专利名称：重组蛋白的重折叠的制作方法
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发明领域 本发明涉及用于获得在细胞培养物中生成的异源重组蛋白的方法。本发明包括用于回收和纯化重折叠的重组蛋白的方法，所述重组蛋白已经在原核宿主细胞中生成并存在于这些细胞中，典型地存在于周质空间或胞内空间中。所述在原核宿主细胞中生成的重组蛋白还可以作为可溶性蛋白质或者作为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质的混合物被发现。
背景技术：
许多治疗上有关的重组蛋白是在多种宿主生物体中生产的。大多数蛋白质可以在真核宿主(诸如CHO细胞)中以它们的天然形式表达。动物细胞培养一般要求延长生长时间以达到最大的细胞密度并最终获得比原核细胞培养低的细胞密度(Cleland，J.(1993)ACS Symposium Series526，ProteinFoldingIn Vivo and In Vitro，American Chemical Society)。另外，动物细胞培养常常要求昂贵的培养基，其含有可能干扰所需蛋白质回收的培养组分(growth components)。细菌宿主表达系统为生产规模的重组蛋白生产提供了有成本效益的替代方案。有许多关于重组蛋白的常规细菌表达的美国专利，包括美国专利第4,565,785号；第4,673,641号；第4,795,706号；及第4,710,473号。该生产方法的一个主要优点是通过离心或微滤容易地从细胞组分中分离产物的能力。参见例如Kipriyanov和Little，(1999)Molecular Biotechnology，12173-201；及Skerra和Pluckthun，(1988)Science，2401038-1040。
然而，细菌表达系统(诸如大肠杆菌)缺乏促进蛋白质正确重折叠的细胞机器，而且一般不导致大蛋白质分泌进入培养基。在细菌宿主细胞中表达的重组蛋白常常被发现是包涵体，其由部分折叠的和错误折叠的还原的蛋白质的密实块组成。参见例如Baneyx，(1999)Current Opin.Biotechnology10411-421；及Villaverde和Carrio，(2003)Biotech.Letts.251385-1395。蛋白质也可以在不形成包涵体的情况中表达。参见例如同前。典型地在包涵体中，重组蛋白一般是无活性的。
另外，重折叠常常产生错误折叠的和二硫化物连接的二聚体、三聚体、和多聚体(Morris等，(1990)Biochem.J.，268803-806；Toren等，(1988)Anal.Biochem.，169287-299)。这种缔合现象在蛋白质重折叠过程中是非常普通的，特别是在较高的蛋白质浓度，而且常常表现为牵涉经由部分折叠的中间体的疏水相互作用的缔合(Cleland和Wang，(1990)Biochemistry，2911072-11078)。
错误折叠发生于发酵过程或分离规程过程中的细胞中。从周质空间或胞内空间回收的蛋白质必须溶解，而且可溶性蛋白质必须重折叠成天然状态。参见例如Rudolph，Renaturation of Recombinant，Disulfide-Bonded ProteinsFrom“Inclusion Bodies”于Modern Methods in Protein-and Nucleic AcidResearch(Walter de Gruyter New York，1990)pp.149-172。用于重折叠蛋白质成为正确的、有生物学活性的构象的体外方法对于获得功能性蛋白质是至关重要的。自包涵体回收的蛋白质的典型下游加工包括在高浓度的变性剂(诸如尿素)溶解包涵体，接着稀释变性剂以允许发生重折叠(参见美国专利第4,512,922号；第4,511,502号；及第4,511,503号)。还可参见例如Rudolph和Lilie，(1996)FASEBJ.，1049-56；Fischer等，(1993)Biotechnology andBioengineering，413-13；Misawa和Kumagai，(1999)Biopolymers51297-307；Clark，(1998)Current Opinion in Biotechnology，9157-163；及Tsumoto等，(2003)Protein Expression and Purification281-8。此类回收方法被认为是在略微改变后普遍适用于从包涵体中回收有生物学活性的重组蛋白。这些方法已经应用于肝素结合蛋白(HBP)，诸如VEGF(Siemeister等(1996)同上)。这些方法试图消除随机二硫化物成键，之后通过它的其它稳定力使重组蛋白变成它的生物学活性构象，而且可以不消除不正确折叠的中间体，提供正确折叠产物的均质群，或提供足够量的正确折叠产物。
通过将单一蛋白质封装在胶团内或者在树脂上分离它们然后除去变性剂，反胶团(reversed micelle)或离子交换层析已经用于帮助变性蛋白质的重折叠(Hagen等，(1990)Biotechnol.Bioeng.，35966-975；Creighton(1985)于Protein Structure Folding and Design(Oxender，D.L.编)pp.249-251，New YorkAlan R.Liss，Inc.)。这些方法已经用于防止蛋白质聚集和促进正确重折叠。为了改变重折叠的速率或程度，已经用针对蛋白质天然结构的配体和抗体实施了构象特异性重折叠(Cleland和Wang，(1993)，于Biotechnology，(Rehm H.-J.和Reed G.编)pp.528-555，New York，VCH)。例如，肌酸激酶在存在针对其天然结构的抗体时重折叠(Morris等，(1987)Biochem.J.，24853-57)。在抗体之外，配体和辅因子已经用于增强重折叠。这些分子在天然蛋白形成之后更有可能与正在折叠中的蛋白质相互作用。因此，可以将折叠平衡向天然状态“驱动”。例如，血红素铁的轴向位置(axial position)的外在配体(extrinsic ligand)提高了亚铁细胞色素c的重折叠速率(Brems和Stellwagon，(1983)J.Biol.Chem.，2583655-3661)。侣伴蛋白和折叠催化剂也已经用于帮助蛋白质折叠。参见例如Baneyx，(1999)Current Opinion in Biotechnology，10411-421；及Carrio和Villaverde，(2003)FEBS Letters537215-221。然而，这些方法对于生产大量的蛋白质产物未必总是有效的或足够的。
需要从宿主细胞培养物中折叠和/或回收重组蛋白的新的和更有效的方法，例如用于在细菌细胞培养物中高效地和经济地生产重组蛋白。这些新的和更有效的方法提供了高度纯化的、有生物学活性的、正确重折叠的蛋白质的回收的改善，而且普遍适用于生产规模的蛋白质生产。本发明满足了这些需要和其它需要，在阅读以下公开内容后将是显而易见的。
