专利名称：：包含辅助t细胞和细胞毒性t淋巴细胞(ctl)表位的新免疫原性脂肽的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及免疫学领域，更特别地涉及用于产生针对肽免疫原的细胞应答的试剂，以及使用所述试剂增强个体的免疫应答或使用所述试剂接种个体的方法。更特别地，本发明涉及具有增强的免疫原性、特别是增强的激活针对CD8+T细胞表位的T细胞应答以诱导抗一种入侵病原或肿瘤细胞的细胞介导免疫的活性的新脂肽。本发明还提供了包含例如与药物学可接受载体或赋形剂组合的所述脂肽的配制品和疫苗组合物，以及用于制备和使用本发明的配制品和疫苗组合物的方法。
背景技术：
：1.概要本说明书含有用PatentlnVersion3.1制作的氨基酸序列信息，见所附序列表。序列表中的每一序列用数字<210>后接序列标识符表示(例如<210>1，<210>2,等)。每一序列的长度和来源生物体分别在数字范围<2">和<213>内指示。本说明书中指示的序列用术语"SEQIDNO:"加上后接的序列标识符定义(例如，SEQIDNO:1表示标为<400>1的序列)。本文所用术语"来自"、"衍生自"是指一特定的整体(integer)可以得自一特定来源，但不是必需直接得自该来源。在本说明书中，除非上下文有其它含义，术语"包含"、"包括"("comprise","comprises"或"comprising")应被理解为包括所述的步骤、元件或整体或者步骤、元件或整体组，但不排除任何其它步骤或元件或整体或者元件或整体组。本领域技术人员能够理解本文描述的本发明可以进行各种变化和修饰从而与所特异描述的有所不同。应理解的是本发明包括本说明书中单独或集中指出或指明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两个或多个所述步骤或特征的任意组合和全部组合。本发明的范围不受本文描述的具体实施例的限制。很明显，功能等价的产品、组合物和方法属于本文描述的本发明范围。本申请所引用的全部参考文献特别引入本文作参考。除非另有说明，使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术可以无需过多实验而进行本发明。这种程序例如在引入本文作参考的下述教科书中有描述1.Sambrook,Fritsch&Maniatis，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,SecondEdition(1989)，wholeofVolsI，II,andIII;2.DNACloning:APracticalApproach,Vols.IandII(D.N.Glover,ed.，1985)，IRI_Press,Oxford,wholeoftext;3.0ligonucleotideSynthesis:APracticalApproach(M.丄Gait,ed.，1984)IRLPress,Oxford,wholeoftext,andparticularlythepapersthereinbyGait,pp1-22;Atkinsonefa/.，pp35-81;Sproata/,,pp83—115;andWuefa/.，pp135—151;4.NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(B.D.Hames&S.丄Higgins，eds.，1985)IRLPress,Oxford,wholeoftext;5.AnimalCellCulture:PracticalApproach,ThirdEdition(JohnR.W.Masters,ed.，2000)，ISBN0199637970，wholeoftext;6.ImmobilizedCellsandEnzymes:APracticalApproach(1986)IRLPress,Oxford,wholeoftext;7.Perbal，B.'APracticalGuidetoMolecularCloning(1984);8.MethodsInEnzymology(S.ColowickandN.Kaplan,eds.，AcademicPress,Inc.),wholeofseries;9.丄F.RamalhoOrtig§o，"TheChemistryofPeptideSynthesis"//..KnowledgedatabaseofAccesstoVirtualLaboratorywebsite(lnteractiva，Germany);10.Sakakibara，D.，Teichman，丄，Lien，E.LandFenichel,R丄.(1976).8/oc/7em.8/op/ys.Res.Commivn.73336-34211.Merrifield，R.B.(1963).丄>Am.Chem.Soc.超，2149-2154.12.Barany，G.andMerrifield,R.B.(1979)in77ePepf/ofes(Gross,E,andMeienhofer，丄eds.)，vol.2，pp.1-284，AcademicPress,NewYork.13.Wiinsch，E.，ed.(1974)Sy"f/esevonPep〃c/en//〃oiybe/-Wey/sMe的oc/eActe厂OAyaA/sc/e/C/em/e(MCiler，E.，ed.)，vol.15,4thedn.，Parts1and2，Thieme，Stuttgart.14.Bodanszky，M.(1984)P厂/A7c/]o/esofPepf/c/eSy/的es/s，Springer-Verlag，Heidelberg.15.Bodanszky，M.&Bodanszky,A.(1984)77eP厂ac〃ceofPepf/c/eSy/if/es/'s,Sp〃Vge厂-Ve厂/agf，Heidelberg.16.Bodanszky,M.(1985)/"f.丄PeptideP厂ote/nRes.25，449-474.17.HandbookofExperimentalImmunology,Vols.卜IV(D.M.WeirandC.C.Blackwell，eds.，1986，BlackwellScientificPublications).相关现有技术的描述免疫疗法或接种对于各种疾病如某些传染病或癌症的预防和治疗是很有用的。但是这种治疗的应用和成功部分由于耙CTL表位的免疫原性差而受到限制。代表T细胞免疫原的合成肽当被单独输送时仅引发弱免疫，因此在疫苗组合物中没有效果。含有CTL表位的全长蛋白质不能有效进入MHCl类加工途径。另外，CTL表位是HLA限制的，并且人群中高程度的HLA多态性意味着基于CTL的疫苗可能不能提供对人群中所有基因型的全面覆盖。已使用若干技术以增强个体对肽免疫原的免疫应答。己知使用对肽免疫原而言是外来物质的佐剂配制品(即其在使用前与免疫原混合)，如完全Freund佐剂(CFA)，能增强个体对肽免疫原的免疫应答。但是，目前可应用的许多佐剂在人中应用毒性很大，或者无效。另外，这一类型的佐剂需要在即将给药前与肽免疫原预先配制在一起，这种配制品通常溶解度低或者不稳定。脂肽中一种已知作为佐剂的脂部分与肽免疫原共价偶联，其可以增强在缺乏外来佐剂时弱免疫原性肽的免疫原性[Jungefa/.,AngewC/e/7，/nf￡dBg/70，872,(1985);Martinonefa/"J/mm,/M9'3416，(1992);Toyokuniefa/"J/\mC/7emSoc"6，395，(1994);Deprez，efa/.，JMeofChem38，459,(1995);禾口Sauzetefa/"Vacc/ne73，1339，(1995);BenMohamedefa/"￡〃厂.丄/mmtvno/.27，1242，(1997);Wiesmullerefa/.,/acc/ne7，29，(1989);Nardinefa/.,\Zacc/Ve16,590,(1998);Benmohamed，a/./acc/>e78,2843，(2000);andObert，a/.，Vacc/>em161，(1998)]。合适的脂肽显示出没有佐剂配制品相关的有害副作用，并且已观察到针对脂肽的抗体和细胞应答。己知有几种不同脂肪酸可用作脂部分，举例性的脂肪酸包括但不限于棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰和癸酰基团，或者更一般地，任何C2至C30饱和、单不饱和或多不饱和脂肪酰基团均被认为是有用的。脂氨基酸N-棕榈酰-S-[2，3-^^(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，也称为Pam3Cys或Pam3Cys-OH(Wiesmullerefa/.，ZPhys/o/.Chem.364(1983),p593)，是跨越革兰氏阴性细菌的内膜和外膜的Braun's脂蛋白的N-末端部分的合成版本。Pam3Cys具有式(l)的结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>Metzger等人的美国专利5,700,910(1997年12月23日授权)描述了用作制备脂肽的中间体的几种N-酰基-S-(2-羟烷基)半胱氨酸，这些脂肽用作合成佐剂、B淋巴细胞剌激剂、巨噬细胞刺激剂或合成疫苗。Metzger等人还教导了使用这些化合物作为中间体合成Pam3Cys-OH(Wiesmullerefa/.,ZP/ys/'o/.C勿em.364(1983),p593)以及合成包含这一脂氨基酸或其类似物作为N-末端的脂肽。这些脂肽通过在合成过程中将脂氨基酸部分与肽部分偶联而制备。已经显示当Pam3Cys与一CTL表位肽偶联时可以刺激抗流感病毒感染的细胞的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答(Deresa/.，A/afwre342,561，1989)，并且当与合适的合成B细胞表位的N-末端偶联时能引发抗口蹄疫的保护抗体(Wiesmullerefa/.,Vacc/ne7，29，1989;UnitedStatesPatentNo.6,024,964toJungefa/.，February15，2000)。最近已合成了Pam3Cys的一种类似物，Pam2Cys(也称为二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-及(棕榈酰氧基)丙基半胱氨酸)(Metzger,丄W.，A.G.Beck-Sickinger'M.Loleit，M.Eckert，W.G.Bessler，andG.Jung.1995.JPepfSc/'f:784.)，并且示出其相应于MALP-2的脂质部分，MALP-2是一种分离自支原体的巨噬细胞激活脂肽(Sacht，G.，A.Marten,U.Deiters，R.Sussmuth，G.Jung,E.Wingender,andP.F.Muhlradt.1998.B;rJ/mmmo/28:4207:Muhlradt，P.F.,M.Kiess,H.Meyer,R.Sussmuth，andG.Jung.1998./nfecf/m脂/66:4804:Muhlradt,P.F.,M.Kiess，H.Meyer，R.Sussmuth,andG.Jung.1997.JExpA/feof"5:"/957)。Pam2Cys具有式(ll)的结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>据报道Pam2Cys是一种比Pam3Cys更强力的脾细胞和巨噬细胞刺激剂(Metzgera/.,JPepf.Sc/7,184，1995;Muhlradta/.,JExpMeaf785，1951,1997;andMuhlradtefa/.，/"fecf/mmi/A66，4804,1998).。产生针对一特定CTL表位的强CD8+T细胞应答需要产生强辅助T细胞应答。CD4+辅助T细胞通过分泌足够的细胞因子例如IL-2由此促进CD8+T细胞的扩增而在细胞介导免疫(CMI)中发挥功能，或者通过与抗原呈递细胞(APC)相互作用由此使其更易于激活CD8+T细胞而在细胞介导免疫(CMI)中发挥功能。因此，期望的是将CTL表位与至少一种辅助T细胞表位一起给予(Vitielloefa/.