一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体及其应用的制作方法

专利名称：一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种提高植物耐铝毒能力的植物 表达载体的构件与应用。
技术背景我国南方的土壤大多为红壤，营养贫瘠，呈酸性，使土壤中的磷和施放到 土壤中的磷肥呈不可溶状态，因而植物难以吸收利用，发育受阻，生长量低下。 在酸性土壤里，磷与铝和铁形成溶解度很低的化合物。此外在酸性土壤中，铝 变成了可溶性的，很容易进入植物的根部，抑制根部的生长和发育，使根系不 能吸收水分和摄取营养物，从而导致了作物产量降低，因此在酸性土壤中生长的植物常受铝的毒害。酸性土是典型的低产土壤，其中铝(A1)毒被认为是影响 作物生长的主要限制因子。微摩尔水平的铝离子即可对植物产生毒害，而酸性 土壤溶液中Al"的浓度约为10 100 "mol/L—1 (MaJF. 2000. Role of organic acid in detoxification of aluminum in higher plants.Ce_/_Z尸力7"5"iaZ. 41:383-390)。铝毒害的最初反应是抑制铝敏感基因型植物的根系生长，进而抑 制植物对水分、养分的吸收，影响植物的正常生长发育(DelhaizeE， Ryan PR. 1995. Aluminum toxicity and tolerance in plants, 尸7朋t 尸/"5^'o丄 107:315-332; Foy CD. 1983. The pysiology of plant adaptation to mineal stress. To附分We/7 es. 57:355-392)。在酸性土壤中铝离子对植物危害的 分子机制是多种多样的。 一方面，过多的游离铝和交换性铝离子可以通过抑制 根尖生长发育，造成植株对其它离子及水分的吸收障碍，从而影响植物的生长 发育。另一方面，铝也可以与细胞质中以及膜上蛋白的磷酸基、羟基等极性基 团结合，影响膜的结构和功能。农业生产上常用的措施是在酸性土壤中撒石灰以提高土壤的pH值，然而 在发展中国家的农民经常是负不起施用石灰的费用，另外，播撒石灰不能治理 下层土壤的酸性。随着生物技术的快速发展，人们通过基因工程手段来改造现 有植物品种使之具有耐铝性已成为可能。通过在植物中过量或异位表达有机酸 合成酶基因，如苹果酸脱氢酶与柠檬酸合成酶基因，可以提高植物体内的有机 酸含量，而这些有机酸通过根系分泌到土壤中，熬合土壤中的铝离子，就能解 除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。这样不仅可以提高转基因植物对铝毒 的耐受能力，而且还有利于植物对磷等其它必需营养元素的吸收和利用。研究结果表明在酸性土壤上生长良好的植物对铝毒有强的耐受性，植物对 铝毒的抗性在许多情况下与植物分泌有机酸的能力密切相关，在植物体内，有机酸也能够降低铝的毒害作用。有机酸可在质膜的外部螯和铝离子，因此能够 阻止植物对于铝的吸收。已知能有效去除铝毒的有机酸是柠檬酸，草酸，酒石 酸，苹果酸，丙二酸，琥珀酸和醋酸。苹果酸是植物代谢中的一个关键产物， 参与代谢反应中的许多步骤，包括光合作用、气孔和小叶运动、营养吸收、呼吸作用、氮素同化作用和脂肪酸氧化等过程(王忠，王三根，李合声等.2002. 植物生理学(第一版)北京中国农业出版社157-164)。在缺磷的酸性或碱性土 壤中，许多植物会在根部分泌出大量的柠檬酸、草酸或者苹果酸等有机酸，以 螯合土壤中铝、铁等重金属离子，缓解铝毒危害并释放出磷酸根离子供植物吸 收利用。苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase, MDH)是真核生物和原核生物三羧酸 循环(TCA)的关键酶之一。它在柠檬酸循环中催化苹果酸形成草酰乙酸，也可催 化草酸乙酸形成苹果酸。在植物体内苹果酸的合成是首先通过磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶(PEPC)的作用将磷酸烯醇式丙酮酸转换成草酰乙酸，然后由苹果酸 脱氢酶把草酰乙酸氧化成苹果酸。植物中有好几种类型的MDH和PEPC，并且他 们的表达与它们的功能和组织特异性有关。豆类植物的根瘤中含根瘤特异性的 MDH和PEPC基因，它们的表达水平比其它组织高5-15倍。已经在苜蓿的根瘤 中分离出了一种特异性的新型MDH，这个新型的MDH具有特殊的动力学特性使 它在根瘤中能生产大量的苹果酸。Tesfaye等利用烟草花椰菜花叶病毒CaMV35S 启动子构建了根瘤特异性的MDH基因的植物表达载体，通过农杆菌转染的方法 得到转基因苜蓿(Tesfaye M ， Temple SJ, Allan DL， et al. 2001. Overexpression of Malate dehydrogenase in transgenic alfalfa enhances organic acid Synthesis and confers tolerance to aluminum.尸〗a/7f尸力ysio丄 127: 1836-1844)。他们的实验结果显示转基因苜蓿根尖MDH的活性是对照植物 的1.6倍，根部有机酸的含量提高了4.2倍，根部分泌的柠檬酸，草酸，苹果 酸，琥珀酸和醋酸比未转基因的对照苜蓿提升了7.1倍。当植物生长在含有铝 的酸性培养液中时，转MDH的植株积累的生物量比未转基因的苜蓿高，在含有 铝的水培液或土壤中栽培时，非转基因植物的生长困难，转基因植物生长情况 良好，磷素吸收能力增强。植物根部和叶中其它有机酸的浓度增加，从根部分 泌的有机酸浓度增强，并且伴随抗铝毒能力的提高。崔小英等通过农杆菌介导的遗传转化法将苜蓿根瘤型苹果酸脱氢酶MDH导 入苜蓿胚性愈伤组织，筛选的转化株在20 iliM Ar+溶液中处理24h后根部的伸 长量比对照植株提高3.6% 22.5%，表明在铝毒胁迫处理下过量表达苹果酸 脱氢酶的转基因苜蓿能够更好的生长(崔小英，崔衍波，邓伟等.2004.超量 表达苹果酸脱氢酶基因提高苜蓿对铝毒的抗受性.分子植物育种.2(5) :621-626)。综上所述，在植物中过量表达MDH可以增强植物中有机酸的合 成，因而是一条对付酸性土壤和铝毒危害的有效策略。因为植物的叶片是光合作用器官，光合作用产物可以为有机酸的合成提供 大量的碳骨架，如果在植物叶片的细胞质中过量表达苹果酸脱氢酶(MDH)，就可 以更直接地利用光合作用产物合成苹果酸分泌到细胞外，然后通过根系进入到 土壤中，熬合土壤中的铝离子，提高可溶性磷的含量，促进磷的吸收，解除酸 性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。