发明概述 本发明提供了一种用于从细胞培养物中回收和纯化重折叠的重组蛋白的方法。具体而言，本发明提供了一种从原核宿主细胞(例如细菌细胞)中回收重组蛋白的方法。本发明的方法广泛适用于重组蛋白。在某些实施方案中，所述重组蛋白是生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)。在一个实施方案中，所述生长因子是VEGF165。
在一个实施方案中，一种方法包括(a)从所述原核细胞培养物中分离所述重组蛋白；(b)使所述蛋白质在第一缓冲溶液中溶解，所述第一缓冲溶液其pH大于9且包含第一离液剂；(c)使所述溶解的蛋白质在第二缓冲溶液中重折叠，所述第二缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且包含第二离液剂、两种或更多种还原剂且通入空气或氧气，其时间和条件使得所述重组蛋白发生重折叠；并(d)回收所述重折叠的重组蛋白。在一个实施方案中，所述第一缓冲溶液和/或所述第二缓冲溶液还包含精氨酸。在一个实施方案中，所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH11。在另一个实施方案中，所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH11。在一个实施方案中，所述第二缓冲溶液包含两种或更多种还原剂，例如DTT和半胱氨酸。在一个实施方案中，所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH10。在另一个实施方案中，所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH10。
在一个实施方案中，一种方法包括(a)从所述原核细胞培养物中分离所述重组蛋白；(b)使所述蛋白质在组合缓冲溶液(combo buffered solution)中溶解并重折叠，所述组合缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且通入空气或氧气；并(c)回收所述重组蛋白。在一个实施方案中，所述组合缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH10。在另一个实施方案中，所述组合缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH10。
用于重折叠反应的氧气或空气可以通过空气源或富氧压缩气体源(anoxygen enriched compressed gas supply)来提供。在一个实施方案中，使用例如0.004min-1的kLa，在含有船用型叶轮(marine type impeller)的2.5L容器中其代表200-400rpm的混合速率和0.3cc/min/L的鼓泡速率(sparging rate)。在其它实施方案中，使用kLa＝0.01min-1或0.1min-1来生产重折叠的蛋白质。
溶解和/或重折叠可以在多个温度进行。在一个实施方案中，用于溶解和/或重折叠的温育温度是室温。温育时间可以根据正在进行回收和重折叠的重组蛋白而不同。在一个实施方案中，所述重组蛋白在所述第一缓冲溶液中温育至少1小时，或1-2小时。在一个实施方案中，所述溶解的蛋白质在所述第二缓冲溶液中温育约3-24小时。在一个实施方案中，所述分离的重组蛋白在所述组合缓冲溶液中温育3-24小时。
另外，本发明提供了用于重折叠重组蛋白的工序和方法，或是单独的或是联合重组蛋白的回收，正如本文中所描述的。在一个具体的实施方案中，纯化方法包括使含有所述重组蛋白的溶液澄清，并使经过澄清的溶液中的所述重折叠的重组蛋白接触混合模式支持物、阳离子层析支持物、第一疏水相互作用层析支持物、和任选的第二疏水层析支持物或离子交换支持物；并从每个支持物中选择性回收或洗脱重折叠的重组蛋白。在一个实施方案中，使所述溶液澄清包括添加去污剂至1％的终浓度，调节pH至约8.5-9.5，在25-30℃将溶液温育1-10小时，将所述溶液离心，并将从所述离心步骤中回收的液体过滤。在一个实施方案中，pH是约8.7。在另一个实施方案中，pH是约9.0。可以以任意次序实施回收步骤的各步骤，例如相继地或改变层析支持物的次序。在本发明的某些实施方案中，提供了从生产或工业规模的细胞培养物中回收并纯化重折叠的重组蛋白的方法。
附图简述
图1显示了如本文中所述的重折叠方法的时间过程研究(其通过rpHPLC层析来评估)的一个例子。
图2显示了由细菌菌株W3110生成的VEGF加载到CaptoMMCTM柱上的层析图。使用25mMHEPES pH9.0平衡该柱。用1M精氨酸/25mM HEPES，pH6-9从MMC柱中等度洗脱VEGF。
图3显示了由细菌菌株W3110生成的VEGF加载到SPHP柱上的层析图。例如，在50mM HEPES pH7.5中平衡SPHP柱。使用1个柱体积里的50mMHEPES pH7.5中的0.0-1.2M乙酸钠的线性梯度洗脱该柱。在280nm监测洗脱液。从280nm处具有最高吸光度(最大OD在约42mS/cm时)的级分(其典型地含有大于90％的VEGF)中回收蛋白质，并合并，供进一步加工用。
图4显示了由细菌菌株W3110生成的VEGF加载到HiPropyl柱上的层析图。
图5显示了由细菌菌株W3110生成的VEGF加载到苯基Sepharose柱上的层析图。
图6显示了尿素和精氨酸对重折叠条件的影响。
图7显示了在重折叠开始后6小时通入N2时，如rpHPLC时间过程所评估的N2在使重折叠集合稳定(up to)48小时中的作用。
图8显示了不同的空气鼓泡速率对重折叠条件的影响。
图9显示了柱测定法，其中使用阳离子交换HPLC来测定重折叠的VEGF。
图10显示了具有所指出的二硫键的VEGF165的氨基酸序列。
发明详述 定义 在用于本文时，“多肽”通常指来自任何细胞来源的、具有多于大约十个氨基酸的肽和蛋白质。“异源的”多肽是那些对所使用的宿主细胞而言是外来的多肽，诸如由大肠杆菌生产的人类蛋白质。虽然异源的多肽可以是原核的或真核的，但是优选它是真核的，更优选是哺乳动物的，最优选是人类的。在本发明的某些实施方案中，它是重组生产的(例如重组多肽或重组蛋白)。
