二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法

专利名称：：二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法
技术领域：
：本发明涉及二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的高效率的制备方法。
背景技术：
：下述式(I)表示的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸中，例如由于P、P、二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)或其盐具有促进排痰的作用，因此是作为祛痰药或肺炎治疗药有待于开发的化合物，P、2，-脱氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)或其盐是P2Y2和/或P2Y4。票呤受体的选择性激动剂，因此是作为慢性支气管炎、副鼻腔炎等的治疗药有待于开发的化合物。e2『6hh匕$式中，W和W表示氢原子或羟基，B'和BZ表示嘧咬石威基，W和R2以及Bi和BZ各自可以相同也可以不同，n表示1~4的整数。作为上述二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成方法，例如当为Up4U时，以尿苷5，-单磷酸(UMP)作为起始原料，使用氯磷酸二苯酯(DPC)等活化剂和焦磷酸(PPi)等磷酸化剂来合成，但目标化合物的合成收率极低、为约10°/。，根本无法成为实际应用的方法(专利文献l)。因此，作为改善这些方法的尝试，正在研究经由核苷5，-环状三磷酸的方法。具体而言，有人报道了使尿苷5，-环状三磷酸与UMP反应制备Up4U的方法(非专利文献l)、使腺苷5，-环状三磷酸与腺苷5，-单磷酸G=to6士6反应制备P、P气二(腺苷5，-)四磷酸的方法(非专利文献2)。专利文献l:W099/5155非专利文献l:Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,11(2001)，157-160非专利文献2:OrganicLetters,第8巻，No.lO，2075-2077(2006)
发明内容发明所要解决的课题有报道称，使尿苷5，-环状三磷酸与UMP反应制备Up4U的方法可以以32。/。的收率合成Up4U(非专利文献l)。但是，在该反应条件下要求高达40。C的反应温度，在该加热条件下生成大量的除目标物以外的副产物，因此存在着非常难以纯化的问题。特别是在加热下进行如dCp4U等非对称型的二(嘧。定核苷5，-)多磷酸的合成时，同时还副生结构与目标物酷似的对照型Up4U，在各种纯化条件下几乎都不能分离。由此可知在核苦5，-环状三磷酸与核苷5，-单磷酸的反应中，在不会使副产物增加的室温左右的温度下实施反应至关重要。但是，在室温左右实施该反应时，如后述实施例中详述的那样，无法重现该收率，所得Up4U的合成收率极低，为10°/。以下。另一方面，在报道了使腺苷5，-环状三磷酸与腺苷5，-单磷获应得到P、P气二(腺香5，-)四磷酸的方法的文献中，暗示了该方法可适用于各种二(核香5，-)多磷酸的主旨，但是用于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸时的具体数据则完全没有显示。另外，该方法使用保护了羟基和氨基的核苷酸作为原料化合物，因此在合成目标化合物之后必需将该保护基进行脱保护，结果，使操作变得复杂，同时也成为收率下降的原因之一。另外，反应中使用的试剂类必须大大过剩地使用，在成本上也不利。更重要的是，在我们进行的将该方法应用于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的追加试验中，如后述所示，存在着目标化合物的合成收率低、绝对不能满足要求的问题。4解决课题的方法
技术领域：
：本发明人等为了解决上述问题反复进行了深入研究，结果发现通过使嘧啶核苷5，-环状三磷酸和嘧啶核苷酸在特定的金属盐、特别是4美盐的存在下反应，即使在室温下，与公知的方法相比也可以显著提高目标物二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成收率，从而完成了本发明。因此本
