专利名称：一种纯化重组人白细胞介素12的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质纯化方法，特别是指一种纯化重组人白细胞介素12的方法。
背景技术：
白细胞介素12(Interleukin-12，IL-12)，又称细胞毒性淋巴成熟因子(cytotoxiclymphocyte maturation factor，CLMF)或称自然杀伤细胞刺激因子(natural killer cell stimulation factor，NKSF)，是一种人体的重要细胞因子。它具有广泛的免疫效应；如促进自然杀伤细胞(naturekiller，NK)和T细胞的增值及杀伤作用，促使细胞因子的分泌，诱导抗原特异性辅助性T细胞(helper Tcell TH)向Th1分化。IL-12是一种具有多种免疫调节功能的细胞因子。它作为一种功能性桥梁连接于早期的非特异性先天性免疫与后期抗原特异性的适应性免疫之间，在感染、肿瘤、自体免疫性疫病中起重要作用。目前被广泛运用于治疗肝炎、肿瘤、结核和风湿等重大疾病的研究。
1989年，美国学者Kobayashi ML(J.Exp.Med.170；827)首次从经佛波醇脂(PDBU)刺激的EB病毒转化的人B淋巴母细胞株(RPMI8866)培养上清中纯化出人IL-12，后定名为IL-12。机体中主要分泌IL-12的是抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)，如单核巨噬细胞，树突状细胞，B细胞。IL-12是一种糖蛋白，由p40和p35两个亚单位经一对二硫键连接组成。其重链p40由306个氨基酸组成，分子量为34699Da，包含10个半胱氨基酸残基(3对分子内二硫键和1个分子间二硫键)和4个可能的N-端糖基化位点；轻链p35由197个氨基酸组成，分子量为22513Da，包含7个半胱氨基酸残基(2对分子内二硫键和1个分子间二硫键)和3个可能的N-端糖基化位点。(Ueli Gubler.et al.proc Natl.Acad.sci USA 884143，1991；ChristinaYoon.et al.the EMBO journal 193530，2000)。经最新质谱测定，rhIL-12分子量为60013Da，其中含有18个糖基。p40在IL-12与受体结合时起关键作用，当两者的cDNA共转染时，才能得到有生物学活性的IL-12。IL-12在原核细胞中难以表达出活性形式，因此，IL-12的真核表达，就成为体外获得IL-12从而对其深入理论和临床研究的唯一途径。目前已有多个专利涉及重组白细胞介素12的表达方法，仅中国专利就有CN01126923.5、CN00113786.7、CN01133631.5、CN03131567.4、CN02100866.3、CN01133658.7。
从细胞培养物中通过各种分离手段得到纯品的下游加工工程，是基因工程产品生产过程中非常重要的一环，目前国内外也有相关的专利涉及重组人白介素12的纯化方法。如美国专利US5853714利用四个柱层析和一次超滤工艺进行纯化，但分子筛层析所用的介质S-200 Sephacryl HighResolution孔径太大，分离效果不理想。又如美国专利US6830751提到的纯化方法包括三个柱层析，它是在专利US5853714的基础上做了进一步的改进；中国专利CN200410080518.7包括三个柱层析和一次超滤工艺，该专利从离子交换层析图谱中看出杂蛋白峰比较高，影响离子交换剂的使用寿命，并且所用的洗脱液与平衡液种类繁多，整个过程显得很繁琐，难于工业应用。因此，建立简便，快速，廉价而有效且稳定性很好的有工业化可行性的rhIL-12纯化工艺是当前急待解决的难题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简便、快速、成本低的纯化重组人白细胞介素12的方法。
本发明的技术方案是这样的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，依次包括下述步骤(1)rhIL-12细胞培养上清液过滤；(2)对步骤(1)所得rhIL-12收集液进行阳离子交换层析；(3)对步骤(2)所得rhIL-12收集液进行硫酸铵沉淀；(4)对步骤(3)所得rhIL-12收集液进行阴离子交换层析；(5)对步骤(4)所得rhIL-12收集液进行分子筛层析，在进行硫酸铵沉淀时所用硫酸铵的pH值远离rhIL-12的等电点。
本发明的技术方案也可以是这样的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，依次包括下述步骤(1)rhIL-12细胞培养上清液过滤；(2)对步骤(1)所得rhIL-12收集液进行阴离子交换层析；(3)对步骤(2)所得rhIL-12收集液进行硫酸铵沉淀；(4)对步骤(3)所得rhIL-12收集液进行阳离子交换层析；(5)对步骤(4)所得rhIL-12收集液进行分子筛层析，在进行硫酸铵沉淀时所用硫酸铵的pH值远离rhIL-12的等电点。
上述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法中，在步骤(4)之前还对步骤(3)所得到的rhIL-12收集液进行疏水层析，可进一步提高纯化效果。