哺乳动物多肽的例子包括下列分子，诸如例如生长因子、肝素结合生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)，例如VEGF-A(同等型)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D；VEGF的受体和抗体，诸如rhuFab V2和贝伐单抗、ranibizumab；VEGF受体的抗体；凝乳酶；生长激素，包括人生长激素(hGH)；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；血小板生成素；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；生长激素受体；生长激素释放蛋白(GHRP)；LIV-1(EP1263780)；TRAIL；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子、和von Willebrands因子；因子VIII；因子VIII B结构域；抗组织因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)及其变体；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；ErbB2结构域的抗体，脑啡肽酶；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；Muellerian抑制性物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物的蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；激活素；激素的或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，诸如NGF；心肌营养蛋白(心脏肥大因子)，诸如心肌营养蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生长因子(PDGF)(A、B、C或D)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)及其受体，诸如IGFBP-1至IGFBP-6；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；(促)红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白(HSA)或牛血清清蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-10；抗HER-2抗体；Apo2配体；超氧化物歧化酶；抗CD20；调蛋白，抗IgE，抗CD11a，抗CD18；肿瘤坏死因子(TNF)及其抗体，TNF受体及相关抗体，TNF-受体-IgG，TNF受体相关因子(TRAF)及其抑制剂，T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；抗TGF，诸如抗TGF-β；抗激活素；抗抑制素；抗Fas抗体；Apo-2配体抑制剂；Apo-2受体；Apo-3；凋亡因子；Ced-4；DcR3；死亡受体和激动性抗体(DR4，DR5)；淋巴毒素(LT)；促乳素；促乳素受体；SOB蛋白；WISP(wnt诱导的分泌性蛋白)；抗NGF；DNA酶；肝炎抗原；单纯疱疹抗原；瘦蛋白；Toll蛋白，TIE配体，CD40和抗CD40，免疫粘附素，枯草杆菌蛋白酶，肝细胞生长因子(HGF)，血小板生成素(TPO)；前列腺特异性癌抗原(PSCA)；病毒抗原，诸如例如AIDS被膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；抗体；及任何上文所列多肽的片段。本文中的术语“抗体”以最广义使用，而且明确涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。在本发明的某些实施方案中，所述重组多肽是生长因子。在一个实施方案中，所述重组多肽是哺乳动物多肽VEGF。在另一个实施方案中，所述重组多肽是人VEGF(例如VEGF165)。在一个实施方案中，所述重组多肽不是血管他丁。在一个实施方案中，所述重组多肽不是IGF-1。
在用于本文时“血管内皮生长因子”或者“VEGF”是指最初衍生自牛垂体滤泡细胞的一种哺乳动物生长因子，其氨基酸序列披露于Castor，C.W.等，(1991)Methods inEnzymol.，198391-405，及其具有相应天然VEGF定性生物学活性的功能性衍生物，包括但不限于Houck等，(1991)Mol.Endocrin.，51806-1814报道的人类VEGF氨基酸序列。还可参见Leung等，(1989)Science，2461306；Robinson和Stringer，(2001)Journal of Cell Science，144(5)853-865；美国专利号5,332,671。这也称为VEGF-A。该家族的其它成员通过在VEGF结尾的字母记号指出，例如VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D。VEGF的主要形式或VEGF-A是165个氨基酸的同二聚体，其具有十六个半胱氨酸残基，它们形成7个分子内二硫键和两个分子间二硫键。可变剪接牵涉由121、145、165、189和206个氨基酸组成的多种人类VEGF多肽的形成，然而VEGF121变体缺乏其它变体的肝素结合结构域。VEGF的所有同等型(isoform)分享共同的氨基末端结构域，但是分子的羧基末端部分的长度不同。优选的VEGF活性形式，VEGF165，在每个单体中在以下氨基酸残基之间具有二硫键Cys26-Cys68；Cys57-Cys104；Cys61-Cys102；Cys117-Cys135；Cys120-Cys137；Cys139-Cys158；Cys146-Cys160。参见图10。还可参见例如Keck等，(1997)Archives ofBiochemistry and Biophysics，344(1)103-113。VEGF165分子由两个结构域构成一个氨基末端受体结合结构域(氨基酸1-110，二硫键相连的同二聚体)和一个羧基末端肝素结合结构域(残基111-165)。参见例如Keyt等，(1996)J.Biol.Chem.，271(13)7788-7795。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF165在残基75(Asn)处不是糖基化的。参见例如Yang等，(1998)Journal ofPharm.& ExDerimental Therapeutics，284103-110。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF165在残基Asn10处是基本上未脱酰胺的。在本发明的某些实施方案中，分离并纯化的VEGF165是脱酰胺的(在残基Asn10处)与未脱酰胺的蛋白质的混合物，典型地大部分蛋白质是未脱酰胺的。既然VEGF165是同二聚体，那么脱氨基作用可以发生在一条或所有两条多肽链上。