现有的苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体 均采用组成型启动子(CaMV35S)， CaMV35S的作用没有组织特异性。用报告基 因的研究结果表明CaMV35S的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱 (Jefferson等，1987;EMB0， 6:3901-3907)。1, 5 二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco) 是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的 40-50%。 Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的 启动子为光诱导型启动子(PrbcS)， PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要 光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强。用报告基因的 研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3_4倍，因此PrbcS是一 种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987; EMB0， 6:3901-3907)，在科研 工作中PrbcS常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达。 发明内容本发明的目的之一在于提供一种提高植物耐铝毒能力的专用载体。 本发明所提供的用于提高植物耐铝毒能力的载体，是具有光诱导型启动子和苹果酸脱氢酶基因(即fMW基因)的植物表达载体。上述载体中，所述的苹果酸脱氢酶基因^M 力來源于大肠杆菌(^sc力en'c力j'acWi)。所述的来源于大肠杆菌的苹果酸脱氢酶基因^M^^]GenBank登录号为Y00129。所述的苹果酸脱氢酶基因f巡W的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。上述载体中，用于构建所述植物表达载体的出发载体为pH2GW7(购自 Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。 本发明的植物表达载体为pH2-35S-PrbcS-^MW。本发明的另一 目的是提供上述载体的应用，将上述载体通过农杆菌介导转化植物，得到耐铝毒能力提高的转基因植株。上述植物，包括单子叶和双子叶植物如水稻、大豆、小麦和烟草等。 本发明的实验结果表明转基因的烟草植株苹果酸脱氢酶活性是野生型烟草(未转AMW基因的烟草)的1 3.3倍。在铝毒的胁迫下，转^MW基因的烟草能分泌较多有机酸，根系生长良好，能提高植物对铝毒的抗性和对磷素 的吸收能力。本发明的专用载体能在提高植物(如烟草)的铝毒耐受性方面发挥 很大作用，为植物品种改良提供了一条新途径。 本发明的植物表达载体由下述方法构建而成一、 苹果酸脱氢酶基因i5MW的扩增1、从GenBank中查找大肠杆菌^/ZW基因的全长基因序列，并设计序列 如下的一对引物EMDH5:caccATGGAAGTCGCAGTCCTCGGCGC EMDH3:ggatccTCAATTACTTATTAACGAACTC 5'端引物EMDH5，末端加CACC特征序列，并由此形成Afcol酶切位点；3' 端引物EMDH3，末端加酶切位点；以大肠杆菌基因组DNA为模板扩增， 得到f巡W基因的全长。二、 ^MW基因的T0P0克隆回收并纯化^//W基因片段，通过T0P0克隆技术亚克隆到pENTR-T0P0载体 (购自invitrogen公司)上，采用碱裂解法提取质粒DNA ,通过PCR检测和 测序分析获得重组质粒pENTR-T0P0-^MW (图4)。三、 中间载体pUC118-PrbcS-T的构建用限制性内切酶5 力I将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中(由Sugita等构建并 提供，Sugitaetal.， 1987， MGG， 209: 247-256)的rbcS-3C切割出来，再用 连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生中间载体pUC118-PrbcS-T;四、 在中间载体pUC118-PrbcS-T中引入NcoI酶切位点 利用一对互补引物Nco15和Nco13 (图1)，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入位点产生中间载体 pUC118-PrbcS-*T;五、 中间载体pENT妙-Prbcs-*T的构建利用一对互补引物Hindl115和Hindl113 (图2)，通过点突变技术把 Gateway的入门载体pENTR-2B (购自invitrogen公司)多克隆位点中的Ztz^I 位点改为历V dIII产生中间载体pENTR*-2B,然后用^// dl11和fcoRI切开 pENTR*-2B和PUC118-PrbcS-*T，回收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断 pENTW及pUC118-PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA片断PrbcS_*T，用连接酶 把pENT妙和PrbcS-*T连接起来获得中间载体pENTR*-Prbcs-*T (图3)。六、 入门载体pENTR氺-PrbcS-EMDH的构建用Afcol和5a/zHI切割pENTR*-PrbcS-*T和pENTR-T0P0-f巡私回收载体 pENTR*-PrbcS片断和^MW基因片断，用连接酶连接PENTR*-PrbcS和EMDH，获得入门载体pENTR*-PrbcS-^MW。七、EMDH基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-^MW的构建 通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-^巡W亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway的目的载体，比利石VIB/Gent公司)中，获得^MW基因的植物表达 载体pH2-35S-PrbcS-^6MW。在上述载体中，f巡W基因的上游添加有光诱导型启动子PrbcS。本发明使 用的光诱导型启动子(PrbcS)是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动 子，是一个由Hindin切割产生的1.7 kb的DNA片断，已经亚克隆于pUC118 中(Sugitaet al. ， 1987， MGG, 209: 247-256)，该亚克隆的质粒载体名称为 pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C。