蛋白质错折叠的治疗的制作方法

专利名称：：蛋白质错折叠的治疗的制作方法
技术领域：
：本发明总体而言涉及用于治疗蛋白质错折叠疾病(proteinmisfoldingdisease)的方法。特别地，本发明关注(concems)利用热休克蛋白90腺苷三磷酸酶激活剂(Aha)基因的调谐子(modulators)进行治疗的方法。例如，本发明提供通过施用减量调节Aha表达的双链RNA(dsRNA)来治疗与不希望出现的Aha活性有关的病症的组合物和方法。介绍内质网(ER)是特化的折叠环境，约三分之一真核基因组编码的蛋白质在其中易位和折叠为腔内分泌性蛋白(lumenalsecretedprotein)或跨膜蛋白。产生转运小泡运送货物(cargo)至高尔基体的多联体复合物II(COPII)系统(machinery)将蛋白质从ER中输出((Leeetal.,Annu.RevCellDev.Biol.20,87(2004))。ER相关的折叠(ERAF)途径也受到ER相关的降解(ERAD)途径的协调，由此将错折叠的蛋白质作为目标易位至胞质蛋白酶体系统(Wegeleetal.,RevPhysiolBiochemPharmacol151,1(2004);Youngetal.,TrendsBiochem.Sci,28,541(2003》。多种错折叠疾病的发生在于内质网腔内货物或跨膜货物的变体未正确折叠，进入COPII输出系统失败并在ER中降解，导致失去功能表型。嚢性纤维化(CF)是一种遗传性儿童疾病，主要由CF跨膜传导调控蛋白(CFTR,—种在铺陈于许多组织的极化上皮的顶膜中存在的多结构域cAMP调控的氯离子通道)的不完全折叠和从ER中输出而诱发(Riordan,Annu.Rev.Physiol.67,701(2005))。CFTR由2个跨膜结构域组成(TMD1和2),通过胞质定向的N禾口C端结构i或(cytosolorientedN-andC-termialdomains)和调4空离子通道电导率(channelconductance)的NBD1、R和NBD2结构域将它们在生物合成水平分开。CFTR的转运涉及指导折叠和从ER中输出的分子伴侣(Amaral,J.Mol.Neurosci.23,41(2004);Wangetal.,J.Struct.Biol.146,44(2004》，以及衔接蛋白质，其指导从跨高尔基体(transGolgi)的运输(Chengetal.,J.Biol.Chem,280,3731(2005))和通过胞吞途径的回收以维持细胞表面适当水平的氯离子通道活性(Gentzschetal.，Mol.Biol.Cell15,2684(2004);Swiatecka-Urbanetal"J.Biol.Chem.280,36762(2005))。超过90%的CF患者在CFTR的胞质NBD1ATP结合结构域中携带至少一个Phe508缺失的等位基因(AF508),导致严重的疾病形式。AF508破坏CFTR在ER中的折叠(Quetal.,J.Bioenerg.Biomembr.29,483(1997);Riordan,同上)。报道显示，AF508NBD1的折叠在动力学上受损(Quetal.,supra;Quetal"J.Biol.Chem.272,15739(1997);Qu和Thomas,J.Biol.Chem.271,7261(1996))。作为这种折叠过程中能量缺陷的后果，AF508在ER中未能获得野生型折叠，未能进入COPIIER输出系统(Wang等，同上)并作为ER相关的降解(ERAD)的标靶(Nishikawaetal"JBiochem(Tokyo)137，551(2005))。因此，在治疗CF时提供某些方法以预防AF508CFTR错折叠的后果将是理想的。热休克蛋白90腺苷三磷酸酶1激活剂(Ahal)是Hsp90的腺苷三磷酸酶活性的激活剂并能激发酵母Hsp90固有活性(inherentactivity)U倍和人Hsp90固有活性50倍(Panaretou，B.,etal.,Mol.Cell2002,10:1307—1318)。生化研究显示，Ahal结合Hsp90的中间区域(Panaretouetal.,2002,同上，Lotz,G.P.,etal.,J.Biol.Chem.2003,278:17228-17235),而最近对Ahal-Hsp90核心复合物的结构研究暗示辅分子伴侣(co-chaperone)促进Hsp90中间片段催化环(370-390)的构象转换，这种转换释放催化性的Arg380并辅助其在N-末端核香酸结合结构域与ATP的相互作用(Meyer,P.,etal.,EMBOJ.2004,23:511-519)。分子伴侣热休克蛋白90(Hsp90)负责特定主顾蛋白(clientprotein)的体内激活或成熟(Picard，D,,CellMol.LifeSci.2002，59:1640—1648;Pearl,L.H.和Prodromou,C.,Adv.ProteinChem.2002，59:157-185;Pratt,W.B.和Toft,D.O.，Exp.Biol.Med.2003，228:111—133;Prodromou,C和Pearl,L.H.,Curr.CancerDrugTargets2003,3:301-323)。对此激活至关重要的是Hsp90的基本腺苦三磷酸酶活性(Panaretou,B.,etal.，EMBOJ.1998,17:4829-4836),其驱动涉及Hsp90二聚体内N-末端核苷酸结合结构域瞬时结合的构象循环(Prodromou,C.,etal.,EMBOJ.2000,19:43834392)。作为分子伴侣，HSP卯促进大量构象不稳定的主顾蛋白成熟并维持其稳定性，其中多数涉及在肺瘤细胞内经常是紊乱的(deranged)生物过程，例如信号转导、细胞周期进行和细胞凋亡。因此，与其他分子定向治疗剂相反的是，HSP卯的抑制剂通过在癌细胞中同时破坏许多致癌物质来获得前景光明的(promising)抗癌活性(WhitesellL和DaiC.,FutureOncol.2005;1:529-540;WO03/067262)。另外，已经暗示HSP90与嚢性纤维化跨膜传导调控蛋白(CFTR)的降解有关。作为HSP90腺苷三磷酸酶活性的后果，CFTR基因中的突变导致该蛋白质不完全的折叠和泛素化作用。紧随泛素化作用的是CFTR在能够到达其活性位点之前降解。活性CFTR的缺失将导致嚢性纤维化在具此突变的人受试者中发展。因此，HSP90活性的抑制可能对于受癌症或嚢性纤维化困扰的受试者有益处。Hsp卯构成总细胞蛋白质的约1-2%(Pratt,W.B.，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.1997,37:297-326),而通过拮抗物或抑制剂的方法抑制如此大量蛋白质将潜在地需要将过量的抑制剂或拮抗物引入细胞。另一种方法是抑制以较小量存在的HSP90腺苷三磷酸酶活性的激活剂，例如Ahal。通过减量调节细胞中存在的Ahal量，HSP90的活性可以显著地减低。显著的序列同源性存在于人(Homosapiens)(NM—012111.1)、小家鼠(Musmusculus)(NM—146036.l)和黑猩猩(Pantroglodytes)(XM—510094.1)Aha1之间。明确的褐家鼠(rattusnorvegicus)Aha1同源物(homologue)还未鉴定，不过有一个褐家鼠(XM一223680.3)基因已基于其与酵母Ahsa2的序列同源性而被命名为热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂同源物(homolog)2(Ahsa2)。其序列与小家鼠RIKENcDNA1110064P04基因(NM—172391.3)同源，因而(intum)在序列上除N末端截短之外与小家鼠(Ausmusculus)Aha1相似。人Ahsa2(NM一152392.1)也已被预观'J，但是序列同源性有限。这后三个基因的功能还未充分地进行阐释。但是，在所有以上序列中存在一个区域是相同的，其可能用作RNAi试剂的标靶。抑制多于一个Aha基因的活性可能是有利的。最近已经显示，dsRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调控机理阻断基因表达。WO99/32619(Fire等)公开了使用长度为至少25个核苷酸的dsRNA抑制秀丽隐杆线虫(C.e/egara)的基因表达。已经显示，dsRNA也可降解其他生物体包括植物(参见如WO99/53050,Waterhouse等；和WO99/61631,Heifetz等)、果蝇属CDmsopfe7a)(参见如Yang,D.,等，C紅肠/.(2000)10:1191-1200)和哺乳动物(参见WO00/44895,Limmer;和DE10100586.5,Kreutzer等)的靶RNA。此天然机制已成为用于开发新类型药剂的焦点，所述新类型药剂用于治疗由异常或非期望的基因调控而引起的病症。尽管RNAi领域有显著的进展并在治疗由HSP90介导的病理过程中有进展，但是仍有对能够选择性和高效性地削弱HSP90腺苷三磷酸酶活性的试剂的需要，例如通过利用细胞自身的RNAi系统。此类试剂可同时具有高生物活性和体内稳定性，并可有效地抑制靶Aha基因(例如Ahal)的表达，用以治疗直接或间接地由Aha表达(例如Ahal的表达)介导的病理过程。此类试剂也可有效地抑制功能性Ahal蛋白质的活性，例如热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性。概述因此，本发明人们的成功在于发现降低功能性Ahal(—种热休克蛋白(Hsp)的辅分子伴侣和腺苷三磷酸酶激活剂)的水平能够导致CF相关的CFTR的AF508变体能量上的稳定化。这导致AF508折叠、运输和功能的重建。因此，本发明包含用于治疗由蛋白质错折叠所导致的疾病的组合物和方法。组合物通常可以包含用以抑制细胞中功能性Aha蛋白质表达的dsRNA、载体、短发夹RNA(shRNA)、小分子、抗体、反义核酸、适配体、核酶和它们的任意组合。例如，所述dsRNA可以包含有义链和反义链，其中所述反义链包含具有与Aha靶序列基本上互补的序列的互补性区域，其中所述靶序列的长度少于30个核苷酸，其中所述有义链与所述反义链基本上互补，而其中所述dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。在许多方面，Aha靶序列可以包含选自由SEQIDNO12-56组成的组中的序列。另一方面，dsRNA可以包含有义链和与有义链互补的反义链；所述有义链具有选自下组的序列SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143和SEQIDNO:145;所述反义链具有选自下组的序列SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144和SEQIDNO:146。在另一个实例中，用于在细胞中表达用以抑制功能性Ahal表达的shRNA的载体可以包含有义链、发夹接头和反义链。在多个方面，有义链可包含具有与Aha靶序列基本上互补的序列的互补性区域，其中所述靶序列的长度少于30个核苷酸，反义链与所述有义链可以基本上互补，并且dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时能够将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。在多个方面，Aha靶序列可以包含选自由SEQIDNO12-56组成的组中的序列。另一方面，载体可以包含具有选自SEQIDNO:147、SEQIDNO:149或SEQIDNO:151中序列的有义链；和具有选自SEQIDNO:148、SEQIDNO:150或SEQIDNO:152中序列的反义链。在另一个实例中，用于在细胞中抑制功能性Ahal蛋白质表达的shRNA可以包含具有与Aha靶序列基本上互补的序列的互补性区域，其中所述耙序列的长度少于30个核苷酸，其中所述shRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。在多个方面，Aha靶序列可以包含选自由SEQIDNO12-56组成的组中的序列。另一方面，shRNA可以包含选自由SEQIDNO:153、SEQIDNO:154和SEQIDNO:155组成的组中的序列。本发明也提供包含dsRNA、载体和/或shRNA的细胞或细胞群体。在另一个实例中，抗体可以特异性地结合功能性Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal结合位点和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶复合物。在另一个实例中，试剂可以包括小分子、抗体、反义核酸、适配体、dsRNA和核酶的任意组合。本发明也提供治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的方法。所述方法可以包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的降低功能性Ahal蛋白质胞内水平的至少一种试剂。在多个方面，试剂可以选自下组小分子、抗体、反义核酸、适配体、siRNA、核酶和它们的组合。在多个方面，所述疾病可以包括嚢性纤维化(CF)、马方综合症(Marfansyndrome)、法布莱病(Fabrydisease)、高歇病(Gaucher，sdisease),色素性视网膜炎3(retinitispigmentosa3)、阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease),II型糖尿病(TypeIIdiabetes)、帕金森病(Parkinson'sdisease)禾口克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)。另一方面，声斤述4普4斤叠的蛋白质可以是错误折叠的CFTR。另一方面，错误折叠的蛋白质可以是AF508蛋白质。所述方法也可以包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的功能性Ahal表达的至少一种dsRNA抑制剂，所述dsRNA包含有义链和反义链。在多个方面，反义链可以包含具有与Aha靶序列基本上互补的序列的互补性区域，其中所述靶序列的长度少于30个核苷酸，有义链与所述反义链基本上互补，并且所述dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。在多个方面，所述疾病可以包括嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述错折叠的蛋白质可以是错折叠的CFTR。另一方面，错折叠的蛋白质可以是AF508蛋白质。所述方法也可包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的功能性Ahal表达的至少一种dsRNA抑制剂。在多个方面，dsRNA抑制剂可以包含基于以下方面选择的序列a)所述dsRNA包含约19个核苷酸到约25个核苷酸的有义链序列和约19个核苷酸到约25个核苷酸的反义链序列；和b)所述有义链序列或反义链序列包含不多于15个与连续序列相同的连续核苷酸，所述连续序列包含在功能性Ahal之外的任何基因或mRNA的5'非翻译区域、3，非翻译区域、内含子或外显子中。在多个方面，所述疾病可以包括嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述错折叠的蛋白质可以是错折叠的CFTR。另一方面，错折叠的蛋白质可以是AF508蛋白质。本发明的方法也可以包括筛选用于治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的试剂。在多个方面，所述方法可以包括提供表达功能性Ahal的细胞或细胞群体；对细胞或细胞群体施用候选试剂；定量细胞或细胞群体中功能性Ahal的活性；和测定候选试剂是否降低细胞或细胞群体中的功能性Ahal活性，由此功能性Ahal活性的降低指示蛋白质错折叠的减少。在多个方面，候选试剂可以是抑制功能性Ahal表达的dsRNA。另一方面，dsRNA可以包含a)约19个核苦酸到约25个核苦酸的序列，和b)所述序列含有不多于15个与连续序列相同的连续核苷酸，所述连续序列包含在除Aha基因或mRNA之外的任何基因或mRNA的5'非翻译区域、3'非翻译区域、内含子或外显子中。在多个方面，Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。另一方面，所述疾病可以选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述错折叠的蛋白质可选自下组错折叠的CFTR、错折叠的肌原纤蛋白、错折叠的a-半乳糖苦酶、错折叠的(3-葡糖脑苷脂酶、错折叠的视紫红质、聚集的淀粉状蛋白(3和t、聚集的支链淀粉、聚集的a-突触核蛋白和聚集的朊病毒(prion)。另一方面，错折叠的蛋白质可以是错折叠的CFTR。另一方面，错折叠的蛋白质可以是AF508蛋白质。筛选方法也可以包括提供表达功能性Ahal的细胞或细胞群体；对细胞或细胞群体施用候选试剂；定量细胞或细胞群体中的Hsp90/ADP复合物、Hsp90/ATP复合物或其组合；和测定候选试剂是否降低细胞或细胞群体中Hsp90/ADP复合物、Hsp90/ATP复合物或其组合的量，由此Hsp90/ADP复合物或Hsp90/ATP复合物量的减少指示蛋白质错折叠的减少。在多个方面，候选试剂可以是抑制功能性Ahal表达的dsRNA。另一方面，dsRNA可以包含a)约19个核苷酸到约25个核苷酸的序列；和b)所述序列含有不多于15个与连续序列完全相同的连续核苷酸，所述连续序列包含在除Aha基因或mRNA之外的任何基因或mRNA的5，非翻译区域、3'非翻译区域、内含子或外显子中。另一方面，Aha基因或mRNA可以是人Aha基因或mRNA。在许多方面，所述疾病可以选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述错折叠的蛋白质可选自下组错折叠的CFTR、错折叠的肌原纤蛋白、错折叠的a-半乳糖苷酶、错折叠的(3-葡糖脑苷脂酶、错折叠的视紫红质、聚集的淀粉状蛋白P和t、聚集的支链淀粉、聚集的a-突触核蛋白和聚集的朊病毒。另一方面，错折叠的蛋白质可以是错折叠的CFTR。另一方面，错折叠的蛋白质可以是AF508蛋白质。本文教导的这些和其他特征、方面和优点将会由以下描述、实例和附加的权利要求作为参考更好地为人所理解。附图本领域技术人员将理解下述的附图仅作说明性目的。附图不意图在任何方面限制本发明的范围。图1:CFTR蛋白质相互作用组(interactome)的描述。图2:(A)ER折叠网络的描述，和(B)描述野生型(WT)和AF508型表达细胞中蛋白质表达水平的免疫印迹。图3:描述Hsp卯辅分子伴侣p23对AF508折叠和从ER中输出的影响的条线图系列。图4:描述Hsp90辅分子伴侣FKBP8对AF508折叠和从ER中输出的影响的条线图系列。图5:描述Hsp90辅分子伴倡HOP对AF508折叠和从ER中输出的影响的条线图系列。图6:说明AF508向细胞表面的输出可以通过减量调节功能性Ahal来重建的条线图系列。图7:显示dsRNAAhal对CFBE41o-细胞系碘外流(iodideefflux)影响的点线图和条线图。图8:Hsp90分子伴估/辅分子伴侣相互作用引导的CFTR折叠的系列描述。图9:dsRNAAha1对Hsp90的作用的说明(使用免疫印迹)。详述缩写和定义为了有助于对本发明的理解，以下定义了一些本文用到的术语和缩写，如下:"G"、"C"、"A"、"T，，和"U，，(无论写为大写或小写字母)各自通常代表依次含有鸟噤呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。但是应当理解，术语"核糖核苷酸"或"核苷酸"也可以指修饰的核苦酸(如下详述)或者替代物代替的部分(surrogatereplacementmoiety)。技术人员熟知鸟口票呤、胞嘧啶、腺噤呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以被其他部分替代而基本上不改变含有具此替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如，但不限于，含有肌苦作为碱基的核苦酸可以与含有腺噤呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，本发明的核苷酸序列中可将含有尿嗜啶、鸟。票呤或腺噤呤的核苷酸用含有例如肌苷的核苷酸代替。本文使用的术语"功能性Ahal蛋白质，，或"功能性Ahal"意在包括具有热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性的人Ahal多肽(SEQIDNO:4)和具有热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性的与Ahal相关的分子。此类与人Ahal相关的分子包括具有热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性和与功能性Ahal具有至少80。/。同源性的多肽。例如，相关分子可以与人Ahal具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性并可以具有热休克蛋白腺苦三磷酸酶激活剂活性。此类分子可以包括例如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。另外，此类与人Ahal相关的分子包括具有更长或更短氨基酸序列并且具有热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性的多肽。热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性可以用标准测定法进行测定，例如，通过测定由Hsp90产生的无机磷(Pi)。Pi的产生可以通过例如测量或测定报告分子的产生或消耗来测定。一个此类方法利用再生腺苷三磷酸酶测定法，该测定法使用了Pi的产生可以用分光光度法测定的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶偶联测定法(Ali等，Biochemistry(1993)32:2717-2724)。其他分光光度方法包括那些由以下所描述的Lanzetta等(1979)Anal.Biochem.100,95-97;Lill等,(1990)Cell60，271-280;和Cogan等，Anal.Biochem.(1999)271:29-35。本领域技术人员也会明白其他测定热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性的方法。本文使用的"Aha基因"是指能够表达功能性Ahal蛋白质的热休克蛋白卯腺苷三磷酸酶的激活剂基因。"Ahal，，表示热休克蛋白90腺苷三磷酸酶1的激活剂基因，其非穷举性的实例为Genbank登录号NM_012111.1(人)、NM—146036.1(小家鼠)和XM—510094.1(黑猩猩)。本文使用的"靶序列"是指在Aha基因转录过程中所形成的mRNA分子核苷酸序列的一个连续的部分，包括对初级转录产物进行RNA加工后作为产物的mRNA。本发明中任意给定的RNAi试剂的靶序列是指X个核苷酸的mRNA序列，其依靠RNAi试剂的反义链对此序列的互补性而作为该RNAi试剂的标草巴，并且当反义链与所述mRNA接触时可以与其杂交，其中X是反义链的核苷酸数目加上有义链单链突出端的核苷酸数目(如果有的话)。本文使用的术语"包含序列的链"是指寡核苷酸，其包含使用标准的核苷酸命名法表示的序列所描述的核苷酸链。除非另作说明，本文使用的术语"互补，'，如本领域技术人员公知的，当用来描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力。这些条件可以是例如严紧条件，而严格条件可包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、50°C或70。C下12-16小时后洗涤。其他条件也可应用，例如有机体内可遇到的生理上相关的条件。技术人员将能够依据杂交核苷酸最终的用途来决定最适合用于互补性测试的条件设定。这包括将含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在所述第一和第二核苷酸序列的完整长度上进行碱基配对。这类序列在本文可以称为相对于彼此"完全互补"。但是，当第一序列在本文被称为与第二序列"基本上互补"时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交时形成一个或多个，但通常不多于4个、3个或2个错配碱基对，同时在与它们的最终用途最相关的条件下保持杂交的能力。但是，当两个寡核苷酸按照设计在杂交时形成一个或多个单链突出端时，在测定互补性时不应当将这类突出端视为错配。例如，含有一个21个核苷酸长的寡核香酸和另一个23个核苷酸长的寡核苦酸的dsRNA,其中长一些的寡核苷酸含有与短一些的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，就本发明而言这也可以称为"完全互补"。本文使用的"互补，，序列也可以包括，或完全由非Watson-Crick碱基对和/或从非天然的和修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要针对它们杂交能力的上述要求可以满足。术语"互补"、"完全互补"和"基本上互补，，此处可按照使用它们的上下文理解为关于dsRNA有义链和反义链之间或者dsRNA反义链和靶序列之间的碱基配对。本文使用的与信使RNA(mRNA)的"至少一部分基本上互补"的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如编码Ahal的)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码Ahal的mRNA的非间断的部分基本上互补，多核苷酸即与AhalmRNA的至少一部分互补。本文使用的术语"双链RNA"或"dsRNA"是指核糖核酸分子复合物，其具有包含两条反平行并且基本上互补(如上定义)的核酸链的双链结构。形成双链结构的两条链可以是一个较大的RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。当两条链是一个较大的分子的一部分，因而是通过一条链的3，端和相应形成双链结构的另一条链的5，端经由非间断核苷酸链连接时，连接性的RNA链被称为"发夹环，，，并且整个结构被称为"短发夹RNA"或"shRNA"。当两条链不是通过一条链的3，端和相应形成双链结构的另一条链的5'端之间的非间断核苷酸链的方法共价连接时，连接性的结构被称为"接头"。在多个方面，接头可以包括序列AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA中最短链的核苷酸数目减去双链中存在的任何突出端。