术语“肝素结合蛋白”在用于本文时是指能够结合肝素(如上文所定义的)的多肽。该定义包括天然的和重组生产的肝素结合蛋白的成熟、前(pre)、前-原(pre-pro)、和原(pro)形式。肝素结合蛋白的典型例子是“肝素结合生长因子”，包括但不限于表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)(又称为散射因子，SF)、和神经生长因子(NGF)、IL-8等。
“肝素”(heparin或heparinic acid)是高度硫酸化的、直链阴离子粘多糖(称作糖胺聚糖)的异质群。虽然可以存在其它糖类，肝素中的主要糖类是α-L-艾杜糖醛酸2-硫酸酯、2-脱氧-2-磺氨基-α-葡萄糖6-硫酸酯、β-D-葡萄糖醛酸、2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-葡萄糖、和L-艾杜糖醛酸。这些和任选的其它糖类通过糖苷键相连，形成不同大小的多聚体。由于其共价连接的硫酸酯和羧酸基团的存在，肝素是强酸性的。肝素的分子量的范围从大约3,000到大约20,000道尔顿，取决于来源和测定方法。天然的肝素是多个组织的组分，尤其是肝和肺，以及数个哺乳动物物种中的肥大细胞。肝素和肝素盐(肝素钠)可商购，而且主要在各种临床情况中用作抗凝血剂。
在用于本文时，“正确折叠的”或“有生物学活性的”VEGF或其它重组蛋白等等指具有生物学活性构象的分子。熟练技术人员会认可，错误折叠的和二硫键混乱的中间体可能具有生物学活性。在这种情况下，正确折叠的或有生物学活性的VEGF或重组蛋白相当于天然折叠样式的VEGF(上文所述的)或其它重组蛋白。例如，在二聚体分子中的两个分子间二硫键之外，正确折叠的VEGF具有上文所述的二硫化物对，然而其它中间体可以通过细菌细胞培养物来生产。对于正确折叠的VEGF，所述两个分子间二硫键发生在每个单体的相同残基，即Cys51和Cys60之间。参见例如WO 98/16551。VEGF的生物学活性包括但不限于例如促进血管通透性、促进血管内皮细胞生长、与VEGF受体结合、结合VEGF受体并通过VEGF受体发信号(参见例如Keyt等，(1996)Journal of Biological Chemistry，271(10)5638-5646)、诱导血管发生等。
术语“纯化的”或“纯的重组蛋白”等等指不含通常在其重组生产中，尤其在原核或细菌细胞培养物中发现的伴随物质的材料。如此，该术语指不含污染性DNA、宿主细胞蛋白质或与其原位环境相关的其它分子的重组蛋白。该术语指至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约95％或至少大约98％或更高的纯度。
术语“包涵体”或“折射体”指聚集的感兴趣多肽的密集胞内块，其构成总细胞蛋白质的重大部分，包括所有细胞组分。在有些情况中，但不是所有情况，这些多肽聚集体在降至1,000倍放大率的相差显微镜下可识别为细胞外壳内明显的亮点。
在用于本文时，术语“错误折叠的”蛋白质指折射体内包含的沉淀的或聚集的多肽。在用于本文时，“不溶性的”或“错误折叠的”VEGF或其它重组蛋白指沉淀的或聚集的VEGF或重组蛋白，其包含在原核宿主细胞的周质空间或胞内空间内，或者以其它方式与原核宿主细胞相关，且呈现出无生物学活性的构象，具有错配的或未形成的二硫键。不溶性重组蛋白通常是但非必然是包含在折射体中的，即在相差显微镜下它可以是或可以不是明显的。
在用于本文时，“离液剂”指在水溶液中有合适浓度时，能够通过多肽表面的变化而改变多肽的空间构型或构象从而使多肽可溶于该水性介质的化合物。所述变化可以通过改变例如水合状态、溶剂环境、或溶剂-表面相互作用而发生。离液剂的浓度将直接影响它的强度和效力。强变性的离液溶液在溶液中含有高浓度的离液剂，将有效地使溶液中存在的多肽解折叠，从而有效地消除该蛋白质的二级结构。解折叠可以是相对广泛的，但是可逆的。中等变性的离液溶液在溶液中含有足够浓度的离液剂，允许多肽从无论怎样的扭曲构象(该多肽通过在溶液中可溶的中间体所呈现的)部分折叠成如下的空间构象，其中当以其在内源的或同源的生理学条件下的活性形式运作时它发现它自己功能所在。离液剂的例子包括盐酸胍、尿素、和氢氧化物诸如氢氧化钠或氢氧化钾。离液剂包括这些试剂的组合，诸如氢氧化物与尿素或盐酸胍的混合物。
在用于本文时，“还原剂”指在水溶液中有合适浓度时，维持游离巯基，使得分子内或分子间二硫键遭到化学破坏的化合物。合适的还原剂的代表性例子包括二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、β-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸、半胱胺、巯基乙酸盐/酯、谷胱甘肽、和硼氢化钠。
在用于本文时，“缓冲溶液”指通过其酸-碱共轭(conjugate)组分的作用而耐受pH变化的溶液。
“细菌”为了本文包括真细菌和古细菌。在本发明的某些实施方案中，本文所述方法和工艺中使用真细菌，包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。在本发明的一个实施方案中，使用革兰氏阴性细菌，例如肠杆菌科。属于肠杆菌科的细菌的例子包括埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和志贺氏菌属(Shigella)。其它类型的合适细菌包括固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、和副球菌属(Paracoccus)。在本发明的一个实施方案中，使用大肠杆菌或大肠埃希氏菌(E.coli)。合适的大肠杆菌宿主包括大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)、大肠杆菌294(ATCC31,446)、大肠杆菌B、和大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)。这些例子是例示性的，而不是限制性的，而且W3110是一个例子。也可以采用任何上述细菌的突变细胞。当然，在选择适宜细胞时考虑复制子在细菌细胞中的复制性是必要的。例如，在使用本领域公知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177、或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可以合适地用作宿主。关于合适细菌宿主细胞的例子还可参见下文。
在用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”、“菌株”和“细胞培养物”可互换使用，而且所有这类名称都包括后代。如此，词语“转化子/转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞及由其衍生的培养物，不管转移的次数。还应理解，由于有意的或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上不是精确相同的。在最初转化细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的突变后代包括在内。若想做出不同的命名，上下文会有清楚的表述。
