专利名称:一种抑制癌细胞生长的短肽及其应用的制作方法
技术领域:
本发明属于生物技术医药领域,本发明更具体涉及了一种抑制癌细胞生长的短肽及其应用。
背景技术:
在癌症发生与治疗的过程中,化学治疗一直属于主体部分。现有的临床使用的化疗药物, 如环磷酰胺、顺铂、阿糖胞苷、阿雾素和长春新碱等,它们主要是用来破坏细胞的周期的, RNA、 DNA和蛋白质都是此类药物的耙向目标。近年来,AsA在对于白血病的治疗上取得了很 大的进展,但是,该药物和其他化疗药物,其本身都有自己的毒性,不管是一种化疗药物单 独使用还是几种化疗药物结合运用在临床治疗上,其在对癌症有明显疗效,杀伤杀死癌细胞 的同时,也会损害病人的正常细胞。化疗药物的副作用最普遍的就是对病人的骨髓产生极度 抑制,造成病人的极大痛苦,甚至引起死亡。到目前,除了早发现癌症病情并实行手术切除 肿瘤包块外,对于已经扩散的肿瘤和白血病仍没有特效药物去治疗[Cancer Biology癌生物 学,R.J.B金著,刘以训主译,科学出版社,2002],现有临床上用于癌症治疗的药物大都 是化合物,而短肽在癌症方面的应用尚无文献报道。 发明内容本发明目的是针对上述问题,提供一种抑制癌细胞生长的短肽及其应用。本发明的一种抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于组成短肽的氨基酸主序列a〉和编码短肽的核苷酸主序列〈2〉如下<1> J-Leu-B-Ser-O"Ala-Lys其中,J代表氨基酸Lys, Thr或lie; B代表贫基黢 Pro或Leu: 0代表氛基酸Ser或Ala;<2> AHA CTG CMT TCA NCT GCC AAA其中,H代表核苷酸T, A或C; M代表核苷酸T 或C; N代表核苷酸T或A。本发明的抑制癌细胞生长的短肽片段,其氨基酸主序列具有与该短肽氨i^襯主序列^70%的相同性,>90%的相似性,片段为把所述的7个氨基酸的序列从任意位置截取成3个 或4个或5个或6个氣基酸组成的与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的抑制癌细胞生长的短肽类似物具有与所述短肽相同的生物活性,所述类似物是 指在用所述短肽和另一种化合物融合或者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白 质而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白质。本发明的抑制癌鎺胞生长的短肽衍生物,其氨基酸序列具有与短肽氨基酸主序列>70% 的相同性,>90%的相似性,该衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氛基酸的一个或者几个 氨基酸的某个基团用另外的基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。本发明的抑制癌细胞生长的短肽变体,其贫基酸序列具有与短肽氨基酸主序列>70%的 相同性,>90%的相似性,该变体是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序 列或编码它的核苷酸序列,所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中,在序列中间的任一 位置缺失、插入或替换氨基酸或核苷酸,或在序列两端添加氨基酸或核苷黢。本发明的短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有 治疗非实体肿瘤人髄系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实体肿瘤痛细胞增殖的各类 癌症、抑制高血压、诊断与检測癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物的应用。本发明的短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物 或者检測试剂的应用。本发明的显審优点是本发明的短肽来自于运用生物信息学的方法把国际蛋白质数据库 的蛋白进行序列比对,筛选出来的一种新型的具有活性功能的生物活性肽,运用本发明的短 肽抑制或杀伤癌细胞的同时对正常细胞无显著伤害作用,解决了现有癌症药物在抑制或杀死 癌细胞的同时对人体正常细胞也有严重伤害的缺陷。