除双链结构外，dsRNA还可以包含一个或多个核苷酸突出二山*。本文使用的"核普酸突出端，，是指当dsRNA—条链的3'端延伸至另一条链的5，端之后时，或相反的情况下，从dsRNA的双链结构伸出的未配对的一个核香酸或多个核苷酸。"平"或"平端"是指在dsRNA的那端没有未配对的核香酸，即没有核苷酸突出端。"平端的"dsRNA是分子的任一端都没有核苷酸突出端的dsRNA。术语"反义链，，是指dsRNA中包含与靶序列基本上互补的区域的链。本文使用的术语"互补性区域，，是指反义链上与序列，例如靶序列，如本文定义的基本上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，最容许的(mosttolerated)是错配在末端区域，并且如果有，错配一般处在末端区域，或者例如在5，和/或3，末端的6个、5个、4个、3个或2个核苷酸之内的区域中。在本发明的某些方面，所述错配可以处在反义链5，末端和/或有义链3，末端的6个、5个、4个、3个或2个核苷酸之内。本文使用的术语"有义链，，是指dsRNA中包含与反义链的区域基本上互补的区域的链。如本领域技术人员理解的那样，当"引入细胞，，指dsRNA时，意为有助于摄取(uptake)或吸收(absorption)至细胞中。dsRNA的吸收或摄取可以通过独立的(unaided)扩散性的或主动的细胞过程或者通过辅助性试剂或设备进行。此术语的意义不限于体外的细胞；也可以将dsRNA"引入细胞，，，其中所述细胞是活的有机体的一部分。这种情况下，向细胞中引入将包括向有机体的递送。例如，对于体内递送，可以将dsRNA注入组织位点或系统性地施用。在体外向细胞中引入包括本领域公知的方法，例如电穿孔和脂转染。本文使用的术语"降低水平、已降低的水平或正在降低的水平(decrease，decreasedordecreasinglevels)"旨在包括在细胞中抑制Ahal热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性和降低功能性Ahal蛋白质的量。例如，抗体或dsRNA能够通过干扰或沉默热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂活性而不将Ahal蛋白质从细胞中去除来降低功能性Ahal蛋白质的水平。另一个实例中，核酶能够切割功能性Ahal蛋白质以减少细胞中全Ahal蛋白质的量。另一个实例中，dsRNA能够使Aha基因(如Ahal基因)的表达沉默以降低从Aha基因转录的mRNA的量。术语"沉默，，和"抑制表达，，当它们指Aha基因(如Ahal基因)时，此处代表对Aha基因(如Ahal基因)表达的至少部分抑制，表现为从可以分离自第一细胞或细胞组的Aha基因转录的mRNA量在与第二细胞或细胞组相比时减少，在所述第一细胞或细胞组中Aha基因被转录并受到处理因而使Aha基因的表达受到抑制，所述第二细胞或细胞组与第一细胞或细胞组基本上相同但没有受到所述处理(对照细胞)。在本发明的多个方面，所述细胞可以是HeLa或MLE12细胞。抑制的程度通常表述为(对照细胞中的mRNA)-(经处理细胞中的mRNA)工(对照细胞中的mRNA)0或者，抑制的程度也可以根据与Aha基因转录功能性相关的参数的降低来表示，如细胞分泌的或是这些细胞裂解后的溶液中存在的Aha基因所编码蛋白质的量，或显示特定表型(如细胞凋亡或细胞表面CFTR)的细胞的数目。Aha基因沉默原则上可以在表达靶物的任何细胞中测定，不论是组成性的还是通过基因组工程构建的细胞，并且可以通过任何合适的测定法来测定。但是，为了确认给定的dsRNA是否在一定程度上抑制Aha基因的表达而需要参考并且因而将其涵盖在本发明范围中时，下面提供的实施例中的测定法将会作为此种参考。例如在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸将Aha基因(如Ahal基因)的表达抑制至少约20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%。在多个方面，通过施用本发明的双链寡核苷酸将Aha基因(如Ahal基因)的表达抑制至少约51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在多个方面，通过施用本发明的双链寡核苷酸将Aha基因(如Ahal基因)的表达抑制至少约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在本文Aha表达(如Ahal表达)的上下文中使用的术语"治疗(treat)"、"治疗(treatment)"等是指减轻(relieffrom)或緩和(alleviation)Aha表达介导的病理过程。在本发明的上下文中，在其涉及下文所述的任何其它状况(除了Aha表达介导的病理过程之外的状况)时，术语"治疗(treat)"、"治疗(treatment)"意为减轻或緩和至少一种与此状况相关的症状，或者减緩或反转该状况的发展。本文使用的短语"治疗有效量，，和"预防有效量"是指在治疗、预防或控制由Aha表达介导的病理过程或由Aha表达介导的病理过程的明显症状时提供治疗益处的量。治疗有效的特定量可以由普通开业医生方便地决定，并且可能根据本领域公知的因素改变，例如如Aha表达所介导的病理过程的类型、患者的病史和年龄、Aha表达所介导的病理过程的时期(stage)和其他对抗Aha表达所介导的病理过程的试剂的施用。本文使用的"药物组合物"包含药理学有效量的dsRNA和可药用的载体。本文使用的"药理学有效量"、"治疗有效量，，或筒单的"有效量，，是指足够产生预定的药理学的、治疗的或预防性结果的RNA量。例如，如果当伴随疾病或病症的某种可测定参数有至少25%降低时即认为给定的临床治疗是有效的，那么治疗这种疾病或病症的药物的治疗有效量就是为了实现那种参数的25%的降低而必需的剂量。术语"可药用的载体，，是指用于施用治疗剂的载体。这些载体包括但不限于盐水、緩冲盐水、葡萄糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它们的组合。此术语特别排除细胞培养基。用于口服施用药物的可药用载体包括但不限于可药用的赋形剂，例如惰性稀释剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括钠和钙的碳酸盐、钠和钙的磷酸盐以及乳糖，而玉米淀粉和褐藻酸(alginicacid)是合适的崩解剂。黏合剂可以包括淀粉和明胶；而润滑剂(如果有的话)将通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，可以用如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯包覆药片以延缓在胃肠道内的吸收。本文使用的"转化的细胞，，是引入了可以表达dsRNA分子的载体的细胞。蛋白质错折叠的治疗本发明提供通过降低功能性Ahal蛋白质(如SEQIDNO:4)和/或具有类似功能的其他相关分子的水平来治疗错折叠疾病的方法，以及筛选用以治疗蛋白质错折叠疾病的有用试剂的方法。本文描述的技术部分基于如下观察，即降低水平的功能性Ahal,—种Hsp卯腺苷三磷酸酶激活剂，能够明显地将AF508(SEQIDNO:3的AF508多肽)，一种特征在于508的苯丙氨酸缺失的CRTR(SEQIDNO:1的CFTRmRNA;SEQIDNO:2的CFTR多肽)突变体，稳定在COPII输出系统可处理(accessible)以使其运输至细胞表面的折叠状态。本文描述的多种治疗策略的目标是在受试者体内减量调节功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子、补救CFTR突变抹的错折叠、重建Hsp90介导的向细胞表面的运输和至少部分恢复通道功能。降低功能性Ahal的试剂降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的水平的试剂能够靶向功能性Ahal和/或Hsp90腺苷三磷酸酶，因此通过该试剂对一种组分或两种组分的结合会导致热休克蛋白腺苷三磷酸酶激活剂的活性、Hsp90腺苷三磷酸酶的激活状态和/或已激活的Hsp90腺苷三磷酸酶活性水平的降低，继而导致错折叠蛋白质的稳定。已经报道了Hsp90和Ahal之间的复合物的晶体结构(Meyer等(2004)EMBOJ.23,511-519)。鉴于对Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶和两者之间形成的结合复合物的结构的和动力学的理解，设计能够结合(例如离子地或共价地)一种或两种组分并且因而降低功能性Ahal对Hsp90腺苷三磷酸酶的激活的试剂属于本领域技术范围之内。此处作为降低功能性Ahal水平和/或具有类似功能的相关分子水平的试剂使用的多种类型的试剂通常包括但不限于RNA干扰分子、抗体、小的无机分子、反义寡核苷酸和适配体。RNA干扰(RNAi)可用以降低功能性Ahal(和/或具有类似功能的其他相关分子)的水平(参见如实施例8-10)。RNAi方法可以使用双链RNA，例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA。下述讨论将基本上聚焦于dsRNA，但本领域技术人员会认识到对其他RNAi分子，如miRNA,可以适用的多种方法。特别针对功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的RNAi分子也可从多种来源以商业途径获得(如SilencerInVivoReadydsRNAs、AhaldsRNAID#s1136422、136423、36424、19683、19588、19773,Ambion,TX;SigmaAldrich,MO;Invi加gen,CA)。几个使用多种运算法则的dsRNA分子设计程序是本领域公知的(参见如Cenix算法，Ambion;BLOCK-iTTMRNAiDesigner(BLOCK-iTRNAi设计器)，Invitrogen;dsRNAWhiteheadInstituteDesignTools(dsRNA怀特赫德研究所^殳计工具)，Bioinofrmatics&ResearchComputing)。定义最佳dsRNA序列时具有重要影响的特性(trait)包括dsRNA末端的G/C含量、dsRNA特定内部结构域的Tm、dsRNA长度、CDS(编码区)内靶序列的位置和3'突出端的核苷酸组成。特异性地针对功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的dsRNA的施用能够影响RNAi介导的靶(如Ahal)mRNA的降解。例如，可以向需要施用的患者施用治疗有效量的特异性地针对Ahal的dsRNA来治疗蛋白质错折叠的疾病。在一个方面，导致功能性Ahal水平降低的dsRNA具有包括SEQIDNOs:57-146(参见下面的表2)的核苷酸序列。一般来说，dsRNA分子的有效量可以包含在错折叠的位点处或该位点附近的细胞间浓度为约1纳摩尔(nM)到约100nM,在多个方面是约2nM到约50nM,而另一些方面是约2.5nM到约10nM。可以预期，可以施用更多或更少量的dsRNA。dsRNA可以通过任何适合于递送RNAi分子到感兴趣的细胞的方法来向受试者施用。例如，可以用基因枪、电穿孔或通过其他合适的肠胃外的或肠道的施用途径如玻璃体内注射来施用dsRNA分子。RNAi分子可以局部地(肺组织)或经由肺部递送系统地(循环系统)施用。在向受试者递送功能性Ahal特异性的RNAi分子时，可以有多种肺部递送装置是有效的(见下文)。RNAi分子可以与多种递送和靶向系统如以下进一步详述的那样联合使用。例如可以将dsRNA包入为促进有效负载内化(payloadinternalization)而设计的靶向多聚体运送系统(targetedpolymericdeliverysystem)中。dsRNA可以靶向到功能性Ahal(或具有类似功能的其他相关分子)mRNA靶序列，如SEQIDNOs:12-56(参见下面表l)中少于30个连续核苷酸，通常为大约19-25个连续核苷酸的任何序列段(stretch)上。可以进行对人基因组数据库的搜索(BLAST)以确保选定的dsRNA序列不会靶向到其他基因转录物。为dsRNA选定靶序列的技术是本领域公知的(参见如Reynolds等(2004)NatureBiotechnology22(3),326—330)。因此，此dsRNA的有义链可以包含与功能性Ahal(或具有类似功能的相关分子)的靶mRNA中约l9到约25个核苷酸的任何连续序列段相同的核苷酸序列。通常情况下，耙mRNA上的耙序列可以从给定的耙mRNA对应的cDNA序列中选择，例如从起始密码子下游(即3，方向)50到100nt开始。但是，靶序列可以位于5，或3'非翻译区域或者靠近起始密码子的区域。本发明的dsRNA可以包含具有少于30个核苷酸长(通常为19-25个核苷酸长)的区域的RNA链，并与Aha基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。这些dsRNA的使用使得靶向降解下述基因的mRNA成为可能，所述基因涉及哺乳动物体内癌细胞的复制和/或维持，和/或涉及错折叠的嚢性纤维化跨膜调控蛋白(CFTR)的降解。使用基于细胞的测定法和动物测定法，非常低剂量的此类dsRNA能够特异地和有效地介导RNAi,导致对Aha基因的表达的显著抑制。因此，包含此类dsRNA的本发明的方法和组合物通过靶向蛋白质降解中涉及的基因，可用于治疗由Aha表达介导的病理学过程，如蛋白质错折叠，包括癌症和/或嚢性纤维化。下面的详述公开了如何制备和使用抑制Aha基因表达的dsRNA和包含dsRNA的组合物，还有用于治疗由Aha基因表达引起的疾病和病症如癌症和/或嚢性纤维化的组合物和方法。本发明的药物组合物包含具有反义链的dsRNA和可药用载体，所述反义链包含长度少于30个核苷酸的，通常长度为19-25个核苷酸的互补性区域，并且所述互补性区域与Aha基因的RNA转录物的至少一部分基本上互补。因此，本发明的某些方面提供包含本发明的dsRNA和可药用载体的药物组合物、使用所述组合物抑制Aha基因表达的方法和使用所述药物组合物治疗由Aha基因表达所引起疾病的方法。本发明的一个方面提供抑制细胞或哺乳动物中Aha基因(如Ahal基因)表达的dsRNA分子，其中所述dsRNA包含反义链，所述反义链包含与Aha基因(如Ahal基因)表达所形成的mRNA的至少一部分互补的互补性区域，并且其中所述互补区域的长度少于30个核苷酸，通常长度为19-25个核苷酸。所述dsRNA可以与表2所示的dsRNA之一相同，或者它可以实现对表2所示dsRNA之一的靶序列内编码Aha基因的mRNA的切割。表l.人AhalmRNA靶序列(序列位置基于GenBank登录号NM—012111.1(SEQIDNO:11;Ensembl基因报告号ENSG00000100591)编码序列)1.基于Aha基因序列AAATTGGTCCACGGATAAGCT的mRNA草巴序列AAAUUGGUCCACGGAUAAGCU(SEQIDNO:12)基因序列中的位置992.基于Aha基因序列AAGCTGAAAACACTGTTCCTG的mRNA耙序列AAGCUGAAAACACUGUUCCUG(SEQIDNO:13)基因序列中的位置1153.基于Aha基因序列AAAACACTGTTCCTGGCAGTG的mRNA耙序列AAAACACUGUUCCUGGCAGUG(SEQIDNO:14)基因序列中的位置1214.基于Aha基因序歹'JAAAATGAAGAAGGCAAGTGTG的mRNA草巴序列AAAAUGAAGAAGGCAAGUGUG(SEQIDNO:15)基因序列中的位置1495.基于Aha基因序列AATGAAGAAGGCAAGTGTGAG的mRNA靶序列AAUGAAGAAGGCAAGUGUGAG(SEQIDNO:16)基因序列中的位置1516.基于Aha基因序列AAGAAGGCAAGTGTGAGGTGA的mRNA靶序列:AAGAAGGCAAGUGUGAGGUGA(SEQIDNO:17)基因序列中的位置1557.基于Aha基因序列AAGTGAGTAAGCTTGATGGAG的mRNA靶序列AAGUGAGUAAGCUUGAUGGAG(SEQIDNO:18)基因序列中的位置1798.基于Aha基因序列AACAATCGCAAAGGGAAACTT的mRNA萃巴序歹'J:AACAAUCGCAAAGGGAAACUU(SEQIDNO:19)基因序列中的位置2119.基于Aha基因序列AATCGCAAAGGGAAACTTATC的mRNA革巴序列AAUCGCAAAGGGAAACUUAUC(SEQIDNO:20)基因序列中的位置21410.基于Aha基因序列AAAGGGAAACTTATCTTCTTT的mRNA耙序列AAAGGGAAACUUAUCUUCUUU(SEQIDNO:21)基因序列中的位置22011.基于Aha基因序列AAACTTATCTTCTTTTATGAA的mRNA耙序列AAACUUAUCUUCUUUUAUGAA(SEQIDNO:22)基因序列中的位置22612.基于Aha基因序列AATGGAGCGTCAAACTAAACT的mRNA草巴序列:AAUGGAGCGUCAAACUAAACU(SEQIDNO:23)基因序列中的位置24513.基于Aha基因序列AAACTAAACTGGACAGGTACT的mRNA草巴序列:AAACUAAACUGGACAGGUACU(SEQIDNO:24)基因序列中的位置25614.基于Aha基因序列AAACTGGACAGGTACTTCTAA的mRNA耙序列AAACUGGACAGGUACUUCUAA(SEQIDNO:25)基因序列中的位置26115.基于Aha基因序列AAGTCAGGAGTACAATACAAA的mRNA耙序列:AAGUCAGGAGUACAAUACAAA(SEQIDNO:26)基因序列中的位置28016.基于Aha基因序列AATACAAAGGACATGTGGAGA的mRNA靶序列:AAUACAAAGGACAUGUGGAGA(SEQIDNO:27)基因序列中的位置29317.基于Aha基因序列AATTTGTCTGATGAAAACAGC的mRNA靶序列AAUUUGUCUGAUGAAAACAGC(SEQIDNO:28)基因序列中的位置31918.基于Aha基因序列AAAACAGCGTGGATGAAGTGG的mRNA耙序列AAAACAGCGUGGAUGAAGUGG(SEQIDNO:29)基因序列中的位置33219.基于Aha基因序列AAGTGGAGATTAGTGTGAGCC的mRNA革巴序列AAGUGGAGAUUAGUGUGAGCC(SEQIDNO:30)基因序列中的位置34720.基于Aha基因序列AAAGATGAGCCTGACACAAAT的mRNA乾序列AAAGAUGAGCCUGACACAAAU(SEQIDNO:31)基因序列中的位置37321.基于Aha基因序列AAATCTCGTGGCCTTAATGAA的mRNA草巴序列AAAUCUCGUGGCCUUAAUGAA(SEQIDNO:32)基因序列中的位置39022.基于Aha基因序列AATGAAGGAAGAAGGGGTGAA的mRNA耙序列:AAUGAAGGAAGAAGGGGUGAA(SEQIDNO:33)基因序列中的位置40523.基于Aha基因序列AAGGAAGAAGGGGTGAAACTT的mRNA靶序列AAGGAAGAAGGGGUGAAACUU(SEQIDNO:34)基因序列中的位置40924.基于Aha基因序列AAGAAGGGGTGAAACTTCTAA的mRNA靶序列AAGAAGGGGUGAAACUUCUAA(SEQIDNO:35)基因序列中的位置41325.基于Aha基因序列AAGGGGTGAAACTTCTAAGAG的mRNA草巴序列:AAGGGGUGAAACUUCUAAGAG(SEQIDNO:36)基因序列中的位置41626.基于Aha基因序列AAACTTCTAAGAGAAGCAATG的mRNA耙序列AAACUUCUAAGAGAAGCAAUG(SEQIDNO:37)基因序列中的位置42427.基于Aha基因序列AAGAGAAGCAATGGGAATTTA的mRNA耙序列AAGAGAAGCAAUGGGAAUUUA(SEQIDNO:38)基因序列中的位置43228.基于Aha基因序列AAGCAATGGGAATTTACATCA的mRNA耙序列AAGCAAUGGGAAUUUACAUCA(SEQIDNO:39)基因序列中的位置43729.基于Aha基因序列AATGGGAATTTACATCAGCAC的mRNA靶序列AAUGGGAAUUUACAUCAGCAC(SEQIDNO:40)基因序列中的位置44130.基于Aha基因序列AATTTACATCAGCACCCTCAA的mRNA靶序列AAUUUACAUCAGCACCCUCAA(SEQIDNO:41)基因序列中的位置44731.基于Aha基因序列AATGAATGGAGAGTCAGTAGA的mRNA靶序列AAUGAAUGGAGAGUCAGUAGA(SEQIDNO:42)基因序列中的位置50132.基于Aha基因序列AATGGAGAGTCAGTAGACCCA的mRNA草巴序列AAUGGAGAGUCAGUAGACCCA(SEQIDNO:43)基因序列中的位置50533.基于Aha基因序列AAGCCTGCTCCTTCAAAAACC的mRNA革巴序列AAGCCUGCUCCUUCAAAAACC(SEQIDNO:44)基因序列中的位置56534.基于Aha基因序列AAAATCCCCACTTGTAAGATC的mRNA耙序列AAAAUCCCCACUUGUAAGAUC(SEQIDNO:45)基因序列中的位置60735.基于Aha基因序列AATCCCCACTTGTAAGATCAC的mRNA耙序列AAUCCCCACUUGUAAGAUCAC(SEQIDNO:46)基因序列中的位置60936.基于Aha基因序列AAGATCACTCTTAAGGAAACC的mRNA孝巴序列AAGAUCACUCUUAAGGAAACC(SEQIDNO:47)基因序列中的位置62237.基于Aha基因序列AAGGAAACCTTCCTGACGTCA的mRNA革巴序列AAGGAAACCUUCCUGACGUCA(SEQIDNO:48)基因序列中的位置63438.基于Aha基因序列AACATTAGAAGCAGACAGAGG的mRNA耙序列AACAUUAGAAGCAGACAGAGG(SEQIDNO:49)基因序列中的位置72039.基于Aha基因序列AAGCAGACAGAGGTGGAAAGT的mRNA耙序列:AAGCAGACAGAGGUGGAAAGU(SEQIDNO:50)基因序列中的位置72840.基于Aha基因序列AAAGTTCCACATGGTAGATGG的mRNA耙序列:AAAGUUCCACAUGGUAGAUGG(SEQIDNO:51)基因序列中的位置74441.基于Aha基因序列AACGTCTCTGGGGAATTTACT的mRNA革巴序列AACGUCUCUGGGGAAUUUACU(SEQIDNO:52)基因序列中的位置76642.基于Aha基因序列AATTTACTGATCTGGTCCCTG的mRNA耙序列AAUUUACUGAUCUGGUCCCUG(SEQIDNO:53)基因序列中的位置77943.基于Aha基因序列AAACATATTGTGATGAAGTGG的mRNA草巴序列AAACAUAUUGUGAUGAAGUGG(SEQIDNO:54)基因序列中的位置80244.基于Aha基因序列AAGTGGAGGTTTAAATCTTGG的mRNA耙序列AAGUGGAGGUUUAAAUCUUGG(SEQIDNO:55)基因序列中的位置81745.基于Aha基因序列AAACAGACCTTTGGCTATGGC的mRNA輩巴序歹寸AAACAGACCUUUGGCUAUGGC(SEQIDNO:56)基因序列中的位置982表2.用于减量调节人功能性Aha蛋白质表达的dsRNA试剂1.基于Aha基因靶序列1的dsRNA有义链dsRNA:AUUGGUCCACGGAUAAGCU(SEQIDNO:57)反义链dsRNA:AGCUUAUCCGUGGACCAAU(SEQIDNO:58)2.基于Aha基因靶序列2的dsRNA有义链dsRNA:GCUGAAAACACUGUUCCUG(SEQIDNO:59)反义链dsRNA:CAGGAACAGUGUUUUCAGC(SEQIDNO:60)3.基于Aha基因靶序列3的dsRNA有义链dsRNA:AACACUGUUCCUGGCAGUG(SEQIDNO:61)反义链dsRNA:CACUGCCAGGAACAGUGUU(SEQIDNO:62)4.基于Aha基因革巴序列4的dsRNA有义链dsRNA:AAUGAAGAAGGCAAGUGUG(SEQIDNO:63)反义链dsRNA:CACACUUGCCUUCUUCAUU(SEQIDNO:64)5.基于Aha基因靶序列5的dsRNA有义链dsRNA:UGAAGAAGGCAAGUGUGAG(SEQIDNO:65)反义链dsRNA:CUCACACUUGCCUUCUUCA(SEQIDNO:66)6.基于Aha基因靶序列6的dsRNA有义链dsRNA:GAAGGCAAGUGUGAGGUGA(SEQIDNO:67)反义链dsRNA:UCACCUCACACUUGCCUUC(SEQIDNO:68)7.基于Aha基因耙序列7的dsRNA有义链ds脂A:GUGAGUAAGCUUGAUGGAG(SEQIDNO:69)反义链dsRNA:CUCCAUCAAGCUUACUCAC(SEQIDNO:70)8.基于Aha基因草巴序列8的dsRNA有义链dsRNA:CAAUCGCAAAGGGAAACUU(SEQIDNO:71)反义链dsRNA:AAGUUUCCCUUUGCGAUUG(SEQIDNO:72)9.基于Aha基因靶序列9的dsRNA有义链dsRNA:UCGCAAAGGGAAACUUAUC(SEQIDNO:73)反义链dsRNA:GAUAAGUUUCCCUUUGCGA(SEQIDNO:74)10.基于Aha基因靶序列10的dsRNA有义链dsRNA:AGGGAAACUUAUCUUCUUU(SEQIDNO:75)反义链dsRNA:AAAGAAGAUAAGUUUCCCU(SEQIDNO:76)11.基于Aha基因靶序列11的dsRNA有义链dsRNA:ACUUAUCUUCUUUUAUGAA(SEQIDNO:77)反义链dsRNA:UUCAUAAAAGAAGAUAAGU(SEQIDNO:78)12.基于Aha基因靶序列12的dsRNA有义链dsRNA:UGGAGCGUCAAACUAAACU(SEQIDNO:79)反义链dsRNA:AGUUUAGUUUGACGCUCCA(SEQIDNO:80)13.基于Aha基因靶序列13的dsRNA有义链dsRNA:ACUAAACUGGACAGGUACU(SEQIDNO:81)反义链dsRNA:AGUACCUGUCCAGUUUAGU(SEQIDNO:82)14.基于Aha基因靶序列14的dsRNA有义链dsRNA:ACUGGACAGGUACUUCUAA(SEQIDNO:83)反义链ds固A:UUAGAAGUACCUGUCCAGU(SEQIDNO:84)15.基于Aha基因靶序列15的dsRNA有义链dsRNA:GUCAGGAGUACAAUACAAA(SEQIDNO:85)反义链dsRNA:UUUGUAUUGUACUCCUGAC(SEQIDNO:86)16.