上述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法中，在进行硫酸铵沉淀时，是在rhIL-12收集液中加入1～10倍体积的1～5M的(NH4)2SO4溶液，混匀，4℃静置10～60min，待其充分沉淀后，15000rpm离心60min，去沉淀，rhIL-12在上清液体中。
上述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法中，在第一次离子交换层析时进行了盐离子浓度阶段洗脱，使目标蛋白与杂蛋白在不同的洗脱峰中分开。在采取离子交换层析方法时，应先调节细胞培养上清的离子强度，控制离子强度在适当的范围之内，方法是在进行离子交换层析之前对细胞培养上清进行2～10倍体积的稀释。
本发明中所用的阳离子交换介质可选择的范围很广，例如SPSepharose HP、SP Sepharose FF、S Sepharose FF、SP Sepharose XL、SP Sepharose Big Beads、CM Sepharose FF、Capto MMC、Capto S、CM SephadexC50、SP Sephadex C50或Mono S等。进行阳离子交换层析的方法是先用平衡缓冲液10～35mM PBS，pH6.0～7.5洗脱到基线，然后采用阶段洗脱的方法，用含0～1M NaCl的10～35mM PBS，pH6.0～7.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
本发明所选用的阴离子交换介质可选择的范围也是很广的，例如Souce 30Q、Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Capto Q、Q Sepharose XL、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Souce Q、Mono Q或Q Sepharose Big Beads等。进行阴离子交换层析的方法是先用10～48mM Tris-Cl，pH7.5～8.5洗脱至基线，然后采用阶段洗脱的方法，用含0～1M NaCl的20～50mM Tris-Cl，pH7.5～8.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
本发明中所述的分子筛层析，可以去除分子大小差异明显的rhIL-12聚体等杂质，能进一步提高rhIL-12的纯度，常用的分子筛层析介质有Sephacryl S-100 High Resolution、Sephacry S200 HR、Sephadex G200、Sephadex G100、Superdex 75 prep grade、Bio-gel P100或Superose 12 preograde；所述分子筛层析所用洗脱剂为10～40mM PBS，pH6.5～8.0。
本发明的疏水层析介质可选用Phenyl Sepharose High Performance或者Phenyl Sepharose Fast Flow(High Sub)疏水层析洗脱收集的方法是先用平衡缓冲液20～50mM Tris-Cl，0.6～2.5M硫酸铵，pH7.0～8.5洗脱至基线，然后用阶段洗脱的方法洗脱，用含0.6～2.5M盐离子的20～50mMTris-Cl，pH7.0～8.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
由于rhIL-12培养上清中含有较多且比较复杂的杂蛋白，本发明的纯化方法其精妙之处是用价格低廉的硫酸铵采取简单的沉淀方法，除去大部分杂蛋白，使以后的纯化更简便有效，最终可以得到纯度在98.7％以上的rhIL-12蛋白，并且整个纯化工艺的回收率在54％以上；对所得到纯品经质谱MALDI-TOF分子量检测与理论相符合；其质谱肽图、N端氨基酸序列与理论值也完全符合；SDS-PAGE电泳、免疫印迹结果与标准品一致；经PBMCIFN-γ诱生法检测活性，比活在5.5×106IU/mg以上；经固相斑点杂交法检测外源性DNA残留量在10pg/ug以下；符合国家生物制品规范的要求，能用于动物实验和临床试验；本发明具有分离纯化成本低、操作简便、周期短、回收率和纯度高等优点，特别适合于工业化生产。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
图1为阳离子交换层析洗脱图；图2为硫酸铵沉淀效果的SDS-PAGE电泳图；图3为疏水层析洗脱图；图4为阴离子交换层析洗脱图；图5为分子筛层析洗脱图；图6为经纯化的rhIL-12的HPLC-SEC图；图7为经纯化的rhIL-12的MALDI-TOF分子量检测的质谱图；图8为经纯化的rhIL-12的SDS-PAGE电泳和免疫印迹图。
具体实施例方式
实施例1rhIL-12的纯化1、样品过滤细胞培养上清以0.45μm微孔滤膜过滤去除杂质，滤液以10mM PB，pH＝6.0进行4倍稀释备用。
