专利名称：：6-修饰的双环核酸类似物的制作方法
技术领域：
：本发明才是供了6-修饰的双环核香及由其制备的寡聚化合物和组合物。更具体而言，本发明提供了具有2'-0-C(H)(R)-4，桥的核苷以及由其制备得到的寡聚物和组合物。在优选的实施方案中，R具有形成(R)或(S)异构体的特定构型。在一些实施方案中，本发明的寡聚化合物和组合物与耙标RNA的一部分杂交以使该靶标RNA丧失正常的功能。
背景技术：
：反义技术是用于减少一种或多种特定基因产物表达的有效手段，因而被证明在治疗、诊断和研究应用中具有独特的用途。化学修饰的核苷常用于整合入反义序列以增强一种或多种属性，例如核酸酶抗性。一类这样的化学修饰包括双环核苷，其中该核苷的呋喃糖部分包含了连接咬响糖上两个原子以形成双环状环系统的桥。该种双环核苷具有各种名称，包括对于双环核酸或锁核酸分别具有BNA和LNA的名称。li各种BNA已得到制备，并报道于专利文献和科技文献，例如参见Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456;Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54，3607-3630;Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000,97,5633-5638;Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998，8,2219-2222;Wengel等人，PCT国际申请WO98-DK39319980914;Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039,各文献的全文在此引用作为参考。已授权的美国专利和公布的申请的实例包括，例如美国专利7,053,207、6,770,748、6,268,490和6,794,499以及公布的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807;各文献的全文在此引用作为参考。许多LNA具有毒性。例如，参见Swayze，E.E.;Siwkowski，A.M.;Wancewicz,E.V.;Migawa，M.T.;Wyrzykiewicz,T.K.;Hung,G.;Monia,B.P.;Bennett,C.F.,Antisenseoligonucleotidescontaininglockednucleicacidimprovepotencybutcausesignificanthepatotoxicityinanimals.Nucl.AcidsRes.,doi:10.1093/nar/gkll071(2006年12月，提前在线出版)因此，对通过反义机制特异性调节基因表达的药剂仍有着长期需求。本文公开了可用于调节基因表达通路的6-取代的BNA和由其制备得到的反义化合物，包括依赖于RNA酶H、RNAi和dsRNA酶等作用机制，以及基于耙标降解或靶标占用的其它反义机制的调节。本领域的技术人员在获知本公开内容后将能够在不进行过度实验的情况下鉴定、制备反义化合物和开发其用途。发明概述本发明提供了具有下式的双环核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中Bx是杂环》咸基部分；1是H或羟基保护基团；T2是H、羟基保护基团或活性磷基团；Z是C广C6烷基、CVC6烯基、CVC6炔基、取代的C广C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、或取代的酰胺。在一实施方案中，各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJi、NJ山、SL、N3、OC(^X)Ji、OC(-X)NJA、NJ3C(-X)NJ山和CN,其中各J"_12和13独立地为H或C广C6烷基，X是O、S或Nh。在一实施方案中，各#:取代的基团独立地祐:取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卣素、氧代、羟基、OL、NJ口2、SJi、N3、OQ^X)Ji和NJ3C(=X)NJjJ2的，其中各JhJ2和J3独立地为H、CrQ烷基或取代的d-Q烷基，X是O或Nl。在一实施方案中，Z是CrQ烷基或取代的CVQ烷基。在另一实施方案中，Z是C广C6烷基。在另一实施方案中，Z是甲基(CHr)。在另一实施方案中，Z是乙基(CH3CH2-)。在另一实施方案中，Z是取代的C广C6烷基。在另一实施方案中，Z是取代的甲基。在另一实施方案中，Z是取代的乙基。在一实施方案中，该取代基为C广C6烷氧基(例如，Z是被一或多个C广C6烷氧基取代的C广C6烷基)。在另一实施方案中，该C广C6烷氧基取代基为CH30-(例如，Z是CH30CH2-)。在另一实施方案中，该C广C6烷氧基取代基可被进一步取代，例如N(W2)CH20-(例如，Z是N(Jj2)CH20CH2-)。在另一实施方案中，该取代基团为卣素(例如，Z是被一或多个卣素取代的C!-C6烷基)。在另一实施方案中，该卣素取代基为氟(例如，Z为CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CH2-)。在另一实施方案中，该取代基为鞋基(例如，Z是被一或多个鞋基取代的C广C6烷基)。在另一实施方案中，Z是HOCH2-。在另一实施方案中，Z是CHr、CH3CH2-、-CH2OCH3、-CH2F或HOCH2-。在一实施方案中，Z基团为被一个或多个xx取代的C!-C6烷基，其中各xx独立为OJ"NJ山、SJ!、N3、OC(二X)h、OC(=X)NJltT2、NJ3C(-X)NJ山或CN;其中各Ji、h和J3独立为H或C广C6烷基，X是O、S或NJ!。在另一实施方案中，Z基团为被一或多个xx取代的d-C6烷基，其中各XX独立为卣素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH30-)、取代的烷氧基或叠氮基。在一实施方案中，Z基团为-CH2XX,其中Xx为OJ!、NJJ2、SJ"N3、OQ^X)L、OC—X)NJ^2、NJ3C^X)NJJ2或CN;其中各^、2和3独立为11或C广Q烷基，X是O、S或NJ!。在另一实施方案中，Z基团为-CH2XX,其中xx为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH30-)或叠氮基。在一实施方案中，Z基团呈(R)-构型在另一实施方案中，Z基团呈(S)-构型:在一实施方案中，T!和T2分别为雍基保护基团。幾基保护基团的优选列表包括苯甲基、苯甲酰基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄噪呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。在一实施方案中，T!为羟基保护基团，该基团选自乙酰、苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基和二甲氧基三苯甲基，其中更优选的羟基保护基团T！为4,4，-二甲氧基三苯甲基。在一实施方案中，T2为活性磷基团，其中优选的活性磷基团包括二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺和H-磷酸酯。在一优选的实施方案中，T!为4,4，-二甲氧基三苯甲基且丁2为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。本发明还提供了寡聚化合物，其具有至少一个具有下式的单体或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中Bx是杂环》咸基部分；T3为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或与核普、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核脊间联接基团；l为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或与核苷、核苷酸、寡核脊、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核普间联接基团；其中T3和T4中至少一个为与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团；且Z是C广C6烷基、C2-CV歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的CrC6烯基、取代的CVC6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、疏醇或取代的疏。在一实施方案中，各被取代的基团被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卣素、氧代、羟基、OJ!、NJ!J2、SJ"N3、OC(-X)JbOC(-X)NJ卩2、NJ3Q^X)NJJ2和CN，其中各^、J2和J3独立地为H或d-C6烷基，X是O、S或NJi。在一实施方案中，各^皮取代的基团独立地被取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卣素、氧代、羟基、OJ^NJ,J2、SJbN3、OC^X)J!、OC(二X)NJ!J2、和NJ3CtX)NJ^2，其中各h、h和h独立地为H或C广C6烷基，X是O或NJlo在一实施方案中，至少一个Z为C!-C6烷基或取代的d-C6烷基。在另一实施方案中，各Z独立地为d-C6烷基或取代的C广C6烷基。在另一实施方案中，至少一个Z为C广C6烷基。在另一实施方案中，各Z独立地为C广C6烷基。在另一实施方案中，至少一个z为甲基。在另一实施方案中，各z均为甲基。在另一实施方案中，至少一个z为乙基。在另一实施方案中，各z均为乙基。在另一实施方案中，至少一个Z为取代的C!-C6烷基。在另一实施方案中，各Z分别独立为取代的d-C6烷基。在另一实施方案中，至少一个z为取代的甲基。在另一实施方案中，各z均为取代的甲基。在另一实施方案中，至少一个z为取代的乙基。在另一实施方案中，各z均为取代的乙基。在一实施方案中，至少一个取代基为CVC6烷氧基(例如，至少一个z是被一或多个C广C6烷氧基取代的d-Q烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立为C广C6烷氧基(例如，各Z独立地为被一或多个C广C6烷氧基取代的d-C6烷基)。在一实施方案中，至少一个CVQ烷氧基取代基为CH30-(例如，至少一个Z是CH3OCH2-)。在另一实施方案中，各d-C6烷氧基取代基均为CH30-(例如，各Z均为CH3OCH2-)。在一实施方案中，至少一个取代基为卣素(例如，至少一个Z是;^皮一或多个囟素取代的C广C6烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立地为卣素(例如，各Z独立地为被一或多个卤素取代的d-C6烷基)。在另一实施方案中，至少一个卤素取代基为氟(例如，至少一个Z为CH2FCH2-、CHF2CH2-或CF3CHr)。在另一实施方案中，各卤素取代基均为氟(例如，各Z独立地为CH2FCH2-、CHF2CH24CF3CH2-)。在一实施方案中，至少一个取代基为羟基(例如，至少一个Z是被一或多个羟基取代的C广C6烷基)。在另一实施方案中，各取代基独立地为羟基(例如，各Z独立地为被一或多个鞋基取代的C广C6烷基)。在另一实施方案中，至少一个Z为HOCH2-。在另一实施方案中，各Z均是HOCHr。在一实施方案中，至少一个Z是CH3-、CH3CH2-、CH2OCH3-、CH2F-或HOCH2-。在另一实施方案中，各Z独立地为CHr、CH3CHr、CH2OCHr、CH2F画或HOCH2-。在一实施方案中，至少一个Z基团为被一或多个xx取代的d-C6烷基，其中各Xx独立地为OJ!、J2、SL、N3、OC(二X)h、OC(二X)NJiJ2、N3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J!、L和J3独立地为H或C广Q烷基，X是O、S或N^。在另一实施方案中，至少一个Z基团为被一或多个xx取代的C广C6烷基，其中各xx独立地为囟素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH3(D-)或叠氮基。在一实施方案中，各Z基团独立地为被一或多个xx取代的C广C6烷基，其中各Xx独立地为OJ!、NJtJ2、SJ!、N3、OC(二X)J！、OC(二X)NJ！J2、NJ3C(二X)NJ！J2或CN;其中各J,、J2和h独立地为H或C广C6烷基，X是O、S或N^。在另一实施方案中，各Z基团独立地为被一或多个xx取代的C广Q烷基，其中各XX独立地为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH30-)或叠氮基。在一实施方案中，至少一个Z基团为-CH2XX,其中Xx为Oh、NJ山、SJ,，、N3、OC(:X)Ji、OC(^X)NJj2、NJ3C(二X)NJJ2或CN;其中各h、2和13独立地为H或C广C6烷基，X是O、S或NL。在另一实施方案中，至少一个Z基团为-CH2XX,其中XX为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH30-)或叠氮基。在一实施方案中，各Z基团独立地为-CH2XX，其中各xx独立地为OJi、NJ山、SJ!、N3、OCex)h、OQ^X)NJ,J2、NJ3C(二X)NJ山或CN;其中各J、J2和J3独立地为H或C广C6烷基，X是O、S或NL。在另一实施方案中，各Z基团独立地为-CH2XX，其中各xx独立地为卤素(例如，氟)、羟基、烷氧基(例如，CH3(D-)或叠氮基。在一实施方案中，至少一个Z为CH3-。在另一实施方案中，各Z均是CH3-。在一实施方案中，至少一个单体的Z基团是由下式表示的(R)-构型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>在另一实施方案中，具有所述式的各单体的Z基团均为(R)-构型。在一实施方案中，至少一个单体的Z基团是由下式表示的(S)-构型:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>或下式:或下式:或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在另一实施方案中，具有所述式的各单体的Z基团为(S)-构型。在一实施方案中，T3是H或羟基保护基团。在另一实施方案中，T4是H或羟基保护基团。在进一步的实施方案中，T3是与核苷、核苷酸或单体亚基连接的核普间联接基团。在另一实施方案中，T4是与核苷、核苷酸或单体亚基连接的核苷间联接基团。在另一实施方案中，T3是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中，T4是与寡聚核苷或寡聚核苷酸连接的核苷间联接基团。在一实施方案中，T3是与寡聚化合物连接的核苷间联接基团。在进一步的实施方案中，T4是与寡聚化合物连接的核脊间联接基团。在更进一步的实施方案中，T3和T4中至少一个包含了选自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷间联接基团。在一实施方案中，寡聚化合物具有至少一个由至少两个具有下式的相邻单体构成的区域或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>或下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>在另一实施方案中，寡聚化合物包含至少两个由至少两个具有上式的相邻单体构成的区域。在另一实施方案中，该寡聚化合物包含了有间隙的(gapped)寡聚化合物。在另一实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由约8至约14个相邻P-D-2，-脱氧核糖基核苷构成的区域。在进一步的实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由约9至约12个相邻P-D-2'-脱氧核糖基核香构成的区。在一实施方案中，该寡聚化合物包含至少一个由2至3个具有上式的相邻单体构成的区，任选的由具有上式的1或2个相邻单体构成的第二区以及由8至14个p-D-2，-脱氧核糖基核苷构成的第三区，其中所述第三区位于该第一和该第二区之间。在另一实施方案中，该寡聚化合物包含8至10个(3-D-2，-脱氧核糖基核苷。在本发明的另一实施方案中，才是供了具有长度为约8至约40个核苷和/或修饰的核苷或模拟物的寡聚化合物。在进一步的实施方案中，寡聚化合物包含了约8至约20个核苷和/或修饰的核普或模拟物。在更进一步的实施方案中，寡聚化合物包含了约10至约16个核香和/或修饰的核苷或模拟物。在另一实施方案中寡聚化合物包含了约10至约14个核苷和/或修饰的核香或模拟物。本发明还提供了抑制基因表达的方法，其包括将一种或多种细胞、組织或动物与本发明的寡聚化合物接触。本发明提供了6-修饰的双环核苷、由其制备的寡聚化合物及组合物、新的合成中间体，以及该核苷、寡聚化合物、組合物和新合成中间体的制备方法。更特定地，本发明提供了核香，其在具有式2，-0-C(H)(Z)-4，的核糖部分的4，和2'位之间具有桥，以及由该核香制备的寡聚体和组合物。在优选的实施方案中，Z具有可形成(R)或(S)异构体的特定构型。在一些实施方案中，本发明的寡聚化合物和组合物经设计与靶标RNA的部分杂交。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物可用于设计适体，该适体为能够在体内环境中结合异常蛋白的寡聚化合物。本发明的双环核苷可用于增强整合了它们的寡聚化合物的所需性质。本发明的寡聚化合物还可用作诊断应用中的引物和探针。在优选的实施方案中，本发明的6-修饰的双环核苷具有如下显示的结构一方面，本发明提4共了具有式I的双环核苷<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>发明详述其中:Bx是杂环碱基部分;Ti是H或羟基保护基团；T2是H、羟基保护基团或活性磷基团；以及Z是C广C6烷基、C2-C6烯基、CVC6炔基、C广C6烷基茚基、C3-C6烯基茚基、取代的C广C6烷基、取代的C2-Q烯基、取代的C2-C6炔基、取代的d-C6烷基茚基、取代的C3-C6烯基茚基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、疏醇、或取代的疏。在一实施方案中，各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代，所述取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ"NJ山、S^、N3、OC(二X)J!、0Q^X)NJJ2、NJ3C(-X)NJ山和CN，其中各^、2和^独立地为H或d-C6烷基，X是O、S或N^。在本发明的一方面中，制备的双环核香具有正交保护的活性基团并进一步包含活性磷基团。该种双环核香可用作寡聚体合成的单体。该种双环核香单体的示范性例子具有下式其中由虚线框围绕的基团是可变的。在6位的基团还可制备为S构型(注意，根据基团的不同位置，对R和S的指定可因之而变化)。所显示的双环核脊单体一般被称为二甲氧基三苯甲基亚磷酰胺，或者更正式地采用IUPAC系统命名法为(18，311，411,611,78)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦酰基]-1-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚坑。本发明的6-修饰的双环核香可用于在一个或多个位置修饰除此以外未经修饰的寡聚化合物。该种修饰的寡聚化合物可描述为具有特定的基序。适用于本发明的基序包括但不限于有间隙的基序、半修饰(hemimer)基序、阻断修饰(blockmer)基序、全修饰基序、定点修饰基序以及交替基序。结合这些基序，还可采用多种联接方式，包括但不限于统一或组合使用磷酸二酯和疏代磷酸酯联接。可简单优化6-修饰的双环核苷的定位和联接策略的使用以针对特定靶标形成最佳活性。指导制备代表性基序的代表性美国专利包括但不限于，5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，某些专利为与本申请共同拥有的申请或专利，其全文分别在此引用作为参考。基序还披露于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公布为WO2005/121371的国际申请PCT/US2005/019219以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22日公布为WO2005/121372的PCT/US2005/019220;其全文分别在此引用作为参考。术语"稳定的化合物"和"稳定的结构"指具有足够稳固性可从反应混合物分离至有用的纯度，并制成有效的治疗剂的化合物。本发明仅预期稳定的化合物。此处描述的化合物中选定的取代基以递归度表示。上下文中的"递归取代基"指一个耳又代基可以引用其本身的另一实例。由于该种3f又代基的递归性，理论上，在任意给定权利要求中可出现大量取代基。医药化学和有机化学领域的普通技术人员可理解该种取代基的总数受到靶标化合物的预期属性的合理限定。该种属性包括，例如但不限于，分子量、溶解性或logP等物理属性，靶向目的靶标的活性等应用属性，以及合成容易度等操作属性。递归取代基为本发明的目标方面。医药和有机化学领域的普通技术人员可以理解这样的取代基的多功能性。在本发明的权利要求所示的递归取代基的程度下，可根据上文所述确定其总数。此处所用的术语"烷基"指含有最多二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基基团的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基团通常包含l至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子(C广C,2烷基)，更优选包含1至约6个碳原子。此处所用的术语"低级烷基"包含1至约6个^5友原子。此处所用的烷基可任选地包含一个或多个进一步的耳又代基。此处所用的术语"蜂基"指含有最多二十四个碳原子并至少具有一个碳-碳双键的直链或支链烃基。烯基基团的实例包括，但不限于，乙烯基、丙烯基、丁烯基、l-甲基-2-丁烯-l-基、如1,3-丁二烯的二烯等。烯基基团通常包含2至约24个^_原子，更通常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6个碳原子。此处所用的烯基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。此处所用的术语"炔基"指含有最多二十四个^_原子并至少具有一个石炭-石友三键的直链或支链烃基。炔基基团的实例包括，但不限于，乙炔基、l-丙炔基、l-丁炔基等。炔基基团通常包含2至约24个^5友原子，更通常包含2至约12个碳原子，更优选包含2至约6个碳原子。此处所用的炔基可任选地包含一个或多个进一步的取代基。此处所用的术语"氨烷基"指氨基取代的烷基。该术语包括了在任何位置具有氨基取代基的CVd2烷基基团，其中该烷基基团将氨烷基连接至母体分子。氨烷基基团的烷基和/或氨基部分可以被取代基进一步取代。此处所用的术语"脂肪族"指最多包含二十四个^f友原子的直链或支链烃基，其中任意两个碳原子之间的饱和度为单、双或三键。脂肪族基团优选包含1至约24个碳原子，更通常包含1至约12个碳原子，更优选包含1至约6个碳原子。脂肪族基团的直链或支链可被包括氮、氧、硫和磷等的一个或多个杂原子所中断。该种被杂原子中断的脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，例如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。此处所用的脂肪族基团可任选地包括其它取代基。术i吾"脂环族的"指环状的环系统，其中该环为脂肪族环。该环系统可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族环。优选的脂肪环包括环中具有约5至约9个碳原子的环。此处所用的脂肪环可任选地包括其它取代基团。此处所用的术i吾"烷氧基"指在烷基基团和氧原子之间形成的基，其中该氧原子用于连接烷氧基基团和母体分子。