一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖及制备方法和用途的制作方法

专利名称：：一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种革兰氏阴性菌细菌表面单糖的合成，尤其涉及大肠杆菌052中一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖及制备方法和用途。
背景技术：
：糖类化合物作为自然界中含量最丰富的生物大分子之一，行使着重要的生物学功能。可以作为能源的储存物，维持细胞的结构，构成胞外填充物，行使细胞间的信号识别和传导功能等。在人体基本的生命活动中(如发育、血型、神经系统和免疫系统的维持)，在医学应用中(如器官移植、炎症、自身免疫疾病、老化、癌细胞增殖及转移、病原体感染)和植物与病原菌相互作用中，糖都是重要信息分子的结构基础。糖链大多存在于细胞表面和细胞分泌的蛋白上，在细胞间的识别、调控、通讯、信号传递中起着重要的作用。革兰氏阴性菌(G—)的细胞壁分三层，由内至外分别为脂蛋白、外膜和脂多糖(LPS)。脂多糖是由类脂A、核心多糖和O-特异性多糖链(0-抗原)组成。O-抗原结合在核心多糖上，位于脂多糖分子的最外层，是细菌细胞主要的表面抗原。细菌O-抗原重复单位一般含有二到八个单糖，所有的单糖均需以核苷二磷酸(NDP)—单糖前体的形式参与合成O-抗原。这些单糖通常分为两类一类是细菌细胞在代谢过程中出现的常见的单糖及其衍生物；第二类单糖为细菌中O抗原中特有的罕见单糖，包括多种单糖，糖衍生物，糖类似物等，一般是由第一类单糖经过多酶反应后产生。罕见单糖存在于各种生物大分子中，如糖蛋白，糖脂及细菌的二次代谢产物包括抗菌素，并对这些大分子的生物活性有着不可替代的作用，尤其是一些罕见单糖的合成与抗菌素的合成及活性有关。人与动物体内的罕见糖，能在人与动物体内产生强烈的免疫反应。对这些罕见单糖的进行发酵生产，或对这些糖的结构进行修饰，或利用基因重组技术创造新的糖，可用来影响相关生物大分子的活性，特别是用来合成新的抗菌素。近年来许多用基因工程合成的新型药物已应运产生，例如通过修饰糖结构和基因重组合成新糖而产生的两种新型抗菌素已被成功开发并用于治疗上。近年来，由于基因组学的迅速发展，已有100余种不同的细菌多糖基因簇被破译，常见糖及一些罕见糖的合成基因的功能及其合成途径也已得到确认(http:Vwww.microbio.usyd.edu.au/BPGD/default.htm)。糖具有高度的复杂性和多样性。化学的方法只能合成部分单糖，而且成本高昂，化学合成罕见单糖有许多困难。与生命有关的罕见单糖非常难分离。大量生产稀有单糖，多年来一直是糖科学研究的最重要的目标。用生物技术大量生产罕见单糖是最有前景的途径。运用已确定功能的单糖合成酶的组合，产生自然界中不存在或非常重要的罕见单糖，这对医疗和生物制药领域有非常重要的意义。dTDP-D-呋喃型岩藻糖是单糖D-呋喃型岩藻糖的前体，D-呋喃型岩藻糖已被证明是抗癌药物GilvocarcinV(GV)的重要组成部分，具有重要的生物活性。目前，有关在大肠杆菌052中合成dTDP-D-呋喃型岩藻糖的酶学和分子生物学特性还未见报道。
发明内容本发明的一个目的是提供一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fUcofiirajiose,具有式(I)结构<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)c所述的dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fUcofUranose是在革兰氏阴性菌细菌中利用还原酶Fcfl和变位酶Fcf2合成的。本发明的另一目的是提供一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-focofUranose的制备方法，主要包括如下步骤①1-磷酸-葡萄糖经dTDP-转移酶RmlA转化为dTDP-D-葡萄糖(dTDP-D-Glc);②所述的dTDP-D-葡萄糖(dTDP-D-Glc)经脱水酶Rm旧转化为dTDP-D-4-酮基-6-脱氧-葡萄糖(dTDP-D-GlcO);③所述的dTDP-D-4-酮基-6-脱氧-葡萄糖(dTDP-D-GlcO)经还原酶Fcfl转化为dTDP-D-岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-半乳糖)dTDP-D-flicose;所述的dTDP-D-岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-半乳糖)dTDP-D-focose经变位酶Fcf2转化为dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fUcofliranose。发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出了在大肠杆菌052中合成dTDP-D-岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-半乳糖)dTDP-D-fUcose，进而合成dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fucoforanose的合成途径RmlARm氾FcflFcf2Glc-l-p->dTDP-D-Glc——>dTDP-D-GlcO——>dTDP-D-focose->dTDP-D-fiicofuranoseRmlA上述途径中的Glc-l-p(l-磷酸-葡萄糖)——>dTDP-D-Glc(dTDP-D-葡萄糖)Rm旧^>dTDP-D-GlC0(dTDP-D-4-酮基-6-脱氧-葡萄糖)为现有技术，由dTDP-D-GlcO合成dTDP-D-fbcose，进而合成dTDP-D-fiicofUr肌ose是本发明的发明人经过大量的研究及创造性的劳动设计出来的。