2、阳离子柱层析对rhIL-12的纯化选用SP Sepharose High Performance阳离子交换柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液(20mM PB，pH6.0)平衡，待色谱柱平衡充分后将步骤1所得的稀释液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM PB，0.30M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM PB，0.60M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，并以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。整个层析过程的洗脱图如图1所示，图中A峰洗脱液I的洗脱峰；B峰洗脱液II的洗脱峰；C峰洗脱液III的洗脱峰。rhIL-12在B峰，其它峰是杂蛋白。
3、硫酸铵沉淀配置4M的(NH4)2SO4溶液，氨水调pH至8.0，在步骤2所得含rhIL-12的收集液中加入5倍体积的4M、pH8.0的(NH4)2SO4溶液，混匀，4℃静置60min，待其充分沉淀后，4℃、15000rpm离心30min，去沉淀，上清液备用。对沉淀效果进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，图中A为硫酸铵沉淀前，B为硫酸铵沉淀后，M为蛋白分子量标准。
4、疏水柱层析对rhIL-12的纯化选用Phenyl Sepharose High performance疏水层析柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液(20mM Tris-Cl，2M(NH4)2SO4，pH8.5)平衡，待色谱柱平衡充分后将步骤3所得含rhIL-12的上清液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM Tris-Cl，1M(NH4)2SO4，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.5M(NH4)2SO4，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后以0.2M NaOH、去离子水分别流洗2倍柱体积使柱再生，并以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。整个层析过程的洗脱图如图3所示，图中A峰洗脱液I的洗脱峰；B峰洗脱液II的洗脱峰；C峰洗脱液III的洗脱峰。rhIL-12在B峰，其它峰是杂蛋白。
5、阴离子柱层析对rhIL-12的纯化选用SOURCE 30Q阴离子交换柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液(20mMTris-Cl，pH8.5)平衡，待色谱柱平衡充分后将步骤4所得含rhIL-12的收集液用平衡缓冲液体积比1∶10稀释后上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mMTris-Cl，0.15M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.25M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后以0.2M NaOH流洗2倍柱体积，去离子水洗至pH＜8.0后，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。整个层析过程的洗脱图如图4所示，通过硫酸铵沉淀后，阴离子交换层析时杂蛋白的峰明显减少。图中A峰洗脱液I的洗脱峰；B峰洗脱液II的洗脱峰；C峰洗脱液III的洗脱峰。rhIL-12在B峰，其它峰是杂蛋白。
6、分子筛层析对rhIL-12的进一步纯化将步骤5所得含rhIL-12的收集液用Sephacryl S-100 HR柱进行进一步纯化。先用200mL 0.2M NaOH流洗凝胶柱，再用平衡缓冲液(120mM NaCl，20mM PB，pH7.0)柱平衡1.5～2个柱体积后上样，单次上样量为柱体积的3％～5％，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，分别收集色谱峰。其洗脱图如图5所示，图中A峰是rhIL-12聚体和大分子杂蛋白；B峰是rhIL-12峰，C峰是杂蛋白。
实施例2纯化rhIL-121、样品过滤细胞培养上清以0.45μm微孔滤膜过滤去除杂质，滤液以10mMTris-Cl，pH8.0进行4倍稀释备用。
2、阴离子柱层析对rhIL-12的纯化选用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用平衡缓冲液(20mMTris-Cl，pH8.0)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤1所得含rhIL-12的稀释液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.28M NaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；收集含rhIL-12的组分。色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
3、硫酸铵沉淀沉淀分离方法与实施例1的步骤3相同。