烷氧基基团的实例包括，但不限于，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。此处所用的烷氧基基团可任选地包括其它取代基团。此处所用的术语"卣素"指选自氟、氯、溴和碘的原子。此处所用的术语"芳基"和"芳香族的"指具有一个或多个芳环的单或多环碳环系统的基团。芳基基团的例子包括，但不限于，苯基、萘基、四氢化萘基、茚满基、茚基等。优选的芳基环系统在一个或多个环中具有约5至约20个^_原子。此处所用的芳基基团可任选地包括其它取代基团。此处所用的术语"芳烷基"指在烷基基团和芳基基团之间形成的基，其中该烷基基团可用于连接芳烷基基团和母体分子。例子包括，但不限于，苯甲基、苯乙基等。此处所用的芳烷基基团可任选地包括与烷基、芳基或两者连接以形成基团的取代基。此处所用的术语"杂环基"指包括至少一个杂原子并且是不饱和、部分饱和或完全饱和的单或多环的环系统基团，因而包括了杂芳基。杂环还包括融合环系统，其中一种或多个融合环包含至少一个杂原子而其它环可包含一个或多个杂原子或任选地不包含杂原子。杂环基团通常包括至少一个选自石克、氮或氧的原子。杂环基团的实例包括，[1，3]二恶茂烷、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唾啉基、。米唾烷基、哌啶基、哌噪基、噪唾烷基、异噪唾烷基、吗啉基、四氢噻唑基、异四氢噻唑基、喹喔啉基、哒溱酮基、四氢呋喃基等。此处所用的杂环基团可任选地包括其它取代基。此处所用的术i吾"杂芳基"和"杂芳香族的"指包含单或多环芳环、环系统或融合环系统的基，其中至少一个环为芳环且包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括例如融合环系统，其包含一个或多个不含杂原子的融合环的系统。杂芳基通常包括选自疏、氮或氧的一个环原子。杂芳基的例子包括，但不限于，吡啶基、吡。秦基、嗜啶基、吡p各基、吡唑基、。米唑基、瘗唑基、噪唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、苯疏基、呋喃基、四氬喹啉基、异四氢唾啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过脂肪族基团或杂原子等连接部分连接至母体分子。此处所用的杂芳基任选地包括其它取代基。此处所用的术语"杂芳烷基"指具有可将杂芳烷基基团连接至母体分子的烷基的如前文定义的杂芳基。例子包括，但不限于，吡啶甲基、嗜啶乙基、27萘啶基丙基等。此处所用的杂芳烷基基团可在杂芳环或烷基部分的一个或两者上任选地包括其它取代基团。本发明中采用的术语"单或多环结构"包括具有融合或联接的环的单或多环的所有环系统，并包括独立选自脂肪族、脂环族族、芳基、杂芳基、芳烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族、杂芳烷基的单环和混合环系统。该种单或多环结构可包含一致或变化的饱和度(包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和)的环。各个环可包含选自C、N、O和S的环原子以形成杂环以及仅含有C环原子的环，其可表示为混合基序，例如，苯并咪唑，其中一个环仅具有石友环原子而融合环具有两个氮原子。单或多环结构可进一步被取代基取代，例如，具有连接至其中一个环的两个=0基的邻苯二甲酰亚胺。在另一方面，单或多环结构可直接通过环原子，通过取代基或双功能连接部分连接到母体分子。此处所用的术语"酰基"指从有机酸去除羟基基团并具有通式-C(O)-X的基团，其中X通常为脂肪族、脂肪环族或芳香族。例子包括脂肪族羰基、芳香羰基、脂肪磺酰基、芳香亚磺酰基、脂肪族亚磺酰基、芳香磷酸酯、脂肪族磷酸酯。此处所用的酰基基团可任选地包括其它取代基。术语"烃基"包括包含C、O、H的基团。包括具有任意饱和度的直链、支链和环状基团。这样的烃基基团可包括一个或多个选自N、O和S的杂原子并可进一步被一或多个取代基单或多取代。此处所用的术语"取代基"包括通常添加至其它基团或母体化合物以增强所需性质或产生所需效果的基团。取代基可以是保护的或未保护的，并可添加至母体化合物的一个或多个可能的位点。取代基还可进一步被其它取代基所取代并且可以直接或通过联接基团(例如烷基或烃基基团)连接至母体化合物。该种基团包括但不限于卣素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂肪族基团、脂肪环族基团、烷氧基、取代的氧代(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳烷基、氨基(-NRbbRce)、亚氨基(-NRbb)、氨基(-C(O)N-RbbRcc或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-化)、硝基(-N02)、氰基(-CN)、脲基(-OC(O)NRbbRee或-N(Rbb)C(0)ORJ、脲基(-N(Rbb)C(O)NRbbRcc)、疏脲基(-N(Rbb)C(S)NRbbRcc)、胍基(-N(Rbb)C—NRbb)NRbbRcc)、amidinyl(-C(=NRbb)NRbbRce或-N(Rbb)C(NRbb)Raa)、硫醇(-SRbb)、亚磺酰基(-S(0)Rbb)、磺酰基(-S(0)2RH)、磺酰氨基(-S(0)2NRbbR^或-N(RHbb)-S(0)2Rbb)以及共轭基团。其中Raa、Rbb和Rcc分别独立为H，任选联接的化学功能基团或进一步的取代基，其优选列表包括但不限于H、烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳环、脂环族、杂环基和杂芳烷基。术语"氧代"指基团(=0)。此处所述的化合物(例如，双环核苷)可通过例如，如下文实施例所示的任意有机合成的适用技术进行制备。众多该类技术已为本领域公知。多种已知技术歹'J举于CompendiumofOrganicSyntheticMethods(JohnWiley&Sons,NewYork)第1巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1971);第2巻,IanT.Harrison和ShuyenHarrison(1974);第3巻,LouisS.Hegedus和LeroyWade(1977);第4巻，LeroyG.WadeJr.,(1980);第5巻，LeroyG.WadeJr.(1984);和第6巻，MichaelB.Smith;以及March,J.,AdvancedOrganicChemistry,第3版,JohnWiley&Sons,NewYork(1985);ComprehensiveOrganicSynthesis.Selectivity,Strategy&EfficiencyinModernOrganicChemistry,第9巻中,BarryM.Trost主编,PergamonPress,NewYork(1993);AdvancedOrganicChemistry,PartB:ReactionsandSynthesis,第4版；Carey和Sundberg;KluwerAcademic/PlenumPublishers:NewYork(2001);AdvancedOrganicChemistry,Reactions,Mechanisms,andStructure,第2版,March,McGrawHill(1977);ProtectingGroupsinOrganicSynthesis,第2版,Greene,T.W.，和Wutz，P.G.M.,JohnWiley&Sons,NewYork(1991);以及ComprehensiveOrganicTransformations,第2版，Larock,R.C.,JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。在本发明的一方面中，寡聚化合物可通过共价连接一个或多个共轭基团进行修饰。一般而言，共轭基团可修饰所连接的寡聚化合物的一种或多种属性，包括但不限于，药效动力学、药代动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、储存和清除。共轭基团常用于化学领域并直接或通过任选联接部分或联接基团联接至诸如寡聚化合物等的母体化合物。共轭基团的优选列表包括但不限于，嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、疏醚、聚醚、胆固醇、疏胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂肪、磷脂、生物素、吩溱、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。如本领域技术人员所知的联接基团或双功能联接部分可适用于本发明。联接基团可用于将化学功能基团、共轭基团、报告基团和其它基团连接至如寡聚化合物等母体化合物的选择性位点。一般而言，双功能联接部分包含具有两个功能基团的烃部分。功能性基团之一被选择用于结合母体分子或乾标化合物，而另一基团被选择用于主要结合任意选定基团，例如化学功能性基团或共轭基团。在一些实施方案中，该接头包含重复单元例如乙二醇或氨基酸单元的链结构或寡聚体。在双功能联接部分中常用的功能基团的实例包括，但不限于，用于与亲核基团反应的亲电试剂以及用于与亲电基团反应的亲核试剂。在一些实施方案中，双功能联接部分包括氨基、鞋基、羧酸、疏醇、不饱和性(例如，双或三键)等。双功能联接部分的部分非限制性实例包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-l-羧酸(SMCC)以及6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其它的联接基团包括但不限于，取代的Q-do烷基、取代的或未取代的C2-Cu)烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苯甲基、苯基、硝基、疏醇、疏烷氧基、囟素、烷基、芳基、烯基以及炔基。此处所用的术i吾"保护性基团"指如下所述的化学部分，其在本领域中已知可针对合成过程中不希望出现的反应来保护反应性基团(包括但不限于幾基、氨基和疏醇基等)。保护性基团通常可以选择性和/或正交采用以在其它活性位点的反应中保护位点，并可随后去除以留下不受保护的基团或供进一步反应。本领i或已知的4呆护性基团一般描述于Greene和Wuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版，JohnWiley&Sons,NewYork(1999)。基团可作为前体选择性地结合至本发明的寡聚化合物。例如氨基基团可作为叠氮基团结合进本发明的化合物，并可在合成中理想的时间点被化学转化为氨基基团。一般来说，基团可被保护或作为前体存在，其对于修饰母体分子其它部位的反应呈现惰性，以在适当的时间转化成为其最终的基团。其它代表性保护或前体基团的讨论参见Agrawal,等人，ProtocolsforOligonucleotideConjugates,Eds,HumanaPress;NewJersey,1994;第26巻，第1-72页。羟基保护基团的实例包括，但不限于，乙酰基、叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基、2,6-二氯苯甲基、二苯基甲基、对硝基苯甲基、二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)、2-三甲基硅烷基乙基、三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯甲基硅烷基、[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(TOM)、苯甲酰甲酸盐、氯乙酰基、三氯乙酰基、三氟乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基、对苯基苯甲酰基、9-剪甲基碳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、三苯甲基(trityl)、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基(DMT)、三甲氧基三苯甲基、1(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基(FPMP)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)。其中优选的羟基保护基团包括但不限于，苯甲基、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、苯甲酰基、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄噤呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄噤呤-9-基(MOX)。氨基保护基团的实例包括但不限于，氨基甲酸盐保护基团，例如，2-三甲基硅烷基乙氧基羰基(Teoc)、l-甲基-l-(4-联苯基)-乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲基甲基氧基羰基(Fmoc)、以及苯甲基氧基羰基(Cbz);酰胺保护基团，例如甲酰基、乙酰基、三卣代乙酰基、苯甲酰基、以及硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基团，例如2-硝基苯磺酰基；以及亚胺和环状酰亚胺保护基团，例如苯二甲酰亚胺和二石克琥珀酰基。疏醇保护基团的实例包括，但不限于，三苯甲基(trityl)、苯甲基(Bn)等。在一些优选的实施方案中，可以用任选被保护的含磷核苷间联接来连接核苷从而制备寡聚化合物。含磷核香间联接(例如磷酸二酯和硫代磷酸酯联接)的代表性保护基团包括P-氰乙基、二苯基硅烷基乙基、S-氰丁烯基、氰对二甲苯基(CPX)、N-甲基-N-三氟乙酰乙基(META)、乙酰氧基苯氧基乙基(APE)以及丁烯-4-基基团。例如参见美国专利号4,725,677以及Re.34,069(p-氰乙基);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.10,第1925-1963页(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,49No.46,第10441-10488页(1993);Beaucage,S丄.和Iyer,R.P.,Tetrahedron,48No.12，第2223-2311页(1992)。此处所用的术语"正交保护"指以不同类别的保护性基团保护的功能基团，其中各类保护性基团可以按任意顺序并在所有其它类别存在的情况下去除(例如，Barany,G.和Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc,1977,99,7363;idem,1980,102,3084.)。正交保护已在例如自动寡核普酸合成等领域得到了广泛应用。功能基团可在一种或多种不受去阻断过程影响的其它被保护功能基团的存在下被去阻断。该被去阻断的功能基团以某种形式反应，且在某一时间点另一正交保护性基团在一组不同反应条件下被去除。这使得可以用选择性化学法获得所需的化合物或寡聚化合物。本发明提供了具有可用于形成核香间联接(包括例如磷酸二酯和疏代磷酸酯核苷间联接)的活性磷基团的化合物。该种活性磷基团已为本领域所知并包含处于Pin或Pv价态的磷原子，包括但不限于亚磷酰胺、H-磷酸酯、磷酸三酯和含磷手性助剂。优选的合成的固相合成采用亚磷酰胺(P111化学)作为反应性亚磷酸。在优选的实施方案中，中间体亚磷酸化合物随后通过已知的方法被氧化至pv状态以获得磷酸二酯或疏代磷酸酯核苷酸间联接。其它的活性磷酸酉旨牙口亚石粦酸才皮露于TetrahedronReportNumber309(Beaucage牙口Iyer,Tetrahedron,1992，48,2223-2311)。可用于本发明的寡聚化合物的特定实例包括含有修饰的例如非天然的核要类別。具有磷原子的修饰的核苷间联接包括，但不限于，疏代磷酸酯、手性疏代磷酸酯、二疏代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基磷酸酯包括3，-亚烃基磷酸酯、5，-亚烃基磷酸酯以及手性磷酸酯、亚磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基碌酸酯、疏羰基氨基磷酸酯、疏羰基烷基磷酸酯，疏羰基烷基磷酸三酯、具有正常3，-5，键的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯、它们的2'-5'联接的类似物，以及具有反转极性的硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其中一种或多种核香酸间联接为3'至3'、5'至5'或2'至2'联接。具有反转极性的寡核脊酸可在3'-最末端核普酸间联接包含单个3，至3'联接，即，可能是无碱基(核苷碱基缺失或该位置被鞋基取代)的单个反转核苷残基。可包括多种盐、混合盐和游离酸的形式。指导制备上述含磷联接的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5，399，676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361;5,194,599;5,565,555;5,527,899;5,721,218;5,672,697以及5,625,050，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。不具有磷原子的修饰的核苷间联接包括但不限于，由短链烷基或环烷基核苷间联接、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间联接，或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间联接构成的核苷间联接。这包括具有硅氧烷骨架；疏化物，亚砜和砜骨架；甲缩醛和辟u甲缩醛骨架;亚甲基甲缩醛和石克甲缩醛骨架;核糖乙酰骨架;含烯烃骨架；氨基磺酸盐骨架;亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架;磺酸盐和磺酰胺骨架;酰胺骨架;和其它具有混合的N，O，S和CH2的组成部分的核苷间联接。指导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5，677,439，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。此处描述的化合物包含一个或多个不对称中心，并因此形成了对映体、非对映体以及其它立体异构形式，其从绝对立体化学的角度可定义为(R)-或(S)-、a或p、或(D)-或(L)-(如氨基酸)。本发明意在包括所有这些可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学异构体可通过上述的过程由其相应的光学活性前体制备，或通过拆分外消旋混合物进行制备。该种拆分可在拆分剂的存在下，通过色谱或重复结晶或本领域技术人员已知的这些技术的組合进行。有关拆分进一步的细节可参见Jacques,等人，Enantiomers，Racemates,andResolutions(JohnWiley&Sons,1981)。当此处所述的化合物包含烯烃双键、其它不饱和性或其它几何不对称中心时，除非另行指明，该化合物意在同时包括E和Z几何异构体或顺式-和反式-异构体。同样地，同样意在包括所有的互变异构形式。此处所示的任意碳-碳双键的构型仅为便利目的选择，若非文中指明，并非意在指定特定的构型；因此，此处任意描述的碳-碳双键或碳-杂原子双键可以是顺式、反式或任意比例的两者的混合物。本发明的上下文中的术语"寡聚化合物"指具有至少一个能与核酸分子杂交的区域的聚合物。术语"寡聚化合物"包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物和寡核苷以及核苷酸模拟物和/或包含核酸和非核酸成分的混合聚合物。寡聚化合物通常可线性制备，但可连接或以其它方式制备成环状，且还可包括分支。寡聚化合物可形成双链构建4本，例如，杂交形成双链組合物的双链。该双Mi旦合物可连接或分离并可在末端包含悬端(overhangs)。一般而言，寡聚化合物包含联接的单体亚基的骨架，其中每个联接的单体亚基直接或间接地连接至杂环碱基部分。寡聚化合物还可包括未联接至杂环碱基部分的单体亚基，从而提供非碱基位点。这些联接连接单体亚基、糖部分或替代物，且该杂环碱基部分可被独立修饰。包括或不包括杂环碱基的联接-糖单元可被肽核酸单体等模拟物取代。在寡聚化合物的各个位点修饰或取代部分或全部单体的能力可形成大量可能的基序。如本领域所知，核苷是碱基-糖组合。核普的碱基部分通常为杂环碱基部分。该种杂环碱基最常见的两种类别为噤呤和嘧啶。核苦酸为进一步包括了共价联接至核苷糖部分的磷酸基团的核苷。对于包含了呋喃戊糖的核香，该磷酸基团可被联接至糖的2'、3'或5'羟基部分。在形成聚核苷酸时，该磷酸基团共价联接彼此相邻的核苷以形成线性聚合化合物。该线性聚合结构的相应末端可被连接以通过杂交或通过形成共价键得到环状结构，然而，通常希望开放的线性结构。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常形成寡核苷酸的核苷间联接。RNA和DNA的常见核香间联接为3'至5'磷酸二酯联接。在本发明的上下文中，术语"寡核苷酸"指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物。该术语包括由天然存在的核苷碱基、糖和共价核香间联接构成的寡核苷酸。术语"寡核苷酸类似物"指具有一个或多个非天然存在部分的寡核苷酸。该种非天然存在的寡核普酸由于其具有理想的性质而通常比天然存在的形式更理想，例如，提高的细胞摄取，对核酸耙标增强的亲和力以及在核酸酶存在下提高的稳定性。在本发明的上下文中，术语"寡核苷，，指由不带磷原子的核普间联接连接的核苷序列。该种类型的核普间联接包括短链烷基、环烷基、混合杂原子烷基、混合杂原子环烷基、一或多种短链杂原子以及一或多种短链杂环。这些核苷间联接包括，但不限于，硅氧烷、疏化物、亚砜、砜、乙酰基、甲缩醛、疏甲缩醛、亚甲基甲缩醛、碌u甲缩醛、烯基、氨基磺酸盐、亚甲基亚胺基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺和其它具有混合的N、O、S和CH2的组成部分的核普间联接。指导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;5,792,608;5,646,269以及5,677,439，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。此处所用的术语"核香碱基"或"杂环碱基部分"意在与"核酸碱基或其模拟物"同义。一般而言，核苷碱基为含有一个或多个能与核酸碱基氢联接结合的原子或原子组合的任意结构。此处所用的"未修饰的"或是"天然的"核苷碱基包括噤呤碱基腺噤呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嗜啶(U)。修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然的核苷碱基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄噤呤、2-氨基腺噤呤、腺噤呤和鸟噤呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺噤呤和鸟噤呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-疏代尿嘧啶、2J克代胸腺嘧啶和2J克代胞嘧啶、5-卣代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C^C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嗜啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-疏代尿嘧啶、8-卣代、8-氨基、8-疏醇、8-疏代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺噤呤和鸟噤呤、5-卣代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟噤呤和7-甲基腺噤呤、2-F-腺噤呤、2-氨基-腺"票呤、8-氮杂鸟噪呤和8-氮杂腺噪呤、7-去氮鸟噤呤和7-去氮腺噤呤、3-去氮鸟噪呤和3-去氮腺噤呤、通用i威基、疏水》威基、混杂碱基、大小扩增碱基以及此处定义的氟化碱基。