上述方法中所述的dTDP-D-岩藻糖具有下述式(II)结构上述方法中所述的还原酶Fcfl的编码基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:l但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:l所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的还原酶Fcfl的核苷酸序列。上述方法中所述的还原酶Fcfl具有选自于下列g)、h)或i)的氨基酸序列g)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；h)SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；i)上述h)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有还原酶的活性。上述方法中所述的变位酶Fcf2的编码基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列(II)。d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:2但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的变位酶Fcf2的核苷酸序列。上述方法中所述的变位酶Fcf2具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列j)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；1)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有变位酶Fcf2的活性。上述方法步骤③中包括应用表达所述的还原酶Fcfl的重组质粒的步骤，其中该质粒的载体为pET-28a(+)。上述方法步骤③中还包括应用导入了所述的还原酶Fcfl的重组菌的步骤。上述方法步骤④中包括应用表达变位酶Fcf2的重组质粒的步骤，其中该质粒的载体为pET-28a(+)。上述方法步骤④中还包括应用导入了所述的变位酶Fcf2的重组菌的步骤。应当指出的是，上述提到的术语"严格杂交条件"在本说明书中的含义是指在该条件下形成了所谓特异杂交而没有形成非特异的杂交。例如，该严格杂交条件可以是，相互之间的同源性不小于70%的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交，优选的是同源性不少于卯％的DNA之间可以杂交。相对于Southern杂交中普通洗涤条件而言，可以例如为如下的杂交条件将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7XSDS)中，5(TC预杂交30分钟；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，5(TC杂交12小时；弃杂交液，加入洗膜液I(2xSSC和0.1^SDS),50°C洗膜2次，每次30分钟；加入洗膜液II(0.5xSSC和0.1。/。SDS)，5(TC洗膜30分钟。所属
技术领域：
的技术人员应该知道，本发明的编码罕见单糖合成的还原酶Fcfl和变位酶Fcf2的DNA序列，还包括编码对SEQIDNO:1、SEQIDNO:2所示核苷酸序列所表达的酶分子的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失并仍具有该酶活性的蛋白质的核苷酸序列。另外，对本发明的罕见单糖合成的还原酶Fcfl和变位酶Fcf2基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的氨基酸序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有还原酶Fcfl和变位酶Fcf2酶活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。本发明还涉及dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fticofiimnose的用途。例如，该糖可以用于制备抗肿瘤药物，该药物较佳为适宜在体内形成生物相容形式。"体内的生物相容形式"是指在通过治疗使任何毒性作用都降低的过程中的物质形式。包括人和动物在内的活的有机体都可服用这些物质。本发明的药物成分的有效剂量的给药指在一定剂量、足够时间的情况下能产生所需结果。比如，一个药物的有效剂量会受诸如病情、患者年龄、性别、体重和注入患者体内的抗体的效果等许多因素影响。比如将每天的剂量分开服用或者根据治疗中的紧急情况减少剂量。可以通过适宜的方式服用这些药物。比如注射(皮下注射、静脉注射等)、口服、吸入、或者直肠吸收。根据给药方法的不同，可以将有效物质包裹起来，与酶、酸和其它可使它失活的物质隔离开。这里所说的药物可以用已知的治疗药物制备方法制备，也就是将有效剂量的活性物质与治疗媒介混合一起。