为了使EMDH基因表达后的产物能定位在叶片细胞质 中，本发明用限制性内切酶Sphl将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS_3C切 割出来，然后用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间 载体pUC118-PrbcS-T，然后利用一对互补引物(图1)，通过点突变技术在 pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入Ncol位点产生中间载体 pUC118-PrbcS-*T。为了使用Gateway技术构建EMDH基因的植物表达载体，本发明采用 Gateway的入门载体pENTR-2B为基本骨架，利用一对互补引物(图2)，通过点 突变技术把pENTR-2B多克隆位点中的位点改为历'/7dl11产生中间载体 pENTR*-2B，然后用历'/7din和AcoRI切开pENTR*-2B和pUC118-PrbcS_*T，回 收pENTR*-2B被切割后产生的载体片断pENTW及pUC118_PrbcS-*T被切割产生 的启动子DNA片断PrbcS-*T，用连接酶把pENTW和PrbcS_*T连接起来获得一个 含有光诱导型启动子(PrbcS)序列的Gateway入门载体pENTR*-Prbcs_*T(图3 )。


图1中间载体pUC118-PrbcS^T的构建策略用Sphl把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切除，并使载体自连接 形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近 引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T。图2中间载体pENTR*-2B的构建策略通过点突变技术把pENTR-2B多克隆位点中的Xmnl改变为HindIII。 图3中间载体pENTR*-Prbcs-*T的构建策略把PrbcS-*T亚克隆于pENTR*-2B中产生中间载体pENTR*-PrbcS_*T。 图4 pENTR-T0P0-EMDH的构建策略 图5 EMDH基因的扩增和T0P0克隆 (A)以E.coli基因组为模板扩增EMDH基因。1-2: EMDH基因的PCR产物；3: DNA Marker (500bp) 。 (B)重组质粒pENTR-T0P0-EMDH的电泳检测。1:正 对照(分子量为3.6的质粒)；2-3:重组质粒pENTR-TOPO-EMDH。 (C)重组质粒 pENTR-TOPO-EMDH的PCR检测。1: DNA Marker (0)X174A^e111) ;2 :以 pENTR-TOPO-EMDH为模板，用引物attLl和EMDH3引物扩增到的PCR产物；3: 以pENTR-TOPO-EMDH为模板，用引物EMDH5和EMDH3引物扩增到的PCR产物；图6入门载体pENTR*-PrbcS-EMDH的构建策略图7 pENTR*-PrbcS-EMDH的检测(A)用^a威I和Wcol酶切检测重组质粒pENTR*-PrbcS-EMDH。 l:入 DNA/HindIII Marker; 2:负对照质粒(pUCl 18-PrbcS-T_rbcS-3C); 3-5:重组 质粒pENTR*-PrbcS-EMDH。 (B)用PCR检测重组质粒pENTR*_PrbcS_EMDH。 1-3: 以pENTR*-PrbcS-EMDH为模板，用引物PrbcS5和EMDH3扩增到的PCR产物；4: 以pENTR*-PrbcS-EMDH为模板，用引物EMDH5和EMDH3扩增到的PCR产物；5: 入DNA/HindIII Marker。图8用Gateway的LR反应构建EMDH基因的植物表达载体 图9 EMDH植物表达载体pH2-35S-PrbcS-EMDH的检测和农杆菌的转化 (A) pH2-35S-PrbcS-EMDH质粒的电泳检测。1.pH2GW7质粒DNA;2-4. pH2-35S-PrbcS-EMDH 质粒 DNA;5. pENTR-TOPO-EMDH 质粒 DNA 。 (B) pH2-35S-PrbcS-EMDH质粒的PCR检测。1. DL2000 DNA Marker; 2.以质粒 pH2-35S-PrbcS-EMDH为模板，利用EMDH5和EMDH3引物扩增得到的PCR产物；3-5. 以质粒pH2-35S-PrbcS-EMDH为模板，利用PrbcS5和EMDH3引物扩增得到的PCR 产物。(C)转化pH2-35S-PrbcS-EMDH质粒的农杆菌PCR检测。1. DL2000 DNA Marker; 2.正对照(以质粒pH2-35S-PrbcS-EMDH为模板，利用EMDH5和EMDH3 引物扩增得到的PCR产物)；3-5.以农干菌菌落为模板，利用EMDH5和EMDH3 引物扩增得到的PCR产物。图10 EMDH在转基因烟草中的插入情况检测 (A)烟草植物基因组DNA的电泳检测。1.入DNA/HindIII digest DNA Marker; 2-5.烟草基因组DNA样品。(B)烟草植物基因组的PCR检测。1. 500bp DNA Marker; 2.正对照(以质粒pH2-35S_PrbcS_EMDH为模板，利用EMDH5和EMDH3 引物扩增得到的PCR产物)；3-5.以转基因烟草基因组为模板，利用EMDH5和 EMDH3引物扩增得到的PCR产物。6.负对照(未转基因的野生型烟草RNA样品)。 图11 EMDH在转基因烟草中的转录水平检测 (A)烟草RNA质量的检测。1-3.转EMDH烟草植物的RNA样品；4.野生型 烟草(负对照)的RNA样品。(B)转基因烟草的RT-PCR检测。1.负对照；2-4. 转基因烟草的RT-PCR产物；5.正对照(以质粒pH2-35S-PrbcS-EMDH为模板，利用EMDH5和EMDH3引物扩增得到的PCR产物);6入DNA/HindIII digest DNA Marker。图12 EMDH在转基因烟草中的酶活性测定图13 EMDH转基因烟草苹果酸分泌量的测定图14 EMDH转基因烟草在铝毒胁迫下根尖的染色情况图15 EMDH转基因烟草在铝毒胁迫下根生长量的测定图16 EMDH转基因烟草在有铝毒胁迫的培养基中的生长情况A:在不含铝离子的Blaydes培养基(pH4.0)上生长17d的烟草幼苗；B:在 不含铝离子的Blaydes培养基(pH4.0)上生长17 d的烟草幼苗经1 mM铝离子处 理lh后用0.1。/。铬天青S对根进行染色；C:在含有300 pmol/LAP的Blaydes 培养基(pH4.0)上生长17天后的烟草幼苗；D:在含有500 pmol/L A^+的Blaydes 培养基(pH4.0)上生长17天后的烟草幼苗。图17 EMDH转基因烟草在有铝毒胁迫的土壤基质中的生长情况具体实施方式