4、疏水柱层析对rhIL-12的纯化选用Phenyl Sepharose Fast Flow(High Sub)疏水层析柱，用平衡缓冲液(20mM Tris-Cl，2M (NH4)2SO4，pH8.5)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤3所得含rhIL-12的上清液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20M Tris-Cl，1M (NH4)2SO4，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.5M(NH4)2SO4，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
5、阳离子柱层析对rhIL-12的纯化选用CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用平衡缓冲液(20mM PB，pH6.0)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤4所得含rhIL-12的收集液用平衡缓冲液10倍体积稀释后上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM PB，0.30M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM PB，0.65M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.O)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
6、分子筛(尺寸排阻层析)对rhIL-12的进一步纯化将步骤5所得含rhIL-12的收集液用Superdex 75 prep grade柱进行进一步纯化。先用200mL 0.2M NaOH流洗凝胶柱，再用平衡缓冲液(120mMNaCl，20mM PB，pH7.4)柱平衡1.5～2个柱体积后上样，单次上样量为柱体积的3％～5％，上样结束后继续以缓冲体系进行流洗，收集含rhIL-12的色谱峰。
实施例3纯化rhIL-12
1、样品过滤细胞培养上清以0.45μm微孔滤膜过滤去除杂质，滤液以10mM PB，pH＝6.5进行4倍稀释备用。
2、阳离子柱层析对rhIL-12的纯化选用Capto S阳离子交换柱，用平衡缓冲液(20mM PB，pH6.5)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤1所得的稀释液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM PB，0.40M NaCl，pH6.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM PB，0.70MNaCl，pH6.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，收集含rhIL-12的组分。色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
3、硫酸铵沉淀沉淀分离方法与实施例1的步骤3相同。
4、阴离子柱层析对rhIL-12的纯化选用Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用平衡缓冲液(20mMTris-Cl，pH8.0)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤3所得含rhIL-12的上清液用平衡缓冲液10倍体积稀释后上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.30MNaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；收集含rhIL-12的组分。色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
5、分子筛(尺寸排阻层析)对rhIL-12的进一步纯化将步骤4所得含rhIL-12的收集液用Sephacryl S-100 HR柱进行进一步纯化，纯化方法与实施例1的步骤6相同。
实施例4纯化rhIL-12
1、样品过滤处理方法与实施例2的步骤1相同。
2、阴离子柱层析对rhIL-12的纯化选用Capto Q阴离子交换柱，用2～3个柱体积平衡缓冲液(20mMTris-Cl，pH8.5)平衡，待色谱柱平衡充分后将步骤1所得含rhIL-12的稀释液上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM Tris-Cl，0.25M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.5)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
3、硫酸铵分级分离沉淀分离方法与实施例1的步骤3相同。