基于Aha基因靶序列16的dsRNA有义链dsRNA:UACAAAGGACAUGUGGAGA(SEQIDNO:87)反义链dsRNA:UCUCCACAUGUCCUUUGUA(SEQIDNO:88)17.基于Aha基因靶序列17的dsRNA有义链dsRNA:UUUGUCUGAUGAAAACAGC(SEQIDNO:89)反义链dsRNA:GCUGUUUUCAUCAGACAAA(SEQIDNO:90)18.基于Aha基因靶序列18的dsRNA有义链dsRNA:AACAGCGUGGAUGAAGUGG(SEQIDNO:91)反义链dsRNA:CCACUUCAUCCACGCUGUU(SEQIDNO:92)19.基于Aha基因靶序列19的dsRNA有义链dsRNA:GUGGAGAUUAGUGUGAGCC(SEQIDNO:93)反义链dsRNA:GGCUCACACUAAUCUCCAC(SEQIDNO:94)20.基于Aha基因靶序列20的dsRNA有义链dsRNA:AGAUGAGCCUGACACAAAU(SEQIDNO:95)反义链dsRNA:AUUUGUGUCAGGCUCAUCU(SEQIDNO:96)21.基于Aha基因靶序列21的dsRNA有义链dsRNA:AUCUCGUGGCCUUAAUGAA(SEQIDNO:97)反义链dsRNA:UUCAUUAAGGCCACGAGAU(SEQIDNO:98)22.基于Aha基因靶序列22的dsRNA有义链dsRNA:UGAAGGAAGAAGGGGUGAA(SEQIDNO:99)反义链dsRNA:UUCACCCCUUCUUCCUUCA(SEQIDNO:100)23.基于Aha基因靶序列23的dsRNA有义链dsRNA:GGAAGAAGGGGUGAAACUU(SEQIDNO:101)反义链dsRNA:AAGUUUCACCCCUUCUUCC(SEQIDNO:102)24.基于Aha基因靶序列24的dsRNA有义链dsRNA:GAAGGGGUGAAACUUCUAA(SEQIDNO:103)反义链dsRNA:UUAGAAGUUUCACCCCUUC(SEQIDNO:104)25.基于Aha基因靶序列25的dsRNA有义链dsRNA:GGGGUGAAACUUCUAAGAG(SEQIDNO:105)反义链dsRNA:CUCUUAGAAGUUUCACCCC(SEQIDNO:106)26.基于Aha基因靶序列26的dsRNA有义链dsRNA:ACUUCUAAGAGAAGCAAUG(SEQIDNO:107)反义链ds固A:CAUUGCUUCUCUUAGAAGU(SEQIDNO:108)27.基于Aha基因靶序列27的dsRNA有义链dsRNA:GAGAAGCAAUGGGAAUUUA(SEQIDNO:109)反义链dsRNA:UAAAUUCCCAUUGCUUCUC(SEQIDNO:110)28.基于Aha基因把序列28的dsRNA有义链dsRNA:GCAAUGGGAAUUUACAUCA(SEQIDNO:111)反义链dsRNA:UGAUGUAAAUUCCCAUUGC(SEQIDNO:112)29.基于Aha基因耙序列29的dsRNA有义链dsRNA:UGGGAAUUUACAUCAGCAC(SEQIDNO:113)反义链dsRNA:GUGCUGAUGUAAAUUCCCA(SEQIDNO:114)30.基于Aha基因靶序列30的dsRNA有义链dsRNA:UUUACAUCAGCACCCUCAA(SEQIDNO:115)反义链dsRNA:UUGAGGGUGCUGAUGUAAA(SEQIDNO:116)31.基于Aha基因靶序列31的dsRNA有义链dsRNA:UGAAUGGAGAGUCAGUAGA(SEQIDNO:117)反义链dsRNA:UCUACUGACUCUCCAUUCA(SEQIDNO:118)32.基于Aha基因靶序列32的dsRNA有义链dsRNA:UGGAGAGUCAGUAGACCCA(SEQIDNO:119)反义链dsRNA:UGGGUCUACUGACUCUCCA(SEQIDNO:120)33.基于Aha基因靶序列33的dsRNA有义链dsRNA:GCCUGCUCCUUCAAAAACC(SEQIDNO:121)反义链dsRNA:GGUUUUUGAAGGAGCAGGC(SEQIDNO:122)34.基于Aha基因耙序列34的dsRNA有义链dsRNA:AAUCCCCACUUGUAAGAUC(SEQIDNO:123)反义链dsRNA:GAUCUUACAAGUGGGGAUU(SEQIDNO:124)35.基于Aha基因耙序列35的dsRNA有义链dsRNA:UCCCCACUUGUAAGAUCAC(SEQIDNO:125)反义链dsRNA:GUGAUCUUACAAGUGGGGA(SEQIDNO:126)36.基于Aha基因靶序列36的dsRNA有义链dsRNA:GAUCACUCUTJAAGGAAACC(SEQIDNO:127)反义链dsRNA:GGUUUCCUUAAGAGUGAUC(SEQIDNO:128)37.基于Aha基因靶序列37的dsRNA有义链dsRNA:GGAAACCUUCCUGACGUCA(SEQIDNO:129)反义链dsRNA:UGACGUCAGGAAGGUUUCC(SEQIDNO:130)38.基于Aha基因靶序列38的dsRNA有义链ds脂A:CAUUAGAAGCAGACAGAGG(SEQIDNO:131)反义链dsRNA:CCUCUGUCUGCUUCUAAUG(SEQIDNO:132)39.基于Aha基因靶序列39的dsRNA有义链dsRNA:GCAGACAGAGGUGGAAAGU(SEQIDNO:133)反义链dsRNA:ACUUUCCACCUCUGUCUGC(SEQIDNO:134)40.基于Aha基因靶序列40的dsRNA有义链dsRNA:AGUUCCACAUGGUAGAUGG(SEQIDNO:135)反义链dsRNA:CCAUCUACCAUGUGGAACU(SEQIDNO:136)41.基于Aha基因靶序列41的dsRNA有义链dsRNA:CGUCUCUGGGGAAUUUACU(SEQIDNO:137)反义链dsRNA:AGUAAAUUCCCCAGAGACG(SEQIDNO:138)42.基于Aha基因靶序列42的dsRNA有义链dsRNA:UUUACUGAUCUGGUCCCUG(SEQIDNO:139)反义链dsRNA:CAGGGACCAGAUCAGUAAA(SEQIDNO:140)43.基于Aha基因靶序列43的dsRNA有义链dsRNA:ACAUAUUGUGAUGAAGUGG(SEQIDNO:141)反义链dsRNA:CCACUUCAUCACAAUAUGU(SEQIDNO:142)物44.基于Aha基因靶序列44的dsRNA有义链dsRNA:GUGGAGGUUUAAAUCUUGG(SEQIDNO:143)反义链dsRNA:CCAAGAUUUAAACCUCCAC(SEQIDNO:144)45.基于Aha基因靶序列45的dsRNA有义链dsRNA:ACAGACCUUUGGCUAUGGC(SEQIDNO:145)反义链dsRNA:GCCAUAGCCAAAGGUCUGU(SEQIDNO:146)表3.转录用以减量调节人功能性Aha蛋白质表达的shRNA的载体的引1.基于Aha基因靶序列1(SEQIDNO:12)的引物有义链ACCAATTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:147)反义链TTATCCGTGGACCAATG(SEQIDNO:148)2,基于Aha基因靶序列7(SEQIDNO:18)的引物有义链ACTCACTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:149)反义链CATCAAGCTTACTCACG(SEQIDNO:150)3.基于Aha基因耙序列13(SEQIDNO:24)的引物有义链TTTAGTTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:151)反义链ACCTGTCCAGTTTAGTG(SEQIDNO:152)表4编码载体转录的shRNA序列1.GUGGACCAAUUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:153)2.GCUUACUCACUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:154)3.CCAGUUUAGUUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:155)在本发明的多个方面，dsRNA的每条链可以与表2所示dsRNA之一的至少一条链，在多个方面与表2所示dsRNA之一的两条链，有至少5个、至少10个、至少15个、至少18个或至少20个相同的连续核苷酸。^>向到表2提供的dsRNA之一的耙序列中其他位置的可供选4,的dsRNA可以容易地用单巴序列和Ahal侧翼序列(flankingAhalsequence)来确定。dsRNA含有两条互补的可杂交形成双链结构的RNA链。dsRNA的一条链(反义链)包含互补性区域，该互补性区域与源自Aha基因表达过程中形成的mRNA的序列的靶序列基本上互补，通常是完全地互补；另一条链(有义链)包含与反义链互补的区域，因而当在合适的条件下结合时，所述两条链可杂交并形成双链结构。通常情况下，双链结构的长度是15-30,更通常是18-25，还更通常是19-24,并且最通常是19-21个碱基对。类似地，靶序列的互补性区域的长度是15-30,更通常是18-25，还更通常是19-24，并且最通常是19-21个核苦酸。本发明的dsRNA还可包含一个或多个单链核苷酸突出端。例如，脱氧核糖核苦酸序列"tt"或核糖核苦酸序列"UU"可以连接到正义和反义链的3，-端形成突出端。dsRNA可以通过如下面详述的本领域公知的标准方法合成，i口通过j吏用DNA自动合成4义，例i口可,人i口Biosearch、AppliedBiosystems，Inc通过商业途径获得。在本发明的一个方面，Aha基因可以是人Ahal基因。在多个方面，dsRNA包含至少两条选自该组的序列，其中所述至少两条序列中的一条与所述至少两条序列中的另一条互补，并且所述至少两条序列中的一条与Aha基因(如Ahal基因)表达生成的mRNA的序列基本上互补。技术人员熟知已经声称包含20到23个，但特别是21个碱基对的双链结构的dsRNA在诱导RNA干扰时特别有效(Elbashir等，EMBO2001,20:6877-6888)。但是其他人已发现更短或更长的dsRNA也是有效的。本发明的dsRNA可以包含一个到三个对靶序列的错配。如果dsRNA的反义链包含对耙序列的错配，优选该错配区域不处在互补性区域的中心。如果dsRNA的反义链包含对靶序列的错配，优选将该错配限制在任一末端的5个核苷酸，如互补性区域的5，或3'端的5、4、3、2或1个核苷酸，并且优选是5，-端。例如，对于与Aha基因的某个区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，此dsRNA在中间的13个核香酸内通常不含有任何错配。另一方面，dsRNA的反义链在从反义链的位置1或2到位置9或10(从5'数到3')的区域中不含任何错配。本发明描述的方法能够用于确定含有对靶序列的错配的dsRNA是否能有效地抑制Aha基因的表达。考虑带有错配的dsRNA在抑制Aha基因表达时的功效是有用的，特别是当已知Aha基因的特定互补性区域在群体中具有多态性序列变异时。一方面，dsRNA的至少一端具有1到4个，通常情况下1个或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA与它们的平端对应物相比具有不可想象的卓越的抑制特性。另外，本发明人们(inventors)已发现只有一个核苷酸突出端存在使dsRNA的干扰活性加强，而不影响它的总体稳定性。已经证明，只有一个突出端的dsRNA在体内和多种细胞、细胞培养基、血液和血清中特别地稳定和有效。通常情况下，单链突出端位于反义链的3，-末端或有义链的3，-末端。dsRNA也可以具有通常位于反义链5，-端的平端。此类dsRNA具有改进的稳定性和抑制活性，因而允许低剂量的施用，即少于每天5mg/kg受者体重。通常情况下，dsRNA的反义链在3，-端具有核苷酸突出端，而5，-端是平的。另一方面，将突出端的一个或多个核苦酸用辟b^石寿酉吏4亥苦(nucleosidethiophosphate)耳又^。栽体编码的RNAi试剂本发明的dsRNA也可以在体内从重组病毒载体细胞内表达。本发明的重组病毒载体包含编码本发明的dsRNA的序列和用于表达dsRNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括，例如U6或HIRNApolIII启动子序列和巨细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择也在本领域技术范围之内。本发明的重组病毒载体也可包含用以在特定组织或特定胞内环境表达dsRNA的诱导型或可调控的启动子。在体内使用重组病毒载体将本发明的dsRNA递送至细胞会在下面详细讨论。本发明的dsRNA可以从重组病毒载体表达为两个分开的、互补的RNA分子，或者表达为有两个互补区域的单个RNA分子。本领域技术人员会明白任何能够接受要表达的dsRNA分子的编码序列的病毒载体都可使用，例如源自腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、反转录病毒(如慢病毒(lentiviruses)(LV)、棒状病毒(Rhabdovirus)、鼠类白血病病毒)、疱渗病毒等。病毒载体的向性可以通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型包装载体或者通过适当地替换不同的病毒衣壳蛋白来进行修饰。例如，本发明的慢病毒载体可以用来自疱疹性口腔炎病毒(vsv)、狂犬病、依波拉(Ebola)、莫科拉(Mokola)等的表面蛋白质进行假型包装。本发明的AAV载体可以通过工程改造载体以表达不同衣壳蛋白血清型来使其靶向不同的细胞。例如，将表达血清型2基因组上的血清型2衣壳的AAV载体称为AAV2/2。可以将AAV2/2载体上的这种血清型2衣壳替换为血清型5衣壳基因以产生AAV2/5载体。构建表达不同衣壳蛋白质血清型的AAV载体的技术在本领域的技术范围之内；参见如RabinowitzJE等(2002)，JVirol76:791-801,将其全文通过引用并入本文。适合本发明使用的重组病毒载体的选择、用于向载体中插入表达dsRNA的核酸序列的方法和将病毒载体递送到感兴趣的细胞的方法在本领域的技术范围之内。参见如DomburgR(1995),GeneTherap.2:301-310;EglitisMA(1988)，Biotechniques6:608-614;MillerAD(1990),HumGeneTherap.1:5-14;AndersonWF(1998),Nature392:25-30;和RubinsonDA等，NatGenet.33:401-406,将它们的全文通过引用并入本文。例如，将本发明的dsRNA从含有如U6或HIRNA启动子或者巨细胞病毒(CMV)启动子的重组AAV载体表达为两个分开的、互补的单链RNA分子。XiaH等(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010描述了用于表达本发明dsRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和将该载体递送至耙细胞的方法。SamulskiR等(1987),J.Virol.61:3096-3101;FisherKJ等(1996),J.Virol,70:520-532;SamulskiR等(1989),J.Virol.63:3822-3826;美国专利No.5,252,479;美国专利No.5,139,941;国际专利申请No.WO94/13788和国际专利申请No.WO93/24641描述了用于表达本发明dsRNA的合适AAV的载体、用于构建重组AV载体的方法和将该载体递送至靶细胞的方法，将它们的全文通过引用并入本文。非dsRNA药剂抗体可用以降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的水平。例如，抗体能够通过与功能性Ahal、Hsp90腺苦三磷酸酶的功能性Ahal结合位点和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶复合物的特异结合来降低功能性Ahal水平。本发明范围内的抗体包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段和基于抗体的融合分子。抗体的工程改造、生产、筛选、纯化、片段化(fragmentation)和治疗用途是本领域公知的(概括地参见Carter(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357;Coligan(2005)ShortProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,ISBN0471715786);Teillaud(2005)ExpertOpinBiolTher.5(Supp.1)S15-27;Subramanian,ed.(2004)Antibodies:Volume1:ProductionandPurification,Springer,ISBN0306482452;Brent等，ed.(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonsInc,ISBN047150338X;Lo,ed.(2003)AntibodyEngineeringMethodsandProtocols,HumanaPress,ISBN1588290921;Ausubel等，ed.(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology5thEd"CurrentProtocols,ISBN0471250929)。功能性Ahal特异性的多种类型的抗体也可通过许多商业渠道获得。血浆中抗体的终末半衰期(terminalhalf-life)可以在一个很广的范围内调节，例如几分钟到几周，来配合治疗蛋白质错折叠疾病的临床目标(参见如Carter等(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357,353)。嵌合的、人源化的和纯人源的(fUllyhuman)MAb能够有效地克服使用源自非人源的抗体治疗蛋白质错折叠疾病时的潜在限制，因而提供降低的免疫原性和优化的效应分子功能(参见如Teillaud(2005)ExpertOpin.Biol.Ther.5(1),S15-S27;Tomizuka等(2000)Proc,Nat.Acad.Sci.USA97,722-727;Carter等(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357,346-347)。可以改变或选择抗体以获得高效的抗体内化。同样地，抗体可以更高效地与胞内的耙分子相互作用，这些胞内的靶分子如功能性Ahal和/或具有类似功能的相关分子，或包括它们的复合物。另外，抗体-药物缀合物(conjugate)能够增加抗体内化的效率。有效的抗体内化对于递送功能性Ahal特异性的抗体至胞内环境来拯救缺陷性折叠和转运以次优(suboptimal)折叠能量学为特征的蛋白质是理想的。抗体与多种能够有助于抗体细胞内化的作用物的缀合是本领域公知的(概括地参见Wu等(2005)NatBiotechnol.23(9),1137-1146;McCarron等(2005)MolInterv5(6),368-380;Niemeyer(2004)BioconjligationProtocols,StrategiesandMethods:HumanaPress,ISBN1588290980;Hermanson(1996)BioconjugateTechniques,AcademicPress,ISBN0123423368)。与热休克蛋白分子伴侣，如Hsp90辅分子伴侣Ahal,特异性相互作用的小无机分子可用以降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的水平。功能性Ahal的药物抑制剂或小分子抑制剂的鉴定可以容易地通过标准高通量筛选方法来完成。另外，可以将标准的医用化学方法应用到这些试剂来增强或修饰他们的活性以产生更多的试剂。特异性地识別和结合功能性Ahal(或具有相似功能的其他相关分子)核苷酸或蛋白质的纯化的适配体可用以降低功能性Ahal(和/或具有相似功能的其他相关分子)的水平。适配体是从大的随机序列集合(largerandomsequencepool)选出的结合特定靶分子的核酸或肽分子。适配体的小尺寸使它们更容易合成和进行化学修饰，并且使它们能够接近抗原表位，否则该抗原表位即可能被阻挡(block)或隐藏。并且由于它们和内源性分子非常相似，适配体通常是非毒性的且弱的抗原。适配体的生成、选择和递送在本领域的技术范围之内(参见如Lee等(2006)CurrOpinChemBiol.10，1-8;Yan等(2005)FrontBiosci10,1802-1827;Hoppe-Seyler和Butz(2000)JMolMed.78(8)，426-430)。负选择方法会产生能够精确识别分子间不同的适配体。例如负选择步骤可产生能够识别Hsp90/ADP和Hsp90/ATP或者能够识别功能性Ahal、Hsp卯腺苷三磷酸酶和功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶复合物的适配体。适配体也可用以在细胞和有机体中在时间上和空间上调节蛋白质功能(如功能性Ahal的功能)。例如，配体调节性肽(LiRP)系统提供一种常规的方法，其中胞内肽的结合活性受到肽适配体的调控，而所述肽适配体则受到可透过细胞的小分子的调控(参见如Binkowski(2005)Chem&Biol.12(7),847-55)。通过使用LiRP或类似的递送系统，功能性Ahal的结合活性可以通过可透过细胞的小分子来控制，所述小分子与引入的胞内功能性Ahal特异性蛋白质适配体相互作用。因此，适配体能够提供降低功能性Ahal水平的有效方法，例如通过直接结合功能性AhalmRNA、功能性Ahal表达的蛋白质、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal结合位点和/或功能性Ahal-Hsp90腺苦三磷酸酶复合物。特异性地识别和结合编码功能性Ahal(和/或具有类似功能的其他相关分子)的核糖核苷酸的纯化反义核酸可用以降低功能性Ahal(和/或具有类似功能的其他相关分子)的水平。本发明的反义核酸分子是在细胞环境下与编码如功能性Ahal蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(如结合)的那些，在某种意义上抑制此蛋白质的表达，如通过抑制转录和/或翻译。有效降低功能性Ahal水平的反义分子可以用本领域公知的方法(参见如Chan等(2006)ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology33(5-6),533-540)来设计、生成和施用。设计为催化性地切割靶mRNA转录物的核酶分子也能够用于降低功能性Ahal和/或具有类似活性的相关分子的水平。对于功能性Ahal特异性的核酶分子可以用本领域公知的方法(参见如Fanning和Symonds(2006)HandbookExperimentalPharmacology173,289-303G,reviewingtherapeuticuseofhammerheadribozymesandsmallhairpinRNA(纟宗述了4垂头4大4亥酶禾口小发夹RNA的治疗用途))来设计、生成和施用。形成三链体的寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotide)可用以降低功能性Ahal和/或具有类似活性的相关分子的水平(概括地参见Rogers等(2005)CurrentMedicinalChemistry5(4),319-326)。施用用于本文中所述方法的试剂可以通过多种本
技术领域：