，丄C//n./wesf.95，341-349，1995;Livingstona/.，丄//■759，1383-1392，1997)。在APC表面存在MHC11类分子情况下，这些表位被辅助T细胞识别。CTL表位或分离的表位可以与具有一系列辅助T细胞表位的大蛋白一起给予，以便适于个体群内II类分子的多样性。或者含有混杂的或允许的(promiscuousorpermissive)辅助T细胞表位的肽可以与一个或多个CTL表位一起给予。含有混杂的或允许的辅助T细胞表位的肽在绝大多数MHCII类单元型中存在，从而它们在大多数远亲人群中诱导强CD4+辅助T细胞应答。混杂的或允许的辅助T细胞的例子是破伤风类毒素肽、P/asmocy/uA7fe/c/》aruA7pfg27、乳酸脱氢酶和HlVgp120(Contreasefa/.，/nfecf./訓ivn,66,3579-3590，1998;Gaudeboutefa/"丄A/.D.S.〃iimanRef讀ro/H91-101，1997;Kaumayaefa/.,J.yWo/.尺ecog.6，81-94，1993;andFernandGood丄/mmuno/.748，907-913，1992)。Ghosha/.，/mmi/no/704，58—66，2001和国际专利申请No.PCT/AU00/00070(WO00/46390)也描述了来自犬瘟热病毒(CanineDistemperVirus)的融合蛋白(CDV-F)的混杂的辅助T细胞表位。某些混杂辅助T细胞表位促进针对一特定CTL表位的强CTL应答，并且可以绕开某些单元型限制的免疫应答(Kaumayaa/.,J.Mo/.尺ecogf.6,81-94，1993)。通常，疫苗制品包含一些多肽的混合物，这些多肽包含辅助T细胞表位和CTL表位，但是还已知其由同时包含辅助T细胞表位和CTL表位的一个单一多肽组成。发明概述在完成本发明的工作中，本发明人努力改进生产高免疫原性脂B太的方法，所述脂肽具有一个脂质部分(lipidmoeity)和一个多肽部分(polyp印tidemoeity)，该多肽部分包含可以引起免疫应答的辅助T细胞表位和CTL表位。本发明人发现一种包含辅助T细胞表位和CTL表位的高免疫原性脂肽可以如下产生，即合成一个包含所述表位的具有一个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基的单一多肽分子，然后将脂质部分与所述内部赖氨基酸残基或所述内部赖氨酸类似物残基的侧链氨基基团偶联，这与先前技术相反，先前技术是脂质附着于N—末端。本发明的脂肽可以使用一个单氨基酸链而方便地合成，从而不需要合成后修饰来掺入两种表位。通过在肽合成过程中将所述一或多个赖氨酸残基或者一或多个赖氨酸类似物残基以预定位置置于多肽内，脂质的附着位点能够容易地确定。因此可以定向将脂质部分置于脂肽中，以增强终产物在疫苗或佐剂配制品中的实用性。本发明人发现经位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的内部赖氨酸残基的侧链s氨基基团或内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团附着脂质部分，当与脂质附着于肽的N-末端而获得的线性结构相比时，能够增强的树突细胞成熟。本发明脂肽所提供的一个优点是它们有足够的免疫原性，从而通常不需要在包含这些脂肽的疫苗配制品中包括外来佐剂。本发明当然也包括经存在于辅助T细胞表位的氨基酸序列或CTL表位的氨基酸序列中的内部赖氨酸残基的s氨基基团或者内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团附着脂质部分，唯一的要求是脂质部分不附着于肽的N-末端或C-末端。"内部"是指在包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽的除N-末端或C-末端之外的一个位置。本领域技术人员能够理解含CTL表位的疫苗的溶解性对于商业规模生产疫苗配制品是非常希望的。优选地，脂质部分经位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的赖氨酸残基的s氨基基团或赖氨酸类似物残基的末端侧链基团而附着。任选地，在辅助T细胞表位和CTL表位之间加入一或多个氨基酸间隔物(spacer)，例如在位于所述表位之间的内部赖氨酸或赖氨酸类似物的任一侧加入。在脂质部分和多肽部分之间也可以加入任何常规类型的间隔物。在此方面特别优选的间隔物有丝氨酸二聚体、三聚体、四聚体等。其它的间隔物如精氨酸二聚体、三聚体、四聚体或6-氨基己酸也可以应用。如本文所示，本发明人通过将脂质部分偶联至合成肽部分中的一内部赖氨酸残基的暴露的S氨基基团而产生了本发明的脂肽。任选地，在加入脂质部分之前可以将一间隔物加至暴露的s氨基基团。如本文所述，式(III)或(IV)的脂氨基酸可以直接加至内部赖氨酸残基的e氨基基团或加至内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。选自如下一组的脂氨基酸也是有用的，所述的组由(i)Pam2Cys(也称为二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-及(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸)，(ii)Ste2Cys(也称为二硬脂酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-双(硬脂酰氧基)丙基半胱氨酸)，Lau2Cys(也称为二月桂酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2,3-双(月桂酰氧基)丙基半胱氨酸)，和Oct2Cys(也称为二辛酰-S-甘油基半胱氨酸或S-[2，3-^^(辛酰氧基)丙基半胱氨酸)组成。如本文所述，针对流感病毒的本发明的脂肽在不存在外来佐剂时也诱导病毒特异性CTL应答，这一点从它们诱导强CTL介导的病毒清除应答、诱导CD8+T细胞迁移至肺以及正调节MHCII类分子在幼(immature)树突细胞(DC)上的表面表达而反映出。与具有N-末端偶联的脂质的脂肽相比，在给予本发明脂肽后树突细胞的成熟增强这一点与增强的辅助T细胞表位呈递一致。本领域技术人员清楚，辅助T细胞和CTL表位的性质在本发明中不是关键的。将脂质部分偶联至构建体的多肽部分内的一或多个赖氨酸残基或赖氨酸类似物残基的s氨基基团的这一新途径具有广泛的应用。因此，基于本文的结果，应能理解各种辅助T细胞和CTL表位可以用于脂肽构建体。附图简述图1是一示意图，其显示了用于本研究的肽和脂肽构建体的一般结构。肽结构由一个CD4+辅助T细胞表位[Th]和一个CTL细胞表位[CTL]组成，它们组装成串连线性序列，具有一连接内部赖氨酸残基(即[Th]-Lys-[CTL])或者不具有任何内部赖氨酸残基(即[Th-[CTL)。脂肽是分支结构，其中脂质部分通过在大约分子中心的位于两个表位之间的一个赖氨酸残基Lys的s氨基基团而附着^[Th]-Z_ys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL];[Th-Lys(Pam2Cys-Ser-SerHCTL]或[Th丄ys(Pam,Cys-Ser-Ser)-[CTL)。在分支构建体的情况中，附着脂质的位于中心的赖氨酸残基用斜体Lys表示。在一些情况中，在肽和脂质部分之间加入2个丝氨酸残基(Ser-Ser)。对于脂肽Pal2LysLys[Th]-[CTL]，网个棕榈酸残基加到N-末端赖氨酸残基的ot和e氨基基团上，[Th]附着于氨基酸序列中的倒数第2个赖氨酸的s氨基基团上。在[ThH_ys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTLI中，两个胆固醇残基附着于N-末端赖氨酸残基。图2示出附着于图1所示结构的脂质部分的肽部分的一级氨基酸序列。包含这些氨基酸序列的未脂化肽如下所示(i)[Th]由来自流感病毒血凝素轻链的CD4+辅助T细胞表位组成，如SEQIDNO:1所示；(ii)[CTL]由流感病毒毒株A/PuertoRico/8/34(PR8;H1N1)的核蛋白的第147—155位氨基酸残基组成的免疫显性H-2^-限制性CTL表位组成，如SEQIDNO:2所示；(iii)[Th-[CTL]由具有(i)和(ii)的多肽组成，组装的肽的序列如SEQIDNO:3所示;(iv)[Th-Lys-[CTL]由具有由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔的(i)和(ii)的多肽组成，组装的肽的序列如SEQIDNO:4所示；(v)[P25]-jLys-[SIINFEKL]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQIDNO:20)和来自卵清蛋白的一个CTL表位(SEQIDNO:173)组成，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQIDNO:174所示；(vi)[P25]-Lys-[LL091-99]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQIDNO:20)和来自L/ste^a/7o/70cytogfeA7es的一个CTL表位(SEQIDNO:172)组成，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQIDNO:175所示；(vii)[P25]-Lys-[HCV]由来自称为P25的CDV-F蛋白的一个辅助T细胞表位(SEQIDNO:2O)和来自丙型肝炎病毒核心蛋白的一个CTL表位(SEQIDNO:176)组成，，这两个表位由一个赖氨酸残基(粗体下划线残基)分隔，组装的肽的序列如SEQIDNO:177所示。包含这些氨基酸序列的脂肽如下指代(i)[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]由肽[Th]丄ys-[CTL](即SEQIDNO:4)和缀合于内部赖氨酸(粗体下划线残基)的s氨基基团的式(lll)的脂质组成；(ii)[Th]-jLys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL由肽[Th丄ys画[CTL](即SEQIDNO:4)和缀合于内部赖氨酸(粗体下划线残基)的s氨基基团的式(IV)的脂质组成；(iii)[P25]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99]由肽[P25]丄ys.[LL091-99]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的s氨基基团的式(IV)的脂质组成；(iv)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]由肽[P25]丄ys陽[SIINFEKL]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的s氨基基团的式(IV)的脂质组成；(v)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV]由肽[P25〗-/_ys-[HCV]和缀合于所述肽的内部赖氨酸(粗体下划线残基)的s氨基基团的式(IV)的脂质组成。图3示出用图1所示脂肽引发并随后用流感病毒攻击的小鼠的降低的病毒负荷。小鼠用在50piPBS中的9nmol脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL和[Th]-Lys(Pam2Cys誦Ser画Ser)國[CTL鼻内接种(第2列和第3列)，或者用50PBS中的[Th争[CTL]肽(第1列)或仅用PBSC第4列)接种。肽和脂肽的代号见图2。在接种后第9天，用甲氧氟烷麻醉小鼠，并用30000噬斑形成单位的称为A/Memphis/1/71(Mem71)的流感病毒亚型H3N1鼻内攻击。5天之后，取出它们的肺，通过在MDCK细胞上的噬斑分析来分析感染性病毒的存在。每个条代表来自一组5个BALB/c小鼠的病毒效价的几何平均效价，误差杆代表平均值的标准差。