试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基 因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转 录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂 盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、pENTR Directional TOPCT Cloning Kits以及Gateway LR clonase Enzyme Mix kit购 自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特 别说明均为常规方法。实施例1、中间载体pUC118-PrbcS-T的构建用质粒抽提试剂盒(博大泰克公司)纯化(按试剂盒说明书操作) pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al. ， 1987， MGG: 209: 247-256)，用限制性内切酶SpM( Ferment as )将pUC118_PrbcS-T-rbcS-3C 中的rbcS-3C切割出来，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体 pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4. 6 kb的载体pUC118-PrbcS-T，然后 用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接(按试剂盒说明书操作)不含rbcS-3C 的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T (图1),用连接反应混合 物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5a，购自天根生化科技公司)， 把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp， 100lag/ml)的平板上，于37 °C过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用 进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生一条4. 6kb 条带，选出连接成功的质粒载体pUC118-PrbcS-T，重新转化大肠杆菌DH5 a ，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。实施例2、利用点突变技术在中间载体pUC118-PrbcS-T中引入位点以纯化质粒pUC118-Prbcs-T为模板，根据叶绿体定位序列设计一对用于点 突变的互补引物(NcoI5和Nco13，图l)，委托TaKaRa合成。在点突变反应混 合液中加入25ng的纯化质粒pUC118-PrbcS-T作为模板，同时加入125ng的点 突变引物NcoI5和Nco13、 lpldNTP (2. 5mM) ， 5|ul的10 XK0D反应Buffer和 l^il的K0D聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸水使反应终体积为50nl。在PCR仪 上于95。C加热30秒，然后按照95。C、 30秒，55 °C、 1分钟，68 °C、 10分钟的 程序进行15个循环的反应，最后在68。C延长反应10分钟，合成含突变位点的 子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1^1 的限制性内切酶Dpn I (lOU/pl)和5^1的Dpn I反应缓冲液，于37 °C保温1 小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌 感受态细胞(DH5a ，购自天根生化科技公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨 苄青霉素(Amp， 100ng/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性 重组子菌落中提取质粒，用Afcat (Fermentas)进行酶切检测，突变成功的质 粒可被切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条4. 6kb的条带，选出突变成 功的质粒载体pUC118-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5 (i ，挑单个菌落进行液 体培养，用试剂盒纯化质粒。在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处 引入lol位点后，为构建由启动子PrbcS控制，表达的目的蛋白定位在叶片细 胞质中的目的基因的植物表达载体奠定基础。实施例3、利用点突变技术把Gateway的入门载体pENTR-2B多克隆位点中 的改变为历/7din以纯化质粒pENTR-2B (购自invitrogen公司)为模板，根据Z鹏I附近的 序列设计一对(Hindl115和Hindl113)用于点突变的互补引物(图2)，委托 上海申能博采公司合成。在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pENTR-2B 作为模板，同时加入125ng的点突变引物Hindl115和Hindl113、 lpldNTP (2. 5 mM) ，5|ul的10XK0D反应Buffer和lul的K0D聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸 水使反应终体积为50^1。在PCR仪上于95°C加热30秒，然后按照95°C、 30秒， 55°C、 l分钟，68°C、 10分钟的程序进行15个循环的反应，最后在68。C延长 反应IO分钟，合成含突变位点的子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却 2分钟，向反应混合液加入的限制性内切酶Dpn I (10U/|Lil)和5^1的DpnI反应缓冲液(晶美)，于37T保温1小时，降解不含突变位点的母链。