图1是本发明的短肽抑制肝癌细胞生长的试验照片。其中,(a)实验组(Test)为具有 显著抑制效果的显微镜照片;(b)对照组(Control)为未加该短肽的阴性对照试验显微镜照片。(Test), (b)对照组(Control),图3是运用透射电镜检验分析宫颈癌细胞超微结构的试验结果。 图4是短肽抑制高血压的试验结果。
具体实施方式
短肽的制备方法采用化学合成的方法,即本领域熟知的已经非常成熟的面相肽合成方法, 既可以采用Boc方法也可以采用Fmoc方法。具体做法就是将被保护的氨基酸逐个偶联到惰性 固相载体上去,然后利用强酸将肽链从载体上裂解下来,同时去除,保护。短肽的氨基酸主序列为氨基酸位置固定的主序列,其间隔的位置选择摊列相对应的贫基 酸,例如,在J位置的氨基酸有3种Lys, Thr或Ile,此3种氨基黢都可以单一地安放在<1>中J的位置上,不管选择其中任何一种,该短肽仍具^^其原有的生物活性,即抑制恶性肿癍 细胞增长,同样地B和0所代表的位置的氨基酸也有如此特性。核苷酸采用人工合成方法制备;编码短肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸(c) 与(a)或(b)中所述核苷酸有>75%相同性的核苷酸;该核苷酸基本由编码具有〈1〉気基醆序列短肽的核苷酸组成,本发明的核苷酸序列包括 <2>中的核苷酸序列,其形式为DNA形式包括cDNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的也可 以是双链的。编码短肽的编码区序列可以和〈2〉中的核苷酸相同,也可以不同,称为变异体, 其中变异体是指具有编码〈1〉中的氨基酸序列的编码,但可以和〈2〉中的核苷酸不同。变异体 可以是一个或几个核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列,但不会改变编码〈1〉中氨基酸序列 的短肽的活性功能。该短肽或核苷酸的"变体"是指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的贫基酸序列 或编码它的核苷酸序列。改变可包括氨基醆序列或核苷黢序列中豕基酸或核苷酸的缺失、插 入、添加或替换。变体可具有"保守性"改变,其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的 结构或化学性质,也可以有"非保守性"改变,其中替换的氨基酸不具有与原氨基酸相类似 的结构或化学性质。"缺失"是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或几个氣基酸或核苷酸的 缺失;"插入"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中间任意位置插入一个或几个氨基酸"添 加"是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸;"替换"是指用不 同的^基酸或核苷酸替换一个或几个氣基酸或核苷酸。该短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有抑制与 治疗包括但不限于下述疾病的药物的用途1. 非实体肿痛髄系白血病急性非淋巴细胞白血病(M1:未分化的原粒细胞白血病; M2:部分分化的原粒细胞白血病;M3:急性早幼粒细胞白血病M4:急性粒、单核 细胞白血病;M5:急性单核细胞白血病;M6:急性红血病或红白血病;M7:急性巨 核细胞白血病),急性淋巴细胞白血病,慢性粒细胞白血病,慢性粒-单细胞白血病, 慢性单核细胞白血病以及其他特殊类型的细胞恶性增殖类型的白血病。2. 实体肿瘤痛症肝癌、宫颈癌、乳臃癌、胃癌、肠癌症以及其他的恶性细胞增殖类型 的癌症疾病。3. 商血压疾病原发性高血压和激发性离血压。在计算短肽片段、短肽衍生物和短肽变体的氨基酸主序列具有与短肽氛基酸主序列的相 同性和相似性时,"相同性百分率"是指两种或多种贫基酸或核酸序列比较中序列相同的百 分率。根据Cluster法(Higging D.G. & Sharp P.M.,Gene 1988, 73:234-237 )通过检査 所有配对之间的距离将各组序列排列成簇,然后将各簇以成对或成组分配。两个贫基酸序列 如序列A和序列B之间的相同性百分率通过下式计算_序列A与序列B之间匹配的残基个数X 100%序列A的残基个数-序列A中间隔的残基个数-序列B中间隔的残基个数 "相似性"是指在确定两条氨基酸序列比对中相同氨基酸序列位置确定后,在相同贫基 酸之间排列的对应的氨基酸的保守性取代程度。