条上的数字代表相对于PBS对照的肺病毒效价降低百分比。图4a示出在接受图2所指示的脂肽的免疫小鼠中增强的脂肽诱导的病毒清除率。小鼠用在50piPBS中的9nmole月旨肽[Th]-Lys(Pam3Cys画Ser-Ser)曙[CTL和[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]接种(第2列和第3列)，或者用50ylPBS中的[Th]-Lys-[CTL]肽(第1列)或仅用PBS(第4列)接种。在接种后第28天，用30000噬斑形成单位的Mem71病毒攻击小鼠。肽和脂肽的代号见图2。数据以攻击后第5天肺病毒效价降低百分比表示。肽和脂肽的代号见图2。数据以攻击后第5天肺病毒效价降低百分比表示。数据显示，在攻击后5天，与肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[Th-^s(Pam3Cys國Ser-Ser)-[CTL](第2列)或[ThKys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL(第3列)免疫的小鼠的肺中有增加的感染性病毒降低。图4b示出在接受具有图2代号的脂肽的免疫小鼠中増强的T细胞激活。小鼠用在50ijIPBS中的9nmole脂肽[化]-/^5^3013〇乂5-36「-Ser)-[CTL]和[Th丄ys(Pam2Cys-Ser-SerHCTL]接种(第2列和第3列)，或者用50piPBS中的[ThKys國[CTL肽(第1列)或仅用PBS(第4列)接种。接种后9天杀死接种的小鼠并进行支气管肺泡灌洗术(BAL)。通过将BAL样品在培养皿中于37。C保温1小时除去粘附细胞。回收非粘附细胞并染色检测CD8和CD4表达。用流式细胞计量术分析细胞。基于正散射和旁散射模式识别淋巴细胞群，并且分析了10000个淋巴细胞。数据以BAL液中是CD8+淋巴细胞的非粘附细胞百分比表示。数据显示，在攻击后5天，与肽(第1列)或PBS(第4列)相比，用脂肽[ThKys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTLI(第2列)或[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](第3列)接种的小鼠的BAL样品中有增加的病毒特异性CD8+T细胞的激活。肽和脂肽的命名见图2。图4c示出作为对如图2命名的脂肽的应答，树突细胞的成熟增加。将将一种BALB/c脾来源树突细胞系(D1细胞)与0.45nmole/mL肽[Th〗-Lys-[CTL](第1歹ij)或脂肽[ThKys(Pam3Cys-Ser画Ser)國[CTL(第2列)或[Th:Kys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL(第3列)或者与作为阴性对照的培养基(第4列)或作为阳性对照的脂多糖(LPS;第5歹U)保温过夜。通过流式细胞计量术确定表达高水平MHCII类分子因而呈成熟状态的D1细胞的百分比。肽和脂肽命名见图2。数据显示与暴露于肽和培养基相比，暴露于脂肽[Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-/^s(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]后树突细胞表面上的MHCII类分子的表达增强(即树突细胞成熟增强)。图5示出在用x轴上指示的合成免疫原接种的小鼠中诱导的肺病毒清除应答，所述合成免疫原每个均包括SEQIDNO:1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示的〃-2^-限制性CTL表位。各组的5只小鼠用在PBS中的9nmole脂肽鼻内接种。在接种后28天用104'5PFU的Mem71流感病毒鼻内攻击小鼠。通过在MDCK细胞单层上的噬斑形成确定在攻击5天后取样的肺匀浆液中感染性病毒的效价。每个圆圈代表一只小鼠的病毒效价，线条代表一组的几何平均效价。相对于PBS对照组的平均病毒效价降低百分比在每一列数据之上显示。图6示出在病毒攻击期间CTL决定簇特异性CD8+-T细胞加速流入脂B太接种的小鼠的肺中。脂肽包含SEQIDNO:1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示的H-2七限制性CTL表位。各由3只小鼠组成的各组鼻内用9nmole所示脂肽接种。在接种后第28天，将小鼠用104'5PFU的Mem71流感病毒进行鼻内攻击。通过胞内细胞因子产生分析对在攻击后第5天小鼠肺中的CTL决定簇特异性IFN-y分泌细胞进行计数。每一样品分析10,000个CD8+细胞。数据代表每组小鼠的平均值和标准差。图7示出在病毒攻击后CTL决定簇特异性CD8-T细胞加速流入脂肽接种的小鼠的肺中。脂肽包含SEQIDNO:1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示的H-2^限制性CTL表位。小鼠用在PBS中的9nmole指示的肽鼻内接种。接种后9天，小鼠用104'5PFU的Mem71流感病毒进行鼻内攻击。在感染后第5天，通过用抗CD8抗体和加载CTL表位的MHCI类复合物染色来自肺的淋巴细胞而计数肺中CTL决定簇特异性CD8T细胞总共分析了30,000个CD8T细胞。图8示出在首次用于实验的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。体内CTL决定簇特异性细胞毒性用经CTL决定簇剌激(pulsed)的并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。每一靶细胞群的15x106个细胞的混合物在感染后第4天静脉注射进首次用于实验的小鼠。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1x106个淋巴细胞。图9示出脂肽接种的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。用在PBS中的9nmole包含SEQIDNO:1所示CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示〃-2气限制性CTL表位的[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL鼻内接种小鼠。在第28天用Mem71攻击小鼠。体内CTL决定簇特异性细胞毒性用经CTL决定簇刺激的并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。每一靶细胞群的15x106个细胞的混合物在感染后第4天静脉注射进脂肽接种的被攻击的小鼠。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1x106个淋巴细胞。图10示出基于各种肽的免疫原诱导表位特异性CTL的能力。脂肽包含SEQIDNO:1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示的H-,限制性CTL表位。用在PBS中的各种脂肽鼻内接种各由3只小鼠组成的各组，并在第28天用Mem71攻击。为了分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，用CTL决定簇剌激并用高密度CFSE标记同基因脾细胞。通过共注射用低密度CFSE标记的同基因脾细胞而控制抗原特异性溶解。在感染后第4天静脉注射每一靶细胞群的15x106个细胞的混合物。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞计量术分析脾中是否存在CFSE-high和CFSE-low细胞群。每一样品总共分析1x106个淋巴细胞。各个小鼠用实心方块代表，条代表几何平均效价。图11示出脂肽对干扰素y产生细胞的诱导。包含一种辅助T细胞表位和/Jste/v'amonocytogenes的CTL表位并经位于所示表位之间的一内部赖氨酸残基的e氨基基团与Pam2Cys连接的肽(即图2列出的基于SEQIDNO:175的肽[P25]丄ys(Pam2Cys隱Ser-Ser)-[LL091-99])或者基于这一结构且其中Pam2Cys经所述赖氨酸的s氨基基团连接的脂肽用于免疫小鼠。如x轴所示，5只BALB/c小鼠用细菌静脉接种或者用9nmole月旨化肽(lipidatedpeptide)[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)_[LL091-99]或9nmole非脂化肽(non-lipidatedpeptide)[P25-/_ys-[LL091-99](SEQIDNO:175;图2)或磷酸缓冲盐水(PBS)皮下免疫。从接种动物获得脾细胞并用具有SEQIDNO:172所示序列的分离的CTL表位(空心条)体外刺激或不用抗原剌激(实心条)，28天后测量存在的(IFN-y)产生细胞数。纵坐标指示每1,000,000个脾细胞中的IFN-y产生细胞数。数据显示用脂肽接种的小鼠的IFN-y产生细胞数增加，表明脂肽相对于非脂化的肽具有增强的激活T细胞的能力。图12示出用图2中命名为『25]-/_)^^3012〇乂8-36「-36「)-[1±091-99]的脂肽免疫的小鼠具有抗L.momjcytogeAes感染的增强的保护。如x轴所示，5只BALB/c小鼠用1000个细菌静脉接种(第1列)，或者用PBS(第2列)或9nmol[P25-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99]肽(第3列)或9nmol非脂化[P25丄ys-[LL091-99]肽(SEQIDNO:175;第4列)皮下免疫。小鼠用完整细菌攻击，在攻击后28天测量肝中存在的集落形成单位数(纵坐标)。图13示出用脂肽免疫产生的抗B16黑素瘤的保护作用。C57BL/6小鼠用20nmole脂化肽[P25]丄ys(Pam2Cys-Ser-SerHSIINFEKL(空心圆)、非脂化肽[P25]-/_ys-[SIINFEKL](空心三角)或用PBS(空心方块)皮K免疫尾根。14大后小鼠用2x10SB16-OVA细胞(每组n-6)背部皮下攻击，如述监测肿瘤生长(Anraku，efa/.，JV7ro/.76;3791-3799,2002)。图14示出由免疫后保持无肿瘤的动物百分比确定的用脂肽免疫原对Lewis肺肿瘤的治疗性处理。用3x1C^个已用卵清蛋白转染并因此表达CTL表位SIINFEKL的LewisLung肿瘤细胞[Nelsonefa/.，J/mA7(VAo/.■/66:5557-5566，2001]注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圆)、非脂化肽[P25]-Lys-[SIINFEKL](空心三角)或PBS(空心方块)。接受肿瘤细胞后11天给予第二次类似剂量的免疫原。监测动物的肿瘤发生，当肿瘤面积超过100mrr^时使动物安乐死。图15示出由免疫后动物存活率确定的用脂肽免疫原对Lewis肺肿瘤的治疗性处理。用3x10A个己用卵清蛋白转染并因此表达CTL表位SIINFEKL的Lewis肺肿瘤细胞[Nelsona/.,J//rm"rJo/."/66:5557-5566,2001]注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]丄ys(Pam2Cys画Ser-Ser)-[SIINFEKL](空心圆)、非脂化肽[P25丄ys-[SIINFEKL(空心三角)或PBS(空心方i央)。接受肿瘤细胞后11天给予第二次类似剂量的免疫原。监测动物的存活率，当肿瘤面积超过100mrr^时使动物安乐死。图16示出基于肽和脂肽的免疫原正调节人树突细胞上MHCII类、CD83和CD86的表达的能力。人单核细胞衍生的树突细胞与培养基单独、LPS(5叩/mL)、非脂化肽[P25]-Lys-[HCV(5jjg/mL)或脂肽(5pg/mL)保温48小时，之后在流式细胞计量术分析之前用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合抗体染色。