用反 应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ci，购自天根生化科技 公司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(A即，100吗/ml)的平板上， 筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用历/7dl11 (晶 美)进行酶切检测，突变成功的质粒可被^"dlll切开并在琼脂糖凝胶电泳图 上产生一条3. 5kb的条带，选出突变成功的质粒载体pENTR*-2B，重新转化大肠 杆菌DH5a，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。 实施例4、中间载体pENTRHc-Prbcs-W的构建用历'/7dl11和fcoRI切开纯化的质粒载体pENTR*-2B和pUC118_PrbcS-*T， 通过琼脂糖凝胶电泳分离己切开的载体和插入片段，回收pENTR*-2B被切割后 产生的载体片断pENTR* (2. 3kb)及pUC118_PrbcS-*T被切割产生的启动子DNA 片断PrbcS-W (1.7kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTI^ 和PrbcS-*T产生中间载体pENTR*-Prbcs-*T (图3)。用连接反应混合物转化高 效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ct，购自天根生化科技公司)，把转化 好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km， 50pg/ml)的平板上，于37 °C过夜培养， 筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，用历/7dl11和&力1 双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生两条带， 一条为 2. 3kb的载体带，另一条为1. 7kb的插入片段PrbcS-W。选出连接成功的质粒载 体pENTR*-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5 a ， 挑单个菌落进行液体培养， 用试剂盒纯化质粒。实施例5、 EMDH基因DNA的扩增及TOPO克隆EMDH基因DNA的扩增及TOPO克隆的策略如图4所示，首选从GenBank 中査找，2W的全长基因序列，并设计一对引物，序列如下 EMDH5: 5， -CACCATGGAAGTCGCAGTCCTCGGCGC-3 ， EMDH3: 5， -GGATCCTCAATTACTTATTAACGAACTC-3，5'端引物EMDH5末端加CACC特征序列，并由此形成#coI酶切位点；3' 端引物EMDH3末端加5a/rfH酶切位点。从Acoh'中提取基因组DNA。制备100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心 10min，去上清液；加9. 5ml TE悬浮沉淀，并加O. 5ml 10% SDS， 50^1 (20mg/ml 或lmg干粉)蛋白酶K (TaKaRa公司)，混匀，37。C保温lh;力口1.5ml 5M NaCl， 混匀；力口l. 5ml CTAB/NaCl溶液(4. lg NaCl溶解于80ml H20，缓慢加入10gCTAB， 加水至100ml)，混匀，65"C保温20min;用等体积酚氯仿异戊醇(25:24: l)抽 提，5000rpm离心10min，将上层清液移至干净离心管；用等体积氯仿异戊醇 (24:1)抽提，取上清液移至干净管中；力tU倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA;用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于lml 含有RNase的TE溶液中，-20'C保存；如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA 沉淀。用^I/"感因上下游特异性引物EMDH5和EMDH3作PCR，用日本东洋纺(TOYOBO)的K0D聚合酶扩增得到^/Z 雄因的全长0.94kb (图4A)。回收并纯化 ^M 姓长基因片段，i5M 力的产物为平末端DNA片段，因此用Invitrogen公司的 pENTR Directional TOPO Cloning试剂盒，把回收到的平末端DNA片段亚克 隆于pENTR/D-TOPO载体中，实验操作按试剂盒的说明书进行，于室温反应过夜 后用反应混合液转化大肠杆菌感受态DH5a (购自天根生化科技公司)，采用碱 裂解法提取质粒DNA,经1X琼脂糖凝胶电泳(图4B)，选取大小和理论值相符的 重组质粒pENTR-T0P0-;5M^故进一步的PCR检测，第一组用位于a1:tLl位点处的上 游特异性引物attLl和EMDH3作PCR，亚克隆成功的重组质粒均能扩增出l. lkb左 右的DNA片段(图4C)，第二组用^M 力基因上下游特异性引物EMDH5和EMDH3作PCR， 亚克隆成功的重组质粒均能扩增出O. 9kb左右的DNA片段(图4C)，经序列分析证 明是^M 力基因的全长基因。实施例6、 EMDH基因的Gateway入门克隆载体pENTR*-PrbcS-EMDH的构建 用vVcoI和万a/zHI切开纯化的质粒载体pENTR*-PrbcS-*T和 pENTR-TOPO-EMDH (图6)，通过琼脂糖凝胶电泳分离己切开的载体和插入片段， 从凝胶中回收pENTR*-PrbcS_*T被切割后产生的载体片断pENTR*-PrbcS(4. Okb)及pENTR-TOPO-EMDH被切割产生的^MW基因的DNA片断(0. 9kb)， 然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*_PrbcS和^FZW基因的DNA 片断产生入门载体pENTR*-PrbcS-^MW (图6)。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5ci，购自天根生化科技公司)，把转化好的 大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km， 50pg/ml)的平板上，于37。C过夜培养，筛选 Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中提取质粒，用(Fermentas) 和5a/dn (Fermentas)双酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只 产生两条带， 一条为4. Okb的载体带，另一条为0.9 kb的^M肝基因片段(图 7A)。