专利名称：：一种从生物组织样品中分离rna的试剂及其从生物组织样品中分离提取rna的方法
技术领域：
：本发明涉及一种从生物组织样品中分离RNA的试剂。本发明还涉及用该试剂从生物组织样品中分离提取RNA的方法。
背景技术：
：核酸是一种大分子遗传物质，包括DNA和RNA。近年来，在基因研究的相关技术中，己越来越多的以RNA为研究对象，细胞中RNA的提取和纯化是分子生物学技术中的重要步骤，对人类的基因组学和蛋白组学的研究有重要意义，只有纯度高、完整性好的总RNA才可用于Northern杂交、mRNA纯化、构建cDNA文库、通过RTP-CR分离基因以及蛋白质体外翻译等进一步实验操作。因此保证RNA的纯度和完整是实验的关键。由于RNA极易被广泛存在的RNA酶降解，在实验中如何防止RNA酶的污染和抑制RNA酶的活性是需要解决的重点问题。有关动植物组织中RNA提取方法的报道已很多。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径其一是提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来。其二是直接在酸性条件下抽提。另外硫氰酸胍/热酚法(guanidini咖/hotphenolmethod)(Feramiscoetal.1992)，氯化胍法guanidiniumchloride(C0X1968)，氯化锂/硫氰酸胍法，氯化铯/异硫氰酸胍法等都可以有效的分离提取RNA。它是先将组织或细胞用含有胍类等强烈蛋白质变性剂的变性液处理后，再根据蛋白质、DNA及RNA的分子量不同，在氯化铯、氯化锂等溶液中进行梯度离心，沉淀得到RNA。但是这些方法操作复杂，操作时间长达24小时以上，而且多次沉淀也会导致RNA的产量大大减少。并可能造成小分子量RNA的丢失。目前普遍采用的是根据DNA和RNA在酸性酚溶液中的溶解度不同，组织或细胞用变性液处理后，再用酸性酚和氯仿抽提的酸性硫氰酸胍—酚一氯仿一步法(又称为"一步法"或acid-guanidine-phenol-chloroformAGPC法)，该方法的优点是有强烈的蛋白变性剂，它能强烈抑制材料及提取液中的Rnase的活性。收获的非降解RNA产量大、纯度高,不需超速离心或多步酚一氯仿抽提，抽提时间縮短至4小时，得到广泛的应用，并有成熟的产品(Trizol等)供应。但在提取组织，尤其是从富含蛋白质组织中抽提RNA时，往往蛋白质抽提不净，影响RNA质量，而且Trizol试剂价格昂贵。改进的SDS-Phenol法，经比较证实该方法比AGPC法优越，RNA纯度略高于AGPC法，且该法操作简单，全程只需要两小时，无需超速离心和多次酚-氯仿抽提。但是同样无法较好的解决杂质多，不溶物多，酚类物质去除不彻底的问题，氧化的多酚能与RNA稳定结合，不利于下游技术的使用。中国专利申请971083665公开了一种总RNA提取试剂以及提取总RNA的方法。该提取试剂以异氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料，以十二垸基硫酸钠，十二烷基肌酸钠两种为去垢剂，柠檬酸三钠、乙酸钠、冰醋提供盐分和调节pH值，以消毒双蒸水和苯酚作为溶剂来制备的，其中抑制剂的重量百分浓度为16—65%，去垢剂浓度为0。2—0。7%,消毒双蒸水10—35%，苯酚为12—46%，pH调节剂0。005-0。02%。该专利申请中还公开了使用其提供的RNA提取设计提取总RNA的方法。该方法由下列步骤组成1)先用该提取试剂预处理样品；2)用萃取剂氯仿和异戊醇萃取；3)离心分离后，取上层水相加入异丙醇在萃取；4)离心分离后获得白色沉淀即是总RNA。5)还可以用酒精进行洗涤并干燥。