柱状图代表了进入正散射和旁散射点图上的活的大粒细胞(livelargegranularcellsgatedontheforwardandsidescatterdotplot)。柱状图灰色区域以及给出的值相应于在分析的群体内表达高水平抗原的细胞白分比。辅助T细胞表位鉴别自Mobillivirus并具有氨基酸序列KLIPNASLIENCTKAEL(SEQIDNO:20);具有氨基酸序列DLMGYIPLV(SEQIDNO:176)的CTL表位是一种来自丙型肝炎病毒核心蛋白的HLAA2限制性CTL表位。优选实施方案的详细描述微本发明的一个方面提供了分离的脂肽，其包含与一或多个脂质部分缀合的多肽，其中(i)所述多肽包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列包含(a)—种辅助T细胞(Th)表位的氨基酸序列和一种CTL表位的氨基酸序列，其中所述这两个氨基酸序列是不同的；禾口(b)—或多个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基，用于经所述赖氨酸或赖氨酸类似物的s氨基基团或末端侧链基团附着每一个所述脂质部分；以及(ii)所述一或多个脂质部分的每一个均直接或间接共价附着于所述一或多个内部赖氨酸残基的s氨基基团或所述内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。本文所用术语"脂肽"是指任何非天然存在的物质组合物，其包含直接或间接缀合的一或多个脂质部分(lipidmoiety)和一或多个氨基酸序列，所述物质组合物基本上不含同种非缀合脂质或蛋白质。术语"直接"是指脂质部分和氨基酸序列并列在所述脂肽中(即它们不由一个间隔分子隔开)。术语"间接"是指脂质部分和氨基酸序列由包含一或多个含碳分子如一或多个氨基酸残基的间隔物隔开。氨基酸序列可以是任意长度，由辅助T细胞表位和CTL表位的功能性需要而限制。本文所用术语"内部赖氨酸残基"是指包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽中的赖氨酸残基，其中所述赖氨酸不是所述多肽的N-末端氨基酸残基或者C-末端残基。因此，内部赖氨酸残基可以是辅助T细胞表位或CTL表位的C-末端或N-末端残基，条件是其位于多肽的内部。这意味着用于附着脂质的赖氨酸残基是存在于辅助T细胞表位的氨基酸序列中或CTL表位的氨基酸序列中的残基。内部赖氨酸残基也可以独立于辅助T细胞表位或CTL表位之外，在这种情况下它必须连接多肽的这两个表位。类似地，术语"内部赖氨酸类似物"是指包含辅助T细胞表位和CTL表位的多肽中的赖氨酸类似物残基，其中所述赖氨酸类似物不是所述多肽的N-末端氨基酸残基或C-末端残基。确定一个赖氨酸残基是否是"内部"的标准同样适用于确定一个赖氨酸类似物是否是内部的。术语"赖氨酸类似物"是指能掺入到肽的内部的合成化合物，其具有合适的侧基可以偶联脂质部分，包括具有这种氨基侧基的氨基酸类似物或非天然存在的氨基酸。优选的赖氨酸类似物包括下述通式(V)的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>其中n是从0到3的整数，X是选自NH、O和S的所述内部赖氨酸类似物残基的末端侧链基团。更优选地，n是具有从1到3的数值的整数。更优选地，X是氨基。在一个特别优选的实施方案中，赖氨酸类似物选自2，3-二氨基丙酸(Dpr)、2，4-二氨基丁酸(Dab)和2，5-二氨基戊酸[即鸟氨酸(Om)]。本领域技术人员/解术语"s氨基基团"的含义。术语"末端侧链基团"是指在赖氨酸类似物侧链上的远离所述类似物oc-碳的取代基，如Dpr的p-氨基、Dab的，氨基或Orn的S-氨基。优选地，脂质部分经赖氨酸残基的s氨基基团附着或者附着于位于辅助T细胞表位和CTL表位的氨基酸序列之间的所述内部赖氨酸类似物的末端侧链基团上。本发明脂肽的增强的引起T细胞应答的能力反映在它们正调节幼树突细胞(DC)、特别是D1细胞上MHCII类分子的表面表达的能力上，以及反映在增加的免疫动物的组织样品中CD8+T细胞数上。在用病毒病原体的CTL免疫的动物中，本发明脂肽引起T细胞应答的能力增强也通过免疫动物后病毒清除增强而指示。优选地，脂肽是可溶的，更优选地是高度可溶的。本领域技术人员己知的是，赖氨酸的s氨基基团是这一氨基酸的侧链的末端氨基基团。使用内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物的末端侧链基团交联脂质部分便于使多肽部分作为掺入辅助T细胞表位和CTL表位的共线性氨基酸序列而合成。脂质经赖氨酸残基的s氨基基团或赖氨酸类似物的末端侧链基团而附着的脂肽与脂质经肽中赖氨酸的ot-氨基基团而附着的脂肽有明显的结构区别。因此，特别优选的是脂质部分所附着的至少一个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物位于多肽部分内，从而分隔免疫功能表位。例如，所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物可以作为表位之间的间隔和/或连接残基。自然地，当内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间时，脂质部分也将位于这些表位之间的一个位置，形成多肽氨基酸序列的一个分支。如本文所示，使用一个单赖氨酸残基分隔，CTL和辅助T细胞表位(例如SEQIDNo:4)。本发明很明显包括所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基位于一第三种氨基酸序列内，该第三种氨基酸序列不是CTL表位或辅助T细胞表位。例如，所述内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物可以缀合于一或多个不同氨基酸残基。内部赖氨的s氨基基团或内部赖氨酸类似物的末端侧链基团可以用与用于保护其它氨基酸的a-氨基和侧链官能团呈正交(orthogonally)的化学基团保护。以此方式，内部赖氨酸或赖氨酸类似物的s氨基基团或其它侧链基团可以选择性暴露以允许化学基团如含脂质部分合适地附着于s氨基基团或侧链氨基。为了用Fmoc化学进行肽合成，通过修饰的氨基酸残基Fmoc-Lys(Mtt)-OH(A/a-Fmoc-A/^/-伊基三,伊基-L-賴富歷J提供合适的正交保护的赖氨酸e基团。对于本文所涉及的各种赖氨酸类似物，有类似的合适正交保护的侧链基团可以利用，例如Fmoc-Orn(Mtt)-OH(/Va-Fmoc-A/^4-伊基^^,伊基丄-鸟賓朥入Fmoc-Dab(Mtt)-OH(A/a-Fmoc画/V^4-尹基三孝伊基丄画二賓基r虔J和Fmoc-Dpr(Mtt)國OH(A/a-Fmoc誦A^4-伊基三,伊基丄-二賓基巧徵。侧链保护基Mtt在存在于赖氨酸或赖氨酸类似物a-氨基基团上的Fmoc被除去的条件下是稳定的，但是其可以用存在于二氯甲垸中的1%三氟乙酸而选择性除去。Fmoc-Lys(Dde)-OH(A/a-Fmoc-A/s隱7國〖4,4-二伊募-2,6画二賓/ef界3"-基J乙基丄-賴賨剩或Fmoc國Lys(ivDde)-OH(//"-/^00//&7-(4，4-二伊基-2，6-二賓/ef界3小萄-3-伊基r基丄-賴賓勒也可以如此应用，其中Dde侧链保护基在肽合成过程中通过用肼处理而选择性除去。为了用Boc化学进行肽合成，可以使用Boc丄ys(Fmoc)-OH。侧链保护基Fmoc可以通过用哌啶或DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)处理而选择性除去，但是当用三氟乙酸从a末端除去Boc基团时，Fmoc仍留在原位。优选地，辅助T细胞表位和CTL表位通过至少一个或两个或三个或四个或五个氨基酸残基包括单个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基而隔开。很显然本发明包括添加多个脂质部分至多肽部分上。例如，多肽可包括多个内部赖氨酸残基和/或多个内部赖氨酸类似物。如果多个内部赖氨酸或多个赖氨酸类似物更紧密地位于一起则可能在脂质添加时发生空间位阻，从而产生终产物混合物或者收率降低。与这一点相关的是无需包含辅助T细胞表位的完整氨基酸序列或者包含CTL表位的完整氨基酸序列均具有免疫应答。因此所述氨基酸序列在包含所述表位的同时也可具有额外的不具备辅助T细胞活性或CTL表位的序列。当这种额外序列包括一或多个内部赖氨酸或赖氨酸类似物残基时，这些残基的末端侧链基团可以作为脂质部分的附着位点。自然地，必须保持辅助T细胞功能和CTL表位功能。用于附着脂质部分的内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物的位置应该也被选择，从而脂质的附着不会干扰辅助T细胞表位或CTL表位在给予脂^:的个体中的免疫功能。例如，根据脂质部分的选择，所述脂质在CTL表位内的附着可能在空间上阻碍CTL表位呈递。下述通式(VI)提供了本发明脂肽的一般优选形式，其中内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间。式(VI):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>其中-表位是辅助T细胞表位或CTL表位；A存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的一种氨基酸间隔物组成；n是值为1、2、3或4的整数；X是选自NH，O和S的末端侧链基团，优选由NH组成；Y存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的一种氨基酸间隔物组成，其中优选的是所述氨基酸为丝氨酸；以及Z是脂质部分，优选为Pam2Cys或Pam3Cys。辅助T细胞表位是本领域技术人员已知能增强一特定耙个体(即人类个体，或特异的非人动物个体如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、马、猪或山羊)中的免疫应答的任何辅助T细胞表位，优选的辅助T细胞表位长度至少约10-24个氨基酸，更通常约15至约20个氨基酸。混杂或允许辅助T细胞表位是特别优选的，因为它们能容易地化学合成，并且无需使用包含多个辅助T细胞表位的较长多肽。适于用于本发明脂肽中的混杂或允许辅助T细胞表位的例子选自如下一组(i)破伤风类毒素肽(TTP)的啮齿类或人类辅助T细胞表位，如TTP的氨基酸830-843(Panina-Bordignonefa/"￡"厂.丄/扁"a.79，2237-2242,1989);(ii)P/asmocf/t/n7fe/c/^ari/mpfg27的啮齿类或人类辅助T细胞表位；(iii)乳酸脱氢酶的啮齿类或人类辅助T细胞表位；(iv)HIV包膜蛋白或HlVgp120的啮齿类或人类辅助T细胞表位(Berzofskyefa/.,丄C//>7./,sf.88，876-884，1991);(v)从已知锚蛋白的氨基酸序列预测的合成的人类辅助T细胞表位(PADRE)(Alexanderefa/"7，751-761，1994);(vi)麻疹病毒融合蛋白(MV-F;Mullerefa/.,Mo/./mmuno/.32，37~47,1995;Partidosefa/.,丄Gen.V7ra/.,77,2099-2105,1990)的啮齿类或人类辅助T细胞表位；(vii)包含犬瘟热病毒融合蛋白(CDV-F)的至少约10个氨基酸残基、例如来自CDV-F的氨基酸位置148-283的辅助T细胞表位(Ghoshefa/.,/mmi;no/.704,58-66，2001;InternationalPatentPublicationNo.WO00/46390);(viii)衍生自MUC1粘蛋白的胞外串联重复结构域的肽序列的人类辅助T细胞表位(USPatentApplicationNo.0020018806);(ix)流感病毒血凝素(IV-H)的啮齿类或人类辅助T细胞表位(Jacksona/.V7ra/.798，613-623,1994);以及W口蹄疫病毒VP3蛋白的牛或骆驼辅助T细胞表位，其包含口蹄疫病毒(FMDVAKau化euren株)的VP3蛋白的残基173-176或另一FMDV毒株的相应氨基酸。如本领域技术人员已知的，一个辅助T细胞表位可以由一或多个不同物种识别。