选出连接成功的质粒载体pENT妙-PrbcS-i5M私用两组引物作PCR检测。 第一组用EMDH上下游的特异性引物EMDH5和EMDH 3进行PCR扩增，所选的质 粒都能扩增出一条0.9kb的75M肝条带(图7B)，第二组用位于PrbcS区域中 的特异性引物PrbcS5和EMDH的下游特异性引物EMDH 3进行PCR扩增，所选的 质粒能扩增出一条1. lkb的条带(图7B)。确认是连接成功的质粒后，重新转 化大肠杆菌DH5 a ，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒 pENTR*-PrbcS-^MW。实施例7、 jWZW基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-f巡W的构建通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-^FZW亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway的目的载体，比利时VIB/Gent公司)中(图8)。具体的做法是用 质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体pH2GW7，在Gateway的LR反应体系 中加pENTR*-PrbcS-AJ/ZW和pH2GW7各150ng， LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25°C反应过夜，通过整合酶的作用把PrbcS-f巡W整合到 pH2GW7中获得y5MW的植物表达载体质粒pH2-35S-PrbcS-^MW(图8)。用反应 混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5a,购自天根生化科技公 司)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe, 50pg/ml)的平板上，于37。C 过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒(图 9A)，选出大小和理论预测值相符的整合质粒pH2-35S-PrbcS-f巡W进行PCR检 测，第一组用^MW上下游的特异性引物EMDH5和EMDH 3进行PCR扩增，所选 的质粒都能扩增出一条0. 9kb的EMDH条带(图9B)，第二组用位于PrbcS区 域中的特异性引物PrbcS5和EMDH的下游特异性引物EMDH 3进行PCR扩增，所 选的质粒能扩增出一条1. lkb的条带(图9B)。确认是整合成功的质粒后，重 新转化大肠杆菌DH5ci ，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。pH2GW7 携带的筛选标记基因为潮霉素抗性基因(Hgr)，这样可用加有Hgr的平板筛选 转基因植物。实施例8、用EMDH基因的植物表达载体转化农杆菌制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体 pH2-35S-PrbcS-f巡W转入农杆菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壮观霉素的平 板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物 加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于 电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用lmm的电击杯和200欧姆，2. 5kV/0. 2cm的参数 进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlS0C培养基，混匀，转移 到1.5ml的离心管中；28°C， 200rpm摇床培养3 —5h;室温下，7500rpm离心 lmin，弃大部分上清，保留IOO)liI将细胞悬浮;把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe， 50!tig/ml)的LB固体培养基上，28'C培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农 杆菌菌落放入20 y 1 ddH20中，98。C处理15分钟后取出10|li1农杆菌裂解液作 为PCR反应的模板。用^MW基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌 落均能扩增出0. 9kb的EMDH基因条带(图9C)，经菌落PCR确认的转化子菌落 用于转化植物。实施例9、用含有^/Z^基因植物表达载体的农杆菌转化烟草 挑取携带有质粒pH2-35S-PrbcS-^MW的农杆菌单菌落接种于50ml的LB 培养基中(含Spe， 100pg/ml)， 180rpm， 28。C培养24h,待菌液OD,至1. 0左右，离心10min (3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮， 离心10min (3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后加入一定体积 的MS液体培养基重悬浮，使菌体的ODe。。值为0. 5。制备烟草OWc"ia朋ta力ac鹏 cv. Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，用叶柄法转化天 竺葵，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无 菌烟草的叶片切成小片叶盘，把天竺葵的叶柄切成小段，在制备好的农杆菌菌 液中浸染15 — 20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02. l|ag/ml+BAP0.02ng/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含潮 霉素(25pg/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NAA0. 53|ug/ml+BAP0. 5pg/ml)上进行 芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含潮霉素(25ug/ml)的MS 培养基上进行根的诱导。实施例10、 ^MW基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测 为了确认通过潮霉素筛选的转基因烟草株系确实含有我们导入的目的基因 的DNA片段，我们用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采 用CTAB法提取植物基因组称取植物叶片100mg左右置于1. 