其它修饰的核脊碱基包括三环嘧啶如吩噁嗪胞啶(lH-嘧啶并[5，4-b][l,4]苯并噁"秦-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞啶(lH-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噻唤-2(3H)-酮)、G型夹(G-clamps)例如取代的吩噁嗪胞啶(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)、呼唑胞啶(2H-嘧啶并[4,5-b]"引咮-2-酮)、吡啶吲哚胞啶(H-吡啶[3，,2，:4,5]吡咯并[2,3-d]嗜啶-2-酮)。修饰的核苷碱基还可包括以其它杂环取代噤呤或嘧啶碱基的核苷碱基，例如7-去氮-腺嘌呤、7-去氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其它的核苷碱基包括披露于美国专利3,687,808的核苷碱基，披露于TheConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J丄编，JohnWiley&Sons,1990的核普石威基；披露于Englisch等人，AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30,613的才亥苦石威基；以及才皮露于Sanghvi,Y.S.,第15章，AntisenseResearchandApplications,第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，CRCPress,1993的核苷碱基。修饰的核普碱基包括，但不限于，此处定义的通用碱基、疏水碱基、混杂碱基、大小扩增碱基以及氟化碱基。这些核普碱基中部分可特别用于提高本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的噤呤，包括2-氨基丙基腺噤呤、5-丙炔基尿嘧咬和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代基已显示可以提高核酸双链稳定性0.6誦1.2。C(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.牙口Lebleu,B.编,AntisenseResearchandApplications,CRCPress,BocaRaton,1993,第276-278页)并且是目前优选的石威基取代基，特别是在与2，-0-甲氧基乙基糖修饰组合时。38指导制备某些上述提到的修饰核苷碱基以及其它修饰的核普碱基的代表性美国专利包括，但不限于，上述美国专利3,687,808以及美国专利4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,594,121;5,596,091;5,614,617;5,645,985;5,830,653;5,763,588;6,005,096;以及5,681,941,其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考；以及美国专利5,750,692，其为与本申请共同拥有的专利，并在此引用作为参考。本发明的寡聚化合物还可包含一种或多种具有修饰糖部分的核苷。呋喃基糖环可以多种方式修饰，包括以取代基取代，桥连形成BNA以及以S或N(R)等杂原子取代4'-0。指导该种修饰糖的制备的部分代表性美国专利包括，但不限于，美国专利4,981,957;5,118,800;5,319,080;5,359,044;5,393,878;5,446,137;5,466,786;5,514,785;5,519,134;5,567,811;5,576,427;5,591,722;5,597,909;5,610,300;5,627,053;5,639,873;5,646,265;5,658,873;5,670,633;5,792,747;5,700,920;6,600,032以及于2005年6月2日提交并于2005年12月22曰公布为WO2005/121371的国际申请PCT7US2005/019219,其中一部分为与本申请共同拥有的申请或专利，各文献全文在此引用作为参考。优选的修饰糖的代表性列表包括但不限于具有2'-F、2，-OCH2或2，-0(CH2)2-OCH3取代基的取代糖；4，-疏代修饰的糖以及双环修饰的糖。此处所用的术语"核苷模拟物"意在包括那些用于替换寡聚化合物的一个或多个位点的糖或非联接的糖和碱基的结构，例如，具有吗啉或双环[3丄0]己基糖模拟物(例如，具有磷酸二酯联接的非呋喃糖)的核香模拟物。术语"糖替代物"与含义更广的术语"核苷模拟物"略微重叠，但仅指糖单元(呋喃糖环)的替换。术语"核苷酸模拟物"意在包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位点的核香和联接的结构，例如，肽核酸或吗啉(被-N(H)-C^O)-0-或其它非-磷酸二酯联接的吗啉)。如本发明所述的寡聚化合物可包含长度从约8至约80个的核普和/或修饰核苷或模拟物。本领域的普通技术人员将可理解本发明包含长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度8至40个的核普和/或修饰核普或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度8至20个的核苦和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或其中任意范围的核普和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度10至16个的核普和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是IO、11、12、13、14、15或16或其中任意范围的核苷和/或修饰核苷或模拟物的寡聚化合物。在另一实施方案中，本发明的寡聚化合物为长度10至14个的核苷和/或修饰核苷或模拟物。本领域普通技术人员将可理解其可具体为长度是IO、11、12、13或14个或其中任意范围的核苷和/或修饰核香或模拟物的寡聚化合物。嵌合寡聚化合物在两个或多个位置具有不同的修饰的核苷并通常定义为具有基序。本发明的嵌合寡聚化合物可形成上述两个或多个寡核脊酸、寡核苷酸类似物、寡聚核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。指导制备这样杂交结构的代表性美国专利包括，但不限于，美囯专利5,013,830;5，149，797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356;以及5,700,922，其中某些专利为与本申请共同拥有的专利，各专利全文在此引用作为参考。本发明的一方面中，修饰和未修饰的核苷及其模拟物可参照文献描述的针对DNA(ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs,Ed.Agrawal(1993),HumanaPress)和/或RNA(Scaringe,Methods(2001),23,206-217;Gait等人,ApplicationsofChemicallysynthesizedRNAinRNA:ProteinInteractions,Ed.Smith(1998),1-36;Gallo等人，Tetrahedron(2001),57,5707-5713)合成的适当方法进行寡聚。固相合成的其它方法可参见Caruthers的美国专利4,415,732;4,458,066;4,500,707;4,668,777;4,973,679;和5,132,418;以及Koster的美国专利4,725,677和Re.34,069。常规用于基于支持基质合成寡聚化合物和相关化合物的的商业可获取设备已由多家供应商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可另外或替代性采用。适用的固相技术(包括自动合成技术)的描述可见F.Eckstein(编)，OligonucleotidesandAnalogues,aPracticalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork(1991)。随着对RNAi-投入的增加，RNA和相关类似物的合成相对于DNA和相关类似物的合成也逐渐增加。目前在商业上采用的初级RNA合成策略包括5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基硅烷基(TBDMS)、5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基哌啶-4-基](FPMP)、2，-0-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基(2，-0-CH2-0-Si(iPr)3(TOM)、以及5'-0-硅醚-2，-ACE(5，-0-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚(DOD)-2，-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基(ACE)。目前提供RNA产品的主要的公司包括PierceNucleicAcidTechnologies、DharmaconResearch乂〉司、AmeriBiotechnologies乂>司禾口IntegratedDNATechnologies乂>司。PrincetonSeparations公司正在推广RNA合成活化剂，该活化剂才居宣传可以特别针对TOM和TBDMS化学法减少偶合次数。该种活化剂也适用于本发明。用于商业RNA合成的初级基团为TBDMS=5'-0-DMT-2，-0-叔丁基二甲基硅烷基；TOM=2'-0-[(三异丙基硅烷基)氧基]甲基；DOD/ACE=(5，-0-二(三甲基硅氧基)环十二烷氧基硅醚-2，-0-二(2-乙酰氧基乙氧基)甲基FPMP=5，-0-DMT-2，-0-[l(2-氟苯基)-4-甲氧基派啶-4-基]。所有前述的RNA合成策略均适用于本发明。上述策略的混合(例如，采用一种策略中的5'-保护基团和另一策略中的2，-0-保护基团)通常可根据本发明而调整。在本发明的上下文中，"杂交"指寡聚化合物互补链的配对。在本发明中，一种配对机制涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷碱基)之间的氢4建结合，其可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氲键结合。例如，腺噪呤和胸腺嘧啶为通过形成氢键进行配对的互补核普碱基。杂交可在多种条件下进行。当寡聚化合物与耙标核酸的结合干扰耙标核酸的正常功能引起活性损失，且当具有足够程度的互补性以在希望产生特定结合的条件下(即，在体内测定或治疗时在生理条件下，以及在进行体外测定时在测定条件下)避免寡聚化合物和非靶标核酸序列的非特异性结合时，寡聚化合物具有特异可杂交性。此处所用的"互补性"指两个核苷碱基无论其所在位置精确配对的能力。例如，如果在寡聚化合物某位置的核苷碱基能够与耙标核酸(该耙标核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置的核苷碱基氢键结合，则寡核普酸和靶标核酸之间的氬键结合的位置被认为是互补性位置。当各分子中的互补性位置被可以彼此以氢键结合的核苷碱基占据时，该寡聚化合物和该DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此具有互补性。术语"特异可杂交性"和"互补性"是用于表示足够数量的核苷碱基中有足够精确的配对或互补程度、由此在寡核苷酸和耙标核酸之间形成稳定和特异性结合的术语。在本领域中可以理解寡聚化合物的序列不需要对其耙标核酸具有100%的互补性以达到特异可杂交性。此外，寡核苷酸可在一个或多个片段上杂交从而使中间的或邻近的片段不参与杂交(例如，环结构或发夹结构)。本发明的寡聚化合物对其耙向的耙标核酸序列中的耙标区域具有至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或至少约99%的序列互补性。例如，当寡聚化合物中20个核苷中有18个与靶标区域互补，因而该寡聚化合物具有特异杂交性，则该寡聚化合物具有90%互补性。在该实例中，剩余的非互补性核苷碱基可以成簇或散布在互补性核苷碱基中，不需要彼此邻近或与互补性核苷碱基邻近。同样地，具有4(四)个非互补性核脊碱基(其侧翼连接两个与把标核酸完全互补的区域)的长度为18个核苷碱基的寡聚化合物对靶标核酸具有77.8%的总体互补性，并因此在本发明的范围之内。寡聚化合物与耙标核酸区域的互补性百分比可通过本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.，1990,215,403-410;Zhang和Madden,GenomeRes"1997,7，649-656)。本发明进一步包括了如反义寡聚化合物、反义寡核普酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、选择性剪切体、引物、探针等寡聚化合物，以及与靶标核酸的至少一个部分杂交的其它寡聚化合物。因此，这些寡聚化合物可以以单链、双链、环状或发夹寡聚化合物的形式引入，并可包含例如内部或末端突起或环的结构元件。本发明的寡聚化合物在引入系统后可引发一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现对#巴标核酸的修饰。该种酶的非限制性实例之一为RNA酶H，一种裂解RNA:DNA双链的RNA链的细胞内切酶。本领域已知"类DNA"单链寡聚化合物引发RNA酶H。RNA酶H的激活可导致RNA耙标的裂解，从而大大增强寡核苷酸-介导的基因表达抑制的效率。其它的核糖核酸酶(例如属于RNA酶III和核糖核酸酶L酶家族的核糖核酸酶)也假定具有类似的作用。尽管寡聚化合物的一种形式为单链反义寡核香酸，在许多物种中已显示引入双链结构(例如双链RNA(dsRNA)分子)可以导致基因或其相关基因产物功能的强效和特异性反义介导的减少。该现象同时存在于植物和动物，并被认为与病毒防御和转座子沉默具有进化联系。在一些实施方案中，在筛选可以调节所选定蛋白表达的其它寡聚化合物中可采用"适当的靶标片段"。"调节剂"为降低或提高编码蛋白的核酸分子表达、并且至少包含与适当靶标片段互补的8-核苷碱基部分的寡聚化合物。该筛选方法包括将编码蛋白的核酸分子的适当靶标片段与一种或多种候选调节剂接触，并选择一种或多种提高或降低编码蛋白的核酸分子表达的候选调节剂的步骤。一旦显示候选调节剂能够调节(例如，提高或降低)编码肽的核酸分子表达，该调节剂可进一步用于肽功能的研究，或如本发明所述用作研究、诊断或治疗剂。本发明的适当靶标片段还可与其相应的本发明互补性反义寡聚化合物组合形成稳定的双链寡核苦酸。本领域已显示该种双链寡核苷酸部分可通过反义机制调节单巴标表达并调节翻译和RNA加工。此外，对该双链部分还可进行化学修饰(Fire等人，Nature,1998,391,806-811;Timmons和Fire,Nature1998，395,854;Timmons等人，Gene,2001,263,103-112;Tabara等人，Science,1998,282,430-431;Montgomery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998，95，15502-15507;Tuschl等人，GenesDev.,1999,13,3191-3197;Elbashir等人,Nature,2001，411,494-498;Elbashir等人，GenesDev.2001,15,188-200)。例如，这种双链部分已显示可通过双链的反义链与耙标进行经典杂交从而引发耙标的酶降解来抑制耙标(Tijsterman等人，Science,2002,295,694-697)。本发明的寡聚化合物还可用于药物开发和靶标确证领域。本发明包含了在药物开发中使用本发明的寡聚化合物和耙标以阐明蛋白和疾病状态、表型或症状之间存在的关系。这些方法包括检测或调节乾标肽，包括将样本、組织、细胞或生物体与本发明的寡聚化合物接触，在处理后一定时间检测耙标核酸或蛋白水平和/或相关的表型或化学终点，并任选地将测量值与未处理样本或以本发明其它寡聚化合物处理的样本进行比较。这些方法可以平行进行或与其它实验组合进行，以确定靶标确证过程中未知基因的功能，或者测定特定基因产物作为治疗或预防特定疾病、症状或表型的耙标的有效性。核苷修饰对RNAi活性的作用参照现有文献进行了评估(Elbashir等人，Nature(2001),411,494-498;Nishikura等人，Cell(2001)，107，415-416;以及Bass等人，Cell(2000),101,235-238)。本发明的寡聚化合物可用于诊断、治疗、预防，并可作为研究试剂和试剂盒。此外，能特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸也常被本领域的普通技术人员用来阐明特定基因的功能或区分生物通路各种組分的功能。对于试剂盒或诊断应用，单独或与其它寡聚化合物或治疗剂联合使用的本发明寡聚化合物可用作差异性和/或组合分析的工具，以阐明在细胞和組织内表达的基因的部分或完整互补体的表达模式。作为一个非限制性实例，以一种或多种寡聚化合物处理的细胞或组织的表达模式可与未以寡聚化合物处理的对照细胞或組织进行比较，并分析各模式基因表达的差异水平，它们与例如疾病关联性、信号转导途径、细胞定位、以及所检测基因的表达水平、大小、结构或功能有关。这些分析可在影响表达模式的其它化合物和/或寡聚化合物存在或不存在的情况下对刺激或未刺激细胞进行。本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo,FEBSLett.,2000,480,17-24;Celis等人,FEBSLett,2000,480，2-16)、SAGE(基因表达系列分析)(Madden等人，DrugDiscov.Today,2000,5,415-425)、READS(消化的cDNA的限制性酶扩增)(Prashar和Weissman,MethodsEnzymol"1999,303,258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe等人,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A"2000,97,1976-81)、蛋白阵列和蛋白组学(Celis等人，FEBSLett"2000,480,2-16;Jungblut等人，Electrophoresis,1999,20,2100-10)、表达序列标记(EST)序列(Celis等人，FEBSLett"2000,480,2-16;Larsson等人,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、消减RNA指紋(SuRF)(Fuchs等人，Anal.Biochem.,2000,286,91-98;Larson等人，Cytometry,2000,41,203-208)、消减克隆、差异展示(DD)(Jurecic和Belmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3，316-21)、比较基因組杂交(Carulli等人，J.CellBiochem.Suppl.，1998,31,286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson,Eur.J.Cancer,1999,35,1895-904)以及质谱方法(To,Comb.Chem.HighThroughputScreen,2000,3,235-41)。本发明的寡聚化合物可用于研究和诊断，因为这些寡聚化合物可与编码蛋白的核酸杂交。例如，可在此处披露的条件下以在此披露的效率杂交从而成为有效蛋白抑制剂的寡核苷酸将在有利于基因扩增或检测的条件下分别作为有效的引物或探针。这些引物和探针可用于需要特异性检测编码蛋白的核酸分子的方法，并可用于核酸分子扩增以供检测或在进一步研究中使用。本发明的反义寡核苷酸，特别是引物和探针与核酸的杂交可通过本领域已知的方法进行检测。该种方法可包括将酶偶联至寡核苷酸，对该寡核香酸放射性标记或任何其它适用的检测方法。还可制备使用这些检测手段检测样本中选定蛋白水平的试剂盒。本发明已根据其一些实施方案进行了具体描述，以下实施例仅用于阐述本发明，并非意在对其进行限制。实施例1尿苷6-(R)-甲基BNA亚磷酰胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(15)的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>示意图1(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时，来自3的产率为59%;(b)Swern氧化(c)MeMgBr,CeCl3，THF,-78°C，来自3的产率为80%;(d)MsCl,Et3N，DMAP，CH2C12，室温，16小时，91%;(e)AcOH,Ac20,H2S04,室温，16小时，88%;(f)尿嗜啶,BSA，TMSOTf,CH3CN,回流，2小时；(g)K2C03,MeOH,室温，16小时；(h)TBDPSCI,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时，来自8的产率为79%;(i)BC13,CH2C12,-15°C,60%;(j)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时；(k)DMTCl，嘧啶，室温，16小时，来自12的产率为89%;(1)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唾，NMI,DMF。A)5-0-(叔丁基二甲基硅烷基)-3-0-苯甲基-1，2-0-异亚丙基-4-C-幾甲基-a-D-赤式-戊呋喃糖(3)通过加料漏斗在10分钟内向含有二醇2(12g,38.8mmol,参照Moffatt等人，J.Org.Chem.1979,44,1301,参考1的方法进行制备)、三乙胺(l1.44mL,81.5mmol)以及4-二甲基氨乙基嘧啶(0.47g,3.9mmol)的CH2C12(184mL)冷(0"C)溶液中添加叔丁基二甲基硅烷基氯(6.24g,40.7mmol)的二氯甲烷(lOmL)溶液。添加完成后，将反应逐渐加热至室温，并继续搅拌16小时。用CH2Cl2稀释反应物，依次以5。/。HCl水溶液、饱和NaHCCb、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以10%至30%的EtOAc/己烷洗脱)纯化产生白色固体的醇3(11.53g,59%)和醇4(3.93g,22%)。B)醇(6)将二甲基亚砜(3.36mL,47.5mmol)逐滴加入含有草酰氯(2.08mL,23.7mmol)的CH2C12冷(-78。C)溶液(130mL)。搅拌30分钟后，向反应中添加醇3(6.7g,15.8mmol)的CH2Cl2溶液(20mL)。在-78。C继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(10.0mL,71.2mmo1)。在-78。C下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH2Cl2中，有机相先后以5。/qHC1水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供醛5，其在不作进一步纯化下使用。将氯化铈ni(5.84g,23.7mmol)的THF(130mL)悬浮液在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，在5分钟内添加甲基溴化镁(17.0mL的1M甲基溴化镁的THF溶液)，继续搅拌90分钟。将含有粗制醛5(由前面获得)的THF(20mL)加入反应物中。继续搅拌90分钟后，以饱和NH4C1溶液淬灭反应并将反应物倒入EtOAc。依次以5。/。HCl水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以15。/。