因此，本文中任何辅助T细胞表位的命名不应被视为仅限于表位被识别的该物种的免疫系统。例如，一个啮齿类辅助T细胞表位可以被小鼠、大鼠、兔、豚鼠或其它啮齿类或者人或狗的免疫系统识别。更优选地，辅助T细胞表位包含选自如下一组的一个氨基酸序列(i)来自IV-H的ALNNRFQIKGVELKS(SEQIDNO:1);(ii)来自IV-H的GALNNRFQIKGVELKS(SEQIDNO:14);(iii)来自MV國F的LS曰KGVIVHRLEGV(SEQIDNO:15);(iv)来自CDV-F的TMQITAGIALHQSNLN(SEQIDNO:16);(v)来自CDV隱F的IGTDNVHYKIMTRPSHQ(SEQIDNO:17);(vi)来自CDV-F的YKIMTRPSHQYLVIKLI(SEQIDNO:18);(vii)来自CDV-F的SHQYLVIKLIPNASLIE(SEQIDNO:19);(viii)来自CDV-F的KLIPNASLIENCTKAEL(SEQIDNO:20);(ix)来自CDV曙F的UENCTKAELGEYEKLL(SEQIDNO:21);(x)来自CDV-F的AELGEYEKLLNSVLEPI(SEQIDNO:22);(xi)来自CDV-F的KLLNSVLEPINQALTLM(SEQIDNO:23);(xii)来自CDV-F的EPINQALTLMTKNVKPL(SEQIDNO:24);(xiii)来自CDV-F的TLMTKNVKPLQSLGSGR(SEQIDNO:25);(xiv)来自CDV-F的KPLQSLGSGRRQRRFAG(SEQIDNO:26);(xv)来自CDV-F的SGRRQRRFAGWLAGVA(SEQIDNO:27);(xvi)来自CDV誦F的FAGWLAGVALGVATAA(SEQIDNO:28);(xvii)来自CDV-F的GVALGVATAAQITAGIA(SEQIDNO:29);(xviii)来自CDV隱F的GIALHQSNLNAQAIQSL(SEQIDNO:30);(xix)来自CDV-F的NLNAQAIQSLRTSLEQS(SEQIDNO:31);(xx)来自CDV-F的QSLRTSLEQSNKAIE曰(SEQIDNO:32);(xxi)来自CDV-F的EQSNKAIEEIREATQET(SEQIDNO:33);(xxii)来自CDV-F的SSKTQTHTQQDRPPQPS(SEQIDNO:34);(xxiii)来自CDV-F的QPSTELEETRTSRARHS(SEQIDNO:35);(xxiv)来自CDV-F的RHSTTSAQRSTHYDPRT(SEQIDNO:36);(xxv)来自CDV-F的PRTSDRPVSYTMNRTRS(SEQIDNO:37);(xxvi)来自CDV-F的TRSRKQTSHRLKNIPVH(SEQIDNO:38);(xxvii)来自CDV-F的TELLSIFGPSLRDPISA(SEQIDNO:39);(xxviii)来自CDV-F的PRYIATNGYLISNFDES(SEQIDNO:40);(xxix)来自CDV-F的CIRGDTSSCARTLVSGT(SEQIDNO:41);(xxx)来自CDV-F的DESSCVFVSESAICSQN(SEQIDNO:42);(xxxi)来自CDV-F的TSTIINQSPDKLLTFIA(SEQIDNO:43);(xxxii)来自CDV-F的SPDKLLTFIASDTCPLV(SEQIDNO:44);(xxxiii)来自MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRAPGSTAPP(SEQIDNO:45);(xxxiv)来自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASSL(SEQIDNO:46);(xxxv)来自MUC-1的GVTSAPDTRPAPGSTASL(SEQIDNO:47);(xxxvi)来自MUC-1的TAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPKKG(SEQIDNO:48);(xxxvii)MUC-1的STAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPK(SEQIDNO:49);(xxxviii)来自FMDV-VP3蛋白的GVAE(SEQIDNO:50);(xxxix)FMDV-VP3的TASGVAETTN(残基170—179)(SEQIDNO:51);和(Xl)来自FMDV的TAKSKKFPSYTATYQF(SEQIDNO:52).本文所述辅助T细胞表位仅为举例目的而包括进来。使用本领域技术人员己知的标准肽合成技术，本文所述的辅助T细胞表位口j以用一不同的辅助T细胞表位取代以适应本发明脂肽在不同物种中的应用。因此，本领域技术人员己知的用于引起或增强在靶物种中的免疫应答的另外的辅助T细胞表位不被排除在外。另外的辅助T细胞表位可以使用用于鉴别合适序列的组分蛋白、蛋白片段和肽的体外T细胞剌激技术经详细分析而鉴别(GoodmanandSercarz，細.尺ev./訓ivno/.,"/，465，(1983);Berzofsky,//:"TheYearinImmunology,Vol.2"page151，Karger，Basel,1986;andLivingstoneandFathman,>Ann.Rev./mm"ro/.,5，477，(1987))。CTL表位方便地衍生自病毒、原核生物或真核生物的免疫原性蛋白、脂蛋白或糖蛋白的氨基酸序列，包括但不限于衍生自哺乳动物个体或感染所述个体的细菌、真菌、原生动物或寄生虫的CTL表位。CTL表位的Mimotope特别包括在本发明范围内。当CTL表位被给予哺乳动物时，其能够引起T细胞应答，优选地通过特异于所述表位或衍生所述表位的抗原的CD8+T细胞而引起T细胞应答，更优选地，通过诱导抗衍生所述表位的病原体或肿瘤细胞的细胞介导免疫而引起T细胞应答。为便于肽合成，优选较短的CTL表位。优选地，CTL表位的长度不超过约30个氨基酸，更优选地，CTL表位序列由约25个氨基酸残基或更少残基组成，更优选地由少于20个氨基酸残基组成，甚至更优选长度约8-12个氨基酸残基。来自寄生虫的优选的CTL表位是与利什曼原虫病(leishmania)，症疾，锥虫病(trypanosomiasis)，巴贝虫病(babesiosis)和血吸虫病(schistosomiasis)相关的CTL表位，例如选自如下一组的一种寄生虫的抗原的CTL表位FVasmoGf/i/mfe/c/》aAiy/77,'C/rcwmsporazoa,'Le/s/7脂n/ac/o/iovan/;Tbxop/asmagone///;Sch/stosoma/77anso/7/;Sc//stosomayapon/civm;Sch/stosomahe脂toib/'"m，.andP.fe/c/]oa/x//77的特别优选的CTL表位衍生自选自如下一组的一种抗原环子孢子蛋白(CSP)，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝阶段蛋白1(LSA1)，裂殖子表面蛋白1(MSP1)，丝氨酸重复抗原(SERA)，和AMA-1抗H(Amante，efa/.丄/mmt/no/,f59，5535-5544，1997;.Chabaefa/./nf.J./mmunop/iarm.20，259-273，1998;Shiefa/"Proc./Vaf/Acacf.Sc/f"SA)96，1615-1620，1999;Wangefa/.Sc/ence282,476-479，1998;andZeveringa/-/mmwno/.94，445-454，1998)。ofonovan/的特别优选的CTL表位衍生自重复肽(Liewa/.,J.E早Meof.772，1359(1990》。T.9-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99])接种或用1000个细菌接种，所述脂化肽中脂质附着于两个表位之间的大约分子中心的位置。在肽疫苗情况下进行皮下接种，在细菌情况下进行静脉内接种。在体外用CTL表位或无抗原刺激后第28天测量脾中存在的产生干扰素i的细胞数。纵轴示出每1,000,000个脾细胞中产生干扰素-Y的细胞数。包诊欽膚歪A游CTL表位游應9只c57bl/6小鼠(8-10周龄)的每一只用在100jjI盐水中的20nmole月旨化的[P25H_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL或非脂化的[P25]丄ys-[SIINFEKL肽皮下免疫。在脂化肽情况下，脂质附着于两个表位之间的大约分子中心的位置。咨^^M^炎疯毒拔W'歪A游C71人单核细胞衍生的树突细胞与脂肽[P25]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5pg/mL)保温48小时，之后用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合的抗体染色以进行流式细胞计量术分析。微减蘇攻絲瘦射、,f经甲氧氟垸麻醉的预先用包含流感病毒CTL表位的肽免疫的小鼠用104'5PFU的感染性Mem71流感病毒进行鼻内(i.n.)攻击。每只小鼠接受50pl用PBS稀释的尿囊液形式的病毒。攻击后5天通过颈脱节杀死小鼠，取出肺并无菌转移进含有每ml补加100U青霉素、100pg链霉素和30jug庆大霉素的1.5mlHank's平衡盐溶液的瓶子中。用组织匀浆机制备肺匀浆，通过在300Xg离心5min沉淀细胞材料。取上清液分成等份，储存在-70。C备用。肺上清液中的感染性病毒效价用在MDCK细胞上的噬斑分析(Tannockefa/，//fecf./A77Am//7.43/,457-462，1984)测定。屑L/7o/7ocytoge/7es^^^i免瘦游^/、潔在致敏后28天通过静脉注射细菌攻击用9nmo1肽免疫原或PBS皮下免疫的或用1000个细菌静脉内免疫的小鼠，在攻击后28天测定肝中存在的细菌的菌落形成单位数。1#蘑潘蘑攻击免座游7、廣黑激攻击用非脂化『25]-/^5-[31旧「￡《1_]或脂化肽『25]-/_>(3巾20乂5-36「-Ser)-[SIINFEKL]接种14天后，每组6只小鼠用2乂105个表达卵清蛋白[B16-OVA]因而表达CTL表位SIINFEKL的黑素瘤细胞(Bellone,efa/，丄/mmuro/.765:2651-2656)攻击。在注射之前用电动剃须刀去除注射部位周围的毛发以便测量出现的肿瘤。监测生长的肿瘤，当肿瘤大小达到15X15mm时杀死动物。在肿瘤攻击后指定天数计算每个处理组的平均肿瘤面积。Lew/s厕蘑攻击小鼠用3x1C^个已用卵清蛋白转染因而表达CTL表位的Lewis肺肿瘤细胞(Nelsonefa/.,J/mmivno/."/66:5557-5566,2001)接种。接受肿瘤细胞后，在动物尾根部皮下接种20nmole脂化肽[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL、非脂化肽[P25-/_ys-[SIINFEKL]或PBS。接受肿瘤细胞11天后给予第2剂免疫原。监测动物中肿瘤发生和动物存活，当肿瘤面积超过100011712时对动物实行安乐死。if##^CD8+r潘應游，衮伴染经使用H-2Kd糖蛋白和结合的CTL肽(TYQRTRALV;SEQIDNO:2)的四聚体复合物鉴别特异于脂肽免疫原中的SEQIDNO:2所示的免疫显性H-2Kd限制性CTL表位的CD8+T细胞(Bodmera/，Ce〃52:253-258,1988;Shermana/，丄Exp.A/teof.775.'1221-1226，1992)，该免疫显性H-2Kd限制性CTL表位由流感病毒株A/PuertoRico/8/34(PR8;H1N1)的核蛋白的氨基酸残基147-155组成。单体由墨尔本大学微生物学和免疫学系的PeterDoherty教授惠赠，并且是在St.JudeChildren'sResearchHospital,MemphisTN，USA制备。四聚体通过以4:1的摩尔比将单体与链亲和素-藻红蛋白(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)保温而制备。