发明内容如下。〔1〕二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的制备方法，其特征在于使用缩合剂将嘧咬核苷5，-三磷酸转化成嘧咬核苷5，-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧咬核苦5，-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应。〔2〕上述〔1〕所述的制备方法，其中二(嗜啶核苷5，-)多磷酸为下述式(I)表示的化合物(I)式中，W和I^表示氢原子或羟基，Bt和B"表示嘧啶碱基，1^和112以及B^口bZ各自可以相同也可以不同，n表示l4的整数。〔3〕上述〔1〕所述的制备方法，其中缩合剂为碳化二亚胺类。〔4〕上述〔1〕所述的制备方法，其中金属盐为镁盐。〔5〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法在1530。C的温度条件下反应。〔6〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿普5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-单磷酸(UMP)来制备P',pt二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)。〔7〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿苦5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-二磷酸(UDP)来制备P',pS-二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)。〔8〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用尿苷5，-三磷酸(UTP)和2，-脱氧胞苷5，-单磷酸(dCMP)来制备P、2，-脱氧胞苦5，-)P、尿普5，-)四磷酸(dCp4U)。〔9〕上述〔1〕所述的制备方法，该方法是使用2，-脱氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)和尿苷5，-单磷酸(UMP)来制备P、2，-脱氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)。发明效果本发明的合成方法，其最大优点在于将嘧啶核苷5，-三磷酸转化成嘧啶核苷5，-环状三磷酸之后，使得到的嘧啶核苷5，-环状三磷酸与嗜啶核苷酸反应时，在选自镁、锰和铁的金属盐、特别是镁盐的存在下进行反应。即，根据以往的方法，在嘧咬核苦5，-环状三磷酸与嘧啶核苷酸的反应中，釆用完全不存在金属盐(非专利文献l)或在锌盐的存在下进行反应的方法(非专利文献2)。但是，在本发明人等的研究中明确在经由核苷5，-环状三磷酸的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成中，在不存在金属盐的非专利文献l的方法中，二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的合成收率极低，且反应温度还较高、达到40。C，生成大量的目标物以外的副产物，因此还存在纯化极其困难的问题。另外，在锌盐的存在下反应的非专利文献2的方法虽然是适于合成P、P气二(腺苷5，-)四磷酸的方法，但在本发明人等的研究中可知该方法不适于合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸，其合成收率未必高。在这样的状况下，在非专利文献2中，本发明人等首次发现被指出不比锌盐有效的镁盐，完全意外地在二(嗜啶核苦5，-)多磷酸的合成中极其有效。即，根据本发明的方法，以非保护的核苷酸类作为起始原料，利用不需进行保护、脱保护步骤的简便操作方法，可以以远远高于现有方法的合成收率(50.5~94.3%)合成目标化合物，并且由于6反应温度为室温左右和温和的反应条件，因此具有副产物也少、纯化容易的优点，是适合于工业上大量合成二(嘧啶核香5，-)多磷酸的方法。实施发明的最佳方式如上所述，本发明方法如下使用缩合剂将嘧啶核苷5，-三磷酸转化成嘧啶核苷5，-环状三磷酸，接着在选自镁、锰及铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5，-环状三磷酸与嘧"定核苦酸反应，合成二(嘧啶核苷5，-)多磷酸。作为用于将嘧啶核苷5，-三磷酸转化成嘧啶核苷5，-环状三磷酸的缩合剂，可以使用二环己基碳化二亚胺(DCQ、水溶性碳化二亚胺(WSC)、二异丙基碳化二亚胺(DIPC)等碳化二亚胺类；羰基二咪唑(CDI)、氯磷酸二苯酯(DPC)等磷酰卣化物；曱苯磺酰氯等磺酰卣化物等公知的缩合剂，特别优选碳化二亚胺类。反应根据所使用的缩合剂而不同，例如可以通过在二曱基曱酰胺(DMF)、二曱基乙酰胺(DMA)、曱酰胺(FA)、吡啶、二嚼烷、二曱基亚石风等的单独或混合溶剂中，相对于1摩尔的嘧啶核苷5，-三磷酸(NTP)使用15摩尔的缩合剂，在0。