的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供醇6(5.52g,来自3的产率为80%)。C)甲磺酸(7)向含有醇6(2.77g，6.4mmol)、三乙胺(l.lmL,7.7mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(84mg，0.7mmol)的CH2C12(14mL)冰(0。C)溶液添加甲烷磺酰氯(0.55mL,7.0mmo1)。室温搅拌l小时后，将反应物倒入CHCl3，有机层依次以5Q/。HC1水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以15%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供甲磺酸7(2.97g,91%)。D)三乙酸酯(8)将浓H2S04(3滴)加入甲磺酸7(2.97g,5.8mmol)的水醋酸(29mL)和乙酸肝(5.8mL)溶液。室温搅拌l小时后，将反应物倒入EtOAc，有机层依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以33%至50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供三乙酸酯8(2.48g,88%)。NMR(CDC13，|3异头体)57.39-7.30(m,5H),6.23(s,1H),5.37(d,1H),5.19(q,1H)，4.62(d，1H),4.52(d,1H),4.38(s,1H),4.34(d，1H),3.98(d,1H),2.91(s，3H),2.12(s,3H),2.08(s,3H),2.06(s,3H),1.55(d，3H)。LCMS:保留时间1.35分钟；M+23计算值511.1，实测值511.0。E)核苷(ll)向三乙酸酯8(2.47g,5.0mmol)和尿嘧啶(0.70g，6.3mmol)的CH3CN(15mL)悬浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(4.9mL，20.0mmol)。在40。C下加热15分钟以获得澄清溶液，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(1.18mL，6.5mmol)。回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗制核香9，其可在不作任何纯化下使用。向核苷9(由前面获得)的MeOH(50mL)溶液添加K2CO3(2.07g，15mmol)。在室温下搅拌16小时后，真空去除溶剂并在25。/o嘧啶/EtOAc和盐水中分配残留物。收集有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩提4共10，其在不作进一步纯化下使用。！H雇R(MeOD):57.74(d,2H),7.29-7.14(m，5H),5,53(d,1H),5.38(s,1H),4,48(s，2H)，4.18(s,1H)，4.14(sm,1H)，3.92(s,1H),3.66(s，2H),1.08(d,3H)。LCMS:保留时间2.40分钟；M+H计算值360.1，实测值361.0。向核苷10(由前面获得)、三乙胺(1.4mL,10.0mmol)和4-二曱基氨基嘧啶(80mg,0.7mmol)的CH2C12(9mL)冰((TC)溶液中添加叔丁基二苯基硅烷基氯(1.73mL,6.7mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以5%HC1水溶液、饱和NaHC03洗涤有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷11(2.02g,来自8的产率为79%)。F)核苷(12)将三氯化硼(1M三氯化硼的16.7mLCH2Cl2溶液)小心加入核苷11(2.0g,3.3mmol)的CH2C12(40mL)冷(-15。C)溶液。在-15。C下搅拌1小时后，将反应物冷却至-78。C并通过添加MeOH/CH2Cl2(l:l,10mL)小心淬灭反应。继续搅拌10分钟后，将反应物倒入CH2Cl2,依次以5n/。HCl水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%至80%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷12(1.02g，60%)。G)核苷(13)在聚丙烯管中向核苷12(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(36mL)溶液中添加三乙胺三氢氟酸盐(2.98mL，18.3mmol)。室温搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以15%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷13(1.31g，产物中掺杂了三乙胺)。H)核普(14)向核苷13(由前面获得)的嘧啶(18mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTC1)(1.23g,3.7mmol)。室温搅拌16小时后，向反应添加额外的DMTC1(0.12g)，继续搅拌8小时。然后将反应物倒入EtOAc，随后以盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以15。/。的丙酮/CHCl3洗脱)纯化^是供白色泡沫状的核苷14(1.85g,89%)。^丽R(CDC13):S8.03(d，1H)，7.44-2.28(m,14H),6.86(d,4H),5.63(d,1H),5.60(s,1H),4.32(m,1H)，4.13(s,1H),3.81(s,6H),3.49(d,1H),3.37(d,1H)，1.18(d,3H)。I)亚磷酰胺,(lS,3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]_1_(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(15)的制备将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.69mL,2.2mmol)加入核苷14(0.83g,1.4mmol)、四唑(80mg,1.2mmol)和N-甲基咪哇(29|iL,0.36mmol)的DMF(7.2mL)溶液中。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90%盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。将残留物溶解于最少量的EtOAc中，将该溶液添加至己烷中。收集所得的沉淀物，进一步通过柱层析(Si02,以66%至75%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺15(1.04g,94%)。31PNMR(CDC13)S:149.21,149.79。实施例2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>示意图2(a)TBSCI,咪唑，DMF，室温，16小时，99%;(b)P0C13,1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN,室温，4小时；(c)NH3水溶液，1,4-二恶坑，室温，16小时；(d)Bz20,DMF，室温，16小时，来自15的产率为90%;(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室温，16小时，93%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾,NMI,DMF,95%。A)核苷(16)将叔丁基二甲基硅烷基氯(0.79g，5.2mmol)添加至核苷14(1.0g,1.7mmol)和咪唑(0.70g,10.4mmol)的DMF(3.5mL)溶液。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc,以盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷16(1.17g，99%)。B)核苷(19)将三氯氧磷(1.27mL,13.6mmol)添加至1,2,4-三唑(4.0g，58.0mmol)的CH3CN(21mL)冷((TC)悬浮液中。搅拌15分钟后，向反应中添加三乙胺(9.57尿普N-Bz-胞嘧啶-6-(R)-甲基BNA亚磷酰胺,(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶_1_基)_6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(21)的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>mL,68mmol)，继续搅拌30分钟。在0。C下向反应中添加核苷16(1.17g,1.7mmol)的CH3CN(10mL)溶液。搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和水之间分配残留物。然后以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗产物17，其可在不作任何纯化下使用。将氨水(4mL)添加至核普17(由前面获得)的二恶烷(20mL)溶液中。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以提供核苷18,其可在不作任何纯化下使用。向核普18(由前面获得)的DMF(3mL)溶液添加苯甲酸酐(0.65g，2.9mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc,以饱和NaHC03、盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷19(1.2g,来自16的产率为90%)。C)核苷(20)在聚丙烯管中向核苷19(1.86g,3.7mmol)和三乙胺(1.03mL,7.3mmol)的THF(15mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(1.48mL,9.1mmo1)。室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc，依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷20(0.91g,90%)。&NMR(MeOD)S:8.62(d,1H),8.02(d.IH),7.63(m,6H)，7.38(m,7H),6.96(d，4H),6.65s，1H),4.49(s,1H),4.36(s,1H),4.25(m,1H),3.53(d,1H),3.41(d，1H),1.18(d,3H)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-l-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(21)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.63mL,2.0mmol)加入含有核苷20(0.89g,1.3mmol)、四哇(73mg,l.lmmol)和N-甲基咪哇(26^L,0.33mmol)的DMF(6.6mL)溶液中。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90%盐水、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。将残留物溶解于最少量的EtOAc，将该溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，进一步通过柱层析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺21(1.1g,95%)。31P丽R(CDC13)5:149.34,149.77。实施例3尿苷-6-(S)-甲基BNA亚磷酰胺,(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(38)的制备<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>示意图3(a)NaH，溴化萘，DMF,室温，2h,98%;(b)醋酸，H20,室温，16小时；(c)NaI04,二恶烷，H20,室温，90分钟；(d)HCHO,NaOH，THF,H20,室温，16小时，由22为80%;(e)TBDPSC1,Et3N,DMAP,CH2C12，室温，16小时，61%;(f)草酰氯，DMSO,Et3N,-78°C;(g)MeMgBr,CeCl3，来自26的产率为89%;(h)草酰氯,DMSO，Et3N,-78°C;(i)DiBAL，CH2C12,隱78。C;(j)MsCl,Et3N,DMAP，CH2C12,室温，1小时；(k)Ac20，AcOH,H2S04,由28为58%;(1)BSA,尿嘧啶，TMSOTf,MeCN,回流，2小时；(m)K2C03，MeOH，室温，16小时，来自34的产率为76%;(n)DDQ,CH2C12,H20,室温，8小时，80%;(o)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量;(p)DMTC1,嘧啶，室温，16小时，86%;(q)CN(CH2)2OP(NiPr2)2,四唑，NMI,DMF，97%。A)醇(22)将氩化钠(2.39g,59.8mmol)小心添加至可从市场购得的1,2:5,6-二-O-异亚丙基-a-D-呋喃阿洛糖1(12.0g,46mmol)的DMF(75mL)冷(0。C)溶液中。搅拌20分钟后，向反应中添加溴化萘(11.12g，50.8mmol)并继续搅拌2小时。以H20小心淬灭反应并将其倒入EtOAc，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(Si02，以10%至33%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体醇22(18.1g,98%)。B)二醇(25)将醇22(18g,46mmol)溶解于冰醋酸(150mL)和H20(60mL)。在室温下搅拌反应物16小时，然后将其真空浓缩。然后将残留物溶解于EtOAc，以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩得到粗品23,其在不作进一步纯化下使用。将高碘酸钠(48mmol,10g)水溶液(350mL)添加至上面获得的粗产品二醇23的1,4-二恶烷(140mL)的溶液。室温搅拌90分钟后，以EtOAc萃取反应物，以水、盐水进一步洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩得到醛24，其可不作进一步纯化下使用。将由前面获得的粗品醛24溶解于THF:H20(1:1,100mL)混合物，并将反应物在冰浴中冷却。向反应中添加甲^(25mL,35。/。w/w)和1NNaOH(100mL)。室温搅拌16小时后，向反应添加甲醛(5mL)并继续搅拌32小时。将反应物浓缩至干燥，在EtOAc和水之间分配残留物。分层并以另外的1NNaOH、水、盐水洗涤有机相，干燥并浓缩得到白色固体二醇25(12.96g,80%,三步)。C)醇(26)将叔丁基二苯基硅烷基氯(0.75mL,2.9mmol)添加至二醇25(1g,2.8mmol)和三乙胺(0.45mL,3.2mmol)的冷(0。C)溶液。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，并依次用5%HC1、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2SOzt)并浓缩。柱层析(Si02，以10%至40%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供油状的醇26(1.02g，61。/o)(还分离得到0.42g区域异构硅保护的二醇)。D)醇(28)将二甲基亚砜(1.6mL,22.4mmol)逐滴加入草酰氯(0.98mL,11.2mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。搅拌30分钟后，向反应中添加醇26(4.8g,8.0mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.72mL,33.7mmo1)。在-78。C下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH2C12，依次以5。/。HCl水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩以^是供醛27，其可在不作进一步纯化下使用。将氯化铈111(2.96g,12.0mmol)的THF(50mL)悬浮液在室温下搅拌90分钟。在冰浴中冷却反应物，历经5分钟添加甲基溴化镁(1.4M甲基溴化镁的8.6mLTHF的溶液，12mmol)，继续搅拌90分钟，然后将反应冷却至-78'C。将粗醛27(由前面获得)的THF(20mL)溶液加入反应物。继续搅拌90分钟后，以饱和NH4C1溶液淬灭反应并倒入EtOAc。依次以5%HC1水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以20%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供醇28(4.37g,来自26的产率为89%)。E)二乙酸(32)将二甲基亚砜(1.41mL,19.9mmol)逐滴加入草酰氯(0.87mL，10.0mmol)的CH2Cl2(70mL)冷(-78。C)溶液。搅拌30分钟后，向反应中添加醇28(4.35g，7.1mmol)的CH2C12(20mL)溶液。在-78。C继续搅拌45分钟并向反应中添加三乙胺(4.20mL，30.0mmo1)。在-78。C下将反应物搅拌15分钟，随后取走冰浴，并在45分钟内对反应物逐渐加温。然后将反应物倒入CH2Cl2，先后以5。/oHCl水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并真空浓缩以才是4共醛29，其可在不作进一步纯化下使用。将二异丁基氢化铝(13.7mL1M二异丁基氢化铝的CH2C12溶液，13.7mmol)添加至酮29(由前面获得)的CH2C12(15mL)冷溶液。在-78"C下搅拌2小时后，添加饱和NH4C1淬灭反应并将其倒入CHC13。然后以5%HC1水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供醇30，其可在不作任何纯化下^f吏用。向含有醇30(由前面获得)、三乙胺(1.77mL,10.5mmol)和4-二甲基氨基嘧啶(85mg，0.7mmol)的CH2C12(21mL)冷(0。C)溶液添加曱烷磺酰氯(O.llmL，1.4mmo1)。室温搅拌1小时后，将反应物倒入CHCl3,依次以5%HC1水溶液、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供甲磺酸31，其在不作任何纯化下使用。将浓H2S04(2滴)加入甲磺酸31(由前面获得)的冰醋酸(15mL)和乙酸酐(3.0mL)溶液。室温搅拌1小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，千燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以20%至33%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供二乙酸32(3.0g,由28为58%)。F)核苷(34)向二乙酸32(3.0g，4.1mmol)和尿嘧咬(0.57g,5.1mmol)的CH3CN(20mL)悬浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.45mL,14.0mmol)。在40。C下加热15分钟以获得澄清溶液后，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.95mL,5.3mmol)。回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗制核苷33,其可在不作任何纯化下使用。向核香33(由前面获得)的MeOH(40mL)溶液添加K2C03(1.66g,12.0mmol)。室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于25%嘧啶/EtOAc,以盐水萃取，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以40%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷34(2.0g,来自32的产率为76%)。G)核苷(35)向核苷34(2.0g,3.1mmol)的二氯甲烷(30mL)和H20(1.5mL)溶液添加2,3-二氯-5,6-二氰-l,4-苯醌(DDQ)(1.4g,6.2mmo1)。室温下搅拌3小时，再次向反应添加DDQ(0.5g)。再搅拌10分钟后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、水:饱和NaHC03(l:l)、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，80%的EtOAc/己烷)纯化提供白色固体核苷35(1.25g，80%)。H)核普(36)在聚丙烯管中向核苷35(1.25g，2.5mmol)和三乙胺(l,OmL,7.4mmol)的THF(25mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(2.4mL,14.7mmol)。室温搅拌24小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩(Na2S04)。柱层析(Si02，以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷36(0.88g)(产物混有Et3N)。I)核苷(37)向核苷36(由前面获得)的嘧啶(12mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(0.91g,2.7mmo1)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc,以盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(Si02,以90%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核香37(1.28g，来自36的产率为86%)。J)(lS，3R,4R,6R，7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(38)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.46mL,1.5mmol)加入含有核普37(0,59g,1.0mmol)、四唾(57mg，l.lmmol)和N-甲基咪峻(20|iL，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc，依次以90%盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺38(0.75g,97%)。31PNMR(CDC13)5:149.36,149.53。实施例4N-Bz-胞嘧啶-6-(11)-甲基BNA亚磷酰胺,(1S,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二曱氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯曱酰胞嘧啶_1-基)_6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(44)的制备A)核苷(39)将叔丁基二甲基硅烷基氯(0.45g,5.2mmol)添加至核苷37(0.59g,1.0mmol)和咪唑(0.41g,6.0mmol)的DMF(2mL)溶液中。