公知的方法递送。外产生或制造并向身体施用的试剂。内源试剂是那些通过某种类型的设备(生物的或其他)在体内产生或制造的用以在体内器官内递送或递送至体内其他器官的试剂。本文描述的试剂可通过任何常规方式使用一种或多种可药用的载体和/或U武形剂来配制，如在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明登药物科学)(A.R.Gennaro，Ed.),第21版，ISBN:0781746736(2005)中描述的，将其全文通过引用并入本文。这些剂型将包含治疗有效量的优选是纯化形式的所述试剂和适量的载体来提供向受试者进行适当施用的形式。剂型应当适合施用的模式。本发明使用的试剂可以通过公知的方法配制，用于使用数种途径向受试者施用，这些途径包括但不限于肠胃外、肺、口服、局部(topical)、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、目艮、口和直肠。单独的试剂也可以与一种或多种本发明的其他试剂和/或其他生物学上有活性的或生物学上惰性的试剂一起施用。这些生物学上有活性的或惰性的试剂可以与所述试剂具有流体或才几械相互作用(influidormechanicalcommunication),或者通过离子、共价、范德华力、疏水、亲水作用或其他物理力附着于所述试剂。当在本发明的方法中使用时，治疗有效量的本文所述试剂之一可以以纯的形式，或者如杲存在的话，以可药用的盐的形式，在含有或不含有可药用的赋形剂的情况下应用。例如，本发明的试剂可以按照可应用于任何医学治疗的合理效益/风险比率以足够的量施用，所述量足以在受试者体内重建以次优折叠能量学为特征的蛋白质的胞内和/或胞外运输，和/或至少部分地恢复通道的功能。这些试剂的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物和/或实验动物中确定LD50(对群体中的50。/。致死的剂量)和ED50(对群体中的50%治疗有效的剂量)的标准药学方法来测定。毒性和治疗效果之间的剂量比率是可以表达为LD50/ED50比的治疗指标，其中大治疗指标是优选的。可与可药用的载体组合产生单一制剂形式(singledosageform)的试剂的量会根据治疗的主体(host)和施药的特定方式改变。本领域技术人员可以理解每一制剂形式的单剂(individualdose)所含有的试剂的单位含量本身不需要达到治疗有效量，因为必要的治疗有效量可以通过施用多个单剂来达到。试剂的施用可以作为单次事件发生或发生一段治疗时间内。例如，可以每天、每周、每两周或每月施用试剂。在一些情况下，治疗可以从几星期延长至几个月，或者甚至是一年或更长。对于任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平依赖于多种因素，这些因素包括所治疗的病症和该病症的严重程度；使用的特定试剂的活性；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、大致健康状况(generalhealth)、性别和饮食；施用的时间；施用的途径；使用的特定试剂的排泄率；治疗的持续时间；与使用的特定试剂联合使用或巧合使用的药物和医学领域公知的类似因素等。有经验的开业医生会理解本发明使用试剂的总的每日用量(totaldailyusage)将由主治医师在合理医学判断的范围内决定。降低功能性Ahal或具有类似功能的其他相关分子的水平的试剂也可以与其他治疗模式一起组合使用。因此，在本文描述的治疗方法之外，也可为受试者提供已知对特定蛋白质错折叠疾病有效的其他治疗方法。可以配制控释(或持续释放)的制备物来延长试剂的活性和减少给药频率。控释制备物也用以影响开始作用的时间或其他特征，如试剂的血液水平，并且因而影响副作用的发生。控释制备物可以设计为首先释放可产生期望疗效的试剂量，然后在延长体内接近恒定水平的试剂，所述试剂可以按照可取代新陈代谢掉的试剂量和/或排出体外的试剂量的速度从试剂形式释放。试剂的控释可以通过多种诱导物激发，如pH的改变、温度的改变、酶、水或者其他生理条件或分子。控释系统可以包括，例如注入泵(infUsionpump),其可用于以类似于递送胰岛素或化疗剂(chemotherapy)至特定器官或肿瘤的方式施用试剂。通常而言，使用这种系统时将试剂与生物可降解的、生物相容性的多聚体植入物(见下文)组合施用，所述植入物在选定的位点经过一段受控制的时间释放试剂。多聚体材料的实例包括多聚酸酐、多正酯(polyorthoester)、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯(polyethylenevinylacetate),和它们的共聚物和组合。另夕卜，可以将控释系统置于治疗目标的附近，因而只需要系统性剂量的一部分。本发明的试剂可以通过其他本领域普通技术人员公知的控释方法或递送装置来施用。这些包括，例如，羟丙基曱基纤维素(hydropropylmethylcellulose)、其他多聚体基质、凝胶、透性膜、渗透系统、多层包被(multilayercoating)、微粒、脂质体、微球或类似物或者上述的任意组合来提供期望的按照不同比例的释放语(releaseprofile)(见下)。控释递送试剂的其他方法是技术人员公知的并在本发明的范围之内。降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子水平的试剂可以通过本领域公知的多种途径施用。实例包括涉及直接注射(如系统性的或立体定向的)、经过工程改造以分泌目的因子的细胞的植入、释放药物的生物材料、可植入的基质装置、可植入的泵、可注射的凝胶和水凝胶、脂质体、微团(micelle)(i口大至30口m)、纳5求(nanosphere)(j口小于1口m)、孩iJ求(如1-100口m)、储存装置(reservoirdevice)等。大分子(macromole)和/或药物(如本文描述的试剂)的肺递送为肺部的局部组织或体循环的循环系统提供相对简单的无损伤(non-invasive)施用(参见如Cryan(2004)AAPSJ.7(1)article4，E20-41,提供对肺递送技术的综述)。肺递送的优点包括无损伤、大的吸收表面面积(75m2)、允许快速吸收的薄的(0.1到0.5口m)肺泡上皮、首过代谢(firstpassmetabolism)的缺失、降低的蛋白水解活性、快速发生作用和高生物利用率。含有或不含赋形剂和/或可分散液体的用于肺递送的药物剂型是本领域公知的。基于载体的生物分子递送系统，如多聚体递送系统、脂质体和微化的碳水化合物(micronizedcarbohydrate)可与肺递送结合使用。渗透促进剂(penetrationenhancer)(如表面活性剂、胆汁盐、环糊精)、酶抑制剂(如胰凝乳蛋白酶抑制剂、抑酶醛肽(leupeptin)、杆菌肽)和载体(如微球和脂质体)可用来增强穿过肺泡上皮细胞的为了系统性分布的摄取。可用以运送本文描述的生物分子的多种吸入递送装置，如定量吸入器(metered-doseinhaler)、喷雾器和干粉吸入器是本领域公知的(如AErx(Aradigm,CA);Respimat(Boehringer，Germany);AeroDose(AerogenInc.,CA))。如本领域公知的那样，装置选择可以依赖于所用生物分子的状态(如溶液或干粉)、贮存的方法和状态、赋形剂的选择以及剂型和装置之间的相互作用。干粉吸入装置对基于蛋白质的试剂的肺递送是特别优选的(如Spinhaler(FisonsPharmaceuticals,NY);Rotohaler(GSK,NC);Diskhaler(GSK,NC);Spiros(DuraPharmaceuticals,CA);Nektar(NektarPharmaceuticals,CA))。提供好的流动性、分散能力和稳定性的活性生物成分的干粉剂型是本领域技术人员乂>^口的。使功能性Ahal水平降低的试剂可以胶囊化并在多种载体递送系统中施用。载体递送系统的实例包括微球、水凝胶、多聚体植入物、智能多聚体载体(smartpolymericcarrier)和脂质体。递送生物分子试剂的基于载体的系统能够提供胞内递送；调适(tailor)生物分子/试剂的释放速率；增加到达其作用位点的生物分子的比例；改进药物到其作用位点的转运；允许与其他试剂或赋形剂的共区域化(colocalized)沉积；改进体内试剂的稳定性；通过减少清除率(clearance)延长试剂在其作用位点的留驻时间；降低试剂到非目的组织的非特异性递送；降低试剂引起的刺激(irritation);降低试剂高的初始剂量带来的毒性；改变试剂的免疫原性；降低给药频率、赶紧产品的味道；和/或提高产品的货架寿命(shelflife)。多聚微球可以使用天然存在的或合成的多聚体生产，其为大小范围在O.l到500jim的颗粒系统(particulatesystem)。多聚孩i团和多聚体组(polymeromes)是与孩i球具有相似特征的多聚体递送运载体(polymericdeliveryvehicle),它也可以有助于胶嚢化和递送本文描述的生物分子。对于许多生物分子净荷的微球的装配(fabrication)、胶嚢化和稳定在本领域技术范围之内(参见如Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol.4(1)35-51)。微球的释放速率可以通过多聚体类型、多聚体分子量、共聚物组成、添加到微球剂型的赋形剂和微球大小来调适。对形成微球有用的多聚体材料包括PLA、PLGA、DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明胶、清蛋白、壳聚糖、右旋糖酐(dextmn)、DL-PLG、SDLMs、PEG(如ProMaxx)、透明质酸钠、二酮哌溱衍生物(如Technosphere)、磷酸4丐-PEG颗粒和寡糖衍生物DPPG(如Solidose)。胶嚢化可以例如使用水/油单享'L剂方法(water/oilsingleemulsionmethod)、？K-油-又又享L剂方法(water-oil-waterdoubleemulsionmethod)或冻干法来实现。几个商业化的胶嚢化技术是可以获得的(如ProLease、Alkerme)。胶嚢化本文所述试剂的微球可以多种方式来施用，包括肠胃外、口服、肺、植入和泵送装置。由亲水的多聚体例如胶原、血纤蛋白和藻酸盐组成的多聚体水凝胶可以用于降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子水平的试剂的持续释放(通常参见Sakiyama等(2001)FASEBJ.15，1300-1302)。毫米到厘米规模的三维多聚植入物可以与降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子水平的试剂一起加载(通常参见Teng等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,3024-3029)。多聚体植入物通常提供生物活性因子的较大储藏。植入物也可以装配成结构支撑体以配合其应用的几何学(如形状、大小、多孔性)。也可以通过商业途径获得具有多种大小和递送谱(deliveryprofile)的可才直入的基于基质的递送系统(如InnovativeResearchofAmerica,Sarasota,FL)。"智能"多聚载体可用于施用降低功能性Ahal和/或具有相似功能的其他相关分子水平的试剂(概括地参见Stayton等(2005)OrthodCraniofacialRes8,219-225;Wu等(2005)NatureBiotech(2005)23(9),1137-1146)。这类载体使用在生理pH下为亲水和隐身-样(stealth-like)的多聚体，但所述多聚体在摄入至内体区室(endosomalcompartment)(即来自内体pH梯度的酸性刺激物)之后就变为疏水和膜去稳定的(membrane-destabilizing)多聚体，它们在内体区室中增强货物分子向胞质中的释放。智能多聚载体的设计可以引入pH敏感的功能性、疏水性膜去稳定基团、允许药物引入的多种缀合和/或络合元件以及可选的细胞靶向成分。潜在的治疗性大分子货物包括致使功能性Ahal和/或具有类似功能的相关分子水平降低的肽、蛋白质、抗体、多核苷酸、质粒DNA(pDNA)、适配体、反义寡聚脱氧核苷酸、沉默RNA(silencingRNA)和/或核酶。作为实例，通过受体介导的胞吞作用内化的智能多聚载体可以增强靶向功能性Ahal的dsRNA和/或其他本文描述的试剂的细胞质递送。多聚载体包括，例如聚(烷基丙歸酸)多聚体家族，具体实例包括聚曱基丙烯酸、聚(乙基丙烯酸)(PEAA)、聚(丙基丙烯酸)(PPAA)和聚(丁基丙烯酸)(PBAA),其中烷基依次增加一个亚曱基基团。具有很强pH响应性、膜去稳定活性的智能多聚载体可设计为肾脏排泄的大小限制以下。例如，聚(EAA-co-BA-co-PDSA)和聚(PAA-co-BA-co-PDSA)多聚体分别在9和12kDa的低分子量时表现出高溶血/膜去稳定活性。多种接头化学可用来为蛋白质、核酸和/或靶向部分提供可降解的缀合。例如吡啶基二硫丙烯酸酯(pyridyldisulfideacrylate)(PDSA)单体允许通过二硫键的有效缀合反应，所述二硫键在治疗物胞内易位之后可在胞质中还原。脂质体可用于施用降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子水平的试剂。脂质体的药物携带能力和释放速率可取决于脂质组成、大小、电荷、药物/脂质比率和递送方法。常规的脂质体由中性或阴离子脂质(天然的或合成的)組成。一般使用的脂质是磷脂酰胆碱(lec池in),例如(磷脂酰胆碱(phosphatidylcholines^磷脂酰乙醇胺(PE)、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)。脂质胶嚢化的方法是本领域公知的(Galovic等(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15,441-448;Wagner等(2002)J.LiposomeRes.12,259-270)。耙向的脂质体(targetediiposome)和反应性脂质体也可用以递送本发明的生物分子。靶向的脂质体有附着至其表面的寻靶配体，例如单克隆抗体或凝集素，允许与特定受体和/或细胞类型的相互作用。反应性或多形性脂质位(phase)和结构的倾向(如pH敏感的脂质体)(参见如Lasic(1997)LiposomesinGeneDelivery,CRCPress,FL)。多种其他递送方法是本领域公知的并可用来施用本发明的试剂。进一步地，可以组合和/或#"饰这些和其他递送系统来最优化本发明的试剂的施用。包含dsRNA的药物组合物在多个方面，本发明提供包含如本文描述的dsRNA和可药用载体的药物组合物。包含dsRNA的药物组合物对于治疗与Aha基因的表达或活性的疾病或病症(如Ahal表达介导的病理过程)是有用的。这些药物组合物基于递送模式配制。一个实例是通过肠胃外递送为系统性施用而配制的组合物。本发明的药物组合物是用足以抑制Aha基因表达的剂量施用的。本发明人已经发现，因为它们改进的功效，含有本发明的dsRNA的组合物可以以令人惊讶的低剂量施用。每天每千克受者体重最大5mg的dsRNA剂量足以抑制或完全阻抑Aha基因的表达。通常情况下，dsRNA的合适剂量在每天每千克受者体重0.01微克到5.0毫克的范围内，通常在每天酶千克体重1微克到1mg的范围内。药物组合物可以每天施用一次，或者dsRNA可以在一天中合适的间隔以两次、三次或更多次亚剂量(sub-dose)施用或者甚至通过控释剂型使用连续的灌输(infosion)或运送来施用。那种情况下，每个亚剂量含有的dsRNA必须相应地小一些来达到总的日剂量。剂量单位也可配制(compoimd)为用于历时几天的递送，如使放剂型是本领域公知的并对试剂的阴道递送特别有用，例如能够与本发明的试剂一起使用。在多个方面，剂量单位包含日剂量的相应多倍。技术人员将会明白一些因素会影响有效地治疗受试者所需要的剂量和时间安排，其包括但不限于疾病或病症的严重程度、以前的治疗、受试者的大体健康状况和/或年龄和存在的其他疾病。另外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单独的治疗或一系列的治疗。本发明包括的对单个dsRNA的有效剂量和体内半衰期的估计可以使用常规的方法学或在使用合适动物模型的体内实验(如本文其他部分所述)的基础上进行。小鼠遗传学上的进展已经产生了许多用于研究不同人类疾病，如Aha表达介导的病理过程的小鼠模型。这些模型可用于dsRNA的体内实验，也可用于测定治疗有效剂量。本发明也包括含有本发明的dsRNA化合物的药物组合物和剂型。本发明的药物组合物也可根据多种方法施用，这些方法取决于需要局部还是系统治疗和接受治疗的区域。施用可以是局部的(topical),肺的，如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通过喷雾器；气管内的、鼻内的、表皮的和经皮的，口服或肠胃外的。肠胃外的施用包括静脉内的、动脉内的(intraartierial)、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或灌输；或颅内的，如鞘内的或心室内的施用。局部施用的药物组合物和剂型可以包括经皮肤的贴片(transdermalpatches)、寿欠膏(ointment)、洗液(lotion)、乳膏(cream)、凑是月交、滴齐寸(drop)、牙全剂(suppository)、喷雾剂(spmy)、液体和粉末。常规的药用载体，水的、粉末的或油状的基底，稠化剂(thickener)等可能是必要的或理想的。涂覆的避孕套、手套等也可能有用。例如，局部剂型包括这样一些剂型，在这些剂型中将本发明的dsRNA与局部递送试剂(如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合。在多个方面，脂质和脂质体可以包括中性的(如二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)=DOPE、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine)=DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearolyphosphatidylcholine))、电负性的(negative)(二豆蔻酰磷脂酰甘油(dimyristoylphosphatidylglycerol)=DMPG)和电正性的(cationic)(二油酰四曱基氨基丙基(dioleoyltetramethylaminopropyl)=DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)=DOTMA)。本发明的ds認A可以包裹入脂质体或在那里形成复合物，特别是和阳离子的脂质体。或者，dsRNA可以与脂质，特别是阳离子的脂质形成复合物。在多个方面，脂肪酸和酯可以包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸(dicaprate)、三癸酸(tricaprate)、单油酸甘油酯(monoolein)、甘油二月桂酸酯(dilaurin)、1-单癸酸甘油酯(glyceryl1-monocaprate)、1-十二》克基氮杂玉不庚-2-酉同(1-dodecylazacycloheptan-2-one)、酰基肉碱(acylcamitine)、酰基胆碱或C^烷基酯(如异丙基肉桂酸酯(isopropylmyristate)IPM)、单酸甘油酯、甘油二酯或它们的可药用的盐。本领域技术人员将了解口服施用的组合物和剂型可以包括粉末或颗粒、微颗粒、纳颗粒(nanoparticulate)、水的或非水基质的悬液或溶液、胶嚢、凝胶胶嚢、嚢剂(sachet)、片剂或小片剂(minitablet)。稠化剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂(dispersingaids)或黏合剂(binder)可能是理想的。口腔剂型可以是那些在其中本发明的dsRNA与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂。表面活性剂可以包括脂肪酸和/或它们的酯或盐、胆汁酸(bileacid)和/或其盐。优选的胆汁酸/盐包括鵝脱氧胆酸(chenodeoxycholicacid)(CDCA)和乌索脱氧鹅脱氧月旦酸(ursodeoxychenodeoxycholicacid)(UDCA)、胆酸(cholicacid)、脱氬胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholicacid)、glycholicacid(gly胆酸)、糖脱氧胆酸(glycodeoxycholicacid)、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠(sodiumtauro-24,25-dihydro-fosidate)和糖二氢梭链孢酸钠(sodiumglycodihydrofosidate)。脂肪酸可以包括花生四烯酸、十一烷酸(undecanoicacid)、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、l-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、单酸甘油酯、甘油二酯或它们的可药用的盐(如钠盐)。渗透促进剂的组合可能是有用的，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。例如，组合可以是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。更多的渗透促进剂可以包括聚氧乙烯-9-月桂基醚(polyoxyethylene-9-laurylether)、聚氧乙烯-20-十六坑基醚(polyoxyethylene-20-cetylether)。本领域技术人员也将了解本发明的dsRNA可以以包括喷雾干燥的颗粒或复合形成微颗粒或纳颗粒通过口服递送。dsRNA复合试剂包括聚氨基酸；聚亚胺(polyimine);聚丙烯酸盐/酯(polyacrylate);聚烷基丙烯酸盐/酯(polyalkylacrylate)、聚氧杂环丁烷(polyoxethane)、聚烷基氰基丙烯酸盐./酯(polyalkylcyanoacrylate);阳离子化明胶、清蛋白、淀粉、丙烯酸盐/酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸盐/酯；DEAE-衍生化聚亚胺(DEAE-derivatizedpolyimines)、支链淀粉(pollulan)、纤维素和淀粉。复合试剂可以包括壳聚糖、N-三曱基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺(polyspermine)、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙氨基曱基乙烯P(TDAE)(polythiodiethylaminomethylethyleneP(TDAE))、聚氨苯乙烯(如对氨基)、聚(曱基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(已己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸盐/酯、DEAE-己基丙烯酸盐/酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-清蛋白和DEAE-葡聚糖、聚曱基丙烯酸盐/酯、聚己基丙烯酸盐/酯、聚(D,L-乳酸)、DL-乳酸乙醇酸共聚物(poly(DL-lactic-co-glycolicacid);PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。用于肠胃外、鞘内或心室内递送的组合物和剂型可以包括可含有緩沖溶液、稀释剂和其他合适添加剂的无菌水溶液，添加剂例如但不限于穿渗透促进剂、载体化合物和其他可药用载体或赋形剂。本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂和含有脂质体的剂型。这些组合物可以从许多成分中生产，所述成分包括但不限于预成液(preformedliquid)、自乳化的固体和自乳化的半固体。可以方便地以单位剂量形式呈现的本发明的药物剂型可以根据制药工业公知的常规技术来制备。这些技术包含把活性成分和药用载体或赋形剂组合到一起的步骤。通常情况下，如下制备剂型通过均一地和紧密地把活性成分和液体载体或精细地分开的固体载体或它们两者组合到一起，然后如果需要的话将产物成型。本发明的组合物可以配制成许多可能的制剂形式中的任何一种，这些制剂形式包括但不限于片剂、胶嚢、凝胶胶嚢、液体糖浆、软胶嚢(softgd)、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可配制成水的、非水的或混合介质中的悬液。水制悬液还可以包括增强悬液粘度的物质，所述物质包括例如羧曱基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖酐。悬液也可包含稳定剂。在本发明的多个方面，可以将药物组合物配制成并用作泡沫。药用泡沫包括例如但不限于如下剂型乳剂、微乳剂、药膏、胶冻剂(jelly)和脂质体。本质基本相似的情况下，这些剂型的区别在于终产物的成分和稠度。这类组合物和剂型的制备对于制药和剂型领域的技术人员通常是公知的，并可以应用到本发明的组合物的剂型。筛选本发明的另一个方面涉及对功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子产生作用的候选试剂的筛选系统，其可用于开发治疗性或预防性处理蛋白质折叠疾病的组合物。测试法(assay)可以在活的哺乳动物细胞中进行，其更紧密地接近了特定血清水平的药物在体内的效果。表达具有能量上欠佳的(energeticallydisfavourable)折叠特性的蛋白质的细胞系可用于评估潜在的生物活性试剂针对功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子或者是针对从培养的细胞系制备的提取物的活性是有用的。使用提取物的研究提供了对直接的试剂/酶相互作用进行更严格测定的可能性。因此，本发明可以提供评估可降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的水平，并且因而稳定哺乳动物宿主(例如人宿主)体内具有能量欠佳折叠特性的蛋白质的折叠的方法。本测试法可以包括将表达错折叠蛋白质的转基因细胞系或其提取物与预先选定量的试剂在合适的培养基或緩沖液中接触，然后测定在与不存在所述试剂的对照细胞系或部分提取物和/或表达目的蛋白质非错折叠变体的对照细胞系对比时，功能性Ahal和/或具有类似功能的其他相关分子的水平。例如，筛选方法可以鉴别具有以下功能的试剂降低功能性Ahal水平、降低结合Hsp卯的胞内Ahal、降低Hsp90腺苷三磷酸酶的激活、降低Hsp90/ATP的胞内水平和/或增加Hsp90/ADP的胞内水平。更具体地说，治疗蛋白质错折叠疾病的候选试剂可以如下筛选提供在合适的培养基或緩冲液中稳定地表达目的错折叠蛋白质的细胞，对所述细胞施用候选试剂，测定该细胞中功能性Ahal的水平，和决定所述候选试剂是否降低胞内功能性Ahal的水平。另外，治疗蛋白质错折叠疾病的候选试剂可以如下筛选提供在合适的培养基或緩冲液中稳定地表达目的错折叠蛋白质的细胞，对所述细胞施用候选试剂，测定与Hsp90结合的胞内Ahal和Hsp90腺苷三磷酸酶的激活水平，和决定所述候选试剂是否降低此类结合和/或激活。理想的候选者通常具有降低细胞内功能性Ahal水平的能力。稳定地表达错折叠蛋白质的细胞的供应在本领域的技术范围之内(参见如实施例1-11)。检测功能性Ahal和/或具有类似功能的相关分子的水平或它们形成的复合物的水平的任何合适的方法都可以应用于检测因施用候选试剂所得的水平(参见如实施例5-9)。可以应用的常规方法中有共免疫沉淀、交联、通过梯度或层析柱的共纯化和与Ahal功能相关的活性测定。应用方法(例如这些方法)使得对感兴趣的蛋白质和/或复合物的鉴定成为可能。筛选中鉴定的试剂将通常展现与功能性Ahal和/或具有类似功能的相关分子相互作用的能力，其相互作用的方式是引起具有次优折叠动力学的蛋白质的稳定化，并因此导致增加的蛋白质转运。例如，鉴定的试剂可以降低功能性Ahal的水平、降低与Hsp90结合的胞内Ahal、降低Hsp90腺苷三磷酸酶的激活、降低Hsp90/ATP的胞内水平和/或增加Hsp卯/ADP的胞内水平。这些试剂可以包括但不限于核酸、多肽、dsRNA、反义分子、适配体、核酶、三螺旋、抗体和小的无机分子。另外，上述描述的筛选方法可以应用另一种稳定表达非错折叠蛋白质变体的细胞。通过与其它细胞(表达次优折叠动力学的蛋白质的细胞)基本相似的方式施用候选试剂，并测定非错折叠蛋白质的转运水平，技术人员可以确定候选试剂是否基本上降低非错折叠蛋白质的转运水平。优选地，鉴定的试剂基本上不干扰非错折叠蛋白质的折叠和/或转运。同样，稳定表达其他蛋白质的细胞也可以类似地用来决定试剂是否影响其他相关或不相关蛋白质的折叠和/或转运。例如，鉴定的降低功能性Ahal水平的试剂优选地基本上不削弱具有能量上更稳定的折叠的其他蛋白质的转运。本发明也包括鉴定特异结合功能性Ahal和/或具有相似功能的其他相关分子的方法。