适宜的媒介己有介绍，比如Remington'sPharmaceuticalSciences(Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pa.,USA1985)。另外，这些药物包括可溶性的物质与一种或多种治疗媒介或稀释液在适宜pH值和离子渗透压的生理液体的缓冲液中混合。该糖还可以作为商品或反应底物组分。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。图l.Fcfl、Fcf2反应的毛细管电泳图谱；图2.dTDP-D-flicose产物的一级质谱图3.dTDP-D-fiicose产物的二级质谱图4.dTDP-D-fUcose产物的三级质谱图5.dTDP-D-fUcofliranose产物的一级质谱图6.dTDP-D-fticoftiranose产物的二级质谱图7.dTDP-D-fUcofuranose产物的三级质谱图8.还原酶Fcfl基因的表达以及纯化的SDS-PAGE鉴定图9.变位酶Fcf2基因表达以及纯化的SDS-PAGE鉴定图。具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅仅是由于说明不是限制本发明。实施例一还原酶Fcfl/变位酶Fcf2基因的克隆1.大肠杆菌052的总DNA提取取其过夜培养的新鲜培养物3ml，离心收集菌体，菌体悬于250pl50mMTris缓冲液中(pH8.0)，离心去上清，菌体重悬于250^150mMTris缓冲液中(pH8.0)加入10jxl0.4MEDTA(pH8.0)，混匀后37。C保温20分钟，之后加入15^il20mg/ml溶菌酶，混匀后37。C保温15分钟，再加入2^150mg/ml蛋白酶K，温柔混匀后再加入15pl10%SDS，50。C保温至澄清，再加入7pl25mg/mlRNA酶，65"保温15分钟，分别用等体积酚:氯仿:异戊醇抽提2次，氯仿:异戊醇抽提1次，最后一次的上清溶液加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇，回收DNA,用70%乙醇洗，沉淀溶于20plTE缓冲液(pH8.0，10mMTris，lmMEDTA)。2.还原酶Fcfl基因的克隆和筛选取前面所述的大肠杆菌052总DNA溶液作为模板，以SEQIDNO:5/SEQIDNO:6的寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。设定的PCR循环参数如下94°C，3分钟；94°C，15秒；50°C，30秒；72°C，1分钟；72°C，5分钟；4°C，2小时。将上述PCR产物用￡co/I和j^ol双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收0.9kb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于50pg/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37'C培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQIDNo:l所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW12(B含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为H1441。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果表明，该基因DNA片段全长951bp，由ATG起始密码开始，到TAA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQIDNo:l所示。该完整的ORF编码一个由316个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于依赖于NAD的异构酶或脱水酶家族，通过blast搜索获得的蛋白的同源性均不高。其中同源性最高的是7Voc///wococcmwan>ms的UDP-glucose-4-epimerase，与之具有33%的同源性和55°/。的相似性。3.变位酶Fd2基因的克隆和筛选取前面所述的大肠杆菌052的总DNA溶液作为模板，以SEQIDNO:7/SEQIDNO:8的寡核苷酸序列为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行30个循环PCR。设定的PCR循环参数如下94°C，3分钟；94°C，15秒；50°C，30秒；72°C，1分钟；72°C，5分钟；4°C，2小时。将上述PCR产物用￡co/和J^7wl双酶切，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收l.lkb酶切产物片段，与经同样限制型内切酶酶解并切胶回收的质粒pET-28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a后，涂于50|ig/mlKan(卡那霉素)的LB固体培养基上。37'C培养12小时后，挑取单克隆菌落提取质粒鉴定，插入有SEQIDNO:2所示的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重组质粒pLW1204，含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为H1442。采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序。