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，随后以盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50o/o的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核香39(0.68g,97%)。B)核苷(42)将三氯氧化磷(0.74mL,8.0mmol)添加至1,2，4-三唾(2.35g,34.0mmol)的CH3CN(16mL)冷(0。C)悬浮液。搅拌15分钟后，向反应添加三乙胺(5.6mL,40mmol)，继续搅拌30分钟。在(TC下向反应添加核苷39(0.68g,1.0mmol)的CH3CN(7mL)溶液。搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>示意图4(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时97%;(b)P0C13,1,2,4陽三唑，Et3N,CH3CN,室温，4小时；(c)NH3水溶液，1,4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz20,DMF,室温，16小时，来自39的产率为91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室温，16小时，87%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻，NMI,DMF,90%。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>真空去除溶剂，在EtOAc和水之间分配残留物。然后以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗产物40，其可在不作任何纯化下使用。将氨水(2.5mL)添加至核苷40(由前面获得)的二恶烷(12mL)溶液。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下千燥8小时以提供核苷41,其可在不作任何纯化下使用。向核苷41(由前面获得)的DMF(25mL)溶液添加苯甲酸酐(0.38g，1.7mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc,以饱和NaHC03、盐水萃取有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化4是供白色固体的核苷42(0.72g,来自39的产率为91%)。C)核苷(43)在聚丙燁管中向含有核苷42(0.72g,0.91mmol)和三乙胺(0.30mL,2.2mmol)的THF(9mL)溶液添加三乙胺三氩氟酸盐(0.89mL,5.5mmol)。室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc,依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核普43(0.53g,87%)。&NMR(CDC13):58.34(s,br，1H),8.33(d,1H),7.83(d，1H),7.57-7.26(m,16H)，6.89(d,4H),5.72(s,1H),4.75(s,1H)，4.22(s,1H),4,14(m,1H),3.83(s,6H),3.63(d,1H),3.46(s，1H),1.20(d,3H)。D)(lS，3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基曱基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(44)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.37mL,1.2mmol)加入含有核苷43(0.89g,1.3mmo1)、四唑(43mg，0.63mmol)和N-甲基口米唾(16(iL,0.20mmol)的DMF(4mL)溶液。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc,依次以90%盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺44(0.61g,90%)。实施例5(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(51)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>示意图5(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流，8小时；(b)K2C03，MeOH,室温,16小时,来自32的产率为73%;(c)Bz20,DMF,室温；(d)DDQ,CH2C12,H20,室温；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时；(f)DMTC1,嘧啶，室温，16小时；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四峻,NMI,DMF。A)核)和6-N-苯甲酰腺噪呤(0.48g，2.0mmol)的二氯乙烷(14mL)悬浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(l.lmL,4.50mmol)。反应混合物在回流45分钟后变澄清，并在冰浴中冷却，添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.49mL,2.7mmol)。回流8小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHC03和盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗制核苷45，其可在不作纯化下使用。向核苦45(由前面获得)的MeOH(14mL)溶液添加K2CO3(0.38g,2.7mmol)。室温搅拌24小时后将反应物真空浓缩。将残留物悬浮于EtOAc，用水和盐水萃取，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以1%至2.5%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷46(0.69g,来自32的产率为73%)。B)核苦47核苷47可由核苷46通过与干DMF中的苯甲酸酐(1.5-2当量)反应进行制备。C)亚磷酰胺51亚磷酰胺51可通过实施例3所示的由核苷34得到亚磷酰胺38的方法由核苷47进行制备。实施例6(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺噤呤-9-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(60)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>铋示意图6(a)MsCl,Et3N，DMAP,CH2CI2,室温，4小时;(b)Ac20,AcOH,催化量H2S04,室温，3小时，来自28的产率为87%;(c)6-N-苯甲酰腺噤呤，BSA，TMSOTf，DCE,回流，2小时；(d)K2C03，MeOH，室温，16小时；(e)Bz20,DMF,室温；(f)DDQ，CH2C12，H20,室温；(g)Et3N.3HF,Et3N，THF,室温，16小时；(h)DMTC1,嘧啶，室温，16小时；(i)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)二乙酸(52)向含有醇28(7.37g,12.0mmol)、三乙胺(2.82mL,20.2mmol)和DMAP(0.20g,Ummol)的二氯甲烷(25mL)冷溶液(0。C)逐滴添加甲烷磺酰氯(1.33mL，16.8mmol)。室温下搅拌2小时后，以二氯甲烷稀释反应物，以5%HC1、饱和碳酸氢钠溶液、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。由此获得粗品甲磺酸52,其可在不作纯化下使用。B)二乙酸(53)将浓石克酸(IO滴)加入甲磺酸52(由前面获得)的乙酸酐(7.2mL)和醋酸(36mL)溶液。室温搅拌2小时后将反应物在高度真空下浓缩。将残留物溶解于乙酸乙酯，以水、饱和碳酸氬钠溶液(直至pH〉8)和盐水小心洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。以柱层析(Si02,以25。/。至35Q/。EtOAc/己烷洗脱)纯化残留物以才是供粘性油二乙酸53(7.66g，来自28的产率为87%)。C)亚磷酰胺(60)亚磷酰胺60可通过实施例3所示的由二乙酸32得到亚磷酰胺51的方法由二乙酸53进行制备。实施例7(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(67)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>示意图7(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA，TMSOTf,DCE,回流，2小时；(b)3-羟基丙腈,NaH,THF,4小时，来自32的产率为82%;(c)异丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小时，71%;(d)DDQ，CH2C12,H20,室温，16小时，91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时，97%;(f)DMTCl，嘧啶，室温，16小时，85%;(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2，四唑，NMI,DMF。A)核苷(61)向二乙酸32(3.44g，4.7mmol)和2-氨基-6-氯噤呤(1.18g,7.0mmol)的二氯乙烷(46mL)悬浮液添加N,0-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(3.8mL，15.5mmol)。回流45分钟得到澄清溶液后，在冰浴中冷却反应物并添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(1.69mL,9.4mmol)。回流8小时后，将反应冷却至室温并倒入氯仿。以饱和NaHC03和盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以摘供粗制核普61，其可在不作纯化下使用。B)核苷(62)向氢化钠(1.07g,27.0mmol,60%w/w)的干THF(10mL)搅拌悬浮液逐滴添加3-羟基丙腈(1.67mL,24.5mmol)。搅拌20分钟后，添加粗品核苷61(由前面获得)的千THF(25mL)溶液。室温下继续搅拌5小时，然后通过添加饱和氯化铵溶液小心淬灭反应。然后将反应物倒入乙酸乙酯，以盐水萃取有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。以柱层析(Si02,以CHC13至2.5%MeOH/CHCl3洗脱)纯化残留物以提供浅棕色固体的核苷62(3.18g,来自32的产率为82%)。C)核苷(63)将异丁酸酐(1.5mL,9.3mmol)添加至核苷62(3.19g,4.6mmol)和4-二甲氨基甲基嘧啶(0.11g,0.93mmol)的DMF(27mL)溶液。在60°C下搅拌14小时后，向反应再加入异丁酸酐(1.5mL，9.3mmol),继续在60。C下搅拌12小时。将反应冷却至室温，以EtOAc稀释，并以水、饱和^炭酸氢钠溶液、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以5%至15Q/。的丙酮/CHCl3洗脱)纯化才是供黄色泡沫状的核苷63(2.5g，71%)。D)核苷(64)向核苷63(2.5g,3.3mmol)的二氯甲烷(33mL)和H20(1.7mL)溶液添加DDQ(1.12g,5.0mmol)。在室温下搅拌2小时后再次添加DDQ(1.0g)。继续在室温下搅拌6小时，然后将反应物在冰箱(4'C)中储存16小时。然后真空浓缩反应物并将残留物溶解于乙酸乙酯。以水、10Q/。亚辟L酸氢钠溶液(2x)、饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以5%MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供核苷64(1.84g,91%)。E)核苷(65)在聚丙烯管中向核普64(1.84g,3.0mmol)和三乙胺(1.25mL,8.9mmol)的THF(30mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(2.88mL,17.9mmo1)。室温搅拌24小时后，真空浓缩反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以5%至10%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体的核苷65(1.05g，97%)。F)核苷(66)向核苷65(1.00g，2.7mmol)的嘧啶(13mL)溶液添加二甲氧基三苯甲基氯(1.07g,3.2mmol)。室温搅拌16小时后，将反应物倒入EtOAc，以盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(Si02，以2.5%至5%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色泡沫状的核苷66(1.52g,85%)。G)(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(67)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.06mL,3.4mmol)加入含有核苷66(1.52g,2.2mmol)、四唾(0.12g,1.7mmol)和N-甲基咪唾(45pL,0.56mmol)的DMF(l1mL)溶液。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc,依次以90%盐水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以2.5%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺67(1.65g,84%)。31PNMR(CDC13)S:148.70,145.81。实施例8(lS，3R，4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟噤呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(74)9ONap79國、,cl..iTBDPSOMe'HO、M錢^*<I72DMTO、7374示意图8(a)2-氨基-6-氯嘌呤,BSA,TMSOTf,DCE,回流,2小时；(b)3-羟基丙腈,NaH,THF,4小时；(c)异丁酸酐，DMAP,DMF,60C,24小时；(d)DDQ,CH2C12,H20,室温，16小时；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时；(f)DMTC1,嘧啶，室温，16小时；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亚磷酰胺74可通过与所示的由二乙酸32得到亚磷酰胺67的相同方法由二乙酸53进行制备。实施例9(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(83)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>示意图9(a)草酰氯，DMSO，Et3N，CH2C12，-78°C;(b)MeOCH2Br,Mg,HgCl2，THF，-20°C,由26为>95%;(c)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,85%;(d)Ac20，AcOH,H2S04,室温，3小时,84%;(e)尿嘧啶,BSA，TMSOTf,MeCN,回流，2小时；(f)K2C03,MeOH,来自77a-b的产率为89%;(g)DDQ,CH2C12,H20,8小时，室温，80a和80b的联合产率为98%;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF，室温，16小时；(i)DMTCl,嘧啶，16小时，室温，90%;(J)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，DMF,96%。A)醇(75a-b)在-78。C下向草酰氯(2.2mL,25.0mmol)的二氯甲烷(130mL)溶液添加二甲亚砜(3.5mL,50.0mmol)。搅拌30分钟后，在10分钟向反应中添加醇26(10.0g,16.7mmol)的二氯甲烷(30mL)溶液。继续搅拌45分钟后，向反应中緩慢添加三乙胺(10.5mL，75.0mmol)。添加完成后，去除冰浴并将反应逐渐升温至(TC(约1小时)并转移至分液漏斗。先后以5。/。HCl、饱和碳酸氪钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩以提供醛27，其在高度真空下干燥(18小时)并可在不作纯化下4吏用。以干THF(5mL)覆盖镁带(2.5g,102.8mmol)和氯化汞(11)(93mg,0.34mmol)的混合物，并将反应物冷却至-20。C。滴入数滴纯甲氧基甲基溴以起始反应。等待数分钟后，经大约3小时向反应加入甲氧基甲基溴(9.33mL，102.8mmol)的THF(12mL)溶液(lmL/10分钟，通过注射器)。在添加过程中外部浴的温度小心维持在-20和-25。C之间。间歇(在3小时内)加入少量的干THF(5mL)以促进搅拌。添加溴化物完毕后，在-25。C下搅拌反应物100分钟，然后添加粗品醛(27)的THF(30mL)溶液。在-20。C下搅拌45分钟后，通过TLC未检测到起始材料趁27。以饱和氯化铵溶液小心淬灭反应并用乙酸乙酯稀释。以5。/。HCl、饱和)碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以25%至30%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供混合物醇75a-b(定量)(约1:1的异构体)。B)甲磺酸(76a-b)向溶于三乙胺(5.3mL,37.9mmol)的醇75a-b(13.38g,20.8mmol)和DMAP(0.36g,2.9mmol)的二氯甲烷(42mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺酰氯(2.3mL,29.2mmol)。搅拌2小时后另外加入甲烷磺酰氯(0.5mL)。继续搅拌1小时，以氯仿稀释反应物。先后以5。/qHC1、饱和)瞍酸氪钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以20y。的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供粘性油状的甲磺酸76a-b(12.8g,85%)。C)二乙酸(77a醫b)将浓石克酸(6滴)加入甲磺酸76a-b(12.8g,17.8mmol)的醋酸(50mL)和乙酸酐(10mL)溶液。室温下搅拌3小时后以LCMS对反应物进行完全鉴定，并在高度真空下挥发掉大部分溶剂。用乙酸乙酯稀释浓缩的混合物，以水、饱和碳酸氢钠溶液(直至pH〉10)和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以20%的EtOAc/己烷洗脱)纯化^是供祐性油状的二乙酸77a-b的异头体混合物(11.44g,84%)。D)核苷(79a-b)向二乙酸77a-b(11.44g,15.0mmol)和尿嘧啶(3.35g,29.9mmol)的CH3CN(75mL)悬浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(14.76mL,59.9mmol)。40。C加热15分钟得到澄清溶液后，在水浴中冷却反应物并添加三甲基珪烷基三氟甲基磺酸盐(4.06mL，22.5mmol)。回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以半饱和石友酸氢钠和盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以提供粗品核苷78a-b，其可在不作纯化下使用。向核普78a-b(由前面获得)的甲醇(130mL)溶液添加石炭酸钾(5.30g，38.4mmo1)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩。将残留物溶剂于乙酸乙酯，用水和盐水萃取，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以5至7.5%的丙酮/氯仿洗脱)纯化提供白色固体的核苷79a-b(9.0g,来自77a-b的产率为89%)。E)核苦(80a和80b)向核普79a-b(9.0g,13.3mmol)的二氯甲烷(130mL)和水(6.5mL)溶液添加DDQ(20.0mmol，4.5g)。将两相反应物在室温下搅拌2小时，然后再次添加DDQ(向反应添加2.75g)。另外2小时后再次向反应添加DDQ(l.lg)，继续搅拌4小时，然后将反应物在冰箱中贮存16小时。第二日早，LCMS显示了痕量的核脊79a-b，因此再次向反应中加入DDQ(0.9g),继续搅拌2小时，此时通过TLC和LCMS再未检测到核苷79a-b。真空挥发溶剂，并在乙酸乙酯和水之间分配残留物。以亚4t酸氢钠溶液(2x)、々包和石友酸氢钠溶液和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以10至20%的丙酮/氯仿洗脱)纯化分别提供核脊80a(洗脱较慢的点)和80b(洗脱较快的点)(7.0g，联合产率为98%)。F)核苷(81)向核苦80a(6.7g，12.5mmol)和三乙胺(5.2mL,37.4mmol)的THF(120mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(12.2mL,74.8mmol)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩至干燥。柱层析(Si02,以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供核苷81(混有三乙胺.氢氟酸盐，产率>100%)，其可在不作进一步纯化下使用。G)核苷(82)向核普81(约12.5mmol)的嘧啶(75mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.8g,14.3mmol)。在室温下搅拌16小时后再次向反应添加DMTC1(2.4g)。继续搅拌4小时后添加MeOH(10mL)。搅拌30分钟后，以乙酸乙酯稀释反应物，并以水和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(83)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷82(2.0g,3.3mmo1)、四唾(0.19g,2.6mmol)和N隱甲基咪唾(68(iL,0.83mmol)的DMF(16mL)溶液。室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90%盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺83(2.54g，96%)。