混合模式柱指所含有的树脂具有阳离子交换性质以及疏水相互作用的柱。
重组蛋白 重组蛋白(例如生长因子，诸如酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子)已经从包括细菌在内的许多来源中回收和纯化(SalterD.H.等，(1996)Labor.Invest.，74(2)546-556(VEGF)；Siemeister等，(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.，222(2)249-55(VEGF)；Cao等，(1996)J.Biol.Chem.，261(6)3154-62(VEGF)；Yang等，(1994)GaojishuTongxun，428-31(VEGF)；Anspach等，(1995)J.Chromatogr.A，711(1)129-139(aFGF和bFGF)；Gaulandris(1994)J Cell.Physiol.，161(1)149-59(bFGF)；Estape和Rinas(1996)Biotech.Tech.，10(7)481-484(bFGF)；McDonald等，(1995)FASEBJ.，9(3)A410(bFGF))。例如，VEGF的主要活性形式是两条165个氨基酸的多肽(VEGF-165)的同二聚体。在这种结构中，每个亚基包含7对链内二硫键和实现两个亚基的共价连接的另外两对(Ferrara等，(1991)J.Cell.Biochem.，47211-218)。天然构象包括一个强碱性结构域，其已经显示出易于结合肝素(Ferrara等(1991)同上)。虽然VEGF的共价二聚化是有效的受体结合和生物学活性所需要的(P
tgens等，(1994)J.Biol.Chem.，26932879-32885；Claffey等，(1995)Biochim.et Biophys.Acta，12461-9)，但细菌产物潜在地包含数个错误折叠的和二硫化物混乱的中间体。提供了可用于分离、纯化和再活化作为可溶性蛋白质以及以“折射体”形式出现于宿主细胞中的蛋白质的规程。
分离重组蛋白 不溶性的、错误折叠的重组蛋白可通过任何本领域标准技术分离自表达该蛋白质的原核宿主细胞。例如，在合适的分离缓冲液中分离不溶性重组蛋白，即将细胞暴露于合适离子强度的缓冲液以溶解大部分宿主蛋白质，但是在该溶液中受试蛋白质基本上是不溶性的，或者破碎细胞以从周质空间或胞内空间释放包涵体或蛋白质并且使得它们可通过例如离心来回收。这种技术是公知的，记载于例如美国专利号4,511,503。Kleid等人披露了通过匀浆继之以离心来纯化折射体(Kleid等，(1984)于Develo Dments in IndustrialMicrobiology，(Society for Industrial Microbiology，Arlington，VA)25217-235)。还可参见例如Fischer等，(1993)Biotechnology and Bioengineering，413-13。
美国专利号5,410,026记载了一种用于从包涵体中回收蛋白质的典型方法，并且概括如下。将原核细胞悬浮在合适的缓冲液中。典型地，缓冲液包含适于在pH5到9、或大约6到8之间进行缓冲的缓冲剂和盐。任何合适的盐，包括NaCl，可用于在该缓冲溶液中维持足够的离子强度。典型地，采用大约0.01到2M或0.1到0.2M的离子强度。细胞在悬浮在此缓冲液中时使用通常采用的技术破裂或溶解，诸如例如机械的方法，例如均质器(Manton-Gaulin压碎器、Microfluidizer、或Niro-Soavi)、弗氏压碎器(French press)、玻珠研磨机、或声波振荡器，或者通过化学的或酶学的方法。
化学的或酶学的破裂细胞方法的例子包括成原生质球，其中必须使用溶菌酶来溶解细菌壁(H.Neu等，(1964)Biochem.BioDhys.Res.Comm.，17215)；和渗压震扰，其中牵涉将活细胞用高张度的溶液处理并用低张度的冷水清洗以释放多肽(H.Neu等，(1965)J.Biol.Chem.，240(9)3685-3692)。通常使用超声处理来破裂分析规模体积的发酵液中所包含的细菌。在更大的规模上，典型地采用高压匀浆。
在细胞破裂之后，典型地将悬浮液在标准离心机中低速离心，一般在500到15,000xg左右，例如在本发明的一个实施方案中采用大约12,000xg，离心的时间足以使基本上所有的不溶性蛋白质沉淀。这类时间可以简单地确定，并且取决于离心的体积和离心的设计。典型地，大约10分钟到0.5小时足以沉淀不溶性蛋白质。在一个实施方案中，将悬浮液以12,000xg离心10分钟。
所得沉淀物包含基本上所有的不溶性蛋白质级分。如果细胞破裂工序是不完全的，那么该沉淀物可能还包含完整细胞或破裂的细胞碎片。细胞破裂的完全性可以通过在少量的相同缓冲溶液中重悬浮所得沉淀物并用相差显微镜检查该悬浮液而确定。破裂细胞碎片或完整细胞的存在指示进一步的超声处理或其它破裂手段是除去碎片或细胞及相关的非折射性多肽所必需的。在这样的进一步破裂之后，如果需要的话，再次离心悬浮液并回收沉淀物，再悬浮，并再检验。重复该工序直到直观检验揭示了沉淀的物质中没有破裂的细胞碎片或直到进一步处理没能减少所得沉淀物的体积。
无论不溶性蛋白质是细胞内的或在周质空间中都可以采用上述的方法。在本发明的一个实施方案中，本文中所给出的用于分离重组蛋白的条件是针对沉淀在周质空间或胞内空间中的包涵体的，而且特别涉及VEGF。然而，认为所述工艺和规程在如下所述略微变更后总体适用于重组蛋白。在本发明的某些实施方案中，所述工艺和规程适用于重组蛋白的制备或工业规模的生产、重折叠、和纯化。
在一个实施方案中，将沉淀物中分离的重组蛋白在第一缓冲溶液中温育，其足以基本上溶解该重组蛋白。此温育在允许期望量或基本上所有重组蛋白发生溶解的浓度、温育时间、和温育温度的条件下进行。
所述第一缓冲溶液包含适于将缓冲液的pH范围维持在至少大约9或更高、典型范围9-11的缓冲剂。在一个实施方案中，用于VEGF的pH是pH11。能提供后一种范围内的pH的合适缓冲剂的例子包括TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)、HEPPS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[3-丙烷-磺酸])、CAPSO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙烷磺酸)、CHES(2-[N-环己基氨基]乙烷磺酸)、精氨酸、赖氨酸和硼酸钠。在一个实施方案中，本文中的缓冲液包含约pH11的CHES和精氨酸。在另一个实施方案中，本文中的缓冲液包含约pH11的Tris和精氨酸。在一个实施方案中，本文中的缓冲液包含约pH11的CHES。在另一个实施方案中，本文中的缓冲液包含约pH11的Tris。在某些实施方案中，所述第一缓冲溶液包括离液剂。