一个此类的方法包括如下步骤提供固定的纯化了的功能性Ahal蛋白质和至少一种测试试剂；将固定的蛋白质和测试试剂相接触；洗脱未结合到固定蛋白质的试剂；和检测测试试剂是否与固定的蛋白质结合。这些仍然与固定的蛋白质结合的试剂是与功能性Ahal蛋白质特异性地相互作用的那些试剂。本发明也包括在发现药物的尝试中，使用功能性Ahal(和/或具有类似功能的其他分子)来阐明功能性Ahal(和/或具有类似功能的其他分子)和疾病(例如蛋白质错折叠疾病)的状态、表型或症状之间存在的关系。这些方法包括检测或降低Ahal多核苷酸的水平，其包括用本发明的试剂接触样品、组织、细胞或有机体；测定功能性Ahal的核酸或蛋白质水平，和/或在处理之后的某个时间的相关表型的或化学的终止点(chemicalendpoint);和任选地将测量值与未处理的样品或用本发明的其他试剂处理过的样品进行比较。这些方法也可以平行地或与其他实验组合实施以对于靶物质有效性验证方法来确定未知基因的功能，或者确定特定的基因产物作为治疗或预防特定疾病、症状或表型的靶物质的有效性。治疗性的处理本发明的一个方面提供治疗蛋白质折叠疾病的方法。不受限于特定的理论，以下现象是可能的降低功能性Ahal的水平，因而降低Hsp90腺苷三磷酸酶活性可以给予动力学上遇到挑战的AF508突变体更多时间来利用重建分子伴侣来制造更适合输出的折叠(moreexportcompetentfold)。因此，在需要治疗的受试者体内，能够通过施用降低功能性Ahal和/或具有类似功能的其它相关分子的水平的试剂来治疗蛋白质折叠。另外，同样不受限于特定的理论，以下现象是可能的Hsp90-ADP状态有利于货物和ERAD途径的关联，而依据Ahal和p23公知的生物化学特性，基于对功能性Ahal(参见如图8B,X)或p23(参见如图8B,Y)的应答Hsp90-ATP状态提供与COPII的偶联。因此，蛋白质错折叠疾病的另一个预防或治疗方法可包括对需要施用的受试者施用可以降低功能性Ahal与Hsp卯腺苷三磷酸酶结合和/或降低因功能性Ahal和Hsp90腺香三磷酸酶的结合而导致的激活水平的试剂。优选地，所述试剂的施用基本上不干扰其他胞内蛋白质的折叠和/或转运。例如，优选地，施用降低功能性Ahal的水平、降低功能性Ahal与Hsp90腺苦三磷酸酶的结合和/或降低因功能性Ahal和Hsp90腺苷三磷酸酶的结合而导致的激活水平的试剂优选不显著的削弱其他蛋白质的转运，例如，具有能量上更稳定折叠的其他蛋白质。表示出需要本发明的上下文中的治疗和/或适合(amenableto)本文描述的治疗方法学的疾病状态和症状包括蛋白质错折叠疾病，例如CF、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、二型糖尿病、帕金森病，海绵状脑病如克雅病、原发性系统性淀粉样变性病、继发性系统性淀粉样变性病、老年系统性淀粉样变性病、家族性淀粉样多神经病I、遗传性脑淀粉样血管病、血液透析相关性淀粉样变性病、家族性淀粉样多神经病III、费氏遗传性系统性淀粉样变性病(Finnishheriditarysystemicamyloidosis),曱状腺髓样癌(medullarycarcinomaofthethyroid)、心房淀粉样变性病(atrialamyloidosis)、遗传性非神经性系统性淀粉样变性病(hereditarynon-neuropathicsystemicamyloidosis)、注射定4立'!"生；定4分才羊变寸生病(injection-localizedamyloidosis)和遗传性肾淀粉样变性(heriditaryrenalamyloidosis)。例如，根据本文描述的方法可治疗的蛋白质错折叠疾病包括错折叠的蛋白质导致从ER中的蛋白质转运减少和蛋白质降解增加的那些疾病，例如CF、马方综合症、法布莱病、高歇病和色素性视网膜炎3。作为另一个例子，根据本文描述的方法可治疗的蛋白质错折叠疾病包括错折叠的蛋白质导致不溶的聚集物沉积的那些疾病，例如阿尔茨海默病、二型糖尿病、帕金森病和海绵状脑病(例如克雅病)。上述所列的蛋白质错折叠疾病可以是，至少部分是，由下列物质的错误折叠引起的CFTR、肌原纤蛋白、a-半乳糖苷酶、(3-葡糖脑苷脂酶、视紫红质、淀粉状蛋白卩和t(胰岛淀粉样多肽)、支链淀粉(amylin)、a-突触核蛋白(alpha-synuclein)、朊病毒、免疫球蛋白轻链、血清淀粉样A、运曱状腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、p2-微球蛋白、脱脂载脂蛋白A-l、凝溶胶蛋白、降血钙素、心钠素、溶菌酶、胰岛素和纤维蛋白原(fibrinogen)。是否需要治疗的决定因素通常是通过与疾病相关的病史和身体检查来评估。例如，CF的诊断可以包括临床标准和汗液Cl-数值分析的结合。另外，可以进行AF508的DNA分析。这种CF诊断在本领域范围之内(参见如Cutting(2005)AnnuRevGenomicsHumGenet6，237-260，综述了CF)。具有确定的治疗需要的受试者包括那些具有下列特征的受试者经诊断有蛋白质错折叠疾病或蛋白质错折叠疾病指征(indication)应遵循本文所描述的治疗处理的受试者，和已经接受治疗、正在治疗和将要治疗蛋白质错折叠疾病的受试者。受试者优选地是动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物和鸟类，更优选地是马、牛(cow)、犬、猫、绵羊、猪和鸡，最优选地是人。本发明的另一个方面涉及拯救受到蛋白质错折叠影响的细胞。这类方法定位于细胞功能，并可以在体外、体内或先体外后体内地实施。在一个实施例中，拯救受到蛋白质错折叠影响的细胞可以发生在来自培养的细胞系的细胞。在另一个实施例中，拯救受到蛋白质错折叠影响的细胞可以发生在取自受试者并且随后重新导入受试者的细胞。在另一个实施例中，拯救受到蛋白质错折叠影响的细胞可以原位发生在受试者体内的细胞中。将可以降低功能性Ahal和/或具有类似功能的相关分子水平的试剂向发生蛋白质错折叠的细胞施用可以有助于能量上不稳定的折叠稳定化，导致对受损的蛋白质胞内和/或胞外转运的重建。例如，对表达错折叠的AF508CFTR的细胞施用可以降低Hsp90辅分子伴侣和功能性Ahal的试剂可以增强AF508的ER稳定性、重建AF508到细胞表面的转运、增加细胞表面AF508的可用性和/或至少部分地重建通道功能(参见如实施例10)。优选地，为了拯救受到蛋白质错折叠影响的细胞而施用降低功能性Ahal水平的试剂基本上不干扰其他胞内蛋白质的折叠和/或转运。使用dsRNA的治疗处理本发明特别地涉及到为了治疗嚢性纤维化而使用dsRNA或从其制备的药物组合物。由于对于Ahal表达的抑制作用，本发明的dsRNA或从其制备的药物组合物可以提高嚢性纤维化患者的生活质量。另外，本发明涉及目的在于治疗癌症(如为了抑制肿瘤生长和胂瘤转移)的dsRNA或本发明的药物组合物的用途。例如dsRNA或从其制备的药物组合物可用于治疗实体瘤像乳腺癌、肺癌、头颈癌(headandneckcancer)、脑癌、腹癌(abdominalcancer)、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胃肠癌、神经胶质瘤(glioma)、肝癌、舌癌、成神经细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤(Wilm，stumor)、多发性骨髓瘤，和用于治疗皮肤癌像黑素瘤，用于治疗淋巴瘤和血癌。本发明还涉及到使用本发明的dsRNA或从其制备的药物组合物来抑制不同种类的癌症中Ahal的表达和/或抑制腹水的积聚和胸腔积液，这些癌症如乳腺癌、肺癌、头癌、颈癌、脑癌、腹癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胃肠癌、神经胶质瘤、肝癌、舌癌、成神经细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、维耳姆斯瘤、多发性骨髓瘤、皮肤癌、黑素瘤、淋巴瘤和血癌。由于对于Ahal表达的抑制作用，本发明的dsRNA或从其制备的药物组合物可以提高癌症患者的生活质量。本发明还涉及dsRNA或其药物组合物与其他药物和/或其他治疗方法如已知药物和/或已知治疗方法组合的用途，如用于治疗嚢性纤维化或癌症或用于预防肿瘤转移，所述已知药物和/或已知治疗方法例如现今用来治疗嚢纤维化或癌症和/或防止肿瘤转移的那些。当药物组合物的目的为治疗嚢性纤维化时，可以将该组合物例如与以下组合提供每日胸部物理疗法、口服的胰腺酶、对抗肺部感染的每日口服或吸入的抗生素、吸入的抗哮喘治疗物、皮质类固醇片剂、膳食维生素补充品(特别是A和D)、吸入Pulmozyme、减轻便秘或改进酶补充物活性的药物、针对CF相关糖尿病的胰岛素、针对CF相关肝病的药物和帮助呼吸的氧气。当药物组合物的目的为治疗癌症和/或防止肿瘤转移时，组合物可以是，例如与放疗和化疗剂例如顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、道诺霉素或它莫西芬相结合来提供。本发明也可以通过4吏特定的RNAi试剂包含另一种抗癌症的化疗剂如任何常规的化疗剂来应用。特定结合剂(bindingagent)和这类其他试剂的组合可以增强化疗方法。从技术人员的角度来看，多种化疗方法可以导入本发明的方法中。可以使用任何化疗剂，包括烷化剂、抗代谢物、激素和拮抗物、放射性同位素，以及天然产物。例如本发明的化合物可以与以下一起施用抗生素例如多柔比星和其他蒽环类抗生素类似物，氮芥如环磷酰胺，嘧啶类似物如5-氟尿嘧啶，顺铂，羟基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物等。在另一个实例中，在混合瘤的情况下，例如其中的肺瘤包括促性腺激素依赖的和促性腺激素不依赖的细胞的乳腺癌，所述化合物可以与亮丙瑞林(leuprolide)或戈舍瑞林(goserelin)(LH-RH的合成肽类似物)一起施用。另一个抗胂瘤方法包括将四环素化合物和另一种治疗形式如手术、放射等一起使用，此处也称为"辅助的抗肺瘤形式"。因此，本发明的方法可以与此类常规的疗法(regimen)一起应用来获得减轻副作用和增强功效的益处。实施例本发明的方面可以通过以下实施例得到更好的理解，实施例不应当理解为以任何的方式对本发明的范围进行限制。实施例1:CFTR蛋白质相互作用组(interactome)为了确定在胞吐和胞吞途径中CFTR的转运和功能所涉及的总体蛋白质相互作用(globalproteininteraction),将包含CFTR的蛋白质复合物从表达野生型CFTR的细胞系中免疫分离(参见如图1),用蛋白酶消化并用多维蛋白鉴定技术(MudPIT)确定肽混合物的组成((Lin等，BiochimBiophysActa1646,1(2003))。CFTR是从过量表达野生型或AF508CFTR的稳定BHK细胞系，或表达野生型CFTR的Calu-3、HT29和T84细胞系免疫沉淀得到的。将稳定表达野生型或AF508CFTR的幼仓鼠肾细胞(BHK)保存在补充有F12、5%胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素(Pen/Strep)各100单位/ml和500pM甲氨蝶呤(methotrexate)的DMEM(XanodynePharmacal,Inc.,Florence,KY)中。将不表达CFTR的亲代BHK细胞培养在除不含曱氨蝶呤外其他均相同的培养基中。都表达内源性野生型CFTR的人肺细胞系Calu-3和人肠细胞系HT29和T84是从ATCC购买的，并根据制造商的说明进行保存。将全细胞去垢剂裂解物中的CFTR和共免疫沉淀蛋白质结合到偶联有抗CFTR的单克隆抗体M3A7的琼脂糖珠(Sepharosebead)。为了捕获(capture)CFTR在不同的亚细胞区室内转运时的瞬时的或微弱的相互作用，免疫沉淀在有或没有在细胞裂解之前向完整的细胞加入可切割的化学交联剂二硫代二琥珀酰亚胺丙酸酯(dithiobissuccinimidylpropionate)(DSP)的情况下进行。为了对照出蛋白质和珠的非特异结合，使用了几种情况来显示背景还原，其包括在以下条件下温育细胞裂解物只有珠存在时，或珠与对抗VSV-G的单克隆抗体偶联时，VSV-G是一种仅存在于感染了疱渗性口腔炎病毒的细胞中的蛋白质(Calu-3、T84和H89数据集)。在BHK细胞的情况下，将从稳定表达野生型和AF508的细胞中的免疫沉淀物直接与不表达CFTR的亲本细胞系比较。在Excel文件中提供的数据集中，汇集了从非偶联和偶联两种方法中回收的蛋白质。免疫沉淀之后，将蛋白质复合物通过在新鲜制备的8M盐酸胍中变性来消化，然后稀释到2M。用内蛋白酶LysC消化蛋白质8小时，接着稀释到1M胍盐酸，并用PorozymeTM胰蛋白酶珠进行胰蛋白酶消化。所有的消化都在37。C进行。将蛋白酶消化的免疫复合物用MudPIT来进行LC/LC/MS/MS分析。此方法已经由几位作者详细描述了(Link等，1999NatBiotechnol17，676-682;MacCoss等，2002,ProcNatlAcadSciUSA99，7900-7905;MacCoss等，2002,AnalChem74，5593-5599;McDonald等，2002IntJMassSpect219，245-251;Washburn等，2001NatBiotechnol19,242-247)。简而言之，将变性、还原并烷基化的蛋白质分为三份并在37°C用三种不同的蛋白酶(胰蛋白酶、枯草蛋白酶(subtylisin)和弹性蛋白酶)过夜消化。得到的肽混合物用蚁酸(5%)酸化。然后，通过匀浆填充~7cm的5-|imAquaC18材料(Aqua，Phenomimex)到100jam的熔融石英毛细管构建三相微毛细管柱，所述熔融石英毛细管先前已经用SutterInstruments;敫光4立4申器(SutterManufacturing,Novato,CA)4立长到尖端直径5jLim。接着，先后将3cm的5卞mPartisphere强阳离子交换树脂(Partisphere:Whatman)和另一个3cm的5屮mAquaC18层析材料填充到柱上。然后在用高压装置(highpressurecell)把肽混合物上样至三相层析柱的后端之前，用5%乙腈/0.1%蚁酸平衡柱子~30分钟。上样肽消化物之后，将柱子与Agilent1100四元HPLC连在一起(placeinline)并用改进的6步分离方法分析。緩冲溶液为5%乙腈/0.1%蚊酸(緩冲溶液A)、80%乙腈/0.1%蚁酸(緩冲溶液B)和500mM乙酸铵/5%乙腈/0.1%蚁酸(緩冲溶液C)。第1步由100分钟的从0-100。/o的緩冲溶液B的梯度组成。第2-5步设定如下3分钟100%緩沖溶液A、2分钟X。/。的緩冲溶液C、10分钟的0-15%梯度的緩冲溶液B和97分钟的15-45%梯度的缓冲溶液B。所述2分钟的緩沖溶液C的百分比(X)对6步分析来说分别是10、20、30、40%。在最后一步，梯度包括3分钟100%的緩沖溶液A、20分钟100%的緩冲溶液C和10分钟的0-15%梯度的緩沖溶液B和107分钟的15-70%梯度的緩冲溶液B。当肽从微毛细管柱洗脱出来，将它们用末梢2.4kV喷射电压(distal2.4kVsparyvoltage)直接电喷射入LCQ-Deca质谱仪。在多维分离的每一步过程中，始终连续地重复在35。/。标准化的碰撞能量下的一个全扫描质谱(400-1400m/z)之后接着3个的数据依赖性MS/MS质谱的循环。质谱仪扫描功能和HPLC溶剂梯度的应用由Xcalibur数据系统控制。然后用下列方法分析串联质谱(tandemmassspectra)。首先，使用软件算法(2to3)从多电荷的肽质i普中来确定合适的电荷状态(+2或+3)，并除去低质量的谱(Sadygov等，2002,JProteome(蛋白质组)Res1,211-215)。在Beowolf计算机簇(~75cpu)上用SEQUESTTM的并行虚拟机(PVM)版本(Yates等，1995,AnalChem67,3202-3210;Yates等，1995,AnalChem67,1426-1436),在构建自Refseq的人、小鼠和大鼠数据库的联合数据库(HMR)的蛋白质数据库中搜索2to3之后所得的MS/MS质谱。用DTASelect程序(Tabb等，2002,JProteome(蛋白质组)Res1,21-26)过滤、分类和显示数据库搜索结果。使用缺省的DTASelect标准(即，+11.8,+22.5,+33.5,ACN0.08和每个位点至少2将从重复的免疫沉淀鉴定的蛋白质成分合并，并将得到的数据集用NIH提供的EASE分析程序标注GO—Annotation(GO注解)(Hosack等，2003,GenomeBiol《R70)。在减去对照的蛋白质组中，将GO—Molecular—Function(GO分子功能)注解为属于结合核酸的或结构类别的蛋白质去除，这些蛋白质通常是来自全细胞蛋白质组实验的普通污染物。得到的蛋白质列表主要包括了胞质分子伴侣、内质网(ER)腔内蛋白质、分泌途径的后部成分(latesecretorypathwaycomponent)、细胞表面相互作用因子和蛋白酶体/泛素化作用成分。图1的草图描绘了作为网络中的节点包含在CFTR蛋白质相互作用组中的成分(浅色椭圆形已经建立的相互作用；深色椭圓形本研究找回的新的相互作用)，并且将其分为可能有助于在ER(I)、ERAD(II)、膜转运(III)和后ER调节因子和效应物(IV)中蛋白质折叠的次级网络(subnetwork)。深色的线是网络中的边缘，其显示CFTR和MudPIT鉴定的标示成分(indicativecomponent)之间直接或间接蛋白质相互作用。浅灰色的线说明的边缘定义了基于Tmm共表达数据库用Cytoscape平台获得的相互作用。表7显示的是对蛋白质进行阵列(array)的结果，所述蛋白质是在所示的表达野生型CFTR的细胞种类中用多维蛋白质鉴定技术(MudPIT)回收的蛋白质，通过质谱以分级的序列覆盖率的顺序排歹寸(arrangedintheorderoffractionalsequencecoveragebymassspectrometry)。结果显示，鉴定的蛋白质生成了定义CFTR蛋白质组或蛋白质相互作用组的蛋白质相互作用网络(参见如图1)。组成CFTR蛋白质相互作用组的蛋白质可以分为共同定义了功能性组的次级网络，所述功能性组包括折叠和从ER输出需要的成分(参见如图1-1)、介导ERAD的成分(参见如图l-II)、指导胞吐和胞吞区室之间运输的成分(参见如图l-III)和在细胞表面的CFTR功能和调节中涉及的有可能的结合配偶体(bindingpartner)的成分(参见如图IB-IV)。在细胞表面发现的相对于成熟的野生型CFTR存在的许多蛋白质相互作用证实所述数据库的有效性(参见如表8)。例如，CFTR是活性由依赖cAMP的蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶调节的门控氯离子通道(Guggino和Banks-Schlegel,2004)。蛋白质磷酸酶2A(PP2A)或PP2C在许多细胞类型的CFTR去磷酸化和CFTR活性的减量调解中具有作用。虽然大概由于它们的非常短暂的相互作用，激酶在任何测试过的细胞系中都没有检测为稳定的相互作用配偶体，但是野生型CFTR在几乎所有的细胞系中都显出与PP2A调节亚基和催化亚基二者强烈的相互作用(Thelin等，2005;Vastiau等，2005)。除了PP2A,钠氢交换剂(sodium-hydrogenexchanger;NHE)同种型(isoform)3调节因子1和3(NHERF-1/3)(Mohler等，1999;Yun等，1997)也在CFTR蛋白质组中回收。NHERF位于肺细胞的顶端表面，并已充分证明其通过C末端的PDZ结构域与CFTR相互作用(Guggino和Banks-Schlegel,2004,AmJRespirCritCareMed170,815-820)。一种以前未知的相互作用因子包括4丐粒蛋白B(S100-A8),其是包含EF-手的胞质Ca"结合蛋白的去垢剂S100家族的成员(Donato,2003，MicroscResTech60,540-551;Heizmann，2002,MethodsMolBiol172,69-80)。已有暗示钙粒蛋白B涉及到CF炎性途径(Fanjul等，1995,AmJPhysiol268,C1241-1251;Renaud等,1994，BiochemBiophysResCommun201,1518-1525;Xu等，2003,JBiolChem278,7674-7682),暗示了可能的与CFTR肺病理生理学相关的调控作用。结果也说明在通常情况下，多个内吞作用转运成分的鉴定说明CFTR内化和回收在正常功能中的重要性。第二组成分强调出野生型CFTR与质膜转运系统的直接或间接的相互作用(参见如表7)。这些包括选蛋白相关受体L(sortilinrelatedreceptorL)(SORLl)、失去功能的同系物2(Dab2)、含有RalBPl相关Eps结构域的蛋白质(Reps1)、ARF4、网格蛋白轻链、空泡分选蛋白4(vacularsortingprotein4)(Vps4p)、夕卜蛋白(enthoprotin)和分选连才妾蛋白(sortingnexin)(SNX)4和9。SORL1具有单一跨膜结构域，其定位于回收内体并涉及到多个配体的内化(Jacobsen等，2001，JBiolChem276,22788-22796)。Dab2功能是作为货物选择性的内吞作用网格蛋白接头(clathrinadaptor)(Bonifacino和Traub,2003,AnnuRevBiochem72,395-447;Mishra等,2002,EmboJ21,4915-4926),而Repsl能够结合到包含CFTR中发现的NPF内化基序的蛋白质(Yamaguchi等，1997，JBiolChem272,31230-31234)并通过包含AP2、Dab2的货物选"t奪系统偶:f关到内吞作用GTPase调控因子的Rabll-FIP2家族(Bilan等，2004,JCellSci117,1923-1935;Cullis等，2002,JBiolChem277,49158-49166;Gentzsch等，2004,MolBiolCell15,2684-2696;Swiatecka-Urban等，2005,JBiolChem280,36762-36772)。ARF4是在内吞作用/回收区室中显示的小GTPase(Donaldson和Honda，2005,BiochemSocTrans33,639-642;Langhorst等，2005，CellMolLifeSci62，2228-2240;Morrow和Parton,2005,Traffic6,725-740)，其中VPS4很可能在从后期保内区室(lateendosomalcompartment)到融酶体的蛋白质运输中发挥作用(Bowers等，2004,Traffic5,194-210;Hislop等，2004,JBiolChem279,22522-22531;Scheuring等，2001,JMolBiol312，469-480;Scott等，2005，EmboJ24,3658-3669)。外蛋白与网格蛋白接头API相互作用，与位于高尔基体的含有y耳(y-earcontaining)的ARF结合蛋白质2相互作用(McPherson和Ritter,2005,MolNeurobiol32,73-87;Wasiak等,2003,FEBSLett555,437-442;Wasiak等，2002,JCellBiol158,855-862),并通过它的羧基末端结构域与网格蛋白重链的末端结构域相互作用来刺激网格蛋白包被的嚢泡的形成(Kalthoff等，2002,MolBiolCell13,4060-4073;Wasiak等，2003,同上；Wasiak等，2002,同上)，与网格蛋白轻链的回收(Ybe等，2003,Traffic4,850-856)和已有的网格蛋白在CFTR回收中的功能相一致(Cheng等，2004,JBiolChem279,1892-1898;Hu等，2001,BiochemJ354,561-572;Lukacs等,1997，BiochemJ328(Pt2),353-361;Peter等，2002,JBiolChem277，49952-49957;Picciano等，2003,AmJPhysiolCellPhysiol285,C1009-1018;Weixel和Bradbury,2000,JBiolChem275,3655-3660;Weixel和Bradbury,2001,PflugersArch443Suppl1,S70-74;Weixel和Bradbury,2001，JBiolChem276，46251-46259)。蛋白质相互作用组中鉴定的其他接头包括Snx4和Snx9(Carlton等，2005，Traffic6,75-82;Lundmark和Carlsson，2003,JBiolChem278,46772-46781;Wasiak等，2003，JCellBiol158,855-862)。Snx9与AP2的卩附属结构域(P-appendagedomain)结合并协助AP2在质膜上由网格蛋白和发动蛋白介导的内化作用中的功能(Lin等，2002,同上；Lundmark和Carlsson,2003,同上；Lundmark和Carlsson,2004,JBiolChem279，42694-42702;Lundmark和Carlsson,2005,MethodsEnzymol404,545-556;Soulet等，2005,MolBiolCell16,2058-2067;Teasdale等，2001,BiochemJ358,7-16)。已经报道，Snx4与两性蛋白(amphiphysin)相互作用以有助于铁传递蛋白(transferrin)和其他循环成分的内吞作用转运(Hettema等，2003,EmboJ22,548-557;Leprince等，2003，JCellSci116,1937-1948)。尽管以上结果聚焦于影响因子和转运成分，野生型和AF508CFTR都通过包含泛素和蛋白酶体成分的ERAD途径降解(Amaral,2004,JMolNeurosci23,41-48)(参见如表8)。来自表达野生型和AF508CFTR的细胞中的蛋白质组都包括ERAD涉及的成分。这些成分包括易位/脱位Sec61通道和指导转运至蛋白酶体的分子伴侣VCP/p97/Cdc48。蛋白酶体的作用通过蛋白质相互作用组中的26S蛋白酶体亚基和泛素化途径成分的富集得到显示(参见如表8)。有趣的是，蛋白质组中回收的泛素化结合蛋白(ubiqutinating-conjugatingUbc6的相互作用，Ubc6是一类经常引起ERAD包括CFTR的E2泛素结合酶(Lenk等，2002,JCellSci115,3007-3014)。这些连接酶是否仅在ER的水平上涉及到ERAD中，还是在细胞表面也通过胞吞作用/溶酶体定向的途径参与CFTR的减量调节还未确定(Gentzsch等,2004,MolBiolCell;Sharma等，2004，JCellBiol164,923-933;Swiatecka-Urban等，2005，同上)。除了以上讨论的那些实例之外，经预测，其他成分也具有与CFTR的直接或间接的相互作用(参见如表1和2)。