31PNMR(CDC13)S:149.78，149.44。实施例10(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(86)DMTO9、嶋"0，、8$示意图10(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时；(i)DMTC1,嘧啶，16小时，室温，91%;(j)CN(CH2)2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF，96%。A)核苷(84)向核苷80b(6.43g,12.0mmol)和三乙胺(5.0mL,35.7mmol)的THF(125mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(11.6mL,71.5mmol)。室温搅拌16小时后将反应物真空浓缩至干燥。柱层析(Si02，以7.5至12.5%的MeOH/CHCl3洗脱)纯化残留物提供核苦84(混有三乙胺.氢氟酸盐，产率>100%),其可在不作进一步纯化下使用。B)核苷(85)向核苷84(约12.0mmol)的嘧啶(72mL)溶液添加4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(DMTCl,4.6g,13.8mmo1)。在室温下搅拌16小时后再次向反应添加DMTC1(2.3g)。继续搅拌4小时后添加MeOH(10mL)。搅拌30分钟后，以乙酸乙酯稀释反应物，并以水和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析C)(lS,3R，4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(86)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.58mL,5.0mmol)加入核苷85(2.0g,3.3mmo1)、四唑(0.19g,2.7mmol)和N-甲基咪唑(68(iL,0.83mmol)的DMF(17mL)溶液。室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90%盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以66%至75%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺86(2.55g，96%)。31PNMR(CDC13)5:149.97，149.78。实施例11(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-l-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(92)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>示意图11(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时98%;(b)POCl3,1，2,4-三唑,Et3N,CH3CN,室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷，室温，16小时；(d)Bz20,DMF，室温，16小时，来自82的产率为91%;(e)Et3N.3HF,Et3N,THF，室温，16小时，94%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四哇，NMI，DMF,84%。A)核苷(87)将叔丁基二甲基硅烷基氯(2.40g,15.9mmol)添加至核苷82(3.20g,5.3mmol)和咪唑(2.16g，31.8mmol)的DMF(10.6mL)溶液。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。以盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷87(3.70g,98%)。B)核苷(90)将三氯氧磷(3.86mL,41.4mmol)添加至1,2,4-三哇(12.15g,176.1mmol)的CH3CN(80mL)冷悬浮液(0。C)。搅拌15分钟后加入三乙胺(29.0mL,207.2mmol),继续搅拌30分钟。在0°C下向反应混合物添加核普87(3.70g,5.2mmol)的CH3CN(20mL)溶液。搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。然后真空去除溶剂，在EtOAc和之间分配残留物。然后以饱和NaHC03和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩以才是供粗产物88,其可在不作任何纯化下使用。将氨水(10mL)添加至核苷88(由前面获得)的二恶烷(50mL)溶液。在室温下搅拌16小时后，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以^是供核脊89，其可在不作纯化下使用。向核苷89(由前面获得)的DMF(IOmL)溶液添加苯甲酸酐(1.99g,8.8mmol)。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。依次以饱和NaHC03和盐水萃取有机层，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体的核苷90(3.86g，来自87的产率为91%)。C)核苷(91)在聚丙烯管中向核苷90(3.81g,4.7mmol)和三乙胺(1.56mL,11.2mmol)的THF(46mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(4.54mL，27.9mmol)。室温搅拌16小时后，真空干燥反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHC03和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02,以5%MeOH/CHCl3洗脱)纯化提供白色固体核苷91(3.07g,94%)。D)(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(92)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(0.90mL,4.3mmol)加入核苷91(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16g，2.3mmol)和N-甲基。米唾(58(iL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室温搅拌8小时后将反应物倒入EtOAc。依次以90%盐水和盐水洗涤有机层，然后干燥(Na2S04)并浓缩。将残留物溶解于最小量的EtOAc，将该溶液添加至己烷。收集所得的沉淀物，进一步通过柱层析(Si02,以75%至90%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体亚磷酰胺92(2.14g,84%)。31PNMR(CDC13)S:149.82。实施例12(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(98)示意图12(a)TBSC1,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时，97%;(b)POCl3，1,2,4-三唑,Et3N，CH3CN，室温，4小时；(c)NH3水溶液，1，4-二恶烷,室温，16小时；(d)Bz20,DMF,室温，16小时，来自93的产率为89%;(e)Et3N.3HF,Et3N，THF,室温，16小时，89%;(f)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四。坐，NMI，DMF,84%。A)核苷(93)将叔丁基二甲基硅烷基氯(2.25g,15.0mmol)添加至核苷85(3.0g,5.0mmol)和咪唑(2.03g，29.9mmol)的DMF(IOmL)溶液。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。以盐水萃取有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核普93(3.45g,97%)。B)核苷(96)将三氯氧磷(3.59mL,38.5mmol)添加至1,2，4-三唾(11.3g，163.9mmol)的CH3CN(80mL)冷悬浮液(0。C)。搅拌15分钟后向反应中加入三乙胺(27.0mL,192.8mmol)，继续搅拌30分钟。在(TC下向反应中添加核苷93(3.45g,4.82mmol)的CH3CN(20mL)溶液。搅拌10分钟后，去除冰浴并在室温下搅拌反应物4小时。真空去除溶剂，在EtOAc和之间分配残留物。然后以NaHC03饱和溶液和盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩以纟是供粗产物94，其在不作任何纯化下使用。将氨水(10mL)添加至核香94(由前面获得)的二恶烷(50mL)溶液。在室温下搅拌16小时，真空浓缩反应物并在高度真空下干燥8小时以才是供核香95,其在不作纯化下使用。向核苷95(由前面获得)的DMF(9mL)溶液添加苯甲酸酐(1.63g,7.2mmol)。室温搅拌16小时后将反应物倒入EtOAc。依次以饱和NaHC03和盐水萃取有机层，然后干燥(Na2S04)并真空浓縮。柱层析(Si02，以50%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷96(3.53g,来自93的产率为89%)。C)核苷(97)在聚丙烯管中向核苷96(3.53g,4.3mmol)和三乙胺(1.43mL,10.3mmol)的THF(43mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(4.20mL，25.8mmol)。室温搅拌16小时后，真空干燥反应物并将残留物溶解于EtOAc。依次以水、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，然后干燥(Na2S04)并真空浓缩。柱层析(Si02，以25%至40%的丙酮/CHCl3洗脱)纯化^是供白色固体的核苦97(2.87g,95%)。D)(lS,3R,4R,6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯曱基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰胞嘧啶-1-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环庚烷(98)将2-氰乙基四异丙基亚磷二酰胺(1.35mL,4.3mmol)加入核苷97(2.0g,2.8mmo1)、四唑(0.16mg，2.3mmol)和N-甲基咪唑(58nL,0.71mmol)的DMF(14mL)溶液。室温搅拌8小时后，将反应物倒入EtOAc,依次以90%盐水和盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以75%至90%的EtOAc/己烷洗脱)纯化提供白色固体核苷98(2.15g,84%)。31PNMR(CDC13)5:150.33。实施例13(lS,3R,4R,6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基-(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(105)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage82</formula>示意图13(a)6-N-苯甲酰腺嘌呤，BSA,TMSOTf,CH3CN,回流，8小时；(b)K2C03,MeOH，室温，16小时；(c)Bz20，DMF,室温；(d)DDQ,CH2C12,H20,室温；(e)Et3N.3HF，Et3N,THF,室温，16小时；(f)DMTCl,嘧啶，室温，16小时；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唑，NMI,DMF。亚磷酰胺105通过所示的由二乙酸混合物77a-b合成亚磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制备。实施例14(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4，4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰腺嘌呤-9-基)-6-甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(雨)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>示意图14(a)Et3N.3HF,Et3N，THF，室温，16小时；(b)DMTC1,嘧啶，室温，16小时；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亚磷酰胺108通过所示的由80b合成亚磷酰胺86的方法由核脊102b制备c实施例15(lS,3R，4R，6R,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧三苯甲基氧基甲&)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2,5-二氧杂-双环[2.2.1]庚烷(114)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula>示意图15(a)2-氨基-6-氯嘌呤，BSA，TMSOTf，CH3CN,回流，2小时；(b)3-幾基丙腈，NaH,THF,4小时；(c)异丁酸酐，DMAP,DMF,60°C,24小时；(d)DDQ，CH2C12，H20，室温，16小时；(e)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温；(f)DMTC1,嘧啶，室温；(g)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI，固F。亚磷酰胺114通过所示的由二乙酸混合物77a-b合成亚磷酰胺83的方法由二乙酸77a-b制备。实施例16(lS,3R,4R，6S,7S)-7-[2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基]-l-(4,4，-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丁酰鸟嘌呤-9-基)-6-甲氧基甲基-2，5-二氧杂-双环庚烷(in)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage85</formula>示意图16(a)Et3N.3HF,Et3N,THF,室温，16小时；(b)DMTC1,嗜啶，室温，16小时；(c)CNCH2CH2OP(N-iPr2)2,四唾，NMI,DMF。亚磷酰胺117通过所示的由80b合成亚磷酰胺86的方法由核苦11lb制备。实施例176-CH2OHBNA合成A)核普118将二甲基亚砜(1.77mL,25.0mmol)逐滴加入草酰氯(1.10mL，12.5mmol)的二氯甲烷(60mL)冷溶液(-78。C)。搅拌30分钟后，向反应中添加醇26(5.0g,8.4mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液。在78。C下继续搅拌45分钟，然后逐滴向反应中添加三乙胺(5.05mL,37.5mmo1)。搅拌10分钟后，去除冰浴并将反应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage86</formula>示意图17(a)草酰氯，DMSO,Et3N,CH2C12,-78至0°C;(b)Ph3PCH2Br,nBuLi,THF,-78。C至室温，来自26的产率为97%;(c)TBAF，THF，室温，16小时，97%;(d)NaH,BnBr，DMF,室温，1小时，定量；(e)Os04,NMO，95%丙酮水溶液，室温，48小时，87%;(f)TBSCI,嘧啶,0°C,4小时，定量；(g)MsCl,Et3N,DMAP,CH2C12,室温，16小时，分别为44%和40%收率;(h)Et3N.3HF,Et3N,THF,定量；(i)PivCl,DIPEA,DMAP,CH2C12,室温，16小时；(j)AcOH,Ac20,催化量H2S04,来自125的产率为92%;(k)BSA,尿嘧啶,TMSOTf,CH3CN,回流2小时；(I)K2C03,MeOH,来自127的产率为74%。逐渐升温至约Or，此时TLC显示没有起始醇。以二氯甲烷稀释反应物，并先后以10Q/qHC1、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩以提供醛27,其不经纯化用于下一步骤。B)核苷118向三苯基溴化磷(3.88g,10.9mmol)的干THF(60mL)冷搅拌溶液(0。C)逐滴添加nBuLi(2.5M,4.34mL,10.9mmol)。搅拌1小时后，将红色溶液冷却至-78°C,并逐滴向反应中添加由前面获得的醛27(8.4mmol)的干THF(15mL)溶液。将反应物逐渐加热至室温，继续搅拌16小时。使用饱和NH4C1小心淬灭反应，且反应物在EtOAc和水之间分配。然后以盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以10%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化^是供无色油状的烯烃118(4.84g，由26为97%)。C)核苷119将氟化四丁基铵(1M存在于THF中，10,00mL,10.0mmol)添加至烯烃118(4.83g,8.1mmol)的THF(35mL)溶液。室温搅拌反应物16小时后，真空去除溶剂并将残留物溶解于EtOAc。然后以水、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,以40。/。EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇119(2.79g，97%)。D)核苷120将氢化钠(60%w/w存在于矿物油中，0.4g，10mmol)添加入醇119(1.44g,4.1mmol)和苯甲基溴(0.71mL,6.0mmol)的DMF(16mL)冷溶液(0。C)。在0°C下搅拌l小时后，用水小心淬灭反应并在EtOAc和水之间分配。以盐水分离并洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以10至25%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化3是4共无色油状的烯经120(1.84g，定量)。E)核苷121将四氧化锇(25%Os04的iPrOH溶液，lmL)添加至烯烃120(1.80g，4.0mmol)和N-甲基吗砵画N画氧化物(NMO，0.94g,8.0mmol)的95%丙酮/水(25mL)溶液。在室温下搅拌16小时后，向反应中再度添加OsO4溶液(0.5mL)和NMO(0.40g)。搅拌总计48小时后，以EtOAc稀释反应物并以10%NaHS03、盐水洗涤，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以40%至50%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的二醇121(1.68g，87%,约1:1的异构体混合物)。F)核香122和123将TBSC1(0.66g,4.4mmol)添加至二醇121(1.63g,3.4mmol)的嘧咬(17mL)冷溶液((TC)。在0。C下搅拌4小时后，以EtOAc稀释反应物，以水、盐水洗涤有机层，干燥并浓缩。柱层析(Si02,以10至20%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的醇122和123(0.90g和L117g,未指定绝对立体化学)。G)核苷124向醇123(未指定绝对立体化学,0.9g,1.5mmol)、三乙胺(0.46mL,3.3mmol)和二甲基氨基嘧啶(37mg,0.3mmol)的二氯甲烷(5mL)冷溶液(0。C)添加甲烷磺酰氯(0.24mL,3.0mmo1)。在室温下7小时后，再向反应中添加甲基磺酰氯(0.12mL)和三乙胺(0.23mL)。室温下搅拌9小时后，将反应物倒入EtOAc，以10。/。HC1、饱和NaHC03、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以10%至15%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供甲磺酸124(0.44g,44%)和起始的二醇123(0.32g,40%)。H)核苷125向甲磺酸124(0.44g,0.6mmol)和三乙胺(0.23mL,1.7mmol)的THF(7mL)溶液添加三乙胺三氢氟酸盐(0.64mL，4.0mmol)。室温下搅拌16小时后，以EtOAc稀释反应物，并以饱和NaHCOs、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以50Q/oEtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供醇125(0.40g,定量)。I)核苷127向醇125(0.72mmol,0.4g)、二异丙基乙基胺(DIPEA，0.17mL,1.0mmol)和二甲基氨基嘧啶(12mg,0.1mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液((TC)逐滴添加特戊酰氯(0.12mL，l.Ommol)。去除冰浴，在室温下搅拌反应物2小时，然后再向反应中添加DIPEA(0.17mL)和新戊酰氯(0.12mL)，并在室温下搅拌16小时。然后以EtOAc稀释反应物，以10%HC1、饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩得到粗品pivaloate126，其在不作进一步纯化下^吏用。将浓疏酸(2滴)加入斗且品pivaloate126(由前面获得)的冰醋酸(2.5mL)和乙酸酐(0.5mL)溶液。在室温下搅拌2小时后在高度真空下去除溶剂并将残留物溶解于EtOAc,以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，以10至15%EtOAc的己烷溶液洗脱)纯化提供无色油状的二乙酸127(0.45g，来自125的产率为92%)(异构体混合物)。J)核苷129a向二乙酸127(0.45g,0.65mmol)和尿嘧咬(0.15g,1.3mmol)的CH3CN(3.5mL)悬浮液添加N,O-二(三甲基硅烷基)乙酰胺(0.8mL,3.3mmol)。在4(TC下加热15分钟以获得澄清溶液后，向反应中添加三甲基硅烷基三氟甲基磺酸盐(0.24mL,1.3mmol)。回流2小时后，将反应冷却至室温并倒入EtOAc。以饱和NaHC03、盐水洗涤有机层，干燥(Na2S04)并真空浓缩以^是供粗制核苷128a，其在不作任何纯化下使用。向核香128a(0.11g,0.15mmol)的MeOH(1.5mL)溶液添加K2CO3(40mg,0.3mmol)。在室温下搅拌16小时后，真空去除溶剂并在EtOAc和盐水之间分配残留物。收集有机相，干燥(Na2S04)并真空浓缩，提供129a(未确定绝对立体化学)。柱层析(Si02，以35。/。丙酮的CHCl3溶液洗脱)纯化提供核苷129a(57mg,由127为74%)。&丽R(CDC13):S9.37(s,1H),7,92-7.61(m,5H),7.55-7.23(m,9H)，5.58(s,IH)，5.43(d,1H，J=8.1)，4.79(d,1H,J-11.7)，4.66(d,1H,J=11.7),4.58(m,2H),4.51(s,IH)，4.44(m,1H),4.05(s，IH)，3.95-3.72(m,4H)。