5ml离心管中，加 液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900^1预热到65'C的2XCTAB缓冲液(Tris-HC1 pH 7.5 100 mM， EDTA 20 mM， NaCl 1.4 M， CTAB 2%)， 65。C度水浴加 热20分钟后取出冷却；加入500^1氯仿一异戊醇混合液(24: 1)摇匀，4°C 离心10min (7500卬m)后转移上清至1. 5ml EP管；再次加入500|il氯仿_异 戊醇混合液(24: 1)摇匀，4。C离心10min (7500rpm);取出上清置于新的EP 管中，加入1/10体积3MpH5. 2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4'C离心20min(12000卬m);弃上清，用75%乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲 液溶解并降解RNA，所获得的基因组DNA样品用凝胶电泳检测浓度(图10A)。 以植物基因组DNA为模板，用f巡W基因的上下游引物EMDH5和EMDH3作PCR 检测，PCR产物的理论长度为O. 9kb，成功转入目的基因的植株均能扩增出0. 9kb 的条带(图10B)，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取 总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测EMDH基因在转基因植物中的 转录水平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0. lg， 加入lml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加 入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min (12000rpm)，转移上清液至新管，加入 0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min， 4"C离心10min (12000卬m)，弃上清，沉 淀用75X乙醇lml清洗，4"C离心5min (7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自 然晾干，用20ul焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。所获得的RNA样品用凝胶电泳检测质量和浓度(图11A)使用Reverse Transcriptase进行cDNA 的合成，取植物总RNA约0. l|ig-5ng， oligo(dT) 50ng， lOmM dNTP mix 1^1, 用DEPC处理水补足至l(Hil，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65'C加 热5min，冰浴10min，加入反应混合物9jil (5Xreaction buffer 4(xl， 25mM MgCl2 4^1， 0. IMDTT 2|til， RNA酶抑制剂l|nl),将上述混合物混匀，短暂离心 将之收集于管底，25。C保温2min，力口入M-MuLV Reverse Transcriptase, 将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25'C保温20min，然后42。C保 温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用f巡W基因的上下游引物EMDH5和EMDH3 作RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明大部分 转基因烟草植株均有目的基因的转录物(图11B)。实施例ll、转基因烟草苹果酸脱氢酶(MDH)的活性分析选取经RT-PCR分析表明有目的基因的转录物的转基因烟草植株测定柠檬 酸合成酶的活性。从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取1 g烟草叶片，加1 ml 蛋白抽提液[IOO mM Tris-HC1 (pH 7.5); 10% (V/V)甘油;10 mM巯基乙醇; lmMPMSF; 5% (W/V) PVP]研磨，转移至EP管中，13000 r/min离心25 min (4 °C)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。苹果酸脱氢酶活性测定按Tesfaye等(Plant physiology, 2001， 127:1836-1844)的方法进行，其原理为草酰乙酸与NADH在苹果酸脱氢 酶的作用下能够生成L-苹果酸和NAD。在该反应中，通过测定波长为340丽 下NADH的减少量从而获得MDH的相对酶活性。测定MDH酶活性的反应体系为0. 05 M Tris-HCl (pH 8. 0) ， 4mM草酰乙 酸，0. lraMNADH。加入蛋白样品之前，用紫外分光光度仪测定反应溶液在波长 340 nm处的吸收值(0D值)，然后在反应体系中加入100 ^烟草蛋白样品，再 次检测340 nm处的OD值。计算两次读数的差值得到MDH酶活性数据。我们共挑选了三个转基因株系测定其MDH酶活性，结果表明转基因烟草MDH 酶活性为野生型烟草的1 3. 3倍(图12)，可见^MW在转基因烟草植株中的表 达大大提高了MDH活性。实施例12、转基因烟草植株根分泌的苹果酸含量测定苹果酸含量采用酶动力学-紫外分光光度法测定(文献)。首先，将0.35mL 样品与0.45 mL缓冲液Tris-HCl (pH 9. 0)以及30 u L氧化型辅酶I (NAD)溶 液(30 mg/mL)混合，并读取波长为340 nm处的0D值(A 1)。接着加入2 "L 苹果酸脱氢酶悬浮液(16.5U/uL )于上述反应溶液中并混合均匀。15分钟后， 读取340nm处的0D值A2。同时测定苹果酸标准样品的0D值Al'、 A2'。根据供 试样品和苹果酸标准溶液吸光度的增加值(A2-Al)以及(A2'- Al')，计算供试样品中苹果酸的含量。将大小均匀一致的转基因幼苗以及野生型烟草幼苗，分别置于AlCl3浓度 为0、 50、 100、 200、 300 u mol/L的CaCl2溶液中，24小时后收集CaCl2溶液 并浓縮根分泌的苹果酸。分析结果表明，每个处理中EMDH转基因烟草都具有较 高的苹果酸分泌量(图13)。