来自肺的淋巴细胞首先用20^L正常小鼠血清(NMS)在室温处理5分钟，然后用1:25稀释的四聚体复合物染色60分钟。之后，用缀合有别藻蓝蛋白的抗CD8a(53-6.7)在冰上染色30分钟，洗涤2次，经荧光素激活的细胞分选仪(FACSort，BectonDickinson,SanJose's，USA)分析。数据用HowJo(TreeStar,lnc，CA，USA)分析。7"潘應線基T细胞培养基由补加10%(vol/vol)热灭活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、2mM丙酮酸钠、30|jg庆大霉素/ml、100pg链霉素/ml、100lU青霉素/ml和1C^M2-巯基乙醇的RPM11640(CSLLtd.)组成。一智應奉丝r一^^分叛从预先用脂肽免疫原皮下免疫7天的小鼠的腹股沟淋巴结和胭淋巴结产生二级效应细胞，或者从预先用脂肽免疫原致敏至少28天的小鼠的脾细胞产生二级效应细胞(secondaryeffectorcells)。简而言之，在含有15mlT细胞培养基的25-cm2组织培养瓶(Falcon)中，将4X107个通过用Tris缓冲的氯化铵(0.15MNH4CI于17mMTris-HCI中，pH7.2)处理而耗竭红细胞的淋巴结细胞或脾细胞与107个照射的(2,200rads，6QCo源)病毒感染的或脂肽刺激的同基因脾细胞一起培养。所述病毒感染的脾细胞预先与在1ml无血清RPM1中的3000凝血单位的感染性Mem71或PR8病毒在37。C保温30min，并且在加到培养瓶中之前洗涤一次。脂肽刺激的脾细胞预先与100|jgCTL脂肽/ml在37。C保温60min并且在加入培养瓶中之前也洗涤一次。在含有5%c02的潮湿环境下于37。C培养5天后，细胞洗涤3次，用于510释放分析中。51Cr释放分析如前所述(Harling-McNabbefa/，/nf./mmt^o/."，1431-1439,1999)使用P815母细胞瘤细胞(〃-2^，DBA/2)作为靶进行，共重复3份。体内测定基于各种肽的免疫原诱导表位特异性CTL的能力。用在50|iilPBS中的各种脂肽鼻内接种每组3只小鼠，在第28天用Mem71攻击。为了分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，用CTL决定簇刺激同基因脾细胞并用高密度CFSE(2.5pM)标记。通过共注射用低密度CFSE(0.25laM)标记的同基因脾细胞而控制抗原特异性溶解。在感染后第4天静脉内注射每个靶细胞群的15x106个细胞的混合物。16小时后杀死小鼠，通过流式细胞仪分析脾中CFSE-high和CFSE-low细胞群的存在。每一样品总共分析1x106个淋巴细胞。个体小鼠用实心方块代表，条杆代表几何平均效价。CTL特异性IFN-Y分泌细胞通过由Murali-Krishnaefa/，/mmwA7/y8,177-187，1998的方法改良而来的ELISPOT分析进行计数。用50pi于PBS中的5[jg/ml大鼠抗(小鼠IFN-y)抗体(cloneR4-14a2)过夜包被平底聚氯乙烯微滴板(96孔Dynatech)。孔中的未占据位点随后通过与PBS中的10mg牛血清/ml保温1小时而封闭，用含0.05%Tween(PBST)的PBS洗板3次。然后向孔中加入在T细胞培养基中的脾或淋巴结细胞的2倍稀释液以及5X105照射的(2，200rads，6QCo源)来自未免疫小鼠的同基因脾细胞和10U重组人白介素-2(Pharmingen，SanDiego,Calif.)/孔。在存在浓度为1yg肽/ml的CTL肽或不存在CTL肽条件下于37。C、5。/。c02中培养细胞18小时。然后溶解细胞并通过首先用蒸馏水接着用PBST洗板而除去细胞。然后，加入50yl的1/500稀释的生物素化抗(小鼠IFN-y)抗体(cloneXMG1.2;Pharmingen)，在室温保温板2小时。再次洗板，向每孔中加入50pl链亲和素-碱性磷酸酶(Pharmingen;于5mg牛血清白蛋白/mlPBST中的1/400稀释液)，混合物随后进一步保温2小时。洗板，然后向每孔中加入含有1mgBCIP(5-溴4-氯-3』引哚磷酸)/ml2-氨基-2-甲基-1國丙炔醇缓冲液(Sigma)的100fjlELISPOT底物(Sedgwickefa/,丄/Awruvno/.Mef/70Qfs57,301-309，1983)。当出现蓝绿色斑点时，用水洗板并干燥，借助于倒置显微镜计数斑点。m辦潘應普泰激在基于完全IDDM的培养基中培养树突细胞(DC)，这一培养基由含有25mMHEPES且不含a-硫代甘油或L一谷氨酰胺(JRHBioscience,Lenexa，USA)并且补加10%(v/v)热灭活(56。C，30min)胎牛血清(CSLLtd,，Parkville，Victoria,Australia)、庆大霉素(24pg/mL)、谷氨酰胺(2mM)丙酮酸钠(2mM)、青霉素(100lU/mL)、链霉素(180叩/mL)和2-巯基乙醇(0.1mM)的lscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)组成。为产生DC，完全IMDM进一步补加30%来自培养的NIH/3T3细胞的上清和5。/。的呈用GM-CSF基因转染的Ag8653细胞上清形式的GM-CSF(DC培养基)。幼树突细胞的培养方法由Winzlerefa/.，丄￡xpMec/."5，317(1997)适应而来。将来自BALB/c小鼠的脾细胞在3mlDC培养基中以1.5x106细胞/55mm培养皿(Techno-Plas，S.A.,Australia)接种并在37°C、5%C02下保温。用于培养的所有设备均是无热原的。每4天更换培养基，且全部细胞均返回培养皿中。在第12天，通过用力抽吸培养基收集悬浮的和弱粘附的细胞。用2mlPBS重复这一程序。弃去剩余的强粘附细胞。离心沉淀收集的细胞并再接种于一新的培养皿。随后细胞保持在培养基更换和传代的4天交替循环中。连续培养1个月后，漂浮的和半粘附的细胞呈现幼DC的表观和染色特征，被称为D1细胞。在这些传代条件下，大部分培养的D1细胞保持未成熟表型，其特征为细胞表面MHCII类分子呈中等表达水平。W鄉微《银縱封藩将D1细胞(1x105个细胞/样品展种在具有1mLDC培养基的新Petri培养皿中并与溶解在完全IMDM培养基中的0.0045nmole脂肽保温。纯化自Lipopolysaccharide(LPS)purifiedfromE.co卩血清型0"1:B4的脂多糖(LPS)(Difco，Detroit,Michigan,USA)以5pg/mL用作DC成熟的阳性对照。在保温过夜后，收获细胞并用含1XFCS的PBS洗一次。为防止与FC丫RII川I的非特异性结合，细胞预先与20正常小鼠血清在室温保温5分钟。然后细胞在冰上与FITC缀合的单克隆抗体14"4"4S(lgG2a，anti-l-Ek，d;Ozatoefa/"丄/■,/■，"/24,533(1980))接触30分钟。特异于辅助T细胞表位所来源的流感病毒抗原的单克隆抗体36/1(Brownefa/.，^c/V/ra/"4:1，1990)用作同种型对照。所有抗体均以2.5pg/mL的浓度应用。样品用含1%FCS的PBS洗一次，然后在冰上用含4%低聚甲醛的PBS固定15分钟。用FACSort(BectonDickinson,SanJose，USA)进行流式细胞计数分析，数据用FlowJo软件(TreeStar,Inc.,SanCarlos，CA，USA)分析。乂縱一鄉荐泰激微潘應好铺艘潘蕭产主外周血单核细胞(PMBC)通过FicollPaque(AmershamPharmaciaSweden)梯度分离从得自血液供体的淡黄层制备物中制备。细胞在PBS中洗三次，然后与最佳量的鼠抗CD14杂交瘤上清(3C10，AmericanTypeCultureCollection)在冰上保温45分钟。洗涤两次后，将细胞进一步根据厂商指导与山羊抗鼠IgG微珠(MiltenyiBiotech,Germany)保温。然后用磁激活细胞分选(MACS)柱经亲和层析阳性选择CD14+单核细胞。通过在补加GM-CSF和IL-4(分别为40ng/ml和20ng/ml[ScheringPlough,USA])的并含有10%FCS(CSL，Australia)、2mmol/L谷氨酸、2mmol/L丙酮酸钠、100U/ml青霉素、100|jg/ml链霉素、30|jg/ml庆大霉素和0.1mmol/L2-巯基乙醇的RPMI-1640(Gibco，USA)中培养单核细胞而产生幼DC。细胞培养5天，之后每2天更换一半体积的培养基。OC威熟游,蘆通过将每毫升5x105个细胞在补加GM-CSF禾卩IL-4以及LPS(5Mg/mL)、非脂化肽，[ThRys-[CTL](5叩/mL)或脂肽[Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL](5叩/mL)三者中任一种的培养基中保温2天而测定基于肽和脂肽的免疫原正调节人单核细胞衍生的树突细胞上MHCclassII，CD83和CD86的表达的能力，共测试48小时。通过用得自BectonDickinson(USA)的针对HLA画DR(G46-6[L243])，CD83(HB15e)，CD86(Cat.No.2331[FUN-1])的荧光素缀合的单克隆抗体以及合适的同种型匹配抗体(MOPC-21andG155-178)根据厂商指导进行染色来进行表面标记的表型分析。然后洗涤细胞，在1%甲醛中固定并在流式细胞计数仪上分析。柱状图代表在正散射和旁散射点图上的大粒细胞。柱状图的阴影区域和相关数值代表表达高水平CD83,CD86或HLA-DR的细胞群的百分比。实施例2包含来自流感病毒的CTL表位的脂肽的免疫原性测试了具有来自流感病毒的CTL表位的脂J太、特别是包含SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的脂肽[Th]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL〗和[Th]-/^s(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL的诱导增强的CTL介导的病毒清除以及增强，树突细胞成熟的能力。在所有实验中使用具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的非脂化肽作为阴性对照。蘇微与非脂化肽相比脂肽引起更高水平的病毒清除(图3，图4a)。与来自仅用PBS免疫的小鼠的样品相比，在用脂肽免疫并在9天后用感染性Mem71病毒攻击的小鼠的肺中的病毒负荷降低了95%"Th]-Lys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL];图3)或99%([Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL];图3)。相反，非脂化肽仅达到了病毒负荷降低65%([Th]-Lys-[CTL];图3)。在接种了脂肽并且在初次接种后28天用Mem71病毒攻击的动物中也观察到了增加的病毒清除。相反，在用非脂化肽接种的小鼠中在此时间点清除病毒的能力明显较弱。如图4b所示，与仅接受非脂化肽或PBS的小鼠相比，接受根据图2命名的脂肽的免疫小鼠中也存在增强的CD8+T细胞激活，这一点通过在BAL液体中发现的CD8+T细胞数可见。鹏潘舰熟树突细胞对二级淋巴器官中原初CD4+T细胞和CD8+T细胞的弓l发之前是在暴露于抗原表位时DC的成熟。这一成熟的特征在于DC表面上的MHC产物和共刺激分子的正调节。因此，我们测定了各种肽和脂肽是否能差异激活树突细胞，以试图解释这些疫苗候选者的不同免疫原性。实验中，一株幼DC细胞系D1细胞与肽接触，针对MHC11类分子的表达进行染色，随后经流式细胞计量术分析，结果证实在细胞与肽ThKys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]或[Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL接触后，相比于细胞与接触[Th丄ys-[CTL]肽或培养基，树突细胞的成熟增强(图4c)。