LCMS:保留时间3.34min;M+H计算值517.19，实测值517.1。实施例18<formula>formulaseeoriginaldocumentpage90</formula>示意图18(a)N-Bz-胞嘧啶或6-N-Bz-腺嘌呤或2-氨基-6-氯嘌呤，BSA,TMSOTf,MeCH，回流；(b)K2C03,MeOH,室温，16小时(对于129b-c);(c)NaH,3-幾基丙腈，室温(对于129d);(d)TMSC1,嘧啶，BzCl或Bz20,DMF(对于130b-c);(e)TMSC1,嘧啶，异丁酰氯(对于130d)核*128b、128c和128d可分别采用N-Bz-胞嘧啶，6-N-Bz-腺噤呤和2-氨基-6-氯嘌呤通过Vorbrugen反应由糖前体127制备得到(示意图18)。以K2C03和MeOH处理128b和128c可分别提供核普129b和129c。以氬化钠和3-羟基丙腈处理128d可提供核苷129d。以TMSCl瞬时保护羟基基团然后与苯甲酰氯反应可分别提供核苷130b和130c。可选择地，上述转化也可通过以DMF为溶剂，将核普129b和129c与苯甲酸酐反应来实现。核苦130d可通过以存在于嘧啶中的过量TMSCl瞬时保护，再与异丁酰氯反应制备得到。实施例196'-取代类似物的制备示意图19<formula>formulaseeoriginaldocumentpage92</formula>R、R,和R2分别独立为H、烷基、烯基、炔基、取代的烷基、耳又代的烯基、取代的炔基或保护性基团可以使用二氯甲烷为溶剂，通过如DAST等氟化剂处理核苷130制备得到核普131。核香132可通过首先以Dess-Martin高价碘或在Swern条件下氧化130的伯鞋基，然后以DAST处理所得的醛制备得到。核香133可通过首先以Dess-Martin高Y介石典或在Swern条件下氧化130的伯羟基，然后在冰醋酸和还原剂(例如，硼氢化氰钠)存在下以伯胺或仲胺将所得的醛还原胺化制备得到。核苷134可通过先将130的幾基基团转化为离去基团(甲磺酸、甲苯磺酸、囟化物)，然后与过量的叠氮化钠加热制备得到。核普135可通过先将130的伯醇氧化为羧酸，然后在HATU或任意其它肽偶合剂的存在下与胺反应制备得到。核苷136可通过先以羰基二咪唑活化130的羟基基团，然后与胺反应制备得到。核苷137可通过先以适当的碱将130的羟基基团去质子化，然后以烷基化试剂淬灭阴离子制备得到。核苷138可通过先将130的羟基基团转化为离去基团，然后以疏醇亲核试剂取代制备得到。核苷139可通过还原134的叠氮基团，然后与异氰酸酯或异疏氰酸酯反应制备得到。核香140可通过还原134的叠氮基团并与FmocNCS反应提供活化的硫脲进行制备。fmoc活化的疏醇在EDC存在下进一步与胺反应可提供取代胍。去除fmoc保护性基团释放核苷140。实施例206-取代的BNA亚磷酰胺核普的制备示意图20<formula>formulaseeoriginaldocumentpage93</formula>可通过催化氢化去除核苷130-140的3'-和5'-0保护基团制备得到核苷142。或者，可通过首先以DDQ去除130-140的3'O-Nap基团，然后催化氬化去除5，0-苯甲基基团制备得到142。将5'轻基基团后续保护为二甲氧基三甲苯基醚，然后通过亚磷酰化反应可提供亚磷酰胺143。实施例21<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>示意图23(a)DAST,CH2Cl2,.78。C至室温，16小时，52%(b)DDQ,CH2C12,H20,室温，8小时，定量，(e)10%Pd/C,H2气球，50%(d)DMTC1,嘧啶，55%(e)(iPr2)2NPOCH2CH2CN,四唑，丽I，DMFA)核苷(131a)将二乙基氨基三氟化疏(DAST,0.16mL,1.4mmol)加入核香129a(0.1g,0.2mmol)的二氯甲烷(2mL)的冷溶液(-5(TC)。将反应逐渐加热至室温并搅拌16小时，然后以饱和NaHC03溶液小心淬灭反应。在EtOAc和盐水之间分配反应物，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02，33%EtOAc的己烷溶液)纯化提供核苦131a(51mg,52%，混有15-20%的开环杂质)的异构体混合物。19FNMR(CDC13):S-227.98(m)和-231.07(m)。LCMS:保留时间3.84分钟；M+H计算值519.19，实测值519.1，以及3.89min;M+H计算值519.19,实测值519.1。B)核苷(141a)向核苷131a(51mg，0.1mmol)的二氯甲烷(lmL)和7jc(2滴)溶液添加DDQ(44mg，0.2mmol)。室温下搅拌8小时后，以EtOAc稀释反应物，并以10%NaHS03溶液、饱和NaHC03溶液、盐水洗涤有机相，干燥(Na2S04)并浓缩。柱层析(Si02,30%丙酮的氯仿溶液)纯化提供核苷141a(41mg,作为异构体混合物定量)。19FNMR(CDC13):5-229.3(m)和-230.97(m)。LCMS:保留时间2.66分钟；M+H计算值379.12，实测值379.0。C)核苷(142a)使用氢气球氢化核苷141a(41mg,由前面获得)和10%钯炭(10mg)在甲醇(2mL)中的混合物。3小时后，所有的起始核苦141a被耗尽(通过对反应混合物的LCMS分析显示)。以硅藻土过滤反应物并减压浓缩滤除液。柱层析(Si02，10至20%甲醇的氯仿溶液)纯化提供作为异构体混合物的核苷142a(14mg，50%)。19FNMR(CDC13):5-231.45(t)和-232.88(dt)。LCMS:保留时间1.72分钟；M+Na计算值311.08,实测值311.0。D)核苷(142aa)向核苷142a(14mg,0.049mmol)的嘧咬(0.25mL)溶液添加DMTC1(24mg,0.07mmol)。室温搅拌3小时后将反应物减压浓缩。柱层析(Si02,20至30%丙酮的氯仿溶液)纯化提供作为异构体混合物的核苷142aa(16mg，55%)。19FNMR(CDC13):S-228.6(t)和-230.91(dt)。LCMS:保留时间3.56分钟；M+Na计算值613.21,实测值613.1。E)亚磷酰胺(143a)亚磷酰胺143a可参照实施例1的描述通过亚磷酰化(phosphitilation)反应由核苷142aa制备得到。实施例22核香亚磷酰胺的合成核香亚磷酰胺可参照此处和本领域(例如但不限于美国专利6,426,220和公开的PCT申请WO02/36743)所述的方法进行制备。实施例23寡核普酸和寡核普的合成如本发明所述的寡聚化合物可通过公知的固相合成技术进行常规制备。进行该种合成的设备已由多家销售商出售，例如，AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。本领域已知的任何其它该类合成方法均可额外或替代性采用。使用类似技术制备寡核普酸如疏代磷酸酯和烷基化衍生物已众所周知。寡核苷酸未取代和取代的磷酸二酯(P二O)寡核苷酸可在自动化DNA合成仪(AppliedBiosystems394型)上采用被碘氧化的标准亚磷酰胺化学法合成得到。除以下区别外，硫代磷酸酯(P二S)的合成类似于磷酸二酯寡核苷酸采用10%w/v的3，H-l,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物的乙腈溶液氧化亚磷酸联接以产生疏杂化。该辟^杂化反应步骤的时间提高至180秒且在此之前进行常规的带帽步骤。从CPG柱裂解并在55。C下于浓氨水中去封闭(12-16小时)后，以大于3倍体积的乙醇从lMNH4OAc溶液中沉淀回收寡核苷酸。亚磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,508,270的描述进行制备。烷基磷酸酯寡核普酸可参照美国专利4,469,863的描述进行制备。3，-脱氧-3，-亚甲基磷酸酯寡聚核苷酸可参照美国专利5,610,289或5,625,050的描述进行制备。亚磷酰胺寡核普酸可参照美国专利5,256,775或5,366,878的描述进行制备。烷基疏代磷酸酯寡核苷酸可参照公布的PCT申请PCT/US94/00902和PCT/US93/06976(分別公布为WO94/17093和WO94/02499)的描述进行制备。3，-脱氧-3，-氨基磷酰胺酯寡核苷酸可参照美国专利5,476,925的描述进行制备。磷酸三酯寡核普酸可参照美国专利5,023,243的描述进行制备。硼烷磷酸酯寡核苷酸可参照美国专利5,130,302和5,177,198的描述进行制备。寡核苷酸亚甲基甲亚胺基连接的寡核苷(也被称为MMI连接的寡核苷)、亚甲基二甲基肼连接的寡核苷(也被称为MDH连接的寡核香)、和亚甲基羰基氨基连接的寡核苷(也被称为酰胺-3连接的寡核香)、和亚甲基氨基羰基连接的寡核苷(也被称为酰胺-4连接的寡核苷)，以及具有例如交替的MMI和P=0或P=S联接的混合骨架寡聚化合物可参照美国专利5,378,825;5,386,023;5,489,677;5,602，240和5,610,289的描述进行制备。甲缩醛和硫甲缩醛连接的寡核苷可参照美国专利5,264,562和5,264,564的描述进行制备。环氧乙烷连接的寡核苷可参照美国专利5,223,618的描述进行制备。实施例24寡核苷酸分离从可控孔玻璃固相载体上裂解并在55°。的浓氨水中去封闭12-16小时后，以大于3倍体积的乙醇从lMNH4OAc溶液中沉淀回收寡核香酸或寡核香。合成的寡核苷酸可通过电喷雾质谱(分子量测定)和毛细管凝胶电泳进行分析。在合成中获得的疏代磷酸酯和磷酸二酯联接的相对数量可通过正确分子量相对-16amu产品(+/-32+/-48)的比例进行确定。在某些研究中寡核苷酸通过HPLC进行纯化，例如描述于Chiang等人，J.Biol.Chem,1991,266,18162-18171。HPLC-纯化材料所得的结果通常类似于从非-HPLC纯化材料获得的结果。实施例25寡核苷酸合成-96孔板形式寡核苷酸可在能够以96-孔形式同时装配96个序列的自动化合成器中通过固相P(III)亚磷酰胺化学法合成得到。磷酸二酯核香酸间联接可通过碘水溶液氧化得到。硫代磷酸酯核苷酸间联接可通过使用无水乙腈中的3,H-1,2苯并二硫醇-3-酮l,l-二氧化物(Beaucage试剂)疏化得到。标准的碱基被保护的卩-氰乙基-二异丙基亚碌酰胺可从销售商(例如PE-AppliedBiosystems,FosterCity:CA或Pharmacia,Piscataway,NJ)处购得。非标准核苷可参照标准和专利方法进行合成。它们可作为碱基保护的(3-氰乙基-二异丙基亚磷酰胺。寡核苷酸从载体上裂解并在升高的温度(55-60。C)下在浓NH4OH中去保护12-16小时，在真空下干燥所释放的产品。将干燥的产品重悬于无菌水中以提供主平板，从该平板上使用机械移液管稀释得到所有的分析和测试平板样本。实施例26采用96-孔板形式进行寡核普酸分析各徵孔中的寡核香酸浓度可通过稀释样本和UV吸收广谱测定。单个产品的全长完整性可以96-孔形式(BeckmanP/ACETMMDQ)或针对单独制备的样本在商用毛细管电泳设备(例如，BeckmanP/ACE5000,ABI270)上通过毛细管电泳(CE)进行评估。碱基和骨架组成可采用电喷雾质谱对寡聚化合物进行质谱分析确定。所有的测试平板均从主平板采用单和多道机械移液器稀释得到。如果平板上至少85%的寡聚化合物具有至少85%全长，则可认为该平板可接受。实施例27细胞培养和寡核香酸处理寡聚化合物对耙标核酸表达的作用可在各种细胞类型中进行测试，只要该靶标核酸以可测水平在该细胞类型中存在。这可通过使用，例如PCR或Northern印迹分析等方法常^见测定。来自多种組织和物种的细胞系可从美国菌种保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得。下列提供的细胞类型仅供阐述目的，也可常规采用其它细胞类型，只要把标在选定的细胞类型中表达。这可通过本领域常规的方法，例如，Northern印迹分析、核糖核酸酶保护测定或RT-PCR等进行简便的测定。b.END细胞小鼠脑内皮细胞系b.END由MaxPlank研究所(BadNauheim，Germany)的WernerRisau博士提供。b.END细胞常规培养于添加了100/o胎牛血清(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)的高糖DMEM中(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)。在汇合度达到约90%时，通过胰蛋白酶化和稀释进行常规的细胞传代。将细胞以大约3000细胞/微孔的密度接种至96-孔板(Falcon-Primaria#353872,BDBiosciences,Bedford,MA)，从而用于包括但不限于寡聚化合物转染实验。涉及以寡聚化合物处理细胞的实验当细胞达到适当的汇合度时，采用所述的转染方法以寡聚化合物对其进行处理。UPOFECTIN当细胞达到65-75%汇合度时，以寡核苷酸对其进行处理。将寡核苷酸与LIPOFECTINTM(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)在Opti-MEMTM-l低血清培养基(InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad,CA)中混合，以实现寡核普酸的理想浓度，且LIPOFECTINTM的浓度为每100nM寡核香酸2.5或3pg/mL。将该转染混合物在室温下孵育约0.5小时。细胞生长于96-孔板时，以100nLOPTI-MEMTM-l洗涤微孔一次，然后以130pL转染混合物处理。类似地，用适当体积的培养基和寡核香酸处理生长于24-孔板或其它标准组织培养板中的细胞。重复两次或三次处理细胞并取得数值。在37。C下处理约4-7小时后，以新鲜培养基替换含转染混合物的培养基。寡核普酸处理后16-24小时采集细胞。本领域已知的其它适用转染试剂包括，但不限于，CYTOFECTINtm、LIPOFECTAMINEtm、OLIGOFECTAMINEtm和FUGENE。本领域已知的其它适用的转染方法包括，但不限于电穿孔。实施例28寡核普酸抑制靶标表达的分析靶标表达的反义调节可通过本领域已知的多种方法进行测定。例如，耙标mRNA水平可通过，例如，Northern印迹分析、竟争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR进行定量。目前希望采用实时定量PCR。可对总细胞RNA或poly(A)+mRNA进行RNA分析。本发明的一种RNA分析方法采用总细胞RNA，如本文其它实施例中所描述。RNA分离的方法已为本领域公知。Northern印迹分析也是本领域的常i见方法。实时定量(PCR)通过^^用来自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA的ABIPRISM7600、7700或7900序列检测系统并参照生产商iJt明得以便利地实现。靶标蛋白水平可通过本领域公知的多种方法进行定量，例如免疫沉淀、Western印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)或焚光激活细胞分类(FACS)。针对靶标的抗体可从多种来源例如抗体的MSRS目录(AerieCorporation,Birmingham,MI)鉴定并获得，或者可通过本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法制备得到。制备多克隆抗血清的方法可参见，例如，Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻,第11.12.1-11.12.9页，JohnWiley&Sons,Inc.，1997。单克隆抗体的制备可参见，例^口，Ausubel，F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11.11.5页，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。免疫沉淀法是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.16.11页，JohnWiley&Sons,Inc.,1998。Western印迹(免疫印迹)分析是本领域的标准方法，并可参见例如,Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第10.16.1-10.80.21页，JohnWiley&Sons,Inc.,1997。酶联免疫吸附测定(ELISA)是本领域的标准方法，并可参见例如，Ausubel,F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,第2巻，第11.4.1-11,2.22页,JohnWiley&Sons:Inc.，1991。实施例29对把标抑制剂用途的表型测定和体内研究的设计表型测定一旦把标抑制剂通过此处披露的方法进行鉴定，可在一个或多个表型测定中进一步考察该寡聚化合物，其中每个测定具有预示对特定疾病状态或症状进行治疗的效力的可测端点。表型测定、其中适用的试剂盒和试剂已为本领域技术人员公知，并在此处用于考察靶标在健康和疾病中的作用和/或关联。代表性的表型测定(可从多个销售商中购得)包括测定细胞活性、细胞毒性、扩增或细胞存活的测定(MolecularProbes,Eugene,OR;PerkinElmer,Boston,MA)，基于蛋白的测定包括酶法测定(Panvera，LLC,Madison,WI;BDBiosciences,FranklinLakes,NJ;OncogeneResearchProducts,SanDiego,CA)，纟田月包调节、信号转导、炎症、氧化过禾呈以及凋亡(AssayDesignsInc.,AnnArbor,MI)、甘油三酉旨积累(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)、血管生成测定、管道形成测定、细胞因子和激素观'J定以及^U射观'J定(ChemiconInternationalInc.,Temecula，CA;AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)。在一个非限制性实例中，经测定适用于特定表型测定的细胞(即，选择用于乳腺癌研究的MCF-7细胞；用于肥胖研究的脂肪细胞)用体外研究鉴定的耙标抑制剂和对照化合物在最佳浓度下处理(通过上述方法测定的)。在处理末期，用一种或多种对测定特异的方法来分析经处理和未经处理的细胞来确定表型结果和终点。表型终点包括细胞形态随时间或处理剂量的变化以及细胞成分如蛋白、脂质、核酸、激素、糖或金属等的水平变化。对细胞状态(包括pH、细胞周期阶段、细胞对生物指示剂的摄取或排除)的检测通常是感兴趣的。对处理后的细胞中一种或多种基因表达的检测同样可用作把标抑制剂的效力或功效的指示。同时检测经处理和未经处理的细胞中的纯度印记基因或怀疑与特定疾病状态、症状或表型有关的那些基因。体内研究本文所述的体内研究中的个体对象为温血脊推动物，包括人。实施例30RNA分离Poly(A)+mRNA分离Poly(A)+mRNA的分离可参照Miura等人的方法(Clin.Chem.,1996，42,1758-1764)。其它的poly(A)+mRNA分离方法为本领域的常规方法。简言之，对于生长于96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并以200冷PBS洗涤每个微孔。向每个孩i孔添加60nL裂解緩沖液(IOmMTris-HCl，pH7.6,1mMEDTA，0.5MNaCl，0.5%NP-40,20mM氧钒-核糖核苷复合物)，轻柔摇动平板并在室温下孵育五分钟。将55|iL裂解产物转移至涂覆了寡聚d(T)包被的96-孔板(AGCTInc.,IrvineCA)。将平板在室温下孵育60分钟，以200洗涤緩冲液(10mMTris-HClpH7.6,1mMEDTA，0.3MNaCl)洗涤3次。末次洗涤后，以纸巾吸去多余的洗涤緩冲液，然后空气干燥5分钟。将预热至7(TC的60pL洗脱緩冲液(5mMTris-HClpH7.6)添加至各微孔，将平板在90°C热板上孵育5分钟，然后将洗脱物转移至新鲜的96-孔板。生长于100mm或其它标准平板的细胞也可采用适当体积的所有溶液进行类似处理。总RNA分离总RNA可采用由QiagenInc.(Valencia,CA)购得的RNEASY96顶试剂盒和緩冲液并参照生产商的推荐方法进行分离。简言之，对于生长于96-孔板的细胞，从细胞去除生长培养基并分别以200冷PBS洗涤每个微孔。向每个微孔添加150緩冲RLT并将平板剧烈摇动20秒。将150的70%乙醇添加至各微孔，然后通过上下吹吸三次混合内含物。随后将样本转移至装配了废物采集盘并连接至真空源的QIAVactm集流腔所连接的RNEASY96tm孔板上。抽真空1分钟。将500[iL緩冲RW1添加至RNEASY96顶板的各微孔中并孵育15分钟，再次抽真空1分钟。再次将500|iL緩冲RW1添加至RNEASY96tm板的各微孔中并再次抽真空2分钟。然后将1mL的緩冲RPE添加至RNEASY96tm板的各微孔中并抽真空90秒钟。重复用緩冲RPE洗涤，再次吸真空3分钟。然后从QIAVACTM集流腔取走平板并用纸巾吸干。重新将平板连接至装配了含1.2mL采集管的采集管架的QIAVACtm集流腔。然后通过向各微孔中移入140无RNA酶的水，孵育1分钟，抽真空3分钟洗脱RNA。重复移液和洗脱步骤可通过QIAGENBio-Robot9604(Qiagen,Inc.,ValenciaCA)自动完成。简言之，裂解培养平板上的细胞之后，将平板转移至进行移液、DNA酶处理和洗脱步骤的机械平台上。实施例31耙标mRNA水平的实时定量PCR分析耙标mRNA水平可采用ABIPRISM7600、7700或7900序列检测系统(PE-AppliedBiosystems，FosterCity,CA)并参照生产商的i兑明通过实时定量PCR实现定量。这是一个闭管、非凝胶式荧光检测系统，其允许对聚合酶链式反应(PCR)产物进行实时高通量定量。与扩增产物在PCR完成后定量的标准PCR不同，在实时定量PCR中的产物在其积累时定量。这一点可通过在PCR反应中包含在正向和反向PCR引物之间特异性退火并包含两个荧光染料的寡核苷酸探针来实现。报告染料(例如，FAM或JOE，来自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被连接至探针的5'端而淬火染料(例如，TAMRA，来自PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA,OperonTechnologiesInc.,Alameda,CA或IntegratedDNATechnologiesInc.,Coralville,IA)被连接至探针的3'端。当探针和染料完整时，报告染料的发射被邻近的3'端淬火染料淬灭。在扩增过程中，探针与靶标序列的退火生成能被Taq聚合酶的5'-核酸外切酶活性裂解的底物。在PCR扩增周期的延伸阶段，Taq聚合生成了序列特异性荧光信号。在每一个周期中，附加的报告染料分子从其相应的探针中裂解，并可通过整合在ABIPRISMTM序列检测系统中的激光镜头定期监测荧光强度。在每一个测定中，一系列包含来自未处理对照样本的mRNA系列稀释物的平行反应生成标准曲线，它可用于对测试样本进行反义寡核苷酸处理后的抑制百分比进行定量。在定量PCR分析之前，对被测耙标基因特异性的引物-探针组与GAPDH扩增反应的"多重性(multiplexed)"能力进行评估。在多重化中，耙标基因和内标基因GAPDH在单个样本中同时扩增。在该分析中，从未处理细胞中分离的mRNA被系列稀释。各稀释物可在仅特异性耙向GAPDH、仅特异性耙向靶标基因("单重")或对两者都特异(多重)的引物-探针组的存在下扩增。PCR扩增之后，可同时从单重和多重样本生成作为稀释函数的GAPDH和耙标mRNA信号的标准曲线。如果从多重样本中生成的GAPDH和靶标信号的斜率和相关联系数均小于从单重样本所得相应数值的10%之内，则该对把标具有特异性的引物-探针組可认为具有多重性。其它PCR方法已为本领域所知。RT和PCR试剂可从InvitrogenLifeTechnologies(Carlsbad,CA)获得。RT，实时PCR可通过向含有30jiL总RNA溶液(20-200ng)的96-孔板添加20PCR混合物(2.5x无MgCl2PCR緩冲液，6.6mMMgCl2,dATP、dCTP、dCTP和dGTP各375^M,正向引物和反向引物各375nM，125nM探针，4单位RNA酶抑制剂，1.25单位PLATINUMTaq，5单位MuLV逆转录酶以及2.5xROX染料)得以实现。