C50。C、优选1530。C下反应110小时左右来实施。更具体而言，使用DIPC作为缩合剂时，可以通过在DMF中，相对于1摩尔的NTP使用15摩尔、优选1.21.4摩尔的DIPC,在0。C50。C、优选2030。C下反应35小时左右来实施。如此操作而得到的嘧啶核苷5，-环状三磷酸，不用分离、接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下与嘧啶核苷酸反应，合成二(嘧啶核苷5'-)多磷酸。作为反应中共存的金属盐，只要是选自镁、锰和铁的金属盐即可，没有特别限定。具体可以例示氟化镁、氯化镁、溴化镁、碘化镁、氯化锰、氯化铁等金属卣化物；镁、锰、铁的硫酸、硝酸、磷酸、高氯酸、四氟硼酸盐等金属无机酸盐；镁、锰、铁的三氟曱磺酸、曱磺酸、曱苯磺酸、乙酸、三氟乙酸、硬脂酸、枸橼酸盐等金属有机酸盐等。上述金属盐中，从合成收率及容易操作的角度考虑，优选镁盐，特别优选氯化镁。需要说明的是，所使用的金属盐可以是无水物也可以是水合物。反应可以如下实施相对于l摩尔的嗜啶核苷5，-环状三磷酸，添加15摩尔、优选1.01.3摩尔的嘧啶核香酸和15摩尔、优选1.01.3摩尔的金属盐，在010(TC、优选153(TC下反应124小时左右。反应后，对于合成目标物的二(嘧吱核苷5，-)多磷酸，可以适当组合通常的核苷酸的分离纯化中所使用的方法(例如，重结晶法、离子交换柱层析法、吸附柱层析法、活性炭柱层析法等)进行分离纯化，根据需要还可以制成盐的形式。例如，作为离子交换柱层析法中使用的离子交换树脂，可以使用碱性阴离子交换树脂(例如7》六一，4卜IRA402〔口一厶&/、一^社制〕、夕、74才歹PA-312、夕？7*4才^SA-11A〔三菱化学社制〕)、弱碱性阴离子交换树脂(例如，7乂A—，吖卜IRA67〔口一厶&"一7社制〕、夕？7M才》WA-30〔三菱化学社制〕)、强酸性离子交换树脂(例如，夕'M7行才》PK-216〔三菱化学社制〕)或弱碱性阴离子交换树脂(例如，夕'47*4才》WK-30〔三菱化学社制〕)等。作为活性炭，可以使用成形为破碎状或粒状的色谱用活性炭，例如可以使用和光纯药工业社、二村化学工业社制等的市售品。另外，重结晶法可如下进行向得到的已纯化的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸或其盐中加入亲水性有机溶剂，使晶体析出。使用的亲水性有机溶剂可以例示曱醇、乙醇等碳原子数为6以下的醇类；丙酮等酮类；二嗯烷等醚类；乙腈等腈类；二曱基曱酰胺等酰胺类等，特别是可以列举醇类、优选乙醇。上述本发明方法可适用于二(嘧咬核苷5，-)多磷酸、具体例如有上述式(I)表示的二(嘧啶核苷5，-)多磷酸的制备，并不限于特定化合物的制备。例如可适用于(1)使用尿苦5，-三磷酸(UTP)和尿苦5，-单磷酸(UMP)的P^P气二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)的合成；(2)使用尿普5，-三磷酸(UTP)和尿苷5，-二磷酸(UDP)的P^p5-二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)的合成；P)使用尿苷S，-三磷酸(UTP)和2，-脱氧胞苷S，-单磷酸(dCMP)的P'-(2，-脱氧胞苷5，-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成；(4)使用2，-脱氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)和尿苦5，-单磷酸(UMP)的pLp，-脱氧胞苦5'-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成等。实施例以下，给出实施例来具体说明本发明，-f旦本发明并不受这些实施例的任何限定。实施例l:金属盐对P、P乞二(尿苷5，-)四磷酸(Up4U)的合成收率的效果(1)尿普5，-环状三磷酸(cUTP)二曱基曱酰胺溶液的制备将5.00g(9.10mmol)尿苷5，-三磷酸(UTP)三钠溶解于去离子水中，制成50mL溶液，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、27cc),与洗涤液合并，用8.7mL(37mmol)三丁胺进行中和。减压下浓缩该溶液，之后将残余物用20mL二嗯烷共沸4次。将残余物溶解于50mL二曱基甲酰胺中，制成0.15M的UTP三丁胺盐二甲基曱酰胺溶液。向该溶液中加入1535(10.0mmol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时，制成0.15M的cUTP三丁胺盐二曱基甲酰胺溶液。