发明内容本发明的目的是提供一种提取效果好，成本低的从生物组织样品中分离RNA的试剂，同时，提供一种改进的从生物组织样品中分离提取RNA的方法。本发明提供的从生物组织样品中分离RNA的试剂，包括RNA抑制剂，去垢剂，pH调节剂，还加入了聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为1—3%(m/V);上述溶液中再加入等体积的酸性水饱和苯酚和1/5体积的2M乙酸钠混匀；pH为3.2—3.8。本发明中聚乙烯吡咯垸酮(PVP)可以有效地去除多糖、多酚，减轻了这些物质对下游RT-PCR反应的抑制作用。根据本发明的实施例，该分离试剂中RNA抑制剂采用异硫氰酸胍，加入加入苯酚和乙酸钠之前的浓度为4M。根据本发明的实施例，加入苯酚和乙酸钠之前的去垢剂十二烷基肌酸钠和十二烷基硫酸钠浓度分别为2%(m/V)和0.1%(m/V)。十二垸基硫酸钠和十二烷基肌酸钠的比例在20比1时裂解效果最佳。苯酚和酸性胍溶液体积比为等比配制，极大的减少了由于暴露在空气和曰光下所导致的苯酚氧化和降解现象。通常苯酚必须储存在一20度以下或者加入8-羟基喹啉才能保持稳定，这使得苯酚似乎不能用于RNA提取过程，而该新型溶剂储存在4度可长达一年以上，室温下至少一个月。另一个特征在于该发明是一种新型试剂，在总RNA抽提试剂中添加多酚去除剂聚乙烯吡咯垸酮、缓冲体系PH维持在3.2-3.8之间以及联合使用十二垸基肌酸钠和十二烷基硫酸钠等裂解剂。而酚类化合物则是通过提取的初始阶段防止其被氧化，再通过离心与RNA而分离。在该方法的操作过程中，组织样品被包含4M胍的苯酚溶液的变性剂匀浆，4M的浓度使核蛋白复合体充分变性，实现核蛋白与核酸分离。经变性溶液破膜后，RNA酶释放，此时异硫氰酸胍即可有效抑制RNA酶作用；随后，苯酚使核蛋白复合体充分变性。该溶剂处理样品前加入的抗氧化剂e-巯基乙醇可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。而螯合剂聚乙烯吡咯垸酮(PVP)中的CO—N二基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。该方法优势在于使用一步法就可以获取高产量和高质量的RNA。从生物组织样品中分离RNA试剂的提取RNA的方法，包括如下步骤(1)用分离RNA试剂预处理动物或植物组织；(2)加入萃取剂萃取；(3)水相分离后再萃取；(4)分离后得到RNA沉淀；(5)清洗后备用。其中在上述第(1)步中，按每50ml变性液加入14.4mol/L的P-巯基乙醇0.36ml的剂量加入；第(3)步中采用异丙醇和高盐的混合液萃取的。进一步，所述的高盐为0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl。优选所述异丙醇和高盐为等比例混合的。如前所述，该方法包括通过加入氯仿水溶性有机溶剂进一步分离匀浆液成两相(水相和有机相)。在PH为3.2—3.8和有机溶剂浓度为10X的条件下分离RNA是最适合的，酸性溶液在破膜的同时，有利于RNA的稳定，并有助于DNA溶于有机相内。pH值和有机溶剂的浓度高于或者低于这些水平都将显著降低RNA分离效果从而必须反复多次分离。同时在用PVP去除多酚时pH值也是一个重要的影响因素,在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低。一旦加入有机溶剂，在4度条件下离心分层，形成水相和有机相的RNA双相混合物，也就是说RNA被浓縮在水相，而DNA和蛋白质被浓縮在有机相或中间层。该方法包括进一步的分离前一步骤形成的水相。首先加入由高盐和异丙醇，按l:1的体积比配制而成的混合液沉淀RNA，能有效地析出RNA，而多糖和蛋白质仍以可溶的形式留在溶液中。避免了LiCl沉淀所需时间长(3h以上)的缺点。因为RNA不溶于有机溶剂，然后再先后使用75%乙醇和无水乙醇，充分的振荡洗涤两次，离心后弃上清即可回收高质量的RNA。本发明提供的RNA分离试剂与进口TRIzolRNA提取试剂作对照，两种产品提取得的总RNA电泳带型观察一致，产率以及0D260/0D280值也无明显差异(见附图l)，下游RT-PCR反应都可以获得满意结果。由此可见，本发明提供的总RNA分离试剂以及相应的提取组织总RNA的方法，可以达到与进口试剂一致满意的效果，同时大大降低了生产成本。在对于富含蛋白质样品的处理中，显示更好的性能。本发明提供的分离RNA试剂能稳定保存，温度为4'C下有效期长达一年，室温下稳定3个月。具体实施方式实施例l将250g异硫氰酸胍、0.75M(PH7.0)柠檬酸钠17.6ml和25mll0%(m/V)十二烷基肌酸钠、1.25mll0%(m/V)十二烷基硫酸钠、6.54gPVP溶293ml水中。65'C条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。