RT反应可通过在48i:下孵育30分钟得以实现。在95°C下聘育10分钟以激活PLATINUMTaq后，进行40个循环的两步PCR法95。C下进行15秒(变性)后在6(TC下进行1.5分钟(退火/延伸)。通过RT，实时PCR得到的基因目标量通过GAPDH(—种表达恒定的基因)的表达水平或通过以RIBOGREEN(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)定量总RNA来归一化。GAPDH表达可通过与靶标同时多重或单独运行实时RT-PCR来定量。总RNA可采用RiboGreenRNA定量试剂(MolecularProbes,Inc.Eugene,OR)进行定量。通过RIBOGREENtm迸行RNA定量的方法可参见Jones,L.J.,等人，(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)。在该测定中，170|iL的RIBOGREENTM工作试剂(RIBOGREENTM试剂以1:350稀释于10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH7.5)以移液管移入含有30|iL纯化细胞RNA的96-孔板。在CytoFluor4000(PEAppliedBiosystems)中读板，激发波长为485nm,发射波长为530nrn。实施例32靶标特异性引物和探针可采用公开的序列信息设计探针和引物，与把标序列杂交。例如，对于人PTEN，可使用公开的序列信息(GENBANRTM录入号U92436.1,SEQIDNO:l)设计下列引物-探针組正向引物AATGGCTAAGTGAAGATGACAATCAT(SEQIDNO:2)反向引物TGCACATATCATTACACCAGTTCGT(SEQIDNO:3)以及PCR探针FAM-TTGCAGCAATTCACTGTAAAGCTGGAAAGG-TAMRA(SEQIDNO:4),其中FAM为荧光染料，TAMRA为淬火染料。实施例33草巴标蛋白水平的Western印迹分析Western印迹分析(免疫印迹分析)可采用标准方法进行。在寡核苷酸处理后16-20小时采集细胞，以PBS洗涤一次，悬浮于Laemmli緩冲液(100pl/微孔)，煮沸5分钟并上样至16%SDS-PAGE凝胶。在150V下跑胶1.5小时，并转移到膜上进行western印迹。采用适当的针对耙标的一抗，以及针对该一抗的放射标记或焚光标记的二抗。采用PHOSPHORIMAGER(MolecularDynamics,SunnyvaleCA)显示条带。实施例34耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA2-10-2带间隙寡聚体体外研究如本发明所述，合成寡聚化合物并在一定剂量范围内检测其减少PTEN表达的能力。采用此处所述的方法以0.3125、0.0625、1.25、2.5、5、10或20nM浓度的6-(R或S)-CH3-BNA(分别为392748和392749)以及6-(R或S)-CH2-OCH3(分别为396004和396005)修饰的寡聚体处理b.END细胞。如此处其它实施例所述，PTEN的表达水平可通过实时PCR测定并对RIBOGREEN归一化。所得的剂量-响应曲线可如下所示用于测定EC50。可在pH7的含0.1mMEDTA的100mM磷酸盐緩冲液中于260nm下使用4|iM6-(R或S)-CH3-BNA或6-(R或S)-CH2-0-CH3修饰的寡聚体和4(iM互补RNA评估Tm。<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体的核香为6-(R或S)-CH3BNA核普，加下划线和粗体的核香为6-(R或S)-CH2-0-CH3BNA核香，而下标R和S表示了在6位碳原子处的构型。应当指出6-修饰的BNA寡聚化合物显示了更大的效力，尽管它的Tm略微下降。实施例35耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2带间隙的寡聚体体内研究在3周中每周两次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射剂量为0.5或2|imol/kg的把向PTEN的6-CHrBNA修饰寡聚体(6-(S)或6-(R))。在最后一次施用后48小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(%UTC)。SEQH>NO.组成(S，至3，)剂量％UTC/腿腸*《盐水10005/392748C'及U/TAGCACTGGCQfU及2.03105/392748CUffTAG(:ACTGGCC0.58105/392749CyJiTAGCACTGGCCsUs2,02305/392749C函TAGCACTGGCC美0.573所有的核苷间联接为硫代磷酸酯，粗体核苷为6-CH3-BNA核普而下标R和S表示了在6位^_原子处的构型。实施例36靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA和6-(R)-CHrBNA2-10-2带间隙的寡聚体体内研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次剂量为1、2、4或8(imol/kg的靶向PTEN的6-CHrBNA修饰的寡聚体(6-(S)或6-(R))。在施用后72小时处死小鼠。将肝組织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(。/。UTC)。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>所有的核苷间联接均为疏代磷酸酯，粗体和带下划线的核苷为6-CHrO-CH2-BNA核普而下标S和R表示了6位碳原子处的构型。实施例38以SVPD处理的6-(R或S)-CH3-BNA修饰的寡聚体的核酸酶稳定性6-(R或S)-CH3-BNA(分别为392748和392749)修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)进行测定。该研究分别包括了可进行比较的6-未取代的间隙体(gapmer)(4'-CH2-0-2，桥连的BNA，392745，下标l)和2，-0-MOE间隙体(2，-0-(CH2)2-OCH3，392753,下标e)。各寡聚体制备为含有以下成分的500(iL混合物5)iL100寡聚体，50含于SVPD緩冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，8mMMgCl2)的0.5单位/mL磷酸二酯酶，其最终浓度为0.05单位/mL,445pLSVP緩冲液。将样本在37。C下于水浴中孵育。在第0、1、2和4天取等份(100(iL)并在第1和2天添加新鲜的酶。在等份取出后立即添加EDTA以终止酶活性。在IPHPLC/MS上分析样本。SEQM)NO'组成(5'至3，)第4天全长％舰SNO,05/392748C教U及TAGCACTGGCC及Ui>9005/392749C函TAGCACTGGCC函>7005/392745CiUiTAGCACTGGCCWi>400S舰753CATAGCACTGGCC具>30SEQIDNO.在24小时的组在48小时的组在96小时的组/ISISNO.成％成％成％05/—神27站100%89%92%0S/392滩96%纖74%05/39274567%56%48%05/39275358%46%36%所有的核苷间联接为疏代磷酸酯，粗体核苷为修饰的核苷，下标R和S表示了6-CH3-BNA核苦在6位碳原子的构型，下标e表示了2'-OMOE核普而下标1表示了4，-CH2-0-2，修饰的核苷。含有6-甲基取代的BNA的化合物实施例39以SVPD处理的6-(R或S)-CH3-BNA、4，-CHrO-2，BNA和2，-0-MOE修饰的寡聚体的核酸酶稳定性6-CH3-BNA修饰的寡聚体的核酸酶稳定性可采用蛇毒磷酸二酯酶(SVPD)进行测定。各寡聚体制备为含有以下成分的90混合物51iL寡聚体(2pL5pM寡聚体和35，32p-标记的寡聚体)、75H20以及1010x緩冲液(500mMTris-HCl，700mMNaCl以及140mMMgCl2，pH8.6)。在0分钟，从上述制备的寡聚体样本取出9并添加至10(iL终止緩冲液(6.67M尿素，16.67%甲酰胺和83.3mMEDTA)然后添加1|iLH20并在IO(TC下加热2.5至3分钟。通过添加9SVPD(0.5单位/mL)开始测定动力学。最终的酶浓度为0.05单位/mL。将每等份的10寡聚体动力学溶液添加至10(iL终止緩冲液并按如上所述热灭活。取l、3、9、27、80、240和1290为动力学时间点。通过12%丙烯酰胺PAGE在45瓦特/凝胶下跑2小时分析样本。認<|ID膽./腳膽，06/39542107/39542307/395424鹏9542S06/7157组成(5'至3')TTTTTTTTTTU禍TTTTTnTTTTT修饰粗体2-O-MOE粗体4,-CH2-0-2,粗体6-(R〗-CH3未修饰的.(2邻所有的核苷间联接均为疏代磷酸酯，粗体核普为修饰的核苷，下标R和S表示了6-CHrBNA核普在6位碳原子的构型，下标e表示2'-0-M0E核脊而下标1表示4，-CHrO-2，修饰核苷。SEQIDNO.在3分钟的在27分钟的在80分钟的在240分钟在12卯分钟组成％组成％组成％的组成％的组成％06/39542168.727.917.211.69.007/39542332.64.72.52.22,207/39542496.4狄l83.279.072.007/395425邻.O86.383.782.70頻575.2L22,0i,70,9,实施例40在三周、多剂量j本内研究中耙向PTEN的6-(S)-CH3-BNA、4，-CH2-0-2-BNA和2'-0-MOE修饰的寡聚体在三周中每周两次向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射剂量为3.2、1.0、0.32和0.1pmol/kg(以下仅显示了3.2和1(imol/kg的数据)的靶向PTEN的6-(S)-CH3-BNA(2-10-2,14-聚体)、4，-CH2-0-2，-BNA(2-10-2，14-聚体)和2，-0-MOE(5-10-5,20-聚体)修饰的寡聚体。在最后一次施用后48小时处死小鼠。将肝组织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(G/oUTC)。处死后测定血浆化学和肝重。SEQIDNO,组成(5，至3')剂量％UTCALT盐水i節41,305/392749C函TM3CACTCK3CC函124.329.803/392稀C函TAOCACTGGCC胸13624.S05/392063C,线TAGCACTGGCCiU画3,24.2279.308/392063咏C,WTAGCACTGGC,CiT,12641.009/116847CeTeG,CTAGCCTCTGG15341.3ATtHPra^*《le*e^"^e^e所有的核普间联接为硫代磷酸酯，粗体核香为修饰的位置，下标s表示6-(S)-CH3-BNA,下标1表示4，-CH2-0-2，BNA,下标e表示2，-OM0E而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。在研究的最高点，含4，-CH2-0-2，BNA(392063，3.2(imol/Kg剂量組)的寡聚体的高剂量组动物显示肝重明显升高的(相对盐水为153%)。与之相对，含6-(S)-CH3BNA(392749，3.2fimol/Kg剂量组)寡聚体的肝重为盐水组的117%。含2'O-MOE(116847,1.0|imol/Kg剂量组)寡聚体的肝重为盐水組的116%。该实施例证明了6-(S)-CH3-BNA修饰在允许设计的反义寡聚体保持4'-CH2-0-2，BNA所赋予的效力的同时，其ALT水平相对4'-CH2-0-2，BNA修饰的化合物有显著提升。实施例41耙向PTEN的6-(R或S)-CH3和6-(R或S)-CH2-OCH3、4，-CH2-0-2，BNA2-10-2带间隙的寡聚体体内研究向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次剂量为2.5、5、10和201imol/kg(以下仅显示了5和10(imol/kg的数据)的耙向PTEN的修饰的6-(R或S)-CH3(分别为396568和396024)、6-(R或S)画CH2-OCH3(分别为396007和396008)、4,-CH2-0-2，BNA2-10-2带间隙的寡聚体(6-(S)或6-(R))。在施用后66小时处死小鼠。将肝组织匀浆化。SEQIDNO.組成(5'至3')剂量ALT腦)S肌盐水41.305應024CsU5TAGCACTGGCC:函10250.505/3卿24C函TAGCACT冊CC《U5'572.005/3賜S68C，炎TAGCACTGGCC:函10234.3C函TAGCACTGGCC函562.005jQ^TAGCACTGGCg^10129,S0S/39,gg^TAGCACTGGCgg^5鄉.O05/3卿07g^TAGCACTOGCSia10柳05/39,^^TAGCAC',CS^50咖2啦MeC，T,TAGCACTGGC^C'T,10925,008鹏oe綠C,TiTAGCACTGGC隐CiT,5373.0所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体的核苷为修饰的核苷，下标R和S表示所示的6-CH3-BNA(仅粗体)和6-CHrO-CH3-BNA(粗体并带下划线)核苷在6位碳原子的构型，下标1表示4，-CH2-0-2，核苷而Mec表示5'-甲基胞嘧咬核脊。上述寡核苷中，一个寡核苷(IsisNo.392063)在6位碳原子处不含手性核普，其中其它四个(IsisNo.396024、396568、396008和396007)在6位石友原子处含手性的核苷。特别地，这四个寡核苷在1、2、13和14位具有一个该种核苷。在肝中，在6位碳原子处不含手性核苷的寡核苷比包括在6位碳原子处含手性核苷的四个寡核苷具有相对更高的毒性。实施例42輩巴向PTEN的2-14-2带间隙的寡聚体体内研究在向六周大的Balb/c小鼠(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)注射一次剂量为2或10(imol/kg的靶向PTEN的6-CH3-BNA修饰的寡聚体。在施用后72小时处死小鼠。将肝組织匀浆化并按照此处所述通过实时PCR对mRNA水平定量，从而与未处理对照水平进行比较(Q/oUTC)。SEQIDNO.组成(5，至3，)修饰舰SNCX10/394420wCeTeGCTAGCCTCT<3GATTeTe粗体2'-OMOE1i/4助522mCRUR<3CTA(3CCTCTGGATURUR粗体6"(R)-CH311/4彻523mCsUsGCTAC3CCTCTGGATUsUs粗体11/400524mCRURGCTA<}CCTCTGGATCRUR粗体6-(R)-CH2-0-CH31i/40052S"CsUsGCTAGCCTCTGGATUsUs粗体6-(S)-CH2-OCH3ISISNO.剂量％UTC标准偏差盐水湖％12%39442079%2%3944201026%11%柳522218%3%400522104%0%400523217%2%400523104%1%400524之23%7%40052410條0%柳525221%3%400525103%0%所有的核苷间联接均为硫代磷酸酯，粗体的核普为修饰的核苷，下标R和S表示所示的6-CH3-BNA和6-CH2-0-CHrBNA核苷在6位碳原子的构型，下标e表示2'-0-MOE核苷而MeC表示5'-甲基胞嘧啶核苷。此处所引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作为参考。尽管在前述的说明书中本发明通过某些优选实施方案进行了描述，且为了阐述的目的列举了众多具体内容，本领域技术人员显然理解本发明可采用其它的实施方案，且此处所述的某些具体内容可在不悖离本发明基本原则的情况下进行相当的改变。权利要求1.一种双环核苷，其具有下式其中Bx是杂环碱基部分；T1是H或羟基保护基团；T2是H、羟基保护基团或活性磷基团；Z是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫；且其中各被取代的基团独立地由任选被保护的取代基单或多取代，该取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中各J1、J2和J3分别独立为H或C1-C6烷基，X是O、S或NJ1。2.如权利要求1所述的化合物，其中Z是C广C6烷基或取代的d-Q烷基。3.如权利要求2所述的化合物，其中Z是甲基。4.如权利要求2所述的化合物，其中Z是取代的CrC6烷基。5.如权利要求4所述的化合物，其中所述的取代基为CrC6烷氧基。6.如权利要求4所述的化合物，其中Z是CH30CH2-。7.如权利要求1-6任意一项所述的化合物，其中所迷Z基团为(R)-构型:T「C>i、oBx8.如权利要求1-6任意一项所述的化合物，其中所述Z基团为(S)-构型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>9.如权利要求1-8任意一项所述的化合物，其中T！和T2中至少一个为羟基保护基团。10.如权利要求9所述的化合物，其中所述的羟基保护基团分别独立选自苯甲基、苯甲酰、2,6-二氯苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、甲磺酸、甲苯磺酸、二甲氧基三苯甲基(DMT)、9-苯基黄嘌呤-9-基(Pixyl)以及9-(对甲氧基苯基)黄噪呤-9-基(MOX)。11.如权利要求9所述的化合物，其中Tt选自乙酰基、苯甲基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基以及二甲氧基三苯甲基。12.如权利要求ll所述的化合物，其中所述的Ti为4,4，-二甲氧基三苯甲基。13.如权利要求l-8任意一项所述的化合物，其中T2为活性磷基团。14.如权利要求13所述的化合物，其中所述的活性磷基团为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺或H-磷酸酯。15.如权利要求1-8任意一项所述的化合物，其中T\为4,4，-二甲氧基三苯甲基，T2为二异丙基氰基乙氧基亚磷酰胺。16.—种寡聚化合物，其具有至少一个具有下式的单体或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Bx是杂环石威基部分；T3为H、鞋基保护基团、联接的共轭基团或与核苷、核苷酸、寡核香、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核香间联接基团；T4为H、羟基保护基团、联接的共轭基团或与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核苷酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核苷间联接基团；其中至少T3和T4之一为与核苷、核苷酸、寡核苷、寡核普酸、单体亚基或寡聚化合物连接的核普间联接基团；且Z是C广C6烷基、C2-Q歸基、C2-C6炔基、取代的d-Q烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫。17.如权利要求16所述的寡聚化合物，其中各被取代的基团独立地被任选被保护的取代基单或多取代，该取代基独立地选自卣素、氧代、羟基、OJi、NJ山、SJ!、N3、OC(-X)JbOC^X)NJ!J2、NJ3C(二X)NJ!J2和CN，其中各Ji、乙和J3独立为H或C广C6烷基，X是O、S或Nh。18.如权利要求16所述的寡聚化合物，其中各Z独立地为CVC6烷基或取代的CrCe烷基。19.如权利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为甲基。20.如权利要求18所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为取代的d-C6烷基。21.如权利要求20所述的寡聚化合物，其中各所述取代基为CH^烷氧基。22.如权利要求20所述的寡聚化合物，其中至少一个Z为CH3OCH2-。23.如权利要求16-22任意一项所述的寡聚化合物，其中各Z为甲基或CH3OCH2-。24.如权利要求16-23任意一项所述的寡聚化合物，其中具有所述式的至少一个单体的Z基团为由下式表示的(R)-构型<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(IV)、或下式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(V或下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(vi)。25.如权利要求24所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各单体的各Z基团为(R)-构型。26.如权利要求16-23任意一项所述的寡聚化合物，其中所述至少一个单体的Z基团为由下式表示的(S)-构型脚27.如权利要求26所述的寡聚化合物，其中具有所述式的各单体的各Z基团为(S)-构型。28.如权利要求16-27任意一项所述的寡聚化合物，其中T3为H或羟基保护基团。29.如权利要求16-27任意一项所述的寡聚化合物，其中T3为与核苷、核苷酸或单体亚基的连接核苷间联接基团。30.如权利要求16-27任意一项所述的寡聚化合物，其中丁3为与寡核苷或寡核苷酸连接的核苷间联接基团。31.如权利要求16-27任意一项所述的寡聚化合物，其中丁3为与寡聚化合物连接的核苷间联接基团。32.如权利要求16-31任意一项所述的寡聚化合物，其中T4为H或羟基保护基团。33.如权利要求16-31任意一项所述的寡聚化合物，其中T4为与核苷、核苷酸或单体亚基连接的核香间联接基团。34.如权利要求16-31任意一项所述的寡聚化合物，其中T4为与寡核香或寡核苷酸连接的核苷间联接基团。35.如权利要求16-29任意一项所述的寡聚化合物，其中T4为与寡聚化合物连接的核苦间联接基团。36.如权利要求16-27任意一项所述的寡聚化合物，其中丁3和T4中至少一个包含选自磷酸二酯或疏代磷酸酯的核苷间联接基团。37.如权利要求16-36任意一项所述的寡聚化合物，其包含至少一个由至少两个相邻的具有所述式的单体组成的区。38.如权利要求37所述的寡聚化合物，其包含至少两个由至少两个相邻的具有所述式的单体组成的区。39.如权利要求38所述的寡聚化合物，其包含有间隙的寡聚化合物。40.如权利要求37或38所述的寡聚化合物，其进一步包含至少一个由约8至约14个相邻的(3-D-2'-脱氧核糖基核香组成的区。41.如权利要求40所述的寡聚化合物，其进一步包含至少一个由约9至约12个相邻的(3-D-2，-脱氧核糖基核苦組成的区。42.如权利要求37所述的寡聚化合物，其包含由2至3个具有所示式的相邻单体组成的一个区，任选的由1或2个具有所示式的相邻单体组成的第二区以及由8至14个P-D-2，-脱氧核糖基核苷组成的第三区，其中所述的第三区位于所述的第一和所述的第二区之间。43.如权利要求42所述的寡聚化合物，其包含8至10个(3-D-2'-脱氧核糖基核苷。44.如权利要求16-43任意一项所述的寡聚化合物，其包含长度为约8至约40个的核苷和/或修饰的核苷或模拟物。45.如权利要求16-43任意一项所述的寡聚化合物，其包含长度为约8至约20个的核香和/或修饰的核普或模拟物。46.如权利要求16-43任意一项所述的寡聚化合物，其包含长度为约10至约16个的核普和/或修的饰核脊或模拟物。47.如权利要求16-43任意一项所述的寡聚化合物，其包含长度为约10至约14个的核苷和/或修饰的核苷或模拟物。48.—种抑制基因表达的方法，其包括将一种或多种细胞、组织或动物与如权利要求16-45任意一项所述的寡聚化合物接触。49.用于药物治疗的如权利要求16-47任意一项所述的化合物。50.如权利要求16-47任意一项所述的化合物在制备用于抑制基因表达的药物中的应用。全文摘要本发明提供了6-修饰的双环核苷类似物以及包含这些核苷类似物的寡聚化合物。在优选的实施方案中该核苷类似物在6位具有(R)或(S)-手性。这种双环核苷类似物可用于提高寡聚化合物的性质包括核酸酶抗性。文档编号C07H19/04GK101410406SQ200780010566公开日2009年4月15日申请日期2007年1月27日优先权日2006年1月27日发明者埃里克·E·斯威兹,普内特·P·塞思申请人:Isis药物公司