测序结果显示，该基因DNA片段全长1134bp，由ATG起始密码开始，到TGA终止密码子结尾，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。该完整的ORF编码一个由377个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质属于UDP-吡喃型半乳糖变位酶家族，最高相似性同尺/e&zW/ap"ewmom^的UDP-吡喃型半乳糖变位酶，同源性为60%。实施例二还原酶Fcfl/变位酶Fcf2的纯化1.还原酶Fcfl的纯化将上述重组菌五.co/z'DH5aH1441中的质粒pLW1203提出，转入到BL21中，并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50pg/mlKan的LB培养基中，37°C，200rpm培养12小时，然后将培养物按1%(V/V)接种量接入250ml含50pg/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶)，37°C，220rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM，25°C，180rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Binding缓冲液(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl,10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组dTDP-D-GlcO还原酶Fcfl的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSephamse)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组dTDP-D-GlcO还原酶的分子量为40738道尔顿，与理论推算的分子量(39416道尔顿)相似，如图8所示，其中的1，蛋白Marker;2，pET28a载体；3和4，pET28a中插入克隆片断后诱导前(3)和诱导后(4)的总蛋白；5,诱导后的细胞沉淀蛋白；6，诱导后的细胞可容蛋白；7，亲和纯化后的融合靶蛋白。2.变位酶Fcf2的纯化DH5aH1442中的质粒pLW1204提出，转入到五.co//BL21中，并筛选得到阳性转化子。将转化子单克隆接入20ml含50pg/mlKan的LB培养基中，37°C，200rpm培养12小时，然后将培养物按1%(V/V)接种量接入250ml含50pg/mlKan的LB培养基(共2个摇瓶、37°C，220rpm培养A600为0.6时，加入IPTG至终浓度为O.lmM，20°C，220rpm诱导4小时。离心收集菌体，悬于一定量的Bindingbuffer(50mMTris-HClpH8.0，300mMNaCl,10mM咪唑)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组dTDP-D-卩比喃型岩藻糖变位酶Fcf2的粗提液。此上清经螯合琼脂糖凝胶(ChelatingSepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组dTDP-GlcO转氨酶的分子量为50580道尔顿"与理论推算的分子量(48015道尔顿)相似，如图9所示，其中1，蛋白Marker;2，pET28a载体；3和4，pET28a中插入克隆片断后诱导前(3)和诱导后(4)的总蛋白；5，诱导后的细胞沉淀蛋白；6，诱导后的细胞可容蛋白；7，亲和纯化后的融合耙蛋白。实施例三大肠杆菌052中dTDP-D-fucose和dTDP-D-fucofuranose产物的鉴定1.dTDP-D-fucose的鉴定在0.5ml离心管中装入20nl下列反应体系2mMdTDP-D-GlcO，3mMNADPH，50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，0.25nM实施例二中制得的重组dTDP-D-GlcO还原酶的纯化酶制剂。37'C反应2小时。加入等体积的氯仿抽提水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析结果如图1中的C所示，结果显示底物消失，有新产物生成(图1中的B是脱水酶RmlB的产物dTDP-GlcO)。重复此反应，积累50(^1体系后，经FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检测，初步证明产物为dTDP-D-fucose，如图2所示。2.dTDP-D-fucofuranose的鉴定在0.5ml离心管中装入25(il下列反应体系2mMdTDP-D-fiicose，50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，3.9一实施例二中制得的重组dTDP-D-吡喃型岩藻糖变位酶的纯化酶制剂。37t反应3小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析结果如图1中的D所示，结果显示除了原有底物外，有新产物生成。重复此反应，积累500^1体系后，经FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检测，初步证明产物为dTDP-D-fUcofliranose，如图5所示。