以上是辅以MudPIT蛋白质组学技术灵敏度的系统生物学方法，采取MudPIT蛋白质组学技术用以鉴定对CFTR折叠和转运途径有贡献的瞬时相互作用，CFTR蛋白质相互作用组。尽管一些已经显示与后-ER区室(post-ERcompartment)相互作用的蛋白质未得到鉴定，这可能反映了质语技术的局限性、在研究中优化以期一致的免疫沉淀条件和一个事实，那就是蛋白质相互作用组很可能是由非常动态过程组成的，因而瞬时相互作用是很难捕捉的并且高度依赖于细胞种类和生长状况。包含所有已知相互作用的蛋白质相互作用组(参见如图l)可以提供新的基线来启动评估对CFTR在顶端细胞表面获得和维持功能必要的许多不同的蛋白质复合物。Table5.后-ER与CFTR相互作用的已知功能的蛋白质*参考序列登陆码蛋白质名称％覆盖率独特整体细胞表面转运因子和调节因子NM—004252NHERF-1**20%56NM—004785NHERF-2***14%4丽001285CECA12%22后ER运输系统的成分NM—003105NM016760SORL1网格蛋白，轻链1%13%131211丽_003794分选连接蛋白43%35雨—014666外蛋白9%4NM—007479ARF416%24NM一—023118Dab25%33NM—_016451卩COP5%22NM—013245VPS4A5%22丽_009503VCP7%22雇__009048Repsl6%22NM一016224分选连接蛋白95%22恵008028阀蛋白25%22*显示的是如通过质谱鉴定的百分比序列覆盖率(％覆盖率)，独特肽谱数(独特)，和整体肽谱数(整体)**显示的是BHK细胞的肽数据。对于HT29为11%,2,2。***显示的是Calu-3细胞的肽数据。对于HT29为20%,7,10。Table6.与CFTR结合的降解蛋白质组参考序列AF508WT#登陆码蛋白质名称A*B*C*A*B*C*丽一—017314泛素C6%51175%336NM_011664泛素B16%55212%16NM一007126VCP/p97/Cdc4825%10147%22蛋白酶体26S，非腺苷三考fe"而台午敗NM—002808酶,213%784%22NM一—008944蛋白酶体,a型217%2NM—002795蛋白酶体,P型,324%33NM_011185蛋白酶体,P型123%33NM一O11967NM—006503NM—008948NM—002796NM—002815NM—013336NM—004652NM—000462NM—004238薩018144蛋白酶体，a型523%33蛋白酶体26S腺苷三磷酸酶，412%23蛋白酶体26S,腺苦三磷酸酶38%23蛋白酶体，卩型,416%22蛋白酶体26S，非腺香三磷酸酶,ll5%22Sec61a亚基同种型111%4泛素特异性蛋白酶91%2泛素蛋白连接酶E3A6%2THR相互作用因子122%2Sec61,a亚基211%27222#从BHK(野生型CFTR)、Calu-3、HT29、T84细胞系回收的蛋白质*显示的是如通过质镨鉴定的百分比序列覆盖率(A)，独特肽谱的数目(B),以及整体肽谱的数目(C)。Table7:表达野生型CFTR的细胞系的CFTR蛋白质组序列覆盖率(％)蛋白RefSeqAC基因名称BHKCalu-3HT29T84序号wt1而—000492嚢性纤维化跨膜传导调控蛋白0.5990.5260.4550.4072雨_008379核周蛋白(输入蛋白(importin))卩10.5790.2870.0680.0753NM一009037网钩结合蛋白(reticulocalbin)0.4954NM006597Hsc700.46603750.354NM—001539Hsp40-Al啊2)0.4030.0810.1136NM—006391输入蛋白70.3340.0780.0467NM—022310GRP780.3280.1880.137<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>NM—005507NM—005880画002715NM001316雇002717NM—011992NM—002901NM—008302丽一O12030NM—006098NM—002902NM—011313NM—018243NM—009906NM—002882丽—007479NM—003400丽002716激动蛋白丝切蛋白0.307(cofilin)1(非月几肉)Hsp40-A2(Hdj3)0.2820.133蛋白质磷酸酶20.2750.11(原为2A)，催化亚基，a同种型CSEl染色体分离1样0.2550.1430.048(酵母)蛋白质磷酸酶20.248(原为2A),调节亚基B(PR52),a同种型网4丐结合蛋白20.221网4丐结合蛋白1,0.2150.145EF手形钓结合结构域Hsp90f30.2140.1710.076NHERJF-10.1970.112鸟噤呤核苷酸结合蛋白0.189(G蛋白)，卩多肽2样1网4丐结合蛋白2,EF手形4弓结合结构域S1004丐结合蛋白A6(钙周期蛋白)假设蛋白FLJ108490.175蜡样质-脂褐素增多症，0.16神经的2RAN结合蛋白10.159ADP-核糖基化因子40.156核输出蛋白10.154(CRM1同源物,酵母)蛋白质磷酸酶20.151(原为2A),调节亚基A0.1830.1860.1230.180.0930.0530.142(PR65),卩同种型28NM-_001681SERCA20.150.09229画一—021594ERM-结合磷蛋白0.14930丽一—005998含有TCPl的伴侣蛋白，亚基3(y)0.1431NM_007637伴侣蛋白亚基5(s)0.13132NM-—011664泛素B0.1210.07233画_—021671db830.11734NM_013336蛋白质转运蛋白SEC61ot亚基同种型1o.m0.1130.09935丽一028152MMS19(MET18酉良酒酵母)-样0.1136NM一004282BAG-20.10437NM一001746钓联接蛋白0.0960.09538NM——012470转运蛋白-SR(transportin-SR)0.09439丽一025291类固醇受体RNA激活因子10.09140丽一—013686TCPl0.0941NM_005345Hsp70-1AO駕0.3150.08342NM一—020645染色体11开读框140.08343NM——018307ras同源物基因家族，成员Tl0.08144NM一—021979Hsp70-20.0780.1280.1020.07845NM_0012194丐腔蛋白0.070.11146NM—006430含有TCPl的伴侣蛋白，亚基4(S)0.06747NM_006310氨肽酶噤呤霉素敏感性0.06648NM一—006325RAN，成员RAS0.065癌基因家族50丽-_005348Hsp90,a0.06151NM-—007995纤维胶凝蛋白A0.057(ficolinA)52NM_019685RuvB样蛋白10.05753NM—004461苯丙氨酸-tRNA0.055合成酶样54雨_000917前胶原-脯氨酸，0.0542-酮戊二酸4-双加氧酶(脯氨酸4-羟化酶)，a多肽I55雇_—019942隔蛋白6(septin6)0.04956NM_017314泛素C0.04657NM_—004522驱动蛋白家族成员5C0.0458NM_007508腺苷三磷酸酶，0.039H+转运,V1亚基A,同种型159NM—030706三基序蛋白2(tripartite0.039motifprotein2)60NM—009955二氢嘧口定酶样20.03761NM_032069谷氨酸受体0.036相互作用蛋白62NM—002155Hsp70B'0.03463NM_003794分选连接蛋白40.03364NM一033309假设蛋白MGC46550.03265NM—016338输入蛋白110.03266NM_—004521驱动蛋白家族成员5B0.02867鹿一007054驱动蛋白家族成员3A0.02768NM一008633微管相关蛋白40.02569NM—023115原钙粘着蛋白150.024(protocadherin15)70丽016448RA调节性核基质0,0150.1070.0340.102相关蛋白71NM_—000038腺瘤病结肠息肉病0.01472NM一—004624血管活性肠肽受体10.01473丽_004652泛素特异性蛋白酶9，0.014X染色体(肥胖小眼面(fatfacets)样果蝇)74NM_022954MEGF10.01275NM_000296多嚢肾病10.009(常染色体显性)76NM—000層半胱氨酸蛋白酶0.337抑制剂B(stefmB)77丽一007108转录延伸因子B(SIII),0.314多肽2(18kDa,延伸蛋白B(elonginB))78NM_002965S1004丐结合蛋白A90,246(4丐粒蛋白B)79NM_画008143鸟噤呤核苷酸结合蛋白，0.243卩2,相关序列180NM_007355热《木克90kDa蛋白1,卩0.22981NM—002818蛋白酶体(前体，巨0.226蛋白因子(macropain))激活因子亚基2(PA28p)82NM_002306凝集素,半乳糖苷0,212结合性,可溶性,3(半乳凝素3)83NM—017147激动蛋白丝切蛋白10.20584NM_002963S100《丐结合蛋白0.198A7(芥子气1)85雇_006070TRK融合基因0.19586雇016647间质干细胞蛋白0.1780.3980.3140.1980.178878889909192939596979899100101102NM—021199NM—004785画—002156画—005527固014225NM012111NM—006415NM一004208画—022934NM—021863NM—019390NM000462NM002808NM—024334NM004327DSCD75辟^化物醌还原酶样(酵母)NHERF-2热休克60kDa蛋白1(伴侣蛋白)热休克70kDa蛋白1样蛋白质磷酸酶2(原为2A),调节亚基A(PR65),a同种型Ahal,热〗木克90kDa蛋白腺苷三磷酸酶同源物1激活因子(酵母)丝氨酸棕榈酰转移酶，长链基部亚基1程序性细胞死亡8(细胞凋亡诱导因子)DnaJ样蛋白睾丸特异性热休克蛋白相关基因hst70核纤层蛋白A泛素蛋白连接酶E3A(人乳头瘤病毒E6相关蛋白，Angelman综合症)蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)26S亚基，非腺苷三磷酸酶,2假设蛋白MGC3222断裂点簇区0.1510.0730.1510.1390,1330.1310.1260.340.1210.1160.0930.0810.0620.0580.0550.040.0220.0170.1980.1090.0810.1030.0790.162103NM—001035104NM_—005648106雨_005389107NM一—008786108NM_013232109NM一—010481110丽_—000117112丽一—018144114丽_009795115丽——007126116雇—030971117丽一—022314118NM—_006149119NM——014612120NM_—016451121NM_005358122NM013245蓝诺定(ryanodine)受体2(心的)转录延伸因子B(SIII),多肽1(15kDa,延伸蛋白C)蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-转曱基酶蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-转曱基酶l程序性细胞死亡6GRP75伊默菌素(埃德二氏肌营养不良)很可能为小鼠SEC61的直向同系物，a亚基2(酿酒酵母)《丐蛋白酶,小亚基1含缬酪肽蛋白与大鼠三羧酸载体样蛋白相似原肌球蛋白3,y凝集素，半乳糖苷结合性，可溶性，4(半乳凝素4)染色体9开读框10外被体蛋白复合物，亚基卩LIM域仅7空泡蛋白分选(vacuolarproteinsorting)4A(酵母)0.0060.3570.330.6170.2910.2150.1890.2620.1810.1130.1080.1340.0960.0930.0850.3490.0560.0530.0510.0510.050.046123NM_016739GPI-锚定膜蛋白10.046124NM一_007245共济失调蛋白20.044相关蛋白125NM一—004238曱状腺激素受体0.015相互作用因子12126NM_006904蛋白激酶,DNA活化的，0.0140.013催化多肽127NM一031819FAT胂瘤抑制因子0.004(果蝇)同源物128NM一001540热休克27kDa蛋白10.346129NM一013474载脂蛋白A-II0.324130丽——000611CD59抗原pi8-200.297(单克隆抗体16.3A5,EJ16，EJ30,EL32和G344鉴定的抗原)131NM—一031469SH3域结合性富谷氨酸0.29蛋白样2132丽_023009MARCKS样蛋白质0.251133丽一018362lin-7同源物C0.228(秀丽隐杆线虫)134NM一006118HS1结合蛋白0.201135NM——014666外蛋白0.174136雇_—023945跨膜4_域,亚家族A,0.17成员5137画_002067鸟嘌呤核苷酸结合蛋白0.162(G蛋白)，all(Gq类)138NM一001833网格蛋白,轻链多肽0.138(Lea)139NM——002354肺瘤相关的钙信号0.131转导物1140NM018188假设蛋白FLJ107090.128NM-_017724亮氨酸富含重复0.118(FLII中)相互作用蛋白2142NM—016963原肌球调节蛋白30.116143NM_031033鸟噤呤核苷酸结合0.111蛋白a11亚基144而_004447表皮生长因子受体0.101途径底物8145薩一002070鸟噪呤核苷酸结合蛋白0.082(G蛋白)，a抑制活性多肽2146NM_001835网格蛋白,重链多肽样10.077147丽一002087颗粒体蛋白0.074148NM——019653具有SOCS盒1的0.074含WD-40-重复序列的蛋白149薩一009386紧密连接蛋白10.073150NM—002778原皂化蛋白(Prosaposin)0.071(变体高歇病和变体异染性白质营养不良)151NM_004360钙黏着蛋白1,1型，0.068E-钙黏着蛋白(上皮的)152NM—031922Repsl0.062153NM一014935磷酸肌醇3-磷酸-0.06结合蛋白-3154NM—022098布I设蛋白LOC639290.055155NM_001343Dab20.053156丽_004475阀蛋白20,05157NM_016224分选连接蛋白90.05158薩014271白细胞介素10.049受体辅助蛋白样1159NM_014812KARP-l-结合蛋白0.049160NM—002958RYK受体样酪氨酸激酶0.048161丽——033299磷脂酶D基因20.045162丽一—023063赘生物中0.044丢失的上皮蛋白163雨——014428紧密连接蛋白30.039(闭锁小带3)164丽一—031382睾丸表达基因160.037165丽__033049粘蛋白13,上皮跨膜的0.037166丽—016745腺苷三磷酸酶，0.0320&++转运,广泛存在的167丽—031823Wolfram综合症10.027168NM—001115腺苷酸环化酶8(脑的)0.024169丽一007454AP-l,卩1亚基0.024170NM一001285CLCA10,023171NM一—003253T细胞淋巴瘤0.023浸润和转移1172丽一003174超绒毛蛋白(supervillin)0.019173丽_015756施鲁姆(shroom)0.018174丽003105S0RL10.01Table8:野生型和AF508CFTRBHK蛋白质组的比较序列』蛋白BHK质号RefseqAC基因名称盖率(％)BHK△F508野生型1丽_000492嚢性纤维化跨膜传导调控蛋白0.5690.5992NM—008379核周蛋白(输入蛋白)卩10.2090.5793NM一009037网4丐结合蛋白0.2740.4954NM_006597Hsc700.5820.4665NM—001539Hsp40扁Al(Hdj2)0.3070.4036NM—006391输入蛋白70.0437鹿—_022310GRP780.3978鹿——005507激动蛋白丝切蛋白1(非肌肉)0.3379雨—005880Hsp40-A2(Hdj3)0.318蛋白质磷酸酶2(原为2A),10NM-—002715催化亚基，a同种型0.08411NM—001316CSE1染色体分离1样(酵母)0.045蛋白质磷酸酶2(原为2A),12NM——002717调节亚基B(PR52)，a同种型0.23513NM_023565染色体分离l样(酉良酒酵母)0.04514NM_011992网4丐结合蛋白20.087网4丐结合蛋白1,15NM一002901EF手形钓结合结构域0.22416NM—008302Hsp卯，卩0.35817NM一012030NHERF-10.152鸟噤呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，18NM_J306098P多肽2样1网钩结合蛋白2,19NM__002902EF手形鈣结合结构域S1004丐结合蛋白A620而一011313(钙周期蛋白)22NM—018243假设蛋白FLJ108490.18423NM——009906蜡样质-脂褐素增多症,神经的224NM一002882RAN结合蛋白125NM—007479ADP-核糖基化因子426NM—003400核输出蛋白1(CRM1同源物,酵母)蛋白质磷酸酶2(原为2A),27NM—002716调节亚基A(PR65),(3同种型0.20128NM_001681SERCA20.08529NM021594ERM结合磷蛋白0.1040.3340.3280.3070,2820.2750.2550.2480.2380.2210.2150.2140.1970.1890.1830.180.1750.160.1590.1560.1540.1510.150.14930NM—005998包含TCP1的伴侣蛋白,亚基3(y)0.1431NM—007637伴4吕蛋白亚基5(s)0.13132NM—011664泛素B0.1610.12133NM—021671db830.117蛋白质转运蛋白SEC6134NM—013336a亚基同种型l0.11135NM—028152MMS19(MET18酿酒酵母)样0.1136NM—004282BAG-20.280.10437NM—001746钙联接蛋白0.1640.09638NM—012470转运蛋白-SR0.09439NM一025291类固醇受体RNA激活因子10.09140NM:一013686TCPl0.0950.0941NM—005345Hsp70-1A0.1930.08342NM—020645染色体11开读框140.08343NM—018307ras同源物基因家族,成员Tl0.08144NM—021979Hsp70-20.1560.07845NM—0012194丐月空蛋白0.0746NM—006430包含TCPl的伴倡蛋白，亚基4(S)0.06747NM—006310氨肽酶噤呤霉素敏感0.06648NM—006325RAN,成员RAS癌基因家族0.06550NM—005348Hsp90，a0.3920.06151NM—007995纤维胶凝蛋白A0.05752NM—019685RuvB样蛋白质l0.1430.05753NM—004461苯丙氨酸-tRNA合成酶样0.055前胶原-脯氨酸，2-酮戊二酸4—双加氧酶(脯氛酸4-幾化酶)，54NM—000917a多肽I0.05455NM—019942隔蛋白60.04956NM—017314泛素C0.060.04657NM004522驱动蛋白家族成员5C0.0610.04腺苷三磷酸酶，H+转运58NM_—007508VI亚基A,同种型10,03959NM-—030706三基序蛋白20.03960NM—009955二氢嘧啶酶样20.03761NM—032069谷氨酸受体相互作用蛋白0.03662NM—_002155Hsp70B'0.0960.03463NM_003794分选连接蛋白40.03364NM_—0333094支设蛋白MGC46550.0320.03265NM——016338输入蛋白110.0450.03266NM一—004521驱动蛋白家族成员5B0駕0.02867NM—007054驱动蛋白家族成员3A0.02768NM一—008633微管相关蛋白40.02569画一_023115原钙粘着蛋白150週70NM一016448RA调节性核基质相关蛋白0.0150.01571雨一000038^^瘤病结肠息肉病0.0130.01472NM一004624血管活性肠肽受体1泛素特异性蛋白酶9，0.01473NM一004652X染色体(肥胖小眼面样果蝇)0.01474雨一—022954MEGF10.01275雇一■296多嚢肾病1(常染色体显性)蛋白质磷酸酶2(原为2A),0.0310.00976NM一014225调节亚基A(PR65),a同种型0.41378NM一022934DnaJ样蛋白0.3479NM一—010481GRP750.33780NM一.007175染色体8开读框20.32481NM一002965S1004丐结合蛋白A9(4丐粒蛋白B)0.26382画一—007126含缬酪肽蛋白蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)0.24683NM一002795亚基，P型，30.23984丽一005866I型sigma受体0.229蛋白酶体c前体，巨蛋白因子;)85NM—011185亚基，卩型i0.229蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)86NM——002793亚基，p型，i0.228蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)87NM—011967亚基,a型50.228与秀丽隐杆线虫蛋白质88NM—006459C42C1.9相似0.171蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)89NM——008944亚基，a型20.17190NM_007688激动蛋白丝切蛋白2,肌肉0.16991NM—010223FKBP80.166蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)92NM—011971亚基,P型30.16693NM一—024661々I设蛋白FLJ124360.162蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)94画一002796亚基，P型，40.15995NM一006601p230.15696NM一019766端粒酶结合蛋白，p230.15697NM—025736RIKENcDNA4921531Gl4基因0.145鸟噤呤核苷酸结合蛋白，98NM—008143卩2,相关序列10.14299画一000942亲环蛋白(cyclophilin)B0.13蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)100丽一00280826S亚基,非腺苷三磷酸酶,20.129蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)101NM—00650326S亚基,腺苦三磷酸酶,40.124102丽一013863BAG-30.121103雇一016737H叩0.114104NM一013559Hspl050.095105NM—016127假设蛋白MGC87210.088蛋白质磷酸酶2a,催化亚基，106雇_017374卩同种型0細107NM-—011889隔蛋白30.082108NM-—014673KIAA0103基因产物0.081110雨—016742Cdc370.079蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)111NM一00894826S亚基,腺苷三磷酸酶30.077112NM—018085输入蛋白90.077113NM—025754RIKENcDNA4933425L11基因0.074114NM-—018448TBP相互作用蛋白0.072115NM_—002271核周蛋白(输入蛋白)卩30.063蛋白质磷酸酶2(原为2A),116NM—004576调节亚基B(PR52)，卩同种型0.063117NM—015129隔蛋白60.062118丽一—011304RuvB样蛋白20.06119雇_016395丁酸盐诱导的转录物10.056120雨一009864钙黏着蛋白10.055很可能为包含小鼠膜结合C2域121NM_015292的蛋白的直向同系物0.053蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)122NM—00281526S亚基，非腺苷三磷酸酶，110.05123NM—018695erbb2相互作用蛋白0.048124NM一008803磷酸二酯酶8A0.045125NM—004734双皮层蛋白和CaM激酶样10.044126NM_008450驱动蛋白20.044127NM_006640MLL隔蛋白样融合0.042谷氨酸受体，亲离子的，128NM—031508红藻氨酸盐50.042129NM—019548滋养蛋白(trophinin)0.041130NM—004320SERCA10.033131NM_017249含有膜结合C2域的蛋白0.026132NM_000014a-2-巨球蛋白0.023133NM—019120原4丐粘着蛋白卩80.022134NM—004274A激酶(PRKA)锚蛋白60.019含三核苷酸重复11135NM—005120(THR相关蛋白，230kDa亚基)0.018136NM—019226动力蛋白，细胞质的,重链10.015137NM—031819FAT肺瘤抑制因子(果蝇)同源物0.008138NM—001036蓝诺定受体30.005Ahal，热休克卯kDa蛋白腺苷三磷酸酶同源物1139NM一012111激活因子(酵母)0.150.34实施例2:CFTRi普关联(CFTRSpectralinkage)从蛋白质相互作用组观察的大量相互作用(wealthofinteractions)(参见实施例1),从ER中输出AF508的缺陷的基础是通过了解最普通的CF的形式的方法来考察的。响应于Phe508缺失的蛋白质折叠能量学上的改变(Sekijima等，2005,Cell121,73-85;Strickland和Thomas,1997,JBiolChem272,25421-25424)导致AF508CFTR偶联到COPII出芽系统的失败(COPIIbuddingsystem)(Wang等,1998，FEBSLett427，103)，导致ER相关的降解(ERAD)(Nishikawa2005,JBiochem(Tokyo)137,551)。