根据生物信息技术领域周知的氨基酸得分PAM 250 scoring matrix (Dayhoff, M. Schwartz IL M. and Oicutt^ B. C. Atlas of Protein Structure 1978, 345-352: DeLisi, C. and Kanehi叫M. Mathematical Biosciences 1984.69: 77-85: Schwartz R. M. and Dayhoff, M. O. Atl助of Protein Structure, 1979. 353-358),当相对应的不同氛基酸比 较得分>0时,该两个氣基酸相似;当不同贫基酸得分<0时,两个贫基酸不相似。两个氨 基酸序列如序列C和序列D之间的相似性百分率通过下式计算(序列C与序列D之间匹配的残基个数+序列C与序列D之间相似的残基个数)X100*序列C的残基个数-序列C中间隔的残基个数-序列D中间隔的残基个数其中,序列C中间隔的残基个数和序列D中间隔的残基个数都不包括相似氨基酸的个数。下面结合实施例,进一步匍述本发明。这些实施举例仅用于说明本发明而不用于限制本 发明的范围.下辨所有列举实旌例所涉及的所有合成^Jft都具有本发明涉及的药物功能而不 限于所列举功能。实施例l抑制肝癌细胞的试验(合成本发明涉及的短肽Lys-Leu-Pro-Ser-Ser-Ala-Lys或 Lys-Leu-Pro-Ser-Ala-Ala-Lys)人肝痛细胞系Bel-7402细胞的培养是用含有10%新生牛血淸的RPMI 1640培养基来培 养,以5X107孔的细胞密度种植入96孔细胞板,24小时后,把本发B月涉及的短肽按照不同 的浓度加入到细胞培养板中,以等体积的PBS为对照组,24小时后用细胞计数板计数,给药 组和对照组比较,获得肝癌细胞的抑制率。如图1所示,本发明涉及的短肽和人肝癌细胞共 同作用24小时后的显微镜下拍摄的照片,给药组Test中的细胞可明显地观察到显著的抑制 效果,癌细胞在皿药物的作用下已经由贴壁细胞的"梭"形变成"圆"形,而对照组Control 中的细胞形状仍然为"梭"形。如可以诸如在元数据库30中被聚集为公共的动作元数据文件。因此, 当文件在企业中各内容存储器上改变状态时,可以跟踪这些文件。所 有变迁(例如企业上文件流中的节点)对于历史元数据是同等重要的。作为一个说明性示例,电子邮件服务器可以为每一个接收的和发 出的电子邮件消息扫描文件附件。对于每一个文件附件,变迁元数据 被记录,例如包括姓名、日期、附件大小。附件的密码散列 (cryptographic hash )、发送附件者的地址、发送附件的服务器的主 机地址以及接收附件者的地址也可以与动作元数据一起被存储。给定 该数据,可以通过从动作元数据中选择所有具有给定附件散列值的元 数据记录来确定每个接收给定附件的处理装置。可以通过以日期和/ 或时间对具有附件散列值的元数据记录排序而确定第一处理装置,并 因此确定发送文件附件的第一操作员。也可以例如通过在适当的动作元数据上执行一个或多个查询而 确定从给定发送者接收文件的处理装置的范围。例如,可以执行第一 查询以识别感兴趣的文件的第一代接收者。然后,可以实施单独查询 以为每个第一代接收者找到第二代和随后的接收者,等等。上述过程 可以被一般地描述为广度优先树遍历。但是,可以对聚集的动作元数 据实施交替的或附加的查询以及其他动作,诸如打印报告、浏览元数 据历史、将查询结果保存到盘,等等。如这里更详细说明的,动作元数据可以以任何合适的格式被存 储,诸如被存储为日志文件、关系数据库、数组、链接表或其他文件 结构。为了适当地存储、检索、附加或以其他方式操纵存储在相应动 作元数据中的信息,可以将标识符或其他唯一指示属性与相应的动作 元数据相关联。因此,可以在被分配的标识符上查询与感兴趣的给定 文件相关联的动作元数据的生存历史,以确定哪些系统接收感兴趣的 文件。如果需要更新、恶意软件修复、错误补丁或其他必需的修补动 作,则更新后的文件可以被传送到相应标识符所标识的该文件之前已 经被传送到的系统。作为另一个实例,可以实现提供授权审计追踪(licensing audit入待測样品的混合反应液生成的马尿酸的量与以分离用的洗脱缓冲液为对照的混合反应液生 成的马尿酸董的比较得出。通过对照与待拥样品的反应生成的马尿酸的量,用积分算出马尿酸的峰面积,利用下式计算抑制率(Rm) : Rm = [ ( A - B) / A ] X100其中A是空白的混合反应液的马尿酸的峰商或峰面积;B为加入待测样品的混合反应 液的马尿酸的峰离或峰面积。把本发明涉及的短肽制备成浓度为0.216呢/1^ (用PBS溶解)(如图4),取5 ML, 10 ML, 20 HL, 50叱,100 ML,用等体积的PBS作为对照组进行HPLC色谱分析,试验过程用于溶解酶和底 物的缓冲液为O. 