实施例四dTDP-D-fucose和dTDP-D-fucofuranose的分离纯化及质谱检测将反应体系注入BioCAD700E纯化工作站中分离，使用VenusilMP-C18柱(4.6x250mm)，流动相为3.3%乙腈和96.7%50mM三乙胺-醋酸溶液(pH6.8)，流速为0.6ml/分钟。将收集到的产物冻干，用50%甲醇回溶，注入FinniganLCQAdvantageMAX质谱仪检测。使用电喷雾源，负相，4.5kV,250°C。在做二、三级质谱时以氮气作为碰撞气体，氦气为辅助气体，碰撞能量为20-30eV。dTDP-D-fucose的二、三级质谱图分别如图3和图4所示，dTDP-D-fUcofiiranose产物的二、三级质谱图分别如图6和图7所示。实施例五大肠杆菌052中dTDP-D-fucofuranose合成途径的确定大肠杆菌052中dTDP-D-fUcofUranose合成途径中的RmlA和RmlB的功能已在其它菌株中被鉴定，同源性在65%以上，再经过CE检测，发明人认为在大肠杆菌052中上述酶的功能是将Glc-l-P转化为dTDP-GlcO。通过实施例三中的实验证明了大肠杆菌052中的还原酶Fcfl将dTDP-GlcO转化为dTDP-D-fUcose，而大肠杆菌052中的dTDP-D-吡喃型岩藻糖变位酶将dTDP-D-focose转化为dTDP-D-fUcofUranose。至此证明了大肠杆菌052中dTDP-D-flicofliranose的合成途径可以表述如下Glc-1-p~dTDP-D-Glc-dTDP國D-GlcO-dTDP-D-fUcose-dTDP腸D-fucofUranose,实施例六合成酶的活性鉴定1.还原酶Fcfl的活性鉴定在0.5ml离心管中装入20pl下列反应体系2mMdTDP-D-GlcO，3mMNADPH,50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，5mM的二价金属离子氯化物，0.25^iM实施例二中制得的重组dTDP-D-GlcO还原酶Fcfl的纯化酶制剂，在一定温度条件下，反应2小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。(1)最适酶活温度上述反应条件下，在4-80。C范围内测定上述重组dTDP-D-GlcO还原酶Fcfl的活性，结果表明该酶的最适温度范围为15-37°C。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)二价金属离子影响上述反应条件下(37°C)，金属离子为Mg2+,Ca2+,Mn2+，Fe2+，C02+，012+条件下，测定上述重组dTDP-D-GlcO还原酶Fcfl的活性，结果表明抑制能力由小到大为Ca2、Fe2+，Co2+，Ci^+，其中Mg21nMg^对其转化率无影响。Ci^+对其酶活得抑制作用最大。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(3)Km、U直测定上述反应条件下(37°C，3mMMADPH，50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，0.25^M酶，30秒)，dTDP-GlcO的浓度为0.1-1mM，测定dTDP-Qui4N的浓度，根据米氏方程得出上述重组dTDP-D-GleO还原酶Fcfl的A:m值为0.54mM，&。,为956min"。2.还原酶Fcfl的活性鉴定在0.5ml离心管中装入25^1下列反应体系2mMdTDP-D-flicose，50mMTris盐酸缓冲液(pH7.4)，5mM的二价金属离子氯化物，3.9实施例二中制得的重组dTDP-D-吡喃型岩藻糖变位酶的纯化酶制剂，一定温度下，反应3小时。加入等体积的氯仿抽提，水相经BeckmanCoulterP/ACEMDQ毛细管电泳分析。(1)最适酶活温度上述反应条件下，在4-8(TC范围内测定上述重组dTDP-D-卩比喃型岩藻糖变位酶的活性，结果表明该酶的最适温度为37t:。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)二价金属离子影响上述反应条件下(37°C)，金属离子为Mg2+,Ca2+，Mn2+,Fe2+，C02+，012+条件下，测定上述重组dTDP-D-吡喃型岩藻糖变位酶的活性，结果表明除了012+对酶有明显的抑制能力外，其它金属离子的抑制能力不明显。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>虽然本发明已较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
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的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。