适于实施本发明的离液剂包括例如尿素和胍或硫氰酸的盐，例如尿素、盐酸胍、硫氰酸钠等。缓冲液中必需存在的离液剂的量是足以在溶液中解折叠重组蛋白的量。在本发明的某些实施方案中，离液剂在大约0.5-5摩尔之间存在。在本发明的一个买施方案中，离液剂是大约1M的尿素。
缓冲溶液中的蛋白质浓度必须使得根据光密度的测定来看该蛋白质基本上溶解。采用的精确量将取决于例如缓冲溶液中其它成分的浓度和类型，特别是蛋白质的浓度、离液剂、和缓冲液的pH。在本发明的一个实施方案中，重组蛋白的浓度范围是0.5-5.5mg/ml，或1.5-5.0mg/ml。溶解典型地在大约0-45℃、或大约2-40℃、或大约20-40℃、或大约23-37℃、或大约25-37℃、或大约25℃进行至少大约1-24小时。典型地，温度不会受到盐、还原剂和离液剂水平的明显影响。在某些实施方案中，所述溶解在大气压进行。
缓冲溶液中溶解程度的测量可以测定和适当地实施，例如通过浊度测定、通过分析离心后上清液和沉淀物之间的分级、通过还原性SDS-PAGE、通过蛋白质测定法(例如Bio-Rad蛋白质测定试剂盒)、或通过HPLC。
任选地，破坏后的细胞不离心但稀释，例如在本文所述第二缓冲溶液(重折叠缓冲液)中的1:4、1:6、1:8。此温育在允许重组蛋白发生溶解和重折叠的浓度、温育时间、和温育温度的条件下进行。在一个实施方案中，大约30％或更多的重组蛋白溶解或重折叠。
重折叠重组蛋白 在多肽溶解后，或者，细胞遭到破坏后，将它放入或稀释至第二缓冲溶液中，所述第二缓冲溶液含有至少一种还原剂，和离液剂，其浓度允许重组蛋白发生重折叠，同时通入空气或氧气，例如使用恒定的容量传质系数(volumetric mass transfer coefficient)kLa＝0.004至0.1min-1(例如对于具有船用型叶轮的2.5L容器，空气鼓泡速率是0.3-10cc/min/L、0.3-3cc/min/L或1cc/min/L或25cc/min/L，而混合速度是200-400rpm)。用于重折叠反应的氧气或空气可以通过空气源或富氧压缩气体源来提供。从气相至液相的传质效率通过搅拌、鼓泡和增压来控制，并通过容量传质系数kLa捕捉。参见例如Blanch和Clark，Biochemical engineering，Marcel Dekker，NewYork，1997；及Aunins和Henzler，Aeration in cell culture bioreactors，于BiotechnologyAmulti-volume comprehensive treatise，G.Stephanopoulos编，Weinheim，NewYork，1993，第219-281页。在一个实施方案中，使用0.004min-1的kLa，在具有船用型叶轮的2.5L容器中其表示200-400rpm混合速率和0.3cc/min/L的鼓泡速率。在其它实施方案中，使用kLa＝0.01min-1或0.1min-1以生产正确折叠的蛋白质。
在本发明的某些实施方案中，所述第二缓冲溶液含有两种或更多种还原剂。多肽可以用重折叠缓冲液稀释，例如至少5倍、或至少大约10倍、或大约20倍、或大约40倍。可溶性的、解折叠的蛋白质的此第二温育的条件通常使得期望量的或基本上的或全部的蛋白质发生重折叠。确切的条件将取决于例如缓冲液的pH及存在的离液剂和还原剂的浓度和类型。温育温度通常是大约0-40℃，而且温育通常进行至少大约1小时至大约48小时以实现重折叠。在某些实施方案中，该反应在例如大约0-45℃、或大约2-40℃、或大约20-40℃、或大约23-37℃、或大约25-37℃、或大约25℃进行至少大约3小时、至少大约10小时、或大约3和30小时之间、或大约3和24小时之间。在某些实施方案中，该反应在大气压进行。
所述第二缓冲溶液包含适于将缓冲液的pH范围维持在至少大约9或高于9、典型范围9-11的缓冲剂，离液剂，和至少一种还原剂。在某些实施方案中，所述第二缓冲溶液包含两种或更多种还原剂。在一个实施方案中，用于VEGF的pH是pH10。能提供后一种范围内的pH的合适缓冲剂的例子包括TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)、HEPPS(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[3-丙烷-磺酸])、CAPSO(3-[环己基氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、CAPS(3-[环己基氨基]-1-丙烷磺酸)、CHES(2-[N-环己基氨基]乙烷磺酸)、精氨酸、赖氨酸和硼酸钠。在一个实施方案中，本文中的第二缓冲溶液包含约pH10的CHES和精氨酸(终浓度分别约为10mM和100mM的浓度)及两种或更多种还原剂和至少一种离液剂。在另一个实施方案中，本文中的第二缓冲溶液包含约pH10的Tris和精氨酸(终浓度分别约为10mM和100mM的浓度)及两种或更多种还原剂和至少一种离液剂。
精氨酸(或另一种带正电荷的氨基酸)例如L-精氨酸/HCl可以存在于第一缓冲溶液和第二缓冲溶液中。在本发明的某些实施方案中，精氨酸的浓度是例如终浓度大约50-500mM、大约75-300mM、或大约100-300mM、或大约100mM或300mM等。在本发明的某些实施方案中，所述蛋白质在第一缓冲溶液中，所述第一缓冲溶液其pH大于9且含有终浓度0.5-3M尿素、50-500mM精氨酸和5mM EDTA。在一个实施方案中，使用终浓度10mM CHES。在另一个实施方案中，使用终浓度10mM Tris。在一个实施方案中，所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH11。在另一个实施方案中，所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM Tris、5mM EDTA，pH11。在本发明的某些实施方案中，所述蛋白质在第二缓冲溶液(重折叠缓冲溶液)中，所述第二缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且含有终浓度0.5-3M尿素、50-500mM精氨酸、0.25-1mM DTT、5-20mM半胱氨酸、和2-10mM EDTA。在一个实施方案中，使用终浓度10mM CHES。在另一个实施方案中，使用终浓度10mMTris。在一个实施方案中，所述蛋白质在重折叠缓冲溶液中，所述重折叠缓冲溶液含有终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mMCHES、5mM EDTA，pH9-10。在另一个实施方案中，所述蛋白质在重折叠缓冲溶液中，所述重折叠缓冲溶液含有终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mMTris、5mM EDTA，pH9-10。