(2)尿苷5，-单磷酸(UMP)三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液的制备向4.4mL(9.0mmol)2.05M的UMP水溶液中加入4.4mL(19mmol)三丁胺进行浓缩。残余物用20mL二噁烷共沸6次，之后溶解于50mL二曱基曱酰胺中，制成0.18M的UMP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液。(3)研究金属盐在cUTP与UMP的反应中的效果向上述(1)的500(75.0^mo1)0.15M的cUTP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液中加入上述(2)的500〃L(90.0〃mo1)0.18M的UMP三丁胺盐二曱基甲酰胺溶液和表1所示的各种金属盐的200//L(90.0Amol)0.45M的二曱基甲酰胺溶液，在室温(25。C)下反应1小时。用HPLC(262nm)分析反应液，求出目标物Up4U的合成收率。其结果见表l。项目号金属盐(1.2当量)cUTP(当量)UMP(当量)Up4U合成收率(％)1无水MgCb80.2%2MgCl2-6H2084.0%3Mg(OTf)267.9%4MnCl2-4H2011.272.2%FeCl364.9%6Zn(OTf)224.7%7ZnCl219.1%8一3.8%OTf:三氟甲磺酸由表l的结果可知在由cUTP和UMP合成Up4U的反应中，在金属盐未共存的情况下合成收率为3.8°/。(非专利文献l的方法项目号8);在锌盐共存的情况下合成收率为19.1~24.7%(非专利文献2的方法项目号6~7),相对于此，在选自铁、锰和镁的金属盐共存的情况下，合成收率显著提高，达到60%以上；特别是在镁盐共存的情况下，可以达到80%以上的合成收率(项目号1~5)。实施例2:Up4U-钠盐的合成(1)UTP三丁胺盐二曱基甲酰胺溶液将l.OOg(1.82mmol)UTP三钠盐溶解于13mL去离子水中，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、10cc),与洗涤液合并，用1.75mL(7.35mmol)三丁胺进行中和。减压下浓缩该溶液，之后将残余物用10mL二噁烷共沸4次。将残余物溶解于10mL二曱基曱酰胺中，制成0.13310M的UTP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液。(2)UMP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液向1.06mL(2.18mmol)2.05M的UMP水溶液中加入1.06mL(4.46mmol)三丁胺进行浓缩。残余物用IOmL二嗨烷共沸4次，之后溶解于10mL二甲基曱酰胺中，制成0.184M的UMP三丁胺盐二曱基甲酰胺溶液。(3)Up4U的合成向上述(1)的UTP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液中加入364〃L(2.37mmol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时。向其中加入上述(2)的0.18M的UMP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液和将207.5mg(2.179mmol)无水氯化镁溶解于4.9mL二曱基曱酰胺中的溶液，在室温下搅拌255分钟。所得溶液用HPLC(262nm)进行分析，结果可知由UTP以84.2。/。的合成收率生成了目标物Up4U。(4)Up4U的纯化、分离向上述(3)的反应溶液中加入6.5mL去离子水，减压下浓缩。向残余物中加入25mL去离子水，滤去生成的沉淀，之后合并滤液、洗液，使之通过强阳离子交换柱(pK216-质子型、20cc)。合并通过液、洗液，用三乙胺调节至pH7.5。使该溶液吸附在阴离子交换柱(IRA67-氯化物离子型、40cc)上，用0.15N的盐酸、去离子水依次清洗，之后将目标物用0.3-0.4M的碳酸氢铵水溶液进行洗脱。减压下浓缩含有目标物的馏分，之后将残余物用去离子水进行共沸，冷冻干燥。将所得残余物溶解于去离子水中，之后使之通过强阳离子交换柱(pK216-钠型、40cc)，合并洗脱液、洗涤液，减压下浓缩。将残余物溶解于去离子水中，之后加入乙醇进行冷却。过滤收集析出的晶体，得到1.08g(1.23mmol、67.7%)Up4U-钠盐。