序列表<110>天津生物芯片技术有限责任公司<120〉一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖及制备方法和用途<130>7P13007-CN〈腸8<170>Patentlnversion3.2<210>1〈211〉951〈212〉脆<213>编码还原酶Fcfl的核苷酸序列<400>1atggatgctagaa犯aatggagtcctgattacaggcggtgctgggtttataggta犯gca60ttgatcaccgaaatggtcga犯ggcagatcccactagtgtcgttcgatatttcggataaa120ccagactcgttgcctgagctaagtgaatattttaactggtataaatttagctacctcgaa180tcttctcagcgtataaaagaactgcatgagatagttagccgccacaatattaagacagtt240attcatttggcaacaactatgtttccacatgaatcgaaaaaaaalatcgataaagattgt300ctggaaaatgtttatgcgaatgtctgttttttcaaaaacctatatg犯aatggttgtgag360aaaattatatttgcatcatcgggtggcactgtttacggaaaatccgatacaccattttct420gaagatgatgcacttttaccagagatcagttatggcttaagca犯gttatgactgagaca480tacttacgatttattgctaaag朋ctcaatggtaaatccatatca/ttgcggatctcaaat540ccttatggagaagggcagag犯taga/tggtaagcaaggtgtaataccaatatttttaaat600aaaatctcaaatgatattccaattgatattattggttcaattgagagtaaaagagattat660atttatataagtgatcttgtacaagccttcatgtgttcattag幼tatgaaggacatgaa720gatatttttaacataggttctggagaatctattacgttaaaaaaacttattgaaactatc780gaatttaaattgaataaaaaggcagtaatcggttttc犯gatcctatccataccaatgct840aacggaattattttagatattaagcgagctatggctgagttaggatggcgtccgacggtt900gtactcgatgatggcattgataaattaataaaatcaattaggtgtaagtaa951<210〉2<211〉1134<212>藤<213〉编码变位酶Fcf2的核苷酸序列<400〉2atgaata鄉tccttatcattggtagtggatttagcggtgcaacaatagca卿ctgttg60gctgaagagastattaaagt犯agataatagacgacagaaagcatattggtggtaactgc120tatgatgagcgggatgagaaaacaggcattaatgtccacgtttatggaccgcatattttcC3tacggataatgaagatgtatggaattttgtgaataaatatgggacattcc3gccettatacaacgaggcttaaagcgemtgcaaaaggccagatttattcgttacctgta犯tcttcatacaattaatcaatactataaaacagcattgtctcctactgaagccaggaaactgattgcg3gc3朋ggtgatc3gaca3ttastg3tcctC3gtcttttg3ag3ac33gcttt3asatttgttggtgaagatttatacaaaacattcttttatggctatcctaaaaaacagtggggtatggagccaaaggaaataccagcatctgtattaaagcgtctcccagtacgttttaactatgatgataactattttttccataaattccagggcatacctcgtgatggctacacaccattatttcaaaatttactgaaccacccaaatatagagtttgaattaggaaagaaagtaaatagagcaactgttgaagaattaatcacctccgagcaatacggacatgtatttttctctggagcgattgatcatttctacgactatgaatttggcatgttgcaatatcgtacgctggattttgaaaagttttacagcga卿cgatgattatc鄉gttgtgttgtaatgtcttattgtgatgaagatgttccttatacccgcgtsacggaacataaatatttcacgccatgggaagagcataaaggaagcgtgttatacaaagagtttagtcgtagttgcgataaaga卿tattccatattatccagttagacttgtctctggaaatagcatatggaacaaatatgaacaaaaggcaaaagaagagactaatataacattcatcgggcgtttggctacatatcgctatctcgatatggatgtctgtattaaagaagctattgaatgtgctc犯ttgtatataaagaat犯taaagaatga<210>3〈211〉316<212〉PRT<213>编码还原酶Fcfl的氨基酸序列〈400〉3MetA印AlaArgLysAsnGlyValLeulieThrGlyGlyAlaGlyPhe151015lieGlyLysAlaLeulieThrGluMetValGluArgGinlieProLeu202530ValSerPheAsplieSerAspLysProAspSerLeuProGluLeuSer354045GluTyrPheAsnTrpTyrLysPheSerTyrLeuGluSerSerGinArg505560lieLysGluLeuHisGlulieValSerArgHisAsnlieLysThrVal657075801802403003604204805406006607207808409009601020麵1134lieHisLeuAlaThrThrMetPheProHisGluSerLysLysAsnlie859095AspLysAspCysLeuGluAsnValTyrAlaAsnValCysPhePheLys100105110AsnLeuTyrGluAsnGlyCysGluLyslieliePheAlaSerSerGly115120125GlyThrValTyrGlyLysSerAspThrProPheSerGluAspAspAla130135140LeuLeuProGlulieSerTyrGlyLeuSerLysValMetThrGluThr145150155160TyrLeuArgPhelieAlaLysGluLeuAsnGlyLysSerlieSerLeu165170175ArglieSerAsnProTyrGlyGluGlyGinArglieAspGlyLysGin180185190GlyVallieProliePheLeuAsnLyslieSerAsnAsplieProlie195200205AsplielieGlySerlieGluSerLysArgAspTyrlieTyrlieSer210215220AspLeuValGinAlaPheMetCysSerLeuGluTyrGluGlyHisGlu225230235240AspliePheAsnlieGlySerGlyGluSerlieThrLeuLysLysLeu245250255lieGluThrlieGluPheLysLeuAsnLysLysAlaVallieGlyPhe260265270GinAspProlieHisThrAsnAlaAsnGlylielieLeuAsplieLys275280285ArgAlaMetAlaGluLeuGlyTrpArgProThrValValLeuAspAsp290295300GlylieAspLysLeulieLysSerlieArgCysLys305310315〈210>4<211>377<212>PRT<213>编码变位酶Fcf2的氨基酸序列<400〉4MetAsnLysValLeulielieGlySerGlyPheSerGlyAlaThrlie151015AlaArgLeuLeuAlaGluGluAsnlieLysValLyslielieAspAsp202530ArgLysHislieGlyGlyAsnCysTyrAspGluArgAspGluLysThr354045GlylieAsnValHisValTyrGlyProHisliePheHisThrAspAsn505560GluAspValTrpAsnPheValAsnLysTyrGlyThrPheGinProTyr65707580ThrThrArgLeuLysAlaAsnAlaLysGlyGinlieTyrSerLeuPro859095ValAsnLeuHisThrlieAsnGinTyrTyrLysThrAlaLeuSerPro100105110ThrGluAlaArgLysLeulieAlaSerLysGlyAspGinThrlieAsn115120125AspProGinSerPheGluGluGinAlaLeuLysPheValGlyGluAsp130135140LeuTyrLysThrPhePheTyrGlyTyrProLysLysGinTrpGlyMet145150155160GluProLysGlulieProAlaSerValLeuLysArgLeuProValArg165170175PheAsnTyrAspAspAsnTyrPhePheHisLysPheGinGlyliePro180185190ArgAspGlyTyrThrProLeuPheGinAsnLeuLeuAsnHisProAsn195200205lieGluPheGluLeuGlyLysLysValAsnArgAlaThrValGluGlu210215220LeulieThrSerGluGinTyrGlyHisValPhePheSerGlyAlalie225230235240AspHisPheTyrAspTyrGluPheGlyMetLeuGinTyrArgThrLeu245250255AspPheGluLysPheTyrSerGluAspAspAspTyrGinGlyCysVal260265270ValMetSerTyrCysAspGluAspValProTyrThrArgValThrGlu275280285HisLysTyrPheThrProTrpGluGluHisLysGlySerValLeuTyr290295300LysGluPheSerArgSerCysAspLysGluAsplieProTyrTyrPro305310315320ValArgLeuValSerGlyAsnSerlieTrpAsnLysTyrGluGinLys325330335AlaLysGluGluThrAsnlieThrPhelieGlyArgLeuAlaThrTyr340345350ArgTyrLeuAspMetAspValCyslieLysGluAlalieGluCysAla355360365GinLeuTyrlieLysAsnAsnLysGlu370375<210>5<211>32<212>DNA<213>基于还原酶Fcfl基因设计并人工合成的上游引物序列<400>5cgg33ttcatggatgCt3g3犯3a3tgg3gtc32<210〉6<211〉33<212>DNA<213〉基于还原酶Fcfl基因设计并人工合成的下游引物序列<400>6ccgctcgagttacttacacctaattgattttat33〈210〉7<211>33<212〉DNA〈213>基于变位酶Fcf2基因设计并人工合成的上游引物〈柳>7cggaattcatgaataaggtccttatcattggta33<210>8<211>33<212〉腿<213>基于变位酶Fcf2基因设计并人工合成的下游引物<400〉8ccgctcgagtcattctttattattctttatata3权利要求1.