1 M的硼酸和0.5 M的NaCl,用于HPLC洗脱的缓冲液为O. 05 M的翻酸和O. 3 M 的NaCl,底物三肽的浓度为25 mM,取ACE酶5 ML稀释IOO ML,取该稀释液5 ML和等体积的样 品混合,在37TC保温10 min后加入25 HL底物三肽,371C保温30 min,加入42.5礼1N的HC1 终止反应,离心上样IO ML。色谱条件为流量O. 25 mL/min,波长228咖。实施例5抑制肺痛细胞的试验(合成本发明涉及的短肽变体,即在序列的N端增加一个Gla氨基酸 Gla-Ile-L<eu-Pro-Ser~Ala-Ala-Lys)人肺癌细胞系A549细胞的培养是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养基来培养, 以5X107孔的细胞密度种植入96孔细胞板,24小时后,把本发明涉及的短肽按照不同的浓 度加入到细胞培养板中,以等体积的PBS为对照组,24、 48小时后分别用细胞计数板计数, 给药组和对照组比较,获得肺癌细胞的抑制率达76%。实施例6抑制肺癌细胞的试验(合成本发明涉及的短肽Ile-Leu-Pro-Ser-Ala-Ala-Lys)人肺癌细胞系A549细胞的培养是用含有10%新生牛血清的RPMI 1640培养基来培养, 以5X10V孔的细胞密度种植入96孔细胞板,24小时后,把本发明涉及的短肽按照不同的浓 度加入到细胞培养板中,以等体积的PBS为对照组,24、 48小时后分别用细胞计数板计数, 给药组和对照组比较,获得肺癌细胞的抑制率达76%。实施例7肿癯细胞凋亡咖A ladder试验(合成本发明涉及的短肽Ile-Leu-Pro-Ser-Ala-Ala-Lys)白血病HL-60细胞(5X105)和加上磷酸基团的短肽在含有10%新生牛血淸的RPMI 1640培 养基中,共同培养24小时,然后在50H1的缓冲体系中重悬,在每个样品中分别加入RNaseA和 蛋白酶K ,分别在37度的温度下孵育1个小时,在在50度的温度下孵育1个半小时。然后用 EB(ethidium br咖ide)染色,跑琼脂糖电泳,在荧光显微镜下观察,可容易观察到发生凋亡 的肿癯细胞。核苷酸或気基酸序列表<110>李昊<120>—种抑制癌细胞生长的短肽及其应用<160> 2<210> 1<211> 7<212> PRT<213>人工序列<220><223> J代表氨基酸Lys, Thr或Ile; B代表氨基酸Pro或Leu; 0代表氨基酸Ser或Ala。 <400> 1J-Leu-B-Ser-O-Ala-Lys<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220><223> h代表核苷酸T,A或C: m代表核苷酸T或C; n代表核苷酸T或A。 <400> 2aha ctg ant tea net gcc aaa
权利要求
1. 一种抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于组成短肽的氨基酸主序列<1>和编码短肽的核苷酸主序列<2>如下<1>J-Leu-B-Ser-O-Ala-Lys其中,J代表氨基酸Lys,Thr或Ile;B代表氨基酸Pro或Leu;O代表氨基酸Ser或A1a;<2>AHA CTG CMT TCA NCT GCC AAA其中,H代表核苷酸T,A或C;M代表核苷酸T或C;N代表核苷酸T或A。
2. 根据权利要求1所述的一种抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于所述短肽的氨基酸主 序列为氨基酸位置固定的主序列,其间隔的位置选择排列相对应的氨基酸。
3. —种如权利要求1所述的抑制癌细胞生长的短肽片段,其特征在于短肽片段的氨基酸 主序列具有与所述短肽氣基酸主序列>70%的相同性,>90%的相似性,所述片段为把所 述的7个氨基酸的序列从任意位置截取成3个或4个或5个或6个氨基酸组成的与所述 短肽具有同样生物活性的短肽。
4. —种如权利要求1所述的抑制痛细胞生长的短肽类似物,其特征在于所述短肽类似物 具有与所述短肽相同的生物活性,所述类似物是指在用所述短肽和另一种化合物融合或 者用所述短肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白质而形成具有生物活性的多肽序列 或蛋白质。
5. —种如权利要求1所述的抑制痛细胞生长的短肽衍生物,其特征在于所述短肽衍生物 的氨基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列>70%的相同性,>90%的相似性,所述衍 生物是指把所述短肽的贫基酸的主序列中的氨基酸的一个或者几个贫基酸的某个基团用 另外的基团取代后与所述短肽具有同样生物活性的短肽。