现在认为通过ERAD(Sekijima等，2005，同上)途径显著地影响CFTR折叠的分子伴侣成分包括在ER的腔内存在的钩联接蛋白(Farinha和Amaral,2005,MolCellBiol25,5242;Okiyoneda等，2004,MolBiolCell15,563;Pind等，1994，JBiolChem269,12784)，以及胞质分子伴侣复合物Hsc-Hsp70/40和Hsp卯(Albert等，2004,MolBiolCell15,4003;Amaral,2004,同上;Loo等，1998,EmboJ17,6879;Meacham等，1999,EmboJ18,1492;Meacham等，2001,NatCellBiol3,100;Strickland等，1997,JBiolChem272,25421;Younger等，2004，同上)。与这些结果相一致的是，依据回收的整体谱(参见如表7),表达野生型CFTR的细胞的蛋白质组(参见如图1)显示了与钙联接蛋白、Hsc-Hsp70/40和Hsp卯胞质内分子伴侣的强大关联。这些分子伴侣组分很有可能定义有助于野生型CFTR折叠的核心系统(图2),如同对其他蛋白质已经观察到的那样(McClellan等，2005,NatCellBiol7,736-741)。结果显示，依据回收的整体谱(参见如表7),表达野生型CFTR的细胞的蛋白质组(参见如图1)显示了与4丐联接蛋白、Hsc-Hsp70/40和Hsp卯胞质内分子伴侣的强大关联。这些结果与如下的报道一致现在认为会通过ERAF(Sekijima等，2005,同上)途径显著影响CFTR折叠的分子伴侣成分包括在ER腔内发现的钙联接蛋白(Farinha和Amaral,2005,同上；Okiyoneda等，2004,同上；Pind等，1994,JBiolChem269，12784-12788),以及胞质内的分子伴佔复合物Hsc-Hsp70/40和Hsp90(Albert等，2004,同上；Amaral，2004，同上；Loo等，1998,同上；Meacham等，1999,同上；Meacham等，2001,同上；Strickland等，1997,同上；Younger等，2004,同上)。这些分子伴侣组分很有可能定义了有助于野生型CFTR折叠的核心系统(参见如图2A),如同对于其他蛋白质已经观察到的那样(McCldlan等，2005，同上)。Table9.CFTRER相关折叠蛋白质组*AF508CFTR野生型CFTR参考序列％序列％序列AC蛋白质名称覆盖率独特整体覆盖率独特整体ABCABCNM—000492CFTR57NM一024351Hsc7060NM——022310GRP78#40NM—021979Hsp70-216NM_001746钙联接蛋白#16NM—008302Hsp，36恵010481GRP753422924816033341726636948391323085331737235787171352104724492111182340NM—005348Hsp90392437645NM一022934DnaJ样蛋白Hsp40陽Al341135NM_001539卿)311033401325NM—005345Hsp70-1A191220846NM_004282BAG-2Hsp40-A2287201022NM—005880,)3291928616NM_—002155Hsp70B'1081433NM一013559Hspl05106NM—013686TCP110393NM一—010223FKBP38174NM—013863BAG-3124丽一016737Hop1144NM——016742Cdc3782NM—■942亲环蛋白B#1322丽一006601p231622NM一012111Ahal15715341020NM—009037网钓结合蛋白#网钧结合蛋白2758501419NM——0119922#93422612NM001219钧腔蛋白#7;33*表示的是在检验的细胞系中如通过质谱检测(图1)，BHK细胞中相互作用的蛋白质，它们的百分比序列覆盖率(A),独特谱的数目(B)和整体谱的数目(C)。"ER腔内分子伴侣。实施例3:CFTR和AF508的定位和相互作用为了鉴定蛋白质相互作用组中AF508偶联到ER输出系统失败所涉及的成分，将从BHK细胞免疫沉淀的野生型和AF508CFTR蛋白质组进行比较。将不表达CFTR的亲本BHK细胞系用作非特异性相互作用的阴性对照(参见如图2)。图2是对ER折叠网络的一系列的描述。表8显示了蛋白质阵列的结果，这些蛋白质是从不表达CFTR的BHK细胞(对照)或那些表达AF508或野生型CFTR的细胞中用MudPIT回收的，并通过质谱以分级序列覆盖率的顺序排列。图2A的草图描述的是包含CFTR的ER折叠和降解的蛋白质组网络的复合视图(compositeview)。浅灰边界表示与CFTR潜在的直接或间接相互作用；深色边界表示依据来自HPRD、BIND和IntAct蛋白质相互作用数据库的数据已知的成分之间的物理相互作用。浅绿色圈表示核心折叠分子伴侣；浅粉色圈表示调控性辅分子伴侣和ERAD成分。图2B的SDS-PAGE免疫印迹图像显示的是在表达野生型和AF508CFTR的细胞中观察到的条带B和C典型的稳态水平。更多的方法学信息请参见实施例1。对于SDS-PAGE和免疫印迹，细胞用500|il冰冷的PBS洗两次并通过加入添加了1%TritonX-100和每ml裂解緩冲液2mg的蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Pierce)的45jal新鲜制备的TBS(50mMTris-HClpH7.0,150mMNaCl)来裂解，在冰上温育30分钟，不时搅动。收集裂解物，在16,000xg,4。C下离心20分钟并收集上清做蛋白质浓度分析。裂解物(每条泳道蛋白质总量25jug)通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素(nitrocellulose)膜上作Western印迹分析。将肌动蛋白的免疫印迹(Chemicon,Temecula,CA)用作针对样品上样一致性的额外内在对照(未显示)。CFTR是用针对在第二核苷酸结合结构域C末端处的表位的单克隆抗体(M3A7腹水)(Kartner等，1992)来检测的。p23用p23腹水(JJ3，Abeam,Cambridge,MA)来检测，HOP用兔多克隆血清来检测，FKBP8用兔多克隆血清来检测，而Ahal用兔Ahal多克隆血清来检测。同样用到的是针对疱疹口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)C末端胞质尾区的单克隆抗体(P5D4)。每个感兴趣的蛋白的量通过使用AlphalnnotechFluorochemSP(Alphalnnotech,SanLeandro,CA)的光密度法来量化。实验均以一式三份进行，平均值和平均值的标准差是用不配对双尾T检验(unpairedtwo-tailedt-test)得到的。结果显示，在生理温度(37。C)下，野生型CFTR主要(〉80-90%)在条带C中，条带C是细胞表面存在的经过高尔基体处理的糖形(glycoform),而在条带B中检测到其余的CFTR,条带B是与ER相关的核心糖基化的糖形(参见如图2B)。与之相反的是，37。C表达AF508的细胞中，由于显著降低的为了输出的折叠和稳定性，通常只有5-20%的蛋白质(反映细胞类型和生长状况)可以在条带C中检测到。在这种情况下，蛋白质很大程度上限制在未成熟的核心糖基化的条带B的ER糖形(参见如图2B),其中将所述蛋白定向到ERAD(Jensen等，1995,Cell83,129-135;WardandKopito，1994,JBiolChem269,25710-25718;Ward等，1995，Cell83,121-127)。除了很可能包含在ERAD中的成分(表6),ER折叠蛋白质相互作用组(参见如图2A)揭示了AF508也像野生型CFTR—样，显示出与腔钩联接蛋白和胞质的Hsc-Hsp70/40和Hsp90胞质成分的强烈相互作用(参见如表7)。这些结果说明，AF508与指导野生型CFTR折叠的核心系统相互作用(参见如图2A)。实施例4:在AF508ER蛋白质相互作用组中的Hsp卯辅分子伴侣成分分析AF508ER蛋白质相互作用组中Hsp90辅分子伴侣成分的存在性。多种主顾蛋白的Hsp90依赖性折叠受到辅分子伴侣的瞬时调控(Picard,2002,CellMolLifeSci59，1640-1648;Young等，2003,同上;Young等，2001，同上)。以往的研究已经显示，AF508的折叠是动力学上受损的(Qu等，1997,JBioenergBiomembr29,483-490;Qu等，1997,JBiolChem272,15739-15744;Qu和Thomas,1996,JBiolChem271,7261-7264)。因此，可以预计，在AF508蛋白质相互作用组中存在的蛋白质会包括那些与对Phe508缺失敏感的折叠中间物相关的蛋白质，所述折叠中间物可能响应于折叠途径中的动力缺陷而积累。结果显示，AF508ER蛋白质相互作用组中许多Hsp90辅分子伴侣成分通常在野生型蛋白质组中^r测不到(参见如图2A)。这一发现与对AF508中Phe508缺失敏感的折叠中间物积累的预测相一致。通常在野生型蛋白质组中检测不到的AF508ER蛋白质相互作用组中的Hsp90辅分子伴侣成分包括了Hsc-Hsp70/Hsp90组织蛋白(HOP)、p23、Cdc37、抑免蛋白FKBP8和Ahal。已经研究了Hsp90辅分子伴侣作为Hsp90-主顾相互作用的调控因子调节亚稳定的主顾蛋白折叠的作用，所述主顾蛋白包括类固醇激素受体(SHR)和信号转导激酶(Wegele,等，2004,同上)。检测到的其它分子伴侣调控因子包括BAG-2/3,已经研究了这些调控因子在调节CFTR降解过程中的Hsc-Hsp70功能(Amdt等，2005,MolBiolCell;Dai等，2005,JBiolChem280,37634)、Hspl05和折叠分子伴侣TCP1中的功能。Hsc-Hsp70/40、Hsp90和有可能包含在它们的调控中的蛋白质之间已知的相互作用网络阐明了用于ER输出的AF508和野生型CFTR折叠路径的潜在的复杂性(参见如图2A)。实施例5:HEK293细胞中辅分子伴侣对AF508折叠的影响稳定表达AF508的HEK293细胞中关键辅分子伴侣调控因子p23的作用(Pratt和Toft,2003，ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003,CurrCancerDrugTargets3,301-323;Wegele等，2004,同上)在几个温度下进行了测定。P23与HOP和FKBP8—起在环状的Hsp90-主顾相互作用途径中影响ATP依赖性的折叠步骤。为了开始确定Hsp卯在AF508CFTR折叠和输出中的作用，使用dsRNA和瞬时转染来控制选^:的影响环状Hsp90-主顾相互作用途径中ATP依赖性折叠步骤的Hsp90辅分子伴侣的表达，所述辅分子伴倡包括p23(参见实施例5)、HOP(参见实施例6)和FKBP8(参见实施例7)。在Hsc-Hsp70/40复合物识别例如CFTR的主顾分子之后，遍在的辅分子伴侣HOP将新生的Hsc-Hsp70/40-主顾复合物连接到Hsp90(Johnson等，1998,JBiolChem273,3679-3686)。然后，辅分子伴侣调控因子p23在ATP存在的情况下取代Hsc-Hsp70/40和HOP而形成成熟的ATP结合状态下的Hsp90-p23-主顾复合物(Wegele等，2004,同上)。包含p23的Hsp90-主顾复合物的循环由抑免蛋白调控(Johnson和Toft,1994,JBiolChem269,24989-24993;Wu等，2004,ProcNatlAcadSciUSA101,8348-8353)。在原型Hsp卯主顾蛋白类固醇激素受体(SHR)(Pratt和Toft,2003,ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003，同上)的情况下，抑免蛋白FKBP52的缺失使中间物Hsp90-主顾辅分子伴侣复合物去稳定而阻止了激素的装载(Cheung-Flynn等，2005,MolEndocrinol19,1654-1666)。将HEK293细胞保持在如上所述的添加10%FBS和Pen/Strep的DMEM中。稳定表达AF508CFTR的HEK293细胞保持在如上相同的培养基加150jag/ml潮霉素B中。用dsRNA和瞬时转染控制p23的蛋白质表达水平。从ATCC(Manassas,VA)购买p23的cDNA克隆并将其亚克隆到pcDNA表达载体，并且通过DNA测序分析炎症编码区的序列。dsRNA溶液如下制备在12孔皿的每个孔中混合血清和无抗生素的DMEM或MEM-a，DMEM或MEM-a含有工作浓度为0.6|LiM的所示dsRNA(人p23,Ambion(Austin,TX)目录号16704ID18391)，和6|il的HiPerFect(Qiagen,Valencia,CA)。将对照dsRNA(Dharmacon目录号CONJB-000015)按照与测试dsRNA相等的浓度加入。将dsRNA混合物(100iil)加入以终浓度50nM加入含有1.1ml合适培养基的小室中，在37。C/5。/。C02条件下培养48小时。此培养完成之后，将培养液除去并替换为1.1ml新鲜的完全培养基和100pl新鲜制备的dsRNA溶液并在37°C/5%C02条件下再培养33小时。如有说明，接下来将细胞转移到30。C/5%C02培养器或保持在37。C/5%C02条件下继续培养15小时。人p23的过量表达是如前所述通过痘苗病毒的感染用表达CFTRAF508和p23的质粒共转化HEK293来进行(Wang等，2004,同上)。对于在许可温度下分析的样品，将细胞在收获之前转到30。C培养15小时。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。图3是描述Hsp90辅分子伴侣p23对AF508的折叠和从ER中输出的影响的一系列条线图。图3A是一对显示ER糖形AF508(B)、细胞表面糖形AF508(C)和p23表达的稳态池的百分比最高水平的条线图。使用针对p23的人dsRNA(左侧小图)来降低37。C下所示蛋白质的表达。用乱序的dsRNA(scrambleddsRNA)作为对照。使用针对p23的人dsRNA(右侧小图)在37。C下过量表达所示蛋白质。嵌入的小图是ER糖形(条带B)和细胞表面糖形(条带C)的稳态池的SDS-PAGE免疫印记图像。使用免疫印迹测定条带B和C的稳态池。图3B是如图3A所描述的，除了细胞是在许可温度(30。)下培养以促进折叠和从ER中输出。星号("表明统计学显著性(p^).05)。将实验以一式三份独立地重复至少三次并显示代表性的结果。更多的方法学信息请参见实施例5。结果显示，dsRNA使p23水平降低70%导致条带B的ER糖形的稳态池和条带C的细胞表面糖形的小池相对于乱序的模拟对照均有相当的(60-70%)减弱(参见如图3A,左侧小图)。相反，过量表达(3-5倍)部分地稳定了条带B,但是没有造成条带C的显著增加(参见如图3A,右侧小图)。有趣的是，dsRNA使p23水平降低对于HEK293野生型CFTR条带B和C的稳定性具有相似的影响(未显示)，说明p23影响正常折叠的动力学。由于AF508CFTR是温度敏感的折叠突变体(Denning等，1992，Nature358,761-764)，细胞在许可温度(30。)而非37。C培养时可提供能量学上更有利的折叠环境，导致显著水平的定位于细胞表面的AF508。结果显示，在稳态(从37。C到30。C温度转换之后的15小时)，HEK293细胞中总AF508池的40-50%通常存在于条带C中(Denning等，1"2,同上)(参见如图3B,左侧小图)。很明显地，即使在许可折叠温度(30。C),dsRNA引起的p23减少也会造成条带B的稳定性和对条带C的加工的显著减低(参见如图3B,左侧小图)。在30。C,过量表达对条带B没有影响，但却阻止了对条带C的加工(参见如图3B,右侧小图)。对于其它Hsp90依赖的信号途径，已经观察到p23过量表达具有类似的显著的负面影响，反映了对成熟的主顾复合物的过度稳定化(Pratt和Toft,2003,同上)。因此，与对野生型CFTR的影响相一致，p23是在限制和许可折叠条件下均会影响ERAF508稳定性的折叠调控成分。这些结果强调了局部分子伴侣环境对动力学受损的AF508折叠的潜在的不同作用。实施例6:辅分子伴侣FKBP8在HEK293细胞的AF508折叠中的影响对稳定表达AF508的HEK293细胞中辅分子伴侣调控因子FKBP8的作用进行了研究。虽然SHR折叠中涉及的FKBP52(Cheung-Flynn等，2005,同上)在AF508CFTR蛋白质组中未能得到鉴定，但却检测到了抑免蛋白家族成员FKBP8(Nielsen等，2001，Genomics83,181-192;Pedersen等，1999,Electrophoresis20,249-255)。FKBP8是膜相关的抑免蛋白，已有报道其同时定位于线粒体和ER(Kang等，2005，FEBSLett579，1469-1476;Shirane和Nakayama,2003,NatCellBiol5，28-37;Weiwad等，2005,FEBSLett579,1591-1596)。用dsRNA和瞬时转染控制FKBP8的蛋白质表达水平。从ATCC(Manassas,VA)购买FKBP8的cDNA克隆并将其亚克隆到pcDNA表达载体，并且通过DNA测序分析验证编码区的序列。dsRNA溶液如实施例5制备'但使用人FKBP8，Ambion目录号16704ID45182。人FKBP8的过量表达如前所述通过痘苗病毒的感染用表达CFTRAF508和FKBP8的质粒共转化HEK293来进行(Wang等，2004,同上)。对于在许可温度下分析的样品，将细胞在收获之前转到30°C保持15小时。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。图4是描述Hsp90辅分子伴侣FKBP8对AF508的折叠和从ER中输出的影响的一系列条线图。图4A是一对显示ER糖形AF508(B)、细胞表面糖形AF508(C)和FKBP8表达的稳态池的百分比最高水平的条线图。使用针对FKBP8的人dsRNA(左侧小图)来降低37。C下所示蛋白质的表达。将乱序的dsRNA作为对照。使用FKBP8的人cDNA(右侧小图)在37。C过量表达所示蛋白质。嵌入的小图是ER糖形(条带B)和细胞表面糖形(条带C)的稳态池的SDS-PAGE免疫印记图像。图4B(B)是如图4A所描述的，除了细胞是在许可温度(30。)下温育以促进折叠和从ER中输出。星号(*)表明统计学显著性(p$0.05)。将实验以一式三份独立地重复至少三次并显示代表性的结果。更多的方法学信息请参见实施例6。结果显示，FKBP8与ER标记蛋白4丐联接蛋白有实质性的重叠(未显示)，这一结果与以前的才艮道相一致。与p23dsRNA的作用相似，^L察到了在37°C响应于dsRNA使FKBP8的减少，AF508显著地去稳定化(参见如图4A,左侧小图)。有趣的是，37。C时的过量表达也使CFTR去稳定化(参见如图4A,右侧小图)，提高了FKBP8的功能与Hsp90稳态浓度相关的可能性。与之相反，30°C时dsRNA导致的FKBP8表达的减少降低了(30-40%)AF508CFTR的稳定性，和相应的条带C水平的降低(-50。/。)(参见如图4B，左侧小图)，因而30。C时的过量表达仅对稳定性有中等的影响，但它却干扰条带C的加工(参见如图4B,右侧小图)。这些结杲说明Hsp90辅分子伴侣FKBP8像p23—样作为折叠调制因子控制ER中AF508的稳定性。这些结果强调了局部分子伴侣环境对动力学受损的AF508折叠的潜在的不同作用。实施例7:HEK293细胞中辅分子伴侣HOP对AF508折叠的影响对稳定表达AF508的HEK293细胞中辅分子伴侣调控因子HOP的作用进行了研究。用dsRNA和瞬时转染控制HOP的蛋白质表达水平。从ATCC(Manassas,VA)购买HOP的cDNA克隆并将其亚克隆到pcDNA表达载体，并且通过DNA测序分析验证编码区的序列。dsRNA溶液如实施例5制备，但使用人HOP,Ambion目录号16704ID18719。人HOP的过量表达如前所述通过痘苗病毒的感染用表达CFTRAF508和HOP的质粒共转化HEK293来进行(Wang等，2004,同上)。对于在许可温度下分析的样品，将细胞在收获之前转到30°C保持15小时。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。图5是描述Hsp90辅分子伴侣HOP对AF508的折叠和从ER中输出的影响的一系列条线图。图5A是一对显示ER糖形AF508(B)、细胞表面糖形AF508(C)和HOP表达的稳态池的百分比最高水平的条线图。使用针对HOP的人dsRNA(左侧小图)来降低3。C下所示蛋白质的表达。用乱序的dsRNA作为对照。使用针对HOP的人dsRNA(右侧小图)在3"C下过量表达所示蛋白质。嵌入的小图是ER糖形(条带B)和细胞表面糖形(条带C)的稳态池的SDS-PAGE免疫印记图像。图5B是如图5A所描述的，除了细胞是在许可温度(30。)下温育以促进折叠和从ER中输出。星号("表明统计学显著性(pS0.05)。将实验以一式三份独立地重复至少三次并显示代表性的结果。更多的方法学信息请参见实施例7。结果显示，与dsRNA导致p23和FKBP8二者减少的作用相反，HEK293细胞中观察到响应于dsRNA的HOP最大量的减少(40-60%)对条带B的稳定性或条带C的水平产生极少改变(参见如图5A,左侧小图)，而过量表达(4倍)部分地使B和C二者去稳定化(参见如图5A,右侧小图)。同样，在30。C时HOP的dsRNA不影响AF508的折叠或输出(参见如图5B，左侧小图)。但是，过量表达将蛋白质显著地去稳定化说明，在许可折叠条件下与Hsc-Hsp70/40延长的联系倾向于靶向降解(参见如图5B，右侧小图)。这些结果说明，HOP有助于降解中AF508CFTR和Hsc-Hsp70/40功能的连接(Amdt等，2005，同上；Meacham等，1999,surpa;Meacham等，2001,同上；Younger等，2004，同上)。这些结果强调了局部分子伴侣环境对动力学受损的AF508折叠的潜在的不同作用。实施例8:HEK293细胞中辅分子伴侣Ahal对AF508折叠的影响对稳定表达AF508的HEK293细胞中辅分子伴侣调控因子Ahal的作用进行了研究。最新鉴别的Hsp90辅分子伴侣家族的成员是Ahal。Ahal结合到Hsp卯的中部结构域(middledomain),并且提出其功能为调控Hsp90的ATP循环的腺芬三磷酸酶激活蛋白(Harst等，2005,BiochemJ387,789-796;Mayer等，2002,MolCell10,1255-1256;Meyer,2004，EmboJ23,1402-1410;Meyer等，2003，MolCell11,647-658;Pa騰tou等，2002,MolCell10,1307-1318;Siligardi等，2004，JBiolChem279,51989-51998)。用dsRNA和瞬时转染控制Ahal的蛋白质表达水平。Ahal的cDNA克隆通过PCR使用C-末端"^c-标签来扩增，并克隆到pCDNA3.1+,序列通过测序进行确认。dsRNA溶液如实施例5那样制备，但12孔皿的每个孔中使用2(iM人Ahal,两种dsRNA(Dharmacon,Lafyette,CO)各使用1pM，所述两种dsRNA是针对人Ahal序列attggtccacggataagct(SEQIDNO:9;mRNA转录物SEQIDNO:12)和gtgagtaagcttgatggag(SEQIDNO:10;mRNA转录物SEQIDNO:18)的两种dsRNA,以及6jul的HiPerFect(Qiagen,Valencia,CA)。加入与AhaldsRNA相等浓度的对照dsRNA(Dharmacon目录号CONJB-000015)。人Ahal的过量表达如前所述通过痘苗病毒的感染用表达CFTRAF508和Ahal的质粒共转化HEK293来进行(Wang等，2004,同上)。对于在许可温度下分析的样品，将细胞在收获之前转到30。C保持15小时。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。图6是表明AF508向细胞表面的输出可以通过减量调节功能性Ahal来重建的一系列条线图。图6A是一组显示ER糖形AF508(B)、细胞表面糖形AF508(C)和Ahal表达的稳态池的百分比最高水平的条线图。在表达AF508的HEK293细胞中，分別用人的AhaldsRNA(左侧小图)或人的AhalcDNA(右侧小图)在3"C(上方小图)或30。C(下方小图)来减少或过量表达Ahal。嵌入的小图是ER糖形(条带B)和细胞表面糖形(条带C)的稳态池的SDS-PAGE免疫印记图像。图6B是如图5A所描述的，除了是用人AhaldsRNA在37°C(左侧小图)或30°C(右侧小图)在表达AF508的CFBE"o-细胞中减少Ahal表达。星号(*)表明是用非配对双尾t检验(一式三份样品)得到的统计学显著性(p^).05)。一式三份显示的代表性结果来自四个独立的实验。更多的方法学信息请参见实施例8-9。结果显示，HEK293细胞中Ahal内源性水平由于dsRNA引起的50-70%的减少导致AF508条带B明显的3到4倍的稳定化(参见如图6A,左上小图)。在30。C观察到甚至更显著的稳定化(4到5倍)(参见图6A，左下小图)。不可思议的是，在37。C和30。C，稳定化伴随着条带C的相应增加，反映了显著的细胞表面递送(参见图6A，左侧小图)，这是在其他辅分子伴侣中未观察到过的结果(参见如图3-5)。因为Hsp90辅分子伴侣的表达水平能够影响AF508在许可(30。C)和限制(37。C)折叠温度下的折叠和输出，所以AF508CFTR可能是响应于通常有助于野生型CFTR折叠的内源胞质Hsp90分子伴侣的汇集，在动力学上陷于途径中亚稳定的折叠状态(cm-pathway,metastablefoldedstate)。重建的条带C对内切糖苷酶H的加工有抗性(未显示)，这是通过高尔基复合体转运的特点。与dsRNA的影响相反，在表达AF508的HEK293细胞中Ahal的过量表达(4倍)在37°C(-60%)和30°C(>卯％)均使条带B显著地去稳定化，并伴随着对条带C的加工的相应缺失(参见如图6A，右侧小图)。在这些情况下，没有检测到Hsc-Hsp70或BIP总体池的变化，表明不太可能是由Ahal的适度減少诱导了一般性的ER应激(Schroder和Kaufman,2005,AnnuRevBiochem74,739-78)(结果未显示)。以Hsp90在已知折叠途径中的动力学作用(Wegele等，2004,同上；Pratt和Toft,2003,ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003,同上)类推，以上结果说明，通过与辅分子伴侣相继的相互作用调节CFTR主顾与Hsp卯的相互作用可以暂时协调结构域内的折叠和/或协调结构域间的折叠，以在实现野生型构象的过程中避免ERAD。