一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖，其特征在于具有式(I)结构2.—种权利要求1所述的dTDP-D-呋喃型岩藻糖的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤①1-磷酸-葡萄糖经dTDP-转移酶RmlA转化为dTDP-D-葡萄糖；②所述的dTDP-D-葡萄糖经脱水酶Rm旧转化为dTDP-D-4-酮基-6-脱氧-葡萄糖；③所述的dTDP-D-4-酮基-6-脱氧-葡萄糖经还原酶Fcfl转化为dTDP-D-岩藻糖；④所述的dTDP-D-岩藻糖经变位酶Fcf2转化为dTDP-D-呋喃型岩藻3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述的dTDP-D-岩藻糖具有式(II)结构ttUOdTDP(II)。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的还原酶Fcfl的编码基因具有选自于下列a)、b)或c)的核苷酸序列OdTDPdTDP-D-Fuc/a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；b)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:l但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:l所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；c)在严格杂交条件下与上述a)或b)中的序列杂交，并且编码具有活性的还原酶Fcfl的核苷酸序列。5.根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的还原酶Fcfl具有选自于下列g)、h)或i)的氨基酸序列g)上述a)、b)或c)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；h)SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；i)上述h)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有还原酶的活性。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的变位酶Fcf2的编码基因具有选自于下列d)、e)或f)的核苷酸序列-d)SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；e)由于遗传密码的简并性，不同于SEQIDNO:2但编码的氨基酸序列与SEQIDNO:2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；f)在严格杂交条件下与上述d)或e)中的序列杂交，并且编码具有活性的变位酶Fcf2的核苷酸序列。7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于所述的变位酶Fcf2具有选自于下列j)、k)或l)的氨基酸序列j)上述d)、e)或f)所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列；k)SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；1)上述k)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有该序列的蛋白质有变位酶Fcf2的活性。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤③中包括应用表达所述的还原酶Fcfl的重组质粒的步骤，其中该质粒的载体为pET-28a(+)。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤③中还包括应用导入了所述的还原酶Fcfl的重组菌的步骤。10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤④中包括应用表达所述的变位酶Fcf2的重组质粒的步骤，其中该质粒的载体为pET-28a(+)。11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤④中还包括应用导入了所述的变位酶Fcf2的重组菌的步骤。12.权利要求1所述的dTDP-D-呋喃型岩藻糖的应用，其特征在于该糖用于制备抗肿瘤药物。13.权利要求1所述的dTDP-D-呋喃型岩藻糖的应用，其特征在于该糖用于商品或反应底物组分。全文摘要本发明涉及一种dTDP-D-呋喃型岩藻糖(dTDP-6-脱氧-D-呋喃型半乳糖)dTDP-D-fucofuranose，其具有式(I)结构，该糖是在革兰氏阴性菌细菌中利用还原酶Fcf1和变位酶Fcf2合成的。本发明还涉及该糖的制备方法与用途。文档编号C07H19/00GK101381388SQ200710145609公开日2009年3月11日申请日期2007年9月3日优先权日2007年9月3日发明者露冯,磊王,荃王申请人:天津生物芯片技术有限责任公司