赖性方式被显著抑制。特别地，HBD-2、HBD-3和DCD的mRNA表达水平被SPC处理明显地抑制。(2)受试动物中的分析将8周龄大、体重大约为25~30g雄性的ICR小鼠(CharlesRiverLaboratories,MA，USA)用20pl于丙酮中的PMA(2.5pg/nl)对其耳朵、背部和腹部区域的皮肤进行处理以诱导AMP的表达，同吋，给这些小鼠中的一部分分别应用20^1的0.1%或1%SPC，6小吋之后进行同样的SPC处理。给一些不用PMA处理的小鼠仅应用丙酮(对照组)。24小吋后，从被处理的皮肤以6mm的穿刺(punching)收集组织样品，每一样品中包埋在OCT(最佳切割温度)化合物中并于-20'C冷冻。将每一冷冻组织样品切成4nm厚的切片，固定在载玻片上，并于室温与抗-HBD-l或抗-HBD-2抗体(Santacruse，USA)—起温育超过1小时。对每…个获得的样品用Envision试剂盒(DAKO，USA)进行免疫组化分析。结果示于图4((a)至(d))。如图4((a)至(d))屮的结果所示，在ICR小鼠皮肤中HBD画1和HBD-2的蛋白质表达以SPC剂量依赖性方式显著降低。实施例2:通过分析AMP表达的恢复水平筛选SPC拮抗剂(1)受试细胞中的分析将HaCaT细胞以1"05个细胞/孔的浓度接种于6孔平板，并于37°C和5%C02的条件下在添加了10%FBS和1%青霉素-链霉素(Gibco)的DMEM中培养24小时。将培养的细胞用20ngTNF-a处理以诱导HBD-2的表达，同时加入lO[iMSPC以抑制AMP表达。之后，每一组用0、0.1、1或10ppm的2-氨基-2-辛基羟甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-1-胺处理。一些培养的细胞不进行处理(对照细胞)，或仅用20ngTNF-a或10nMSPC进行处理。根据参考实施例的方法，对受试细胞和对照细胞进行RT-PCR，以确定HBD-2和HBD-3的mRNA表达水平。结果示于图3。如图3所示，HBD-2和HBD-3的mRNA表达在用2-氨基-2-辛基羟甲基-丙烷-l，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺处理的受试细胞中显著恢复。因此，这些结果提示可以通过本发明的方法容易地检测到SPC拮抗剂。(2)受试细胞中的分析将20nlPMA(2.5pg/nl)应用于8周龄大、体重大约为25~30g的毎只雄性ICR小鼠的耳朵、背部和腹部区域的皮肤以诱导HBD-1和HBD-2的表达，同吋应用2(^1的1°/。SPC以抑制AMP表达。用20^1的1%2-氨基-2-辛基羟甲基-丙烷-1,3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)W-2-烯-l-胺处理这些小鼠中的一部分，6小吋之后进行同样的SPC处现。24小时后，从被处理的皮肤以6mm的穿刺收集组织样品，包埋在OCT(最佳切割温度)化合物中，并于-20'C冷冻。将每一冷冻组织样品切成4Mm厚的切片，固定在载玻片上，并于室温用抗-HBD-l或抗-HBD-2抗体(Santacruse，USA)温育超过1小时。对每一样品用Envision试剂盒(DAKO，USA)进行免疫组化分析，结果示于图4((d):柳。如图4((d)至(f))中的结果所示，在用2-氨基-2-辛基羟甲基-丙烷-1，3-二醇或N-(2-(萘-2-基氧基)乙基)丙-2-烯-l-胺处理的受试组中，被SPC抑制的HBD-1和HBD-2的表达水平恢复至正常水平。因此，这些结果提示可以通过本发明的方法容易地检测到SPC拮抗剂。虽然根据上述特定实施方式对本发明进行了描述，但是应当认识到本领域技术人员可以对本发明进行各种修饰及改变，这些修饰及改变也落入由所附权利要求书所限定的本发明的范围。权利要求1.鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂在制备用于在需要恢复抗微生物肽的表达的哺乳动物中将抗微生物肽的表达恢复至正常水平的药物中的用途。2.权利要求^的用途r其中所述"氨醇磷酸ii:碱拮抗剂通过抑制鞘敏醇磷酸胆碱的活性或拮抗鞘氨醇磷酸胆碱下调抗微生物肽表达的途径而恢复抗微生物肽的表达。3.权利耍求2的用途，其中所述鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂选自山与鞘氨醇磷酸胆碱活性位点结合的竞争性抑制剂、与鞘氨醇磷酸胆碱活性位点之外的其他位点结合以使活性位点失活的非竞争性抑制剂、鞘氨醇磷酸胆碱细胞内定位的抑制剂、诱导鞘氨醇磷酸胆碱降解的物质、鞘氨醇磷酸胆碱诱导的抗微生物肽表达下调途径的阻断剂、及其混合物组成的组。4.权利耍求1的用途，其，l'所述哺乳动物患有特应性皮炎。5.权利要求1的用途，其中所述鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂经全身或局部施用给所述哺乳动物。6.—种用于筛选鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂的方法，包括步骤1)用鞘氨醇磷酸胆碱或其衍生物处理对象以下调抗微生物肽的表达；和2)用鞘氨醇磷酸胆碱拮抗剂候选物处理所述对象并分析所述对象中抗微生物肽表达的恢复水平。7.权利要求6的方法，其中所述对象是受试细胞或除人以外的哺乳动物。8.权利要求7的方法，其中所述受试细胞表达抗微生物肽或能够针对诱导性物质应答性表达抗微生物肽。9.权利要求8的方法，其中所述受试细胞是角质形成细胞。10.权利要求7的方法，其中所述哺乳动物是小鼠、大鼠或早獭。11.权利要求6的方法，其中在步骤1中，将鞘氨醇磷酸胆碱或其衍生物以从lnM至40mM的浓度施用给所述对象。12.权利要求6的方法，进一步包括在步骤1的鞘氨醇磷酸胆碱处理之前或同时用抗微生物肽表达的诱导性物质处理对象。13.权利要求12的方法，其中所述诱导性物质选自由Ca2+、TNF-a、1L-ip、IFN-y、佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(PMA)、及其混合物组成的组。14.权利要求6的方法，其中在步骤2中通过测定抗微生物肽的基因或蛋白质表达水平分析抗微生物肽表达的恢复水平。15.权利要求14的方法，其中所述抗微生物肽的基因或蛋白质表达水平通过选自由逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、三明治测定、蛋白质印迹、免疫印迹、免疫组化染色法及其组合组成的组的方法测定。全文摘要SPC抑制特应性皮炎患者体内的人β防卫素(HBD-1、HBD-2、HBD-3和HBD-4)、Cathelicidin(LL-37)和Dermcidin的表达，因此，SPC拮抗剂可用于预防和治疗与AMP表达降低相关的病变。文档编号C07K1/00GK101443347SQ200680054636公开日2009年5月27日申请日期2006年12月8日优先权日2006年5月18日发明者成基士,成大石,朴锺喜,李昌勋,赵仙娥,赫金,金亨俊,金光美,金大权,金正铸申请人:株式会社Amorepacific