在导致DC成熟方面，[Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL是最有效的，非脂化肽[Th丄ys-[CTL]是效果最差的，而[ThKys(Pam3Cys-Ser國Ser)-[CTL]与[Th]-/_ys(Pam2Cys画Ser-Ser)陽[CTL]几乎一样有效(图4c)。脂化肽[ThKys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL正调节II类表达的能力与细菌脂多銜LPS)相同。非脂化肽诱导D1细胞成熟不超过约26%，这一水平是培养物中自发发生的水平。这些脂肽诱导D1细胞成熟的相对能力直接反映了它们诱导CTL介导的病毒清除应答以及BAL中的CD8+T细胞的能力。柳微对沐柳斜一微毒叙r一智應機游鄉还测定了缀合不同脂质、包括Parr^Cys，Pam2Cys，Pam3Cys，棕榈酸和胆固醇至肽免疫原的作用。如图5所示，在用含Pam2Cys脂肽免疫的小鼠肺中的病毒负荷低于用包含所测试的其它脂质的脂肽免疫的小鼠肺中的病毒负荷，提示Pam2Cys对于赋予抗病毒的保护作用是优选的。但是所有的脂质均提供一定的抗病毒保护作用。这一作用也反映在IFN-yCD8+T细胞计数上(图6)。总之，这些数据提示如在[Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]表位结构中一样将脂质附着至半胱氨酸甘油残基对于最大细胞毒性作用是重要的。在四聚体分析中，与非脂化肽或脂质加至肽的N-末端的脂肽(例如图7中的构建体Pal2LysLys[Th]-[CTL)相比，使用脂质部分加至一内部赖氨酸残基的s氨基基团的脂肽(例如图7中的脂肽[Th]-Lys(ParrhCys-Ser-Ser)-[CTL'[Th-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]，[Th]画/_ys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]，和[Th]-Lys(Chol2Lys-Ser-Ser)-[CTL〗)观察每个肺四聚体阳性CD8+T细胞数最高。这些数据还证实通过附着于一内部赖氨酸残基的s氨基基团而将脂质置于肽的内部能增强CTL表位的细胞毒性活性。为分析体内CTL决定簇特异性细胞毒性，小鼠鼻内接种9nmole在PBS中的各种脂肽并在第28天用Mem71病毒攻击。用经CTL决定簇刺激并用高密度CFSE标记的同基因脾细胞测量体内CTL决定簇特异性细胞毒性。用低密度CFSE标记的未刺激的脾细胞用作对照。在感染后第4天静脉内注射每一靶细胞群的细胞混合物。16小时后杀死小鼠并用流式细胞计量术分析脾中CFSE-high和CFSE-low细胞群的存在。每一样品分析总共1x106个淋巴细胞。图8中的数据示出在首次用于实验的小鼠中的细胞毒性T细胞活性。图9示出包含SEQIDNO:1所示的CD4+辅助T细胞表位和SEQIDNO:2所示的〃-,限制性CTL表位的脂肽[ThKys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]诱导了明显的体内细胞毒性。如图10所示，脂肽比非脂化肽具有更高的活性，其中与非脂化肽[Th]-Lys-[CTL]和其它所测试的脂肽相比，命名为[Thl-Ly^Parr^Cys-Ser國Ser)-[CTL]，[Th]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[CTL]和[Th]-/_ys(Pam3Cys-Ser-Ser)-[CTL]的脂肽提供了显著增强的体内特异性溶解。这些数据再次证实通过附着于一内部赖氨酸残基的s氨基基团而将脂质置于肽的内部增强了体内CTL表位的细胞毒性活性。实施例3包含来自Lmonocytogenes的CTL表位的脂肽的免疫原性测试了具有来自Lmonocytogenes的CTL表位的脂肽、特别是包含SEQIDNO:175所示氨基酸序列的脂肽『25丄>^(3卬^乂5-36「-Ser)-[LL091-99]诱导CD8+T细胞应答以及抗Z_.monocytogenes攻击的保护作用的能力。在所有实验中使用PBS或具有SEQIDNO:175所示氨基酸序列的非脂化肽作为阴性对照。分离的细菌用作阳性对照。微應产主/F/V7本研究中测试的脂肽诱导抗免疫CTL表位的特异性CD8+T细胞应答，这一点通过相对于非脂化肽在用脂化肽免疫的小鼠中存在的产生IFN-Y的脾细胞数增加而表明。每一百万个脾细胞中，用9nmole包含SEQIDNO:175所示氨基酸序列的脂化肽疫苗[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99]免疫的小鼠产生比接受非脂化肽或PBS对照的小鼠多约15倍的IFN-Y产生细胞，表明在接受脂化肽的小鼠中产生IFN-Y的CD8+T细胞的激活增加(图11)。贫分微微击游餅微图12的数据显示脂化[P25Hys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99]肽成功地提供了抗随后的全细菌攻击的保护作用。在用脂化[P25-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[LL091-99]肽免疫的小鼠中也观察到相对于用非脂化[P25Rys-[LL091-99]肽或PBS(即非免疫小鼠)免疫的小鼠显著增强的保护。实施例4抗肿瘤细胞攻击的保护作用贫歸微微絲靜微评价了含有卵清蛋白CTL表位(SIINFEKL)的脂肽疫苗诱导抗表达这一CTL表位的黑素瘤细胞(B16-OVA细胞)的保护作用的能力。在用如下脂肽接种的小鼠中确定了IFN-y生成，所述脂肽包含CDV-F辅助T细胞表位(P25)和卵清蛋白的CTL表位(SIINFEKL)，这两个表位经位于所述表位之间的一个内部赖氨酸残基的s氨基基团与Pam2Cys连接(即图2所列的基于SEQIDNO:174的肽[P25Kys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKLj)。C57BL/6小鼠用20nmole月旨化肽[P25]-/■ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]、非脂化肽[P25-/_ys-[SIINFEKL或用PBS在尾根部皮下免疫。在14天后小鼠用B16-OVA细胞在背部皮下攻击。从接种动物获得脾细胞并用具有序列SIINFEKL的CTL表位体外刺激，侧链每1,000,000个脾细胞中产生IFN-Y的细胞数。数据显示，用脂肽接种的小鼠中产生IFN-Y的细胞数增加(表1)，表明脂肽相对于非脂化肽激活T细胞的能力增强。重要的是，与用非脂化肽[P25Hys-[SIINFEKL或单独PBS免疫的小鼠相比，用脂肽进行免疫引起了对肿瘤生长的控制(图13)。在用[P25]-Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]免疫的小鼠中在15天期间内未观察到肿瘤生长。相反，在用[P25]丄ys-[SIINFEKL]或单独PBS免疫的小鼠中观察到直径大于75mm2的肿瘤。总之这些数据证实与非脂化肽相比脂肽在抗肿瘤保护方面具有保护能力。表1与接受非脂化[P25]-Lys-[SIINFEKL]肽或PBS相比在接受[P25]陽Lys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[SIINFEKL]脂肽的代表性黑素瘤样品中的分泌<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>娜Lei/Ws鯽微應遂,攻击鄉,微还测试了脂肽提供在动物体内抗Lewis肺肿瘤发育的保护作用的能力。用3x104个用卵清蛋白转染因此表达CTL表位SIINFEKL的Lewis月市月中瘤细胞(Nelsonefa/.，J//77muA70/."/66:5557-5566，2001)注射小鼠。接受肿瘤细胞4天后，在动物尾根皮下接种20nmole脂化肽[P25]-/_ys(Pam2Cys-Ser-Ser)-SIINFEKL，或者非脂化肽[P25]丄ys-[SIINFEKL或PBS。接受肿瘤细胞11天后给予第二次相似剂量的免疫原。图14中的数据表明与接受非脂化肽或PBS的动物相比，接受脂肽的动物中具有较少损害发生的动物的百分数显著较高。如图15所示，接受脂肽免疫原的动物比接受非脂化肽或PBS的动物的存活时间也长。这些数据进一步证实脂肽与非脂化肽相比的抗肿瘤的保护作用的保护能力。实施例5在给予包含CDV-F辅助T细胞表位和来自丙型肝炎病毒的CTL表位的脂肽后人树突细胞上的MHCII类、CD83和CD86的增强表达测试具有图2中所述的命名的脂肽^25]-^5^317120乂3-36「-36「)-的正调节人树突细胞上的MHCII类、CD83和CD86的表达的能力。人单核细胞衍生的树突细胞与培养基单独、LPS(5pg/mL)，非脂化肽[P25Kys-[HCV](5yg/mL)或脂肽[P25]-JLys(Pam2Cys-Ser-Ser)-[HCV](5pg/mL)保温48小时，之后在经流式细胞计量术分析之前用针对HLA-DR，CD83和CD86的FITC缀合的抗体染色。图化所示数据证实在用脂化肽处理之后与用非脂化肽或PBS单独处理之后相比，有更高百分比的在其细胞表面表达HLA-DR，CD83和CD86抗原的树突细胞群。脂肽诱导人树突细胞成熟的能力直接反映了脂肽与非脂化肽相比的免疫原性，提供了免疫原性的一个可能机制。实施例6讨论在本研究中，我们描述了各种脂肽免疫原的组装，所述脂肽免疫原由CD4+T细胞表位、CD8+CTL表位以及经一内部赖氨酸残基的s氨基基团与其连接的Pam3Cys或Pam2Cys组成。脂质部分的精确性质未显示出对于产生免疫应答是关键的，因为一系列脂质、包括胆固醇、棕榈酸、Parr^Cys、Pam2Cys和Pam3Cys均显示出成功引起了T细胞增殖和细胞毒性。但是在保护作用和IFN-y产生方面观察到显著不同，至少是在抗流感病毒的脂肽的情况下，由此提示脂质结构可能在体内是一个重要考虑因素。特别是至少对于掺入流感病毒CTL表位的疫苗而言，Pam2Cys与肽中的一内部赖氨酸残基的氨基基团连接能最有效地赋予保护作用，提示与半胱氨酸甘油的连接是优选的。本发明的脂肽能有效增强免疫动物的抗细菌和病毒病原体以及抗肿瘤细胞的CD8+T细胞应答。考虑到本文表明的肽自身作为佐剂以抗病毒和细菌病原体以及肿瘤细胞的保护作用的成功，可以合理地预期这一技术可广泛地适用于各种免疫方案。在脂质部分和肽序列之间插入丝氨酸残基不负面影响所得的含Pam2Cys免疫原的效力。脂肽可以在不含额外佐剂的情况下激发免疫应答，并可以经肠胃外和非肠胃外途径、特别是鼻内途径输送。总之，本文提供的数据证实将各种脂质、包括但不限于Pam2Cys和Pam3Cys置于CTL表位和辅助T细胞表位之间的大约整个合成肽疫苗的中心位置增加了疫苗的免疫原性。