4、阳离子柱层析对rhIL-12的纯化选用CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱，用平衡缓冲液(20mM PB，pH6.0)平衡2～3个柱体积，待色谱柱平衡充分后将步骤3所得含rhIL-12的上清液用平衡缓冲液10倍体积稀释后上样，上样结束后用平衡缓冲液流洗色谱柱，直至A280达到基线或稳定至基线附近；用洗脱液I(20mM PB，0.20M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰I，并充分流洗色谱柱至基线平稳；继续用洗脱液II(20mM PB，0.55M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰II，并充分流洗色谱柱至基线平稳；最后用洗脱液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.0)对色谱柱进行流洗，收集洗脱峰III，并充分流洗色谱柱至基线平稳；色谱柱使用完毕后分别以0.2M NaOH、去离子水流洗2倍柱体积使柱再生，以20％乙醇浸泡色谱柱长期保存。
5、分子筛(尺寸排阻层析)对rhIL-12的进一步纯化将步骤4所得含rhIL-12的收集液用Superdex 75 prep grade柱进行进一步纯化，纯化方法与实施例2的步骤6相同。
实施例5HPLC-SEC检测纯化的rhIL-12纯度1.仪器选用Waters HPLC系统，色谱柱(Ultrahydrogel 500，7.8×300mm)。
2.流动相200mM NaCl，25mM Na2HPO4(pH＝9.4)。
3.色谱条件流速0.6～1mL/min，上样量100μL，柱温20～25℃，紫外检测波长280nm，样品池温度4℃，环境温度2～25℃。
4.测定用流动相以0.8mL/min流速平衡Waters HPLC系统至基线平衡。取待测样品100μL上柱，用流动相以0.6mL/min流速洗脱，同时在紫外检测器280nm波长下记录色谱图及有关数据，记录数据时间为40min，用面积归一法计算纯度。
5.结果实施例1所纯化的rhIL-12的纯度达到98.8％。(其色谱图如图6示)；实施例2所纯化的rhIL-12的纯度达到98.4％，实施例3所纯化的rhIL-12的纯度达到98.0％；实施例4所纯化的rhIL-12的纯度达到97.5％。
实施例6rhIL-12生物活性检测(PBMC IFN-γ诱生法)1.NIBSC标准品(WHO国际标准品)和纯化rhIL-12的稀释标准品和经准确定量的纯化rhIL-12用RMPI 1640基础培养液稀释成以下浓度8ng/mL、4ng/mL、2ng/ml、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL待用。
2.分离PBMC细胞抽取静脉血5mL，肝素抗凝，Hank液等量混匀，取5mlFicoll淋巴细胞分离液置于15mL刻度离心管中，将稀释的血液沿管壁缓缓叠加于分离液上，形成清晰的界面，置水平离心机中，2000r/min离心20min，用滴管直接吸出单个核细胞层置于另一刻度离心管中，加入4倍量以上的Hank液，充分混匀，1000r/min离心10min，倾去上清液，再用Hank液洗两次，用含10％灭活胎牛血清的RMPI 1640基础培养液配制细胞悬液，计数细胞，同时用台盼兰检测细胞活力，要求细胞活力＞95％以上，每孔加入100uL细胞悬液及相应稀释浓度标准品和纯化rhIL-12至96孔培养板，空白对照组加RMPI 1640基础培养液，阳性对照组加抗人CD3，终浓度(0.2ug/mL)，每个稀释度做两个复孔。
3.37℃，5％CO2，培养48小时。
4.收集细胞培养上清液每孔50ul，离心处理后ELISA(按BD公司试剂盒说明书操作)测定IFN-γ含量。
5.结果计算用MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司)450nm测定各孔吸光度，Ascent software version2.6软件曲线定量计算IFN-γ含量。用标准品各稀释度体外刺激PBMCs IFN-γ产生量与纯化rhIL-12对应稀释度IFN-γ产生量对比。(t检验P＞0.05，两样品间无显著性差异)。(或以IFN-γ含量对样品浓度作图，计算各实验样品的ED50(即IFN-γ含量为最大浓度的一半时的样品浓度)，按公式待测样品效价＝标准品效价×(标准品的ED50/实验样品的ED50)。
6.结果实施例1所纯化的rhIL-12的比活为8.1×106IU/mg；实施例2所纯化的rhIL-12的比活为7.5×106IU/mg；实施例3所纯化的rhIL-12的比活为6.4×106IU/mg；实施例4所纯化的rhIL-12的比活为7.8×106IU/mg。
对所纯化的rhIL-12纯品，经质谱MALDI-TOF分子量检测，结果如图7所示，与理论相符合。
对所纯化的rhIL-12纯品，经SDS-PAGE电泳、免疫印迹实验，结果见图8所示，与标准品一致。
权利要求
1.一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是依次包括下述步骤(1)rhIL-12细胞培养上清液过滤；(2)对步骤(1)所得rhIL-12收集液进行阳离子交换层析；(3)对步骤(2)所得rhIL-12收集液进行硫酸铵沉淀；(4)对步骤(3)所得rhIL-12收集液进行阴离子交换层析；(5)对步骤(4)所得rhIL-12收集液进行分子筛层析，在进行硫酸铵沉淀时所用硫酸铵的pH值远离rhIL-12的等电点。