实施例3:P^P、二(尿苷5，-)五磷酸(Up5U)的合成加入500〃L(75.0pmol)0.15M的cUTP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液、584〃L(90.0,mo1)0.154M的尿苦5，-二磷酸(UDP)三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液、200//L(卯.0〃mo1)0.45M的无水氯化镁二曱基甲酰胺溶液，在室温下搅拌72小时。所得溶液用HPLC(262nm)进行分析，结果可知由UTP以50.5Q/。的合成收率生成目标物Up5U。实施例4:以2，-脱氧胞苷5，-三磷酸(dCTP)作为起始原料的P、2，-脱氧胞苷5，-)P、(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成向166(16.7/miol)0.144M的dCTP三丁胺盐二甲基曱酰胺溶液中加入3.4^L(^mol)二异丙基碳化二亚胺，在室温下搅拌3小时。加入0.18M的UMP三丁胺盐二曱基曱酰胺溶液、0.45M的无水氯化镁或氯化锌二曱基曱酰胺溶液，使达到表2所示的当量数，在室温下搅拌l小时。所得反应液用HPLC(272nm)进行分析，求出目标物dCp4U的合成收率。其结果见表2。项目号dCTP(当量数)UMP(当量数)金属盐(当量数)dCp4U合成收率(％)11.2无水MgCb1.266.0%22.4无水MgCl22.477.2%13.4无水MgCl29.3681.0%41.2ZnCl21.29.580/053.4ZnCl29.3635.0%由表2可知通过在1.22.4当量的氯化镁存在下，使1.22.4当量的UMP与1当量的dCTP反应l小时，由dCTP以66.077.2Q/o的高合成收率生成dCp4U。另一方面，在氯化锌的存在下，仅以10°/。以下的低收率合成了目标化合物，即使增加氯化锌的当量数，收率提高也不明显。12实施例5:以尿苦5，-三磷酸(UTP)作为起始原料的P-(2，-脱氧胞苷5'-)p4-(尿苷5，-)四磷酸(dCp4U)的合成将0.15M的cUTP三丁胺盐二甲基曱酰胺溶液、0.15M的2，-脱氧胞苷5，-单磷酸(dCMP)三丁胺盐曱酰胺溶液、0.45M的氯化镁六水合物二曱基甲酰胺溶液按照表3所示的量比进行混合，用二曱基曱酰胺进行调整，使总量达到lmL。在室温下搅拌l小时，之后将所得溶液用HPLC(272nm)进行分析，求出目标物dCp4U的合成收率。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*:根据dCMP计算的dCp4U的合成收率由表3可知通过使dCMP和cUTP在氯化镁存在下反应l小时，由dCMP定量地生成dCp4U。另外，还确认到在氯化4美未共存时，收率显著下降。权利要求1.二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的制备方法，其特征在于使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应。2.权利要求l所述的制备方法，其中二(嘧啶核苷5，-)多磷酸为下述式(I)表示的化合物式中，1^和112表示氢原子或羟基；81和82表示嘧。定碱基，1^和112以及B1和82各自可以相同也可以不同；n表示1~4的整数。3.权利要求l所述的制备方法，其中缩合剂为碳化二亚胺类。4.权利要求l所述的制备方法，其中金属盐为镁盐。5.权利要求l所述的制备方法，该方法是在1530。C的温度条件下反应。6.权利要求l所述的制备方法，该方法是使用尿苷5，-三磷酸和尿苦5，-单磷酸来制备P)气二(尿苷5，-)四磷酸。7.权利要求l所述的制备方法，该方法是使用尿苷5，-三磷酸和尿苷5，-二磷酸来制备pi,pS-二(尿苷5，-)五磷酸。8.权利要求l所述的制备方法，该方法是使用尿苷5，-三磷酸和2，-脱氧胞苷5，-单磷酸来制备P、2，-脱氧胞苷5，-)P气(尿苷5，-)四磷酸。9.权利要求l所述的制备方法，该方法是使用2，-脱氧胞苷5，-三磷酸和尿苷5，-单磷酸来制备P、2，-脱氧胞苷5，-)P、尿苷5，-)四磷酸。全文摘要使用缩合剂将嘧啶核苷5’-三磷酸转化成嘧啶核苷5’-环状三磷酸，接着在选自镁、锰和铁的金属盐的存在下，使得到的嘧啶核苷5’-环状三磷酸与嘧啶核苷酸反应，合成二(嘧啶核苷5’-)多磷酸。根据该方法，可以使用非保护的嘧啶核苷5’-磷酸类作为原料，可以以50％以上的合成收率获得目标物二(嘧啶核苷5’-)多磷酸，因此作为二(嘧啶核苷5’-)多磷酸的大量合成方法是适合的方法。文档编号C07H19/10GK101495497SQ20078002864公开日2009年7月29日申请日期2007年7月25日优先权日2006年7月26日发明者向后悟,大泽和臣,山田浩平,岩井优子,早川弘之申请人:Yamasa酱油株式会社