序列表<110>昆士兰医学研究所理事会<120〉包含辅助T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位的新免疫原性脂肽<130〉94947/MR0〈150〉US60/402839<151〉2002-08-12<160〉177<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>15<212>PRT<213〉syntheticT-helperepitope<400〉1AlaLeuAsnAsnArgPheGinlieLysGlvValGluLeuLysSer151015〈210〉2<211〉9〈212〉PRT〈213〉syntheticCTLepitope〈400〉2ThrTyrGinArgThrArgAlaLeuVal15〈210>3〈211〉24<212>PRT<213〉syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉3AlaLeuAsnAsnArgPheGinlieLysGlyValGluLeuLysSerThr151015TyrGinArgThrArgAlaLeuVal20<210>4<211>25<212〉PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400>4AlaLeuAsnAsnArgPheGinlieLysGlyValGluLeuLysSerLys151015ThrTvrGinArgThrArgAlaLeuVal2025<210>5<211>27<212>PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400>5LysLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu151015LeuLysThrTyrGinArgThrArgAlaLeuVal2025<210〉6<211〉27<212〉PRT<213〉syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉6LysLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu151015LeuLysAsnLeuValProMetValAlaThrVal2025<210〉7〈211〉27<212>PRT<213〉syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉7AlaGluUuGlyGluTyrGluLysLeuLeuAsnSerValLeuGluPro151015lieLysAsnLeuValProMetValAlaThrVal2025<210>8<211〉27<212>PRT<213〉syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉8ThrAlaAlaGinlieThrAlaGlylieAlaLeuHisGinSerAsnLeu151015AsnLysAsnLeuValProMetValAlaThrVal2025〈210〉9<211>27<212>PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉9ProArgTyrlieAlaThrAsnGlyTyrLeulieSerAsnPheAspGlu151015SerUsAsnLeuValProMetValAlaThrVal2025<210>10<211>27<212〉PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope〈400〉10LvsLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu151015LeuLysTyrLeuLeuGluMetLeuTrpArgLeu2025<210>11<211>27<212>PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400>11AlaGluLeuGlyGluTyrGluLysLeuLeuAsnSerValLeuGluPro151015lieLysTyrLeuLeuGluMetLeuTrpArgLeu2025<210>12<211>27<212>PRT<213〉syntheticpeptidecomprisingCTLandThepitope<400〉12ThrAlaAlaGinlieThrAla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ieCysMetLys15<210>170<211>11〈212〉PRT<213〉syntheticCTLepitopes<400>170ThrThrValTyrProProSerSerThrAlaLys1510<210〉171<211>9<212>PRT<213>syntheticC化epitopes<400〉171ArgArgTyrProAspAlaValTyrLeu15<210>172<211>9<212>PRT<213>ListeriamonocytogenesCTLepitope<400〉172GlyTyrLysAspGlyAsnGluTyrlie15〈210〉173<211〉8〈212>PRT<213>OvalbuminCTLepitope〈400〉173SerlielieAsnPheGluLysLeu15<210>174<211>26<212〉PRT<213>syntheticpeptidecomprisingCHepitopeandT-helperepitope<400>174LysLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu1.51015LeuLysSerlielieAsnPheGluLysLeu2025〈210〉175〈211>27<212〉PRT〈213>syntheticpeptidecomprisingThelperandCTLepitope<400〉175LvsLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu151015LeuLysGlyTyrLysAspGlyAsnGluTyrlie2i)25<210〉176<211〉9〈212〉PRT<213〉CTLepitopefromcoreproteinofhepatitisCvirus〈400〉176AspLeuMetGlyTyrlieProLeuVal15<210>177<211>27〈212〉PRT...<213〉Syntheticp印tide[P25]-Lys-[HCV]<400>177LysLeulieProAsnAlaSerLeulieGluAsnCysThrLysAlaGlu151015LeuLysAspLeuMetGlyTyrlieProLeuVal202权利要求1.一种脂肽，其包含辅助T细胞(Th)表位和细胞毒性T细胞(CTL)表位、一或多个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基和一或多个脂质部分，其中所述Th表位的氨基酸序列不同于所述细胞毒性T细胞(CTL)表位的氨基酸序列，所述脂质部分共价附着于所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基。2.权利要求1的脂肽，其中所述脂质部分所附着的所述内部赖氨酸残基位于Th表位和细胞毒性T细胞(CTL)表位之间。3.权利要求1或2的脂肽，其中脂质部分所附着的所述内部赖氨酸残基位于Th表位内。4.权利要求l一3任一项的脂肽，其中所述脂质部分具有通式(VII)的结构式(VII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中X选自由硫、氧、二硫键(-S-S-)、亚甲基(-CHr)、和氮基(-NH-)组成的组；m是整数l或2;n是从0至5的整数；R,选自由氢、羰基(-CO-)和R，-CO-组成的一组，其中R'选自由具有7—25个碳原子的烷基、具有7—25个碳原子的链烯基和具有7—25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述垸基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧(oxo)、酰基或环垸基取代；R2选自由R，-CO-O-、R，-O-、R，-O-CO-、R，-NH-CO-和R，-CO-NH-组成的一组，其中R'选自由具有7—25个碳原子的烷基、具有7—25个碳原子的链烯基和具有7—25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述垸基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧(oxo)、酰基或环垸基取代；以及R3选自由R，-CO陽O-、R，画O-、R，國O-CO國、R，曙NH-CO國和R，画CO-NH-组成的一组，其中R'选自由具有7—25个碳原子的垸基、具有7—25个碳原子的链烯基和具有7—25个碳原子的炔基组成的一组，其中所述烷基、链烯基或炔基任选地由羟基、氨基、氧(oxo)、酰基或环烷基取代；并且其中R,、R2和R3各自相同或不同。5.权利要求4的脂肽，其中X是硫；m和n均是l;R,选自由氢和R'-CO-组成的一组，其中R，是具有7—25个碳原子的烷基；112和R3选自由R，-CO-O-、R，-O-、R，-O-CO-、R，-NH-CO-和R，-CO-NH國组成的一组，其中R'是具有7—25个碳原子的垸基。6.权利要求5的脂肽，其中R'选自由棕榈酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、月桂酰、辛酰、癸酰和胆固醇组成的一组。7.权利要求4一6任一项的脂肽，其中脂质包含在选自由PamjCys、Pam2Cys、Pam3Cys、Chol2Lys、Ste2Cys、Lau2CysfnOct2Cys组成的一组的一种脂氨基酸部分内。8.权利要求7的脂肽，其中所述脂氨基酸部分是Pam2Cys。9.权利要求l一3任一项的脂肽，其中脂质部分具有下述通式(VIII):式(VIII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R4选自如下一组(i)一种由约7至约25个碳原子组成的ot酰基脂肪酸残基；(ii)一种Ot-烷基-p-羟基脂肪酸残基；(m)—种OC-烷基-p-羟基脂肪酸残基的P-羟基酯；以及(iv)—种脂氨基酸残基；及R5是氢或一种氨基酸残基的侧链。10.权利要求l一9任一项的脂肽，其中脂质部分通过一间隔物与肽部分隔开。11.权利要求10的脂肽，其中所述间隔物包括精氨酸、丝氨酸或6-氨基己酸。12.权利要求10或11的脂^^，其中所述间隔物由丝氨酸同二聚体组成。13.权利要求1一12任一项的脂肽，其中所述内部赖氨酸或内部赖氨酸类似物位于一种具有低免疫原性的合成氨基酸序列内。14.权利要求1一13任一项的脂肽，其中辅助T细胞表位是流感病毒血凝素的辅助T细胞表位或者犬瘟热病毒F蛋白(CDV-F)的辅助T细胞表位。15.权利要求14的脂肽，其中流感病毒血凝素的辅助T细胞表位包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。16.权利要求14的脂肽，其中CDV-F蛋白的辅助T细胞表位包含SEQIDNO:20所示的氨基酸序列。17.—种脂肽，其包含辅助T细胞(Th)表位和细胞毒性T细胞(CTL)表位、一或多个内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基和一或多个脂质部分，其中所述Th表位的氨基酸序列不同于所述细胞毒性T细胞(CTL)表位的氨基酸序列，所述脂质部分共价附着于所述内部赖氨酸残基或内部赖氨酸类似物残基，并且所述脂肽的通式(VI)是式(VI):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中-表位之一是辅助T细胞表位及另一个是细胞毒性T细胞(CTL)表位；A存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的氨基酸间隔物组成；n是值为0、1、2、3或4的整数；X是选自NH，O和S的一个末端侧链基团；Y存在或不存在，由长度约1至约6个氨基酸的氨基酸间隔物组成；以及Z是一个脂质部分。18.权利要求17的脂肽，其中A不存在。19.权利要求17或18的脂肽，其中Y存在并由丝氨酸同二聚体组成。20.权利要求17—19任一项的脂肽，其中Z选自Pam,Cys、Pam2Cys、Pam3Cys、Chol2Lys、Ste2Cys、Lau2Cys禾口Oct2Cys。21.—种包含权利要求1一20任一项的脂肽和一种药物学可接受赋形剂或稀释剂的组合物。全文摘要本发明提供了包含共线性(co-linear)辅助T细胞和CTL表位的合成的免疫原性脂肽分子、其生产方法和其在产生初级和次级免疫应答中的用途以及接种动物个体抗特定CTL表位的用途。更具体地，本发明提供了高度可溶的脂肽，其中脂质部分附着于一内部赖氨酸或赖氨酸类似物的末端侧链基团，优选地附着于一内部二氨基酸残基的末端侧链基团。优选地，所述内部赖氨酸或赖氨酸类似物位于辅助T细胞表位和CTL表位之间。文档编号C07K14/195GK101113178SQ20071011180公开日2008年1月30日申请日期2003年8月12日优先权日2002年8月12日发明者戴维·杰克逊,曾伟光申请人:昆士兰医学研究所理事会