如所述的，该溶液还含有至少一种还原剂。合适的还原剂的例子包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(BME)、半胱氨酸、DTE等。缓冲液中存在的还原剂的量将主要取决于还原剂和离液剂的类型、所采用的缓冲液的类型和pH、溶液中包含或引入的氧的量、及缓冲液中蛋白质的浓度。例如，还原剂合适地选自那些上文所述的，其浓度范围是半胱氨酸为大约0.5到大约20mM、DTT为0.25-3.0mM(例如0.5-2mM DTT)、和BME为小于大约0.2mM。在本发明的一个实施方案中，有两种或更多种还原剂，例如大约0.5-2mM的DTT和0.5至大约20mM的半胱氨酸。尽管一般而言DTT和BME可以与本文中为重组蛋白提供的规程联合使用，如上文所述的，大约15mM的半胱氨酸与DTT的组合是用于回收VEGF的一个例子。在一个实施方案中，所述还原剂是终浓度大约2mM的DTT及15mM半胱氨酸。在另一个实施方案中，所述还原剂是终浓度大约0.5mM的DTT及15mM半胱氨酸。
第二缓冲溶液含有至少一种离液剂，该离液剂的浓度使得重组蛋白发生重折叠。通常，离液剂以大约0.5和2摩尔之间的终浓度存在。在本发明的一个实施方案中，本文中的离液剂是尿素，其终浓度是大约0.5-2M、0.5-2M、或大约1M。在本发明的另一个实施方案中，离液剂是盐酸胍，其终浓度是大约0.1-1M。
重折叠缓冲液可任选地含有别的试剂，诸如任何非离子型去污剂，诸如TRITONTM X-100、NONIDETTM P-40、TWEENTM系列和BRIJTM系列。非离子型去污剂以大约在0.01％和1.0％之间的终浓度存在。在一个例子中，非离子型去污剂的浓度在大约0.025％和0.05％之间或者大约0.05％终浓度。
重折叠的程度如下合适的测定，即通过使用例如rpHPLC层析柱、阳离子交换HPLC(SP-5PW TSK凝胶柱，Tosoh Bioscience LLC)或其它合适的肝素亲和柱的高效液相层析(HPLC)分析。阳离子交换HPLC测定法或肝素结合HPLC测定法中正确折叠重组体峰大小增加直接对应于存在于缓冲液中的折叠的、有生物学活性的重组蛋白的量增加。进行温育以最大化所回收的正确折叠重组蛋白对错误折叠重组蛋白的比率，其通过rpHPLC来测定。
在一个实施方案中，正确折叠的VEGF的质量和数量使用肝素结合测定法来评估。将包含稀释的重组蛋白的样品加载到例如肝素-5PW柱(7.5x75mm，Tosoh Biosciences LLC，Tokyo，Japan)或其它合适的肝素亲和柱上。例如，在含有0.15M氯化钠的10mM磷酸钠pH7.4中平衡肝素-5PW柱。以1ml/min或2ml/min的流速，使用10分钟的10mM磷酸钠pH7.4中的0.15-2M氯化钠线性梯度洗脱该柱。在280nm处监测洗脱液。在一个实施方案中，在对应于有生物学活性的、正确重折叠的VEGF的单一峰中回收蛋白质。在本发明的一个实施方案中，用于测定正确重折叠的VEGF的测定法是RPHPLC。任选地，可以通过肽图来证实二硫键连接。圆二色性也可用于测定二维和三维结构/折叠。
在一个实施方案中，溶解和重折叠在一步中实施。获得遭破坏的细胞沉淀物后，将其放入或稀释至上文所述的第二缓冲溶液中(在这种情况中称为组合缓冲溶液)。多肽可以用该组合缓冲溶液稀释，例如至少5倍，或至少大约10倍，或大约20倍，或大约40倍。沉淀物的此温育的条件通常使得期望量的或基本上的或全部的蛋白质发生溶解和重折叠，且通入空气或氧气。在一个实施方案中，使用0.004min-1的kLa，在具有船用型叶轮的2.5L容器中其表示200-400rpm混合速率和0.3cc/min/L鼓泡速率。在其它实施方案中，使用kLa＝0.01min-1或0.1min-1以生产正确折叠的蛋白质。确切的条件将取决于例如缓冲液的pH及存在的离液剂和还原剂的类型和浓度。温育温度通常是大约0-40℃，而且温育通常进行至少大约1至48小时以实现溶解和重折叠。在一个实施方案中，该反应在例如大约0-45℃、或大约2-40℃、或大约20-40℃、或大约23-37℃、或大约25-37℃、或大约25℃进行至少大约3小时、至少大约10小时、或大约3和48小时之间、或大约3和20小时之间。在某些实施方案中，该反应在大气压进行。
回收和纯化重组蛋白 虽然回收和纯化重组蛋白可以采用用于分离此类蛋白质的各种方法和已知规程，诸如例如盐和溶剂分级、胶体材料的吸附、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、免疫亲和层析、电泳和高效液相层析(HPLC)，描述了澄清步骤和多步骤层析规程的一个例子。澄清步骤包括将去污剂添加至终浓度1％(例如Triton-X-100)，将pH调节至大约8.5-9.5(或大约8.7或大约9)，在25-30℃温育溶液达1-10小时，离心溶液；及过滤自离心步骤回收的液体。多步骤层析规程包括使所述重折叠的重组蛋白接触混合模式树脂、阳离子层析支持物、和第一疏水层析支持物，及任选的第二疏水层析支持物或离子交换支持物；并且从每个支持物上选择性回收或洗脱该重组蛋白。任一规程的各步骤可以以任意次序实施。在本发明的一个实施方案中，所述步骤是相继实施的。
进一步回收和纯化重组蛋白中的合适的第一步骤特征性提供了重组蛋白的浓缩和样品体积的减少。例如，上面所述第二温育步骤可以导致回收的重组蛋白的体积大大增加及蛋白质在重折叠缓冲液中的伴随稀释。合适的第一层析支持物提供了回收的重组蛋白的体积减小，并且可以有利地提供从不想要的污染性蛋白质中一定程度的纯化蛋白质。合适的第一层析步骤包括可以洗脱并直接加载到第二疏水支持物上的层析支持物。
例示性的第一层析支持物包括但不限于混合模式树脂(例如CaptoMMCTM，GE Healthcare，或MEP Hypercel，Pall Corporation)、羟磷灰石层析支持物，例如I型和II型CHT陶瓷(以前称为MacroPrep陶瓷)、Bio-Gel HT、Bio-Gel HTP(Biorad，Hercules，CA)等；金属螯合层析支持物，其由固定化金属离子诸如铜、镍等的惰性树脂组成；以及非衍生化硅胶。在本发明的一个实施方案中，用于VEGF的纯化和回收的第一层析支持物是混合模式离子交换层析支持物。自第一层析支持物洗脱是依照本领域标准实践实现的。合适的洗脱条件和缓冲液将便于洗脱的重组蛋白直接加载到如下所述的阳离子层析支持物上。