其中转基因株系E3在200 "M/L铝离子处理时分 泌的苹果酸是野生型的45倍，在300 u mol/L铝离子处理时分泌的苹果酸是野 生型烟草的15倍。实施例13、转基因烟草对铝毒的抗性检测植物对铝毒的耐受性一般采用根尖染色情况来衡量。根尖染色的染料有苏 木精(hematoxylin)和铬天青(eriochrome cyanine S)，两者均适于鉴定植物对铝的敏感性或忍耐性。其原理是染料能通过死亡的细胞膜进入细胞内部，并与 残留于死亡细胞核中的铝结合产生蓝色(苏木精)或红色(铬天青S)物质，这一 反应对铝具有高度的专一性(Cancado GMA， Loguercio LL， Martins PR. 1999. Hematoxylin staining as a phenotypic indes for aluminum tolerance selection in tropical maize (Z s鹏"L ). 7T eor如/ 2 Ge"". 99:747-754; Ma JF， Zhen SJ， Li XF. 1997. A rapid hydroponic screening for aluminum tolerance in barley. /Va/^ 191:133-137)，而且根尖染色程度与铝对植物的毒害程度呈正相关。将大小均匀一致且生根良好的转基因烟草以及野生型烟草幼苗，分别置于 A1C13浓度分别为0 (对照)、50、 100、 200、 300 |imol/L的CaCl2溶液(pH值 4.3)中处理24h，再经过O. lX的铬天青S染色液染色15min。用蒸馏水冲洗 后，在显微镜下观察并记录根尖染色情况。结果表明野生型烟草的根尖均被染 成紫色，出现铝离子中毒现象，而^MW转基因株系E1、 E3、 E13的根尖不着色 或只有很浅的着色(图14)。这些结果初步证明即使只在叶片中过量表达^/ZW， 也能增强转基因植物对铝毒的耐受性。实施例14、转基因烟草植株在铝毒胁迫下根伸长速率的测定 根在铝毒胁迫下的伸长速率是衡量植物对铝毒耐受能力的另一种指标之 一，因此我们还测定在铝毒胁迫下转基因烟草植株根生长速率。将大小均匀一 致的转基因烟草和野生型烟草幼苗，分别置于AlCl3浓度为0、 50、 100、 200、 300 nmol/L的CaCl2溶液中。处理24小时之后，测量供试植株根的生长量，重 复三次，实验结果如图15时所示。从实验结果可以看出，当铝离子浓度为200 1imol/L和300 lamol/L时，铝离子对野生型烟草根部生长的抑制率为100%，野 生型烟草的根尖变成了鱼钩状，并且根部变黄，在溶液中出现大量的断根。然 而^//W转基因烟草的根却保持相对健康的状态，并且维持较高的生长量。实施例15、转基因烟草植株在铝毒胁迫下的生长情况分析一、 转基因烟草幼苗在含铝的酸性培养基上的生长实验 将大小均匀一致且生根良好的转基因烟草幼苗以及野生型烟草幼苗，分别转移到AlCl3浓度为0、300、 500 |nmol/L的Blaydes培养基(Parrot WA and Bouton JH. 1990. Aluminum tolerance in alfalfa as expressed in tissue culture. 尸7朋t 30:387-389)中，培养17 d后观察其生长状况。在不含铝离子的 Blaydes培养基(pH4.0)上生长17 d的烟草幼苗如图16A所示，经l mM铝离子 处理1 h后用0. 1%铬天青S进行根尖染色，^MW转基因株El根系的染色比对 照植物野生型轻得多(图16B) 。El小苗在含有300 ^irnol/L (图16C)和500 i^imol/L (图16D)A"+的Blaydes培养基(pH4. O)上生长17天后，生长情况良好、根系发 达；而野生型烟草在铝毒胁迫下生长明显受阻，根系发育不良。二、 转基因烟草幼苗在含铝的酸性基质上的盆栽实验 将大小均匀一致且生根良好的转基因烟草幼苗以及野生型烟草幼苗移载到新的珍珠岩基质中，在温室内进行盆栽试验，每星期浇灌含有A1P04的Blaydes 培养基营养液两次，四个月后观察其生长状况。^M肝转基因植株E1、 E3生长 良好，并且已经出现花蕾。然而野生型烟草植株生长明显受阻，不仅植株矮小， 而且发育迟缓，没有现蕾(图17)。对烟草株高的测量结果说明在铝毒胁迫的土 壤基质中^MW转基因烟草的株高是野生型烟草的1. 2 1. 5倍。可见^M^转基 因烟草植株在铝毒胁迫下生长良好，还能正常开花结实。
权利要求
1、一种用于提高植物耐铝毒能力的载体，是具有光诱导型启动子和苹果酸脱氢酶基因的植物表达载体。
2、 根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述的苹果酸脱氢酶基因来 源于大肠杆菌。
3、 根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述的来源于大肠杆菌的苹果酸脱氢酶基因(EMDH)的GenBank登录号为Y00129。
4、 根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于所述的苹果酸脱氢 酶基因的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。
5、 根据权利要求4所述的载体，其特征在于用于构建所述植物表达载体 的出发载体为pH2GW7。
6、 根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述植物表达载体为 pH2-35S-PrbcS-EMDH。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物耐铝毒能力的植物表达载体及其应用，属于植物基因工程领域。该载体含有大肠杆菌(Escherichia coli)苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase，EMDH)基因，在苹果酸脱氢酶EMDH基因的上游是Rubisco小亚基的光诱导型启动子。实验结果表明，用该载体转化烟草获得的转基因烟草的苹果酸脱氢酶活性是野生型烟草的1～3.3倍。在100～300μM的铝毒胁迫下，转EMDH烟草能分泌较多的苹果酸，根系生长较好，对铝毒的耐受性明显增强。本发明的专用载体能提高植物对铝毒的耐受能力，在植物品种尤其是在中国南方酸性土壤中种植的作物的遗传改良中有很大的应用潜力。
文档编号C07H21/04GK101230357SQ20071006641
公开日2008年7月30日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者刘迪秋, 李昆志, 玉永雄, 王奇峰, 玥 赵, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学;西南大学