再加入等体积的酸性水饱和苯酚(PH为3.5)室温条件下保存，该试剂在温度为4'C条件下有效期长达一年，室温下稳定3个月。在每次临用前按每50ml变性液加入14.4mol/L的e-巯基乙醇0.36ml的剂量加入。实施例2(1)取新鲜Balb/c小鼠肾脏组织0.1置于组织匀浆器中，加入预冷的本发明提供的RNA分离试剂lml于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆1530s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mlEp管中，于室温下静置5min。(2)加入200ul氯仿异戊醇=49:1，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，其中间蛋白质层稳定，易于分离。(3)4°C，12000g/min离心15min，RNA分布于澄清水相中，中层为蛋白质，下层为其他。(4)小心将上层无色水相转移到另一EP管中，加入1000u1异丙醇和高盐的等比混合液，室温静置10min。4。C，12000g/min离心10min。(5)弃上清液，用lral75免乙醇洗涤RNA沉淀物，4。C，12000g/min离心5min。(6)进一步用lml无水乙醇洗涤RNA沉淀物，4°C，12000g/min离心5min。(7)弃上清液，室温干燥15min。(8)向干燥过的沉淀物中加入200ul含RNA保护剂DEPC处理水溶解沉淀物，于-20。C保存备用，电泳检测。实施例3(1)取新鲜Balb/c小鼠肾脏组织0.lg置于组织匀浆器中，加入预冷的TRIpure试剂lml0.5ml于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆1530s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mlEp管中，于室温下静置5min。(2)加入200ul氯仿异戊醇=49:1，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，其中间蛋白质层稳定，易于分离。(3)4°C，12000g/min离心15min，RNA分布于水相中，中层为蛋白质，下层为其他。(4)小心将上层无色水相转移到另一EP管中，加入1000ml异丙醇，室温静置10min。4。C，12000g/min离心10min。(5)用lml75")6乙醇洗涤RNA沉淀物,4。C，12000g/min离心5min。(6)弃上清液，进一步用lml无水乙醇洗涤RNA沉淀物，4'C，12000g/min离心5min(7)弃上清液，室温干燥15min.(8)向干燥过的沉淀物中加入200n1含RNA保护剂DEPC处理水溶解沉淀物，于-2(TC保存备用。电泳检测。与实施例2对比见图2。其中a是实施例2的检测结果，b是实施例3的检测结果。从具体实施例2、3对照结果来看，1000ul异丙醇与高盐等比溶液洗涤沉淀效果明显优于1000ul异丙醇沉淀，经过洗涤，条带更清晰。实施例4(1)取新鲜银杏叶组织0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的Tripure试剂lml于玻璃匀浆器中，在冰浴中迅速匀浆1530s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.5mlEp管中，于室温下静置5min。(2)加入200iU氯仿异戊醇=49:1，剧烈振摇15s混匀后，室温静置3min，其中间蛋白质层稳定，易于分离。(3)4°C，12000g/min离心15min，RNA分布于水相中。(4)将上层无色水相转移到另一EP管中，加入1000u1异丙醇和高盐的混合液，室温静置10min。4。C，12000g/min离心10min。(5)弃上清液，用lml75呢乙醇洗涤RNA沉淀物，4。C，12000g/min离心5min。(6)进一步用lml无水乙醇洗涤RNA沉淀物，4°C，12000g/min离心5min(7)弃上清液，室温干燥15min.(8)向干燥过的沉淀物中加入200p1含RNA保护剂DEPC处理水溶解沉淀物，于-2(TC保存备用，电泳检测。