2.一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是依次包括下述步骤(1)rhIL-12细胞培养上清液过滤；(2)对步骤(1)所得rhIL-12收集液进行阴离子交换层析；(3)对步骤(2)所得rhIL-12收集液进行硫酸铵沉淀；(4)对步骤(3)所得rhIL-12收集液进行阳离子交换层析；(5)对步骤(4)所得rhIL-12收集液进行分子筛层析，在进行硫酸铵沉淀时所用硫酸铵的pH值远离rhIL-12的等电点。
3.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是步骤(4)之前还对步骤(3)所得到的rhIL-12收集液进行疏水层析。
4.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是步骤(2)中对rhIL-12收集液进行2～10倍体积的稀释。
5.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是所述的硫酸铵沉淀是在rhIL-12收集液中加入1～10倍体积的1～5M的(NH4)2SO4溶液，混匀，4℃静置10～60min，待其充分沉淀后，15000rpm离心60min，去沉淀，rhIL-12在上清液体中。
6.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是所述的阳离子交换层析的交换介质为SP Sepharose HP、SP Sepharose FF、S Sepharose FF、SPSepharose XL、SP Sepharose Big Beads、CM Sepharose FF、Capto MMC、Capto S、CM Sephadex C50、SP Sephadex C50或Mono S，阳离子交换层析的方法是先用平衡缓冲液10～35mM PBS，pH6.0～7.5洗脱到基线，然后采用阶段洗脱的方法，用含0～1M NaCl的10～35mM PBS，pH6.0～7.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
7.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是所述的阴离子层析的交换介质为Souce 30Q、Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Capto Q、QSepharose XL、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Souce Q、Mono Q或Q Sepharose Big Beads，阴离子交换层析的方法是先用10～48mM Tris-Cl，pH7.5～8.5洗脱至基线，然后采用阶段洗脱的方法，用含0～1M NaCl的20～50mM Tris-Cl，pH7.5～8.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
8.根据权利要求1或2所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是所述的分子筛层析介质为SephacrylS-100 High Resolution、Sephacry S200 HR、Sephadex G200、Sephadex G100、Superdex 75 prep grade、Bio-gel P100或Superose 12 preo grade，分子筛层析所用洗脱剂为10～40mM PBS，pH 6.5～8.0。
9.根据权利要求3所述的一种纯化重组人白细胞介素12的方法，其特征是所述的疏水层析介质用henyl SepharoseHigh Performance或者Phenyl Sepharose Fast Flow(HighSub)，疏水层析洗脱收集的方法是先用平衡缓冲液20～50mM Tris-Cl，0.6～2.5M硫酸铵，pH7.0～8.5，洗脱至基线，然后用阶段洗脱的方法洗脱，用含0.6～2.5M盐离子的20～50mM Tris-Cl，pH7.0～8.5进行阶段洗脱，收集目的蛋白峰。
全文摘要
本发明公开了一种纯化重组人白细胞介素12的方法，属蛋白质纯化技术领域，技术要点是将rhIL－12的细胞培养上清液经过滤、阳离子或阴离子交换层析、硫酸铵沉淀、阴离子或阳离子交换层析和分子筛层析，进行硫酸铵沉淀时pH远离rhIL－12的等电点，本发明的方法中利用硫酸铵沉淀去除大部分的杂蛋白，使以后的分离更简便有效；本发明具有分离纯化成本低、操作简便、周期短、回收率和纯度高等优点，特别适合于工业化生产。
文档编号C07K14/435GK101033254SQ20071002686
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者蒲勤, 李毅, 赵峰, 杨愈丰, 吴思纹, 叶倩君, 夏书奇, 曾振飞, 王翠玲, 郭凯旋, 粟宽源, 曾水娣, 于源, 邱向南, 张宜俊 申请人:广州市恺泰生物科技有限公司