6. —种如权利要求1所述的抑制癌细胞生长的短肽变体,其特征在于^短肽变体的氨 基酸主序列具有与所述短肽氨基酸主序列>70%的相同性,>90%的相似性,所述变体是 指一种具有一个或几个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的核苷酸序列,所述改变包括在氨基酸序列或核苷酸序列中,在序列中间的任一位置缺失、插入或替换氛基 酸或核苷酸,或在序列两端添加氨基酸或核苷酸。
7. 根据权利要求l、 3、 4、 5或6所述的一种抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于所述编 码短肽的核苷酸包含下组中的一种(a) 编码具有所述氨基酸序列的短肽或其片段、类似物、衍生物或其变体的核苷酸;(b) 与(a)所述核苷酸互补的核苷酸;(c) 与(a)或(b)中所述核苷酸有^75缃同性的核苷酸;
8. 根据权利要求1所述的抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于所述的短肽采用化学合成 方法制备。
9. 根据权利要求1或6所述的抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于所迷核苷酸采用人工 合成方法制备。
10. 根据权利要求7所述的抑制癌细胞生长的短肽,其特征在于所述核苷酸采用人工合成 方法制备。
11. 一种如权利要求l、 2、 3、 4、 5或6所述的抑制癌细胞生长的短肽的应用,其特征在于所述短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗 非实体肿癯人髄系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实体肿癯癌细胞增殖的各类 癌症、抑制髙血压、诊断与检测癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物的应用。
12. —种如权利要求7所述的抑制癌细胞生长的短肽的应用,其特征在于所述核苷酸用于制备具有治疗非实体肿癯人雠系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实体肿瘤癌细 胞增殖的各类癌症、抑制离血压、诊断与检測癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物 的应用。
13. —种如权利要求8或10所述的抑制癌细胞生长的短肽的应用,其特征在于所述短肽或核苷酸用于制备具有治疗非实体肿癯人健系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实 体肿瘤癌细胞增殖的各类癌症、抑制高血压、诊断与检測癌症的发生以及癌症发生的恶 性程度药物的应用。
14. 一种如权利要求9所述的抑制痛细胞生长的短肽的应用,其特征在于所述核苷酸用于制备具有治疗非实体肿癯人據系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实体肿瘤癌细 胞增殖的各类癌症、抑制离血压、诊断与检测癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物 的应用。
15. —种如权利要求8或10所述的抑制癌细胞生长的短肽的应用,其特征在于所述短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检測试剂的应用。
全文摘要
本发明提供一种抑制癌细胞生长的短肽。该短肽的短肽片段、类似物、衍生物、变体的氨基酸主序列具有与该短肽氨基酸主序列≥70%的相同性,≥90%的相似性;短肽、核苷酸、短肽片段、短肽类似物、短肽衍生物和短肽变体用于制备具有治疗非实体肿瘤人髓系各类病变细胞增生引起的白血病、治疗人实体肿瘤癌细胞增殖的各类癌症、抑制高血压、诊断与检测癌症的发生以及癌症发生的恶性程度药物的应用,短肽或核苷酸用于制备具有作为蛋白酶抑制剂或者促进剂或者亲和试剂的药物或者检测试剂的应用。该技术能够解决现有癌症药物在抑制或杀死癌细胞的同时对人体正常细胞也有严重伤害的缺陷。
文档编号C07K7/00GK101225106SQ200710008449
公开日2008年7月23日 申请日期2007年1月15日 优先权日2007年1月15日
发明者昊 李 申请人:昊 李