与实施例2对比结果见图3。其中a是实施例2的检测结果，b是实施例4的检测结果。从具体实施例2、4对照结果来看，用本发明提供的RNA提取试剂提取动物组织和植物组织差异不大，植物组织提取效果略好于动物提取效果。实施例5用本发明提供的试剂与现有的进口TRIzolRNA提取试剂处理相同样本，进行对照。结果见图l，其中a是本发明试剂的提取结果，b是对比的TRIzol试剂的提取结果。检测值见下表。吸光度A230_A260A280_A260/280A260/A230P值本发明0.195±0.010.134±0.061.488±0.020.090±0.030.687±0.06P<0.01TRIzol0.142±0.050.286±0.050.148士0.011.932±0.052.014±0.01P<0.01对所提取的12只Balb/c小鼠肾脏组织总RNA按照标准的逆转录过程进行Beta-actin内参照扩增，可以扩增出预期片段的记为'阳性'，不可以扩增出预期片段的记为'阴性'。扩增结果见下表。小鼠肾脏和大鼠骨骼肌总RNA的Beta-actin内参照扩增结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>说明超纯总RNA快速提取系统TRIpure与进口TRIzolRNA提取试剂作对照，两种产品提取得的总RNA电泳带型观察一致，产率以及0D260/0D280值也无明显差异，下游RT-PCR反应都可以获得满意结果。由此可见，国产分析纯试剂配制的本发明提供的试剂提取组织总RNA可以达到与进口试剂基本一致满意的效果，同时大大降低了生产成本。权利要求1、一种从生物组织样品中分离RNA的试剂，包括RNA抑制剂，去垢剂，pH调节剂，其特征在于还加入了聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为1—3％(m/V)；上述溶液中再加入等体积的酸性水饱和苯酚和1/5体积的2M乙酸钠混匀；pH为3.2—3.8。2、根据权利要求1所述的分离RNA的试剂，其特征在于RNA抑制剂为异硫氰酸胍，加入苯酚和乙酸钠之前的浓度为4M。3、根据权利要求1所述的分离RNA的试剂，其特征在于加入苯酚和乙酸钠之前的去坭剂十二烷基肌酸钠和十二烷基硫酸钠浓度分别为2%(m/V)和0.1%(m/V)。4、根据权利要求1至3之一所述的分离RNA的试剂，其特征在于加入苯酚和乙酸钠之前的聚乙烯吡咯烷酮浓度为2%。5、根据权利要求1至3之一所述的分离RNA的试剂，其特征在于pH调节剂为柠檬酸三钠、乙酸钠、冰醋酸，其浓度分别为0.75M、2M，适量冰醋酸。6、一种用权利要求1至5之一所述的从生物组织样品中分离RNA试剂的提取RNA的方法，包括如下步骤(1)用分离RNA试剂预处理动物或植物组织；(2)加入萃取剂萃取；(3)水相分离后再萃取；(4)分离后得到RNA沉淀；(5)清洗后备用；其特征在于在上述第(1)步中，按每50ml变性液加入14.4mol/L的e-巯基乙醇0.36ml的剂量加入；第(3)步中采用异丙醇和高盐的混合液萃取的。7、根据权利要求6所述的提取RNA的方法，其特征在于所述的高盐为0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl。8、根据权利要求7所述的提取RNA的方法，其特征在于所述异丙醇和高盐为等比例混合的。全文摘要本发明涉及一种从生物组织样品中分离RNA的试剂。本发明还涉及用该试剂从生物组织样品中分离提取RNA的方法。本发明提供的从生物组织样品中分离RNA的试剂，包括RNA抑制剂，去垢剂，pH调节剂，还加入了聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为1-3％(m/V)；上述溶液中再加入等体积的酸性水饱和苯酚和1/5体积的2M乙酸钠混匀；pH为3.2-3.8。本发明提供的分离RNA试剂能稳定保存，可以达到与进口试剂一致满意的效果，同时大大降低了生产成本。在对于富含蛋白质样品的处理中，显示更好的性能。文档编号C07H1/00GK101381764SQ20071003569公开日2009年3月11日申请日期2007年9月7日优先权日2007年9月7日发明者易银沙申请人:长沙赢润生物技术有限公司