对协调结构域内和结构域间折叠的需要与AF508不能实现NBD1和TMD1恰当的结构域间相互作用来产生稳定折叠这一事实一致(Riordan,2005，同上；Du等，2005,NatStructMolBiol12，17-25)。另夕卜，同样因TMD2的合成暂时分开的NBD2结构域(Riordan,2005,同上)在表达AF508CFTR的细胞中错折叠，而且必须与NBD1结构域二聚化来为通道功能激活核酸结合袋结构(pocket)之一(Lewis,2004,EmboJ23，282-293)。AF508折叠途径中停滞的(stalled)中间物很可能是聚集某些成分的靶，这些成分例如CHIP和它们的结合Hsc-Hsp70/40复合物并将CFTR定向到ERAD的调控因子HsBPl和Bag-l/2(Alberti等，2004,MolBiolCell15，4003-4010,;Meacham等，2001,同上)。现在很有可能的是，有关Hsc-Hsp70/40和Hsp90二者的特异调控因子和辅分子伴侣成分的相对丰度和有可能的话其平衡性显著地影响野生型和AF508CFTR为了从ER输出而折叠的能力。这一结论与通常的观察一致，即AF508的ER稳定性和细胞表面可用性在不同的细胞类型之间是高度变化的。实施例9:CFBE41o-细胞中辅分子伴侣Ahal对AF508折叠的影响由于HEK293细胞通常不表达AF508，从而可以代表对Ahal活性水平由独特敏感性的特殊情况(参见实施例8),因此在一种表达内源水平AF508的肺细胞系(CFBE41o-)中对37°C下AhaldsRNA的影响作了研究。将来自CF患者的AF508CFTR纯合的人支气管细胞系CFBE41o-和修正的HBE细胞系保持在补充有10%FBS、Pen/Strep、2mM额外的谷氨酰胺和2jig/ml噤呤霉素的MEM中。dsRNA的制备和转染、dsRNA溶液和Ahal的过量表达如实施例8中所述。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。与在HEK293细胞中观察到的结果类似，Ahal的减少导致在37。C(参加如图6B,左侧小图)或30。C(参见如图6B,右侧小图)与乱序的对照相比条带B的稳定化(-4-倍(mold))，和条带C相应的4到5倍的增加，这一水平高于在表达野生型CFTR的CFBE41o-细胞系(HBE)中观察到的水平(Bmscia等，2002,GeneTher9,683-685)(见下)。表达AF508的CFBE41o-中的脉冲追踪分析揭示了在输出到细胞表面之前条带B在ER中2-3倍的稳定化(未显示)。相反，用脉冲追踪分析没有观察到AhaldsRNA对野生型CFTR的稳定化作用(未显示)或使用HBE细胞系的条带C的稳态细胞表面水平说明AF508突变体需要对内源性Ahal池的调整来促进更高效的输出。条带B的稳定化和响应于改变的Ahal水平的AF508条带C的恢复说明，降^^的Ahal活性可能调控Hsp90分子伴侣动力学来促进AF508与COPIIER输出系统的偶联。实施例10:沉默Ahal的siRNAi殳计用于靶向Ahal基因的候选shRNA序列是从来自Ambion的搜索工具(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)获得的。用hAhal的cDNA序列(Ensembl登录号ENSG00000100591)生成示例列表。这些序列提供少于50%的GC含量并且避免4个或更多个的连续G或C。表1提供了完整的列表。每个shRNA都针对人基因组进行了BLAST已鉴别可能在其他基因中的耙外位点。对选出的3个具有约40%的GC含量并在其他基因中基本上没有輩巴外位点的dsRNA进行了选择99(SEQIDNO:12)、179(SEQIDNO:18)和256(SEQIDNO:24)。这3个19碱基对的序列中每一个都不含有多于15个的与任何其他基因的任何5，或3，未翻译区域、内含子或外显子连续同一的位点(consecutiveidentity)。将这3个基因克隆到pSilencer载体(Ambion)产生hAhal表达降低的稳定Hela细胞系。为本文提供的实验生成对应于以上序列99和179的dsRNA(DharmaconandQiagen)。实施例11:表达AF508的CFBE41o-细胞中Aha1dsRNA对卣化物电导的影响由于对抗endoH(内切糖苷酶H)的条带C糖形的加工是从ER转运到高尔基体内侧区室(cis/medialGolgicompartment)的标志(参见如实施例8-9)，重建的蛋白质陷于晚期高尔基体外区室或胞内区室(latetransGolgiorendocyticcompartment)是可能的，反映了在后ER途径中Phe508缺失对不正常分选的意料之外的贡献(参见如图1)(Gentzsch等，2004a;Sharma等，2004;Swiatecka-Urban等，2005)。为了测试这种可能性，用AhaldsRNA处理表达△F508的CFBE41o-细胞并用碘外流测定法(iodideeffluxassay)(Loo等，2005,同上)来检测表面卣化物电导。作为正对照，对表达野生型CFTR的修正HBE细胞系的卤化物电导进行了测定。在石典外流测定法中，将野生型和AF508CFBE41o-细胞以每60mm皿5.0x105个细胞的密度^#，在如上所列的环境下培养5天并每2天更换培养液。用每60mm皿20)il的HiPerFect(Qiagen)如上所述进行dsRNA处理。在碘外流分析之前将CFBE41o-细胞转换到30°C的许可温度保持15小时(Hughes等，2004)。用上样缓冲溶液(136mMNal;3mMKN03;2mMCa(N03)2;20mMHepes和11mM葡萄糖)洗细胞5次并用2.5ml上样緩冲溶液在室温下温育l小时。然后将细胞用外流緩冲溶液(136mMNaN03;3mMKN03;2mMCa(N03)2;20mMHepes和11mM葡萄糖)洗15次，用2.5ml外流緩冲溶液在室温下温育1分钟并将培养液收集做分析。将此温育重复总共4分钟。然后将细胞与2.5ml刺激缓冲溶液(含有10毛喉素(Sigma)和50iiM染料木黄酮(Sigma)的外流緩冲溶液)在室温下温育l分钟并收集培养液做分析。将此温育重复总共4分钟。其后用2.5ml外流缓沖溶液在室温下温育1分钟并将培养液收集做分析。将此温育重复总共12分钟。用碘选择性电才及(AnalyticalSensors&Instruments)牙口Beckmanmodel360pHi十(VWR)只十才羊品中的橫含量进行分析。收集的培养液中碘的量通过从已知Nal浓度的标准曲线的推算得到。SDS-PAGE和免疫印迹如实施例3所述。图7是显示CFBE41o-细胞系中dsRNAAhal对石典外流影响的点线图和条线图。图7A是描述碘随时间外流的点线图。在以下细胞中检测碘外流转染了Ahal(空心圆圈)或乱序的(空心方框)dsRNA的表达野生型CFTR的HBE细胞中(实心方框)或在37°C或如有说明为在30°C的许可温度(最后15小时)下培养的表达AF508的CFBEWo-细胞中(实心圓圈)。CFTR通道通过从1分钟起在历时4分钟的时间段内加入10pM毛喉素和50|iM染料木黄酮来激活，然后用外流緩冲溶液洗出。嵌入的小图中显示了温度转换和dsRNA对CFTR成熟(从条带B到条带C的糖形)和Ahal稳定性的影响。图7B是描述加入毛喉素/染料木黄酮之前(0分钟)和第2分钟时卣素外流峰值期的卣素电导比率的条线图。星号C)显示温度^f多正的(泳道a)和dsRNA处理的(泳道c)CFBE41o-细胞与乱序的dsRNA处理的对照(泳道b)之间用非配对双尾t检验(一式三份样品)得到的统计显著性(p^).05)。温度修正的(泳道a)和dsRNA修正的CFBE41o-细胞(泳道c)的卣素电导率之间没有统计学上显著的区别(p=0.2)。将实验独立地重复至少三次并显示代表性结果。更多方法学信息，参见实施例10。结果显示，用AhaldsRNA处理CFBE41o-细胞系产生70-80。/o内源性Ahal的敲低(knock-down)，导致AF508条带B和C在30°C时相对于温度修正的对照有1.5倍的稳定化，并且条带B相对于乱序的dsRNA处理的细胞有4倍的稳定化(参见如图7A，嵌入的小图)。尽管HBE细胞显示了很强的囟素电导率，但在用乱序的dsRNA处理的对照CFBE41o-细胞中没有检测到电导率(参见如图7A)。CFBE41o-转换到30°C导致HBE细胞中观察到80-90%电导率的恢复(参见如图7A)。不可思议的是，用dsRNA而不是乱序的处理的CFBE41o-细胞与温度修正细胞中观察到的卣素电导率相比显示50-80%卣素电导率的恢复(参见如图7B)。这些结果证明Aha1dsRNA可恢复表达AF508的CFBE41o-细胞的卣素电导率，因而获得CFTR的功能重建。图8是描述指导CFTR折叠的Hsp90分子伴侣/辅分子伴侣相互作用的一系列图示。图8A是强调参与野生型和AF508CFTR折叠的成分的图示。它们包括腔内分子伴侣(l),和包括核心成分Hsc-Hsp70/40(2)和Hsp90(3),以及许多Hsp70/40(2)和Hsp90(3)辅分子伴侣调控因子的双态胞质系统(two-statecytosolicsystem)。其他分子伴侣如TCP1(Spiess等，2004,同上)和Hspl05/S100(3a)也可能对折叠有利。这些蛋白质相互作用中的一个或多个受到Phe508缺失在动力学上的破坏，这导致Hsp90腺苷三磷酸酶循环的破坏和CF的病生理。图8B是Hsp90和辅分子伴侣在AF508CFTR的折叠和重建中的潜在作用的阐述。调控为了通过ERAF输出或定向于ERAD的折叠的ATP/ADP循环能够由辅分子伴侣调控因子(X和Y)动态控制来对折叠途径的动力学和能量学调节分子伴倡循环的动力学。例如，通过dsRNA(X)对Ahal腺苷三磷酸酶活性的减量调节会通过降低Hsp90腺苷三磷酸酶活性而倾向于为了输出的AF508稳定化，而p23(Y)的减量调节将倾向于导致ERAD的去稳定化。图8C是阐明以下三者关系的图示胞质中(辅)分子伴侣浓度(X轴)，由全局蛋白质能量学定义的假定的"折叠稳定性分数"(Sekijima等，2005,Cell121,73-85)(Z轴)和反映转运到细胞表面的水平的"输出效率，，(Y轴)。尽管能量学上更稳定的野生型CFTR(虚折线)响应于由正常Ahal浓度引起的CFTR分子伴侣的折叠活性(有格栅的方框，"正常分子伴侣，，)，AF508减弱的折叠能量学(左侧实线曲线)在此折叠环境中不稳定而未能输出。减量调节Ahal(灰色方框，"拯救分子伴侣，，)提供的Hsp90ATP/ADP循环的设定点的改变通过调节分子伴侣折叠能力(格栅方框)对AF508的折叠(左侧曲线)提供了更有益的解决方案(productivesolvent),而保持了野生型CFTR折叠的功能性(右侧实线曲线，格栅方框)。格尔德霉素(GA),—种Hsp90抑制剂，通过直接与Hsp90结合并阻滞折叠循环来阻止野生型和AF508CFTR的折叠和输出(左下角)(Loo等，同上)。作为总结，以上结果显示，突变CFTR的内在折叠缺陷在动力学上与Ahal敏感的Hsp90腺苷三磷酸酶循环的活性相联系。从本文的结果发展而来的工作模式强调环境敏感的从正常细胞折叠途径的解偶联(uncoupling)。这样看来，控制Hsp90-主顾复合物相互作用的Hsp90ATP/ADP循环的内在速率与通过辅分子伴侣活性折叠野生型CFTR的能量学相配合。尽管推动野生型CFTR输出的折叠能量学相对于正常的细胞分子伴侣池得到了优化(图8),Ahal和潜在的其他辅分子伴倡的活性变化可以改变这些(图8)和分子伴侣折叠/输出途径的容量。在Ahal的情况下，Hsp90腺苷三磷酸酶活性的降低可以给动力学上有缺陷的AF508突变体更多时间(图8)以使用"拯救，，分子伴侣池(图8)以有助于稳定性和为了输出的折叠。因为Ahal池的部分减少不会显著地削弱能量上更稳定的野生型折叠(图8),这些结果强调了Phe508缺失的折叠能量学可能在正常的分子伴侣的折叠范围之外。独特的局部分子伴侣聚集可以调控折叠的能力与最近的观察是一致的，即现在发现折叠分子伴侣可以调控特定的胞内蛋白质折叠途径(Albanese等，2006,Cell124，75-88),而不仅是具有蛋白质聚集的抑制剂作用(Wickner等，1999，Science286,1888-1893)。从进化的角度来看，遗传修饰剂(Qu和Thomas,1996，同上)目前很可能包括为功能减弱的突变体提供有利的遗传或外遗传(epigenetic)(Cowen和Lindquist,2005，Science309,2185;Queitsch等，2002,Nature417,618)环境的折叠分子伴侣，还有当遇到激动剂例如霍乱毒素的挑战时的生存值，其中与野生型种群比较减弱的氯离子通道功能将会降低脱水和死亡的可能性(Gabriel等，1994,Science266,107;Thiagarajah和Verkman，2005，TrendsPharmacolSci26,172)。因此，分子伴侣池的活性可以定义CF和其他蛋白质错折叠疾病的耐受多态性和有害突变之间的区别。实施例12:Hsp90与CFTR的结合响应于Ahal活性为了确定Ahal敲低对于AF508和Hsp90相互作用的影响，在用AhaldsRNA处理细胞之后，我们分析了结合到CFTR的Hsp90的恢复。表达AF508的细胞在37。C下在乱序的或AhaldsRNA存在下培养。将细胞收获，免疫沉淀CFTR,并通过免疫印迹量化与AF508结合的Hsp90的量。对于这些实验，我们分析了Hsp90与从免疫沉淀中回收的CFTR的比率来确定在对照和敲低条件下结合到CFTR的Hsp90相对量。图9阐述了dsRNAAhal对Hsp90的影响。表达AF508的HEK293细胞在37。C下在存在或缺失AhaldsRNA时进行培养。收获细胞，免疫沉淀CFTR,并通过免疫印迹量化与AF508—起回收的Hsp90的量。左侧小图Hsp90与从免疫沉淀中回收的CFTR的比率。右侧小图AhaldsRNA处理之后与乱序的对照相比细胞中剩余的Ahal分数。在我们观察到~60%Ahal敲低(图9，右侧小图)的情况下，我们在降低的Ahal水平观察到了结合的Hsp9050-60%的降低(图9,左侧小图)。相反，在这些条件下，与乱序的对照相比，我们没有检测到钙联接蛋白、BiP、Hsp40、Hsc-Hsp70、Hsp90、HOPFKBP8/38和p23在细胞水平上的变化，显示Ahal的减少可以改变ER中与Hsp90相关的AF508的稳态池。这一结果与如下的观察相一致CFTR野生型蛋白质相互作用组中Hsp90和Hsp卯辅分子伴侣的回收相对于AF508蛋白质相互作用组是降低的，尽管条带B的水平相当。这些结果证明，降低Ahal辅分子伴侣调控因子的水平可以修饰AF508与Hsp90的动力学相互作用，从而有助于更高效地通过折叠途径向前推进，因而有利于输出。其他方面提供以上展示的细节描述是为了帮助本领域技术人员实施本发明。但是此处描述和请求保护的发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面是为了作为本发明几个方面的阐述。任何等同的方面都应当是在本发明的范围之内。事实上，除了此处展示和描述的那些之外，根据前文所述，在没有脱离本发明性的发现的精神或范围的前提下，本发明的多种修饰对于本领域技术人员将是显而易见的。引用的参考文献本文对参考文献的引用不应当理解为承认其为本发明的现有技术。特别应当认为其在本发明范围之内，并用通过引用将其全文并入的是以下出版物Wang,X.等,Hsp90cochaperoneAhaldownregulationrescuesmisfoldingofCFTRincysticfibrosis,Cell(2006Nov17)127(4):673-5。权利要求1.用于抑制细胞中功能性Aha蛋白质表达的dsRNA，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含互补性区域，该区域具有与Aha靶序列基本上互补的序列，其中所述靶序列的长度小于30个核苷酸，其中所述有义链与所述反义链基本上互补，并且其中所述dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时，将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20％。2.根据权利要求1的dsRNA,其中所述Aha靶序列包含选自由SEQIDNOs:12-56组成的组中的序列。3.根据权利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含有义链，有义链具有选自下组中的序列SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143和SEQIDNO:145;和与所述有义链互补的反义链，其具有选自下组中的序列SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.根据权利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:57的序列的有义链和具有SEQIDNO:58的序列与所述有义链互补的反义链。5.根据权利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:69的序列的有义链和具有SEQIDNO:70序列的与所述有义链互补的反义链。6.根据4又利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:81的序列的有义链和具有SEQIDNO:82序列的与所述有义链互补的反义链。7.用于表达shRNA以抑制细胞中功能性Ahal表达的载体，所述载体包含有义链、发夹接头和反义链，其中所述有义链包含互补性区域，该区域具有与Aha靶序列基本上互补的序列，其中所述靶序列的长度小于30个核苷酸，其中所述反义链与所述有义链基本上互补，并且其中所述dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时，将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。8.根据权利要求7的载体，其中所述Aha靶序列包含选自由SEQIDNOs:12-56组成的组中的序列。9.根据权利要求7的载体，其中所述载体包含有义链，所述有义链具有选自由SEQIDNO:147、SEQIDNO:149和SEQIDNO:151组成的组中的序列；和反义链，所述反义链具有选自由SEQIDNO:148、SEQIDNO:150和SEQIDNO:152组成的组中的序列。10.用于抑制细胞中功能性Ahal蛋白质表达的shRNA,所述shRNA包含互补性区域，该区域具有与Aha靶序列基本上互补的序列，并且其中所述靶序列的长度小于30个核苷酸，并且其中所述shRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时，将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。11.根据权利要求10的shRNA,其中所述Aha靶序列包含选自由SEQIDNOs:12-56组成的组中的序列。12.根据权利要求10的shRNA，其中所述shRNA包含选自由SEQIDNO:&153、SEQIDNO:154和SEQIDNO:155组成的组中的序列。13.细胞或细胞群体，其包含根据权利要求1的dsRNA。14.细胞或细胞群体，其包含根据权利要求7的载体。15.细胞或细胞群体，其包括根据权利要求10的shRNA。16.分离的抗体，其特异性地结合功能性Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal结合位点和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶复合物。17.降低功能性Ahal蛋白质胞内水平的试剂，所述试剂选自下组小分子、抗体、反义核酸、适配体、dsRNA、核酶和它们的任意组合。18.治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的方法，所述方法包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的降低功能性Ahal蛋白质胞内水平的至少一种试剂，其中所述试剂选自下组小分子、抗体、反义核酸、适配体、siRNA、核酶和它们的组合。19.根据权利要求18的方法，其中所述疾病选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金-籴病和克《偉病。20.根据权利要求18的方法，其中所述疾病是CF。21.根据权利要求18的方法，其中所述错折叠蛋白质是错折叠的CFTR。22.根据权利要求18的方法，其中所述错折叠蛋白质是AF508蛋白质。23.治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的方法，所述方法包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的功能性Ahal表达的至少一种dsRNA抑制剂，所述dsRNA包含有义链和反义链，其中所述反义链包含互补性区域，该区域具有与Aha靶序列基本上互补的序列，其中所述靶序列的长度小于30个核苷酸，其中所述有义链与所述反义链基本上互补，并且其中所述dsRNA在与表达功能性Aha蛋白质的细胞接触时，将功能性Aha蛋白质的表达抑制至少20%。24.根据权利要求23的方法，其中所述疾病选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金力籴病和克雅病。25.根据权利要求23的方法，其中所述疾病是CF。26.根据权利要求23的方法，其中所述错折叠蛋白质是错折叠的CFTR。27.根据权利要求23的方法，其中所述错折叠蛋白质是AF508蛋白质。28.治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的方法，所述方法包括对需要施用的受试者施用治疗有效量的功能性Ahal表达的至少一种dsRNA抑制剂，其中所述<dsRNA抑制剂包含基于下列各项选择的序列a)所述dsRNA包含约19到约25个核苷酸的有义链和约19到约25个核苷酸的反义链；和b)所述有义链序列或反义链序列包含不超过15个连续核苷酸与包含在除功能性Ahal之外任何基因或mRNA的5，非翻译区域、3'非翻译区域、内含子或外显子中的连续序列相同。29.根据权利要求28的方法，其中所述疾病选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金^籴病和克雅病。30.根据权利要求28的方法，其中所述疾病是CF。31.根据权利要求28的方法，其中所述错折叠蛋白质是错折叠的CFTR。32.根据权利要求28的方法，其中所述错折叠蛋白质是AF508蛋白质。33.筛选用于治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的试剂的方法，所述方法包括提供表达功能性Ahal的细胞或细胞群体；对所述细胞或细胞群体施用候选试剂；量化所述细胞或细胞群体中功能性Ahal的活性；和测定所述候选试剂是否降低所述细胞或细胞群体中功能性Ahal的活性，而功能性Ahal活性的降低表示减少的蛋白质错折叠。34.根据权利要求33的方法，其中所述候选试剂是抑制功能性Ahal表达的dsRNA。35.根据权利要求34的方法，其中所述dsRNA包含a)约19个核苷酸到约25个核苷酸的序列，和b)所述序列包含不超过15个连续核苷酸与包含在除Aha基因或mRNA之外任何基因或mRNA的5'非翻译区域、3，非翻译区域、内含子或外显子中的连续序列相同。36.根据权利要求35的方法，其中所述Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。37.根据权利要求33的方法，其中所述疾病选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金-絮病和克l,病。38.根据权利要求33的方法，其中所述疾病是CF。39.根据权利要求33的方法，其中所述错折叠蛋白质选自下组错折叠的CFTR、错折叠的肌原纤蛋白、错折叠的a-半乳糖苷酶、错折叠的(3-葡糖脑苷脂酶、错折叠的视紫红质、聚集的淀粉状蛋白卩和t、聚集的支链淀粉、聚集的a-突触核蛋白和聚集的朊病毒。40.根据权利要求33的方法，其中所述错折叠蛋白质是错折叠的CFTR。41.根据权利要求33的方法，其中所述错折叠蛋白质是AF508蛋白质。42.筛选用于治疗与蛋白质错折叠相关的疾病的试剂的方法，所述方法包括提供表达功能性Ahal的细胞或细胞群体；对所述细胞或细胞群体施用候选试剂；量化所述细胞或细胞群体中的Hsp90/ADP复合物、Hsp90/ATP复合物或其组合物；和测定所述候选试剂是否降低所述细胞或细胞群体中Hsp90/ADP复合物、Hsp90/ATP复合物或其组合的量，而Hsp90/ADP复合物或Hsp90/ATP复合物量的降低表示减少的蛋白质错折叠。43.根据权利要求42的方法，其中所述候选试剂是抑制功能性Ahal表达的dsRNA。44.根据权利要求43的方法，其中所述dsRNA包含a)约19个核苷酸到约25个核苷酸的序列，和b)所述序列包含不超过15个连续核苷酸与包含在除Aha基因或mRNA之外任何基因或mRNA的5'非翻译区域、3'非翻译区域、内含子或外显子中的连续序列相同。45.根据权利要求44的方法，其中所述Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。46.根据权利要求42的方法，其中所述疾病选自下组嚢性纤维化(CF)、马方综合症、法布莱病、高歇病、色素性视网膜炎3、阿尔茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。47.根据权利要求42的方法，其中所述疾病是CF。48.根据权利要求42的方法，其中所述错折叠蛋白质选自下组错折叠的CFTR、错折叠的肌原纤蛋白、错折叠的a-半乳糖苷酶、错折叠的(3-葡糖脑苷脂酶、错折叠的视紫红质、聚集的淀粉状蛋白(3和T、聚集的支链淀粉、聚集的oc-突触核蛋白和聚集的朊病毒。49.根据权利要求42的方法，其中所述错折叠蛋白质是错折叠的CFTR。50.根据权利要求42的方法，其中所述错折叠蛋白质是AF508蛋白质。全文摘要本发明针对预防蛋白质错折叠的后果，例如那些与蛋白质折叠疾病相关的后果。提供了治疗方法，这些方法涉及施用降低热休克蛋白腺苷三磷酸酶Aha1和/或具有类似功能的相关分子水平的试剂。这些方法能够导致具有非最优折叠动力学的蛋白质的折叠、运输和功能的重建(rescue)。也提供了筛选方法以鉴定用于治疗蛋白质错折叠疾病的试剂。文档编号C07H21/04GK101454335SQ200780018209公开日2009年6月10日申请日期2007年5月21日优先权日2006年5月19日发明者保罗·G·拉普安特,威廉·E·鲍尔奇,王晓冬,约翰·D·维纳布尔,约翰·R·耶茨申请人:斯克里普斯研究所