多种阴离子组分可附着于基质以形成用于层析的阳离子支持物。阴离子组分包括羧甲基、巯乙基(sulfethyl)、磺丙基、磷酸根和磺酸根(S)。纤维素离子交换树脂诸如SE52、SE53、SE92、CM32、CM52、CM92、P11、DE23、DE32、DE52、EXPRESS IONTM S和EXPRESS IONTM C可从Whatman LTD，Maidstone Kent U.K获得。还知道基于SEPHADEXTM和SEPHAROSETM的且交联的离子交换剂，产品名称是CM SEPHADEXTM C-25、CM SEPHADEXTMC-50和SP SEPHADEXTM C-25、SP SEPHADEXTM C-50和SP-SEPHAROSETMHigh Performance、SP-SEPHAROSETM XL、SP-SEPHAROSETM Fast Flow、CM-SEPHAROSETM Fast Flow、及CM-SEPHAROSETM CL-6B，都可以从Pharmacia AB获得。用于实施本发明的离子交换剂的例子包括但不限于例如其商品名为MACROPREPTM的离子交换剂，诸如例如来自BioRad，Hercules，CA的MACROPREPTM S支持物、MACROPREPTM High S支持物和MACROPREPTM CM支持物。
自阳离子层析支持物的洗脱通常通过提高盐浓度来实现。因为自离子柱的洗脱牵涉添加盐，而且因为，如本文所述的，HIC在盐浓度中是增强的，所以任选在离子步骤或其它盐步骤之后引入HIC步骤。在本发明的一个实施方案中，阳离子交换层析步骤至少在HIC步骤之前，例如第一疏水相互作用层析支持物和/或第二疏水相互作用。
疏水柱可以用于纯化该重组蛋白，例如在第2、第3和/或第4纯化步骤中。疏水相互作用层析是本领域公知的，并且依赖分子的疏水部分与附着于“层析支持物”的疏水配体的相互作用。偶联至基质的疏水配体各式各样的称作HIC层析支持物、HIC凝胶、或HIC柱等。还应领会，蛋白质与HIC柱之间的相互作用的力量不只是蛋白质上非极性表面对极性表面的比例的函数，还是非极性表面的分布的函数。
许多基质可用于制备HIC柱。最广泛使用的是琼脂糖，虽然硅土和有机聚合物树脂也可以使用。有用的疏水配体包括但不限于具有大约2到大约10个碳原子的烃基(诸如丁基、丙基、或辛基)或者芳基(诸如苯基)。用于凝胶和柱的常规HIC支持物可以购自以下供应商，诸如Pharmacia，Uppsala，Sweden，产品名称为丁基-SEPHAROSETM、丁基-SEPHAROSETM-Fast Flow、苯基-SEPHAROSETM CL-4B、辛基SEPHAROSETM FF和苯基SEPHAROSETMFF及Tosoh Corporation，Tokyo，Japan，产品名称为TOYOPEARLTM丁基650M(Fractogel TSK Butyl-650)或TSK-GEL苯基5PW。
配体密度是一项重要的参数，因为它不仅影响蛋白质相互作用的强度，还影响柱的容量。可商购的苯基或辛基苯基凝胶的配体密度是5-40μmol/ml凝胶床的数量级。凝胶容量是所讨论具体蛋白质以及pH、温度和盐浓度的函数，但是通常可以预计落在3-20mg/ml凝胶的范围内。
具体凝胶的选择可以由熟练技术人员来确定。一般而言，蛋白质与HIC配体相互作用的强度随着烃基配体的链长而增加，但是具有大约4到大约8个碳原子的配体适于大部分分离。苯基具有与戊基大致相同的疏水性，虽然选择性可以是不同的，这要归于与蛋白质芳香基的π-π相互作用的可能性。
高的盐浓度有利于蛋白质吸附至HIC柱，但是实际浓度可以在很大范围内变化，这取决于蛋白质的性质和所选择的具体HIC配体。通常使用大约1和4M之间的盐浓度。
自HIC支持物洗脱，无论是分步的或者是梯度的形式，可以通过多种方式来实现，诸如a)通过改变盐浓度，b)通过改变溶剂的极性，或c)通过添加去污剂。通过降低盐浓度，吸附的蛋白质按照疏水性升高的次序洗脱下来。可以通过添加溶剂诸如乙二醇或异丙醇来实现极性方面的改变，由此降低疏水相互作用的强度。去污剂发挥蛋白质的置换物的功能，而且已经主要用于膜蛋白的纯化。
用于纯化VEGF的方法的例子在下文有描述，例如参见实施例4和5。
表达重组蛋白 简言之，将能够相对于宿主原核细胞基因组自主复制并表达蛋白质的表达载体导入宿主细胞。适宜表达载体的构建是本领域公知的，包括本文中所描述的重组蛋白的核苷酸序列。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，New York)(2001)；Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols John Wiley and Sons(New Jersey)(2002)；及Baneyx，(1999)CurrentOpinion in Biotechnology，10411-421。适宜原核细胞(包括细菌)、表达载体可购自例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，Maryland。用于大规模培养原核细胞(尤其是细菌细胞)培养物的方法是本领域公知的，这些方法可用于本发明的内容。
例如，将原核宿主细胞用编码感兴趣重组蛋白的表达载体或克隆载体转染，并在常规营养培养基中培养，该培养基酌情为诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而进行改良。编码感兴趣多肽的核酸可以恰当的是任何来源的RNA、cDNA、或基因组DNA，只要它编码感兴趣多肽。选择用于在微生物宿主中表达异源多肽(包括其变体)的适宜核酸的方法是本领域公知的。通过本领域已知的多种方法制备编码多肽的核酸分子。例如，将编码VEGF的DNA分离并测序，例如通过利用能够特异性结合编码VEGF的基因的寡核苷酸探针。
将异源核酸(例如cDNA或基因组DNA)恰当的插入可复制载体，用于在合适启动子的控制下在微生物中表达。许多载体可用于此目的，而且适宜载体的选择将主要取决于将插入载体的核酸的大小及将用该载体转化的具体宿主细胞。每种载体包含多种构件，其取决于它与之相容的具体宿主细胞。取决于宿主的具体类型，载体构件通常包括但不限于以下一项或多项信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、启动子、和转录终止序列。
通常，与微生物宿主一起使用包含衍生自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体。载体通常携带一个复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，一般用pBR322转化大肠杆菌，pBR322是衍生自大肠杆菌物种的质粒(参见例如Bolivar等，(1977)Gene，2:95)。pBR322包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因，并如此提供鉴定转化细胞的容易方法。pBR322质粒或其它细菌质粒或噬菌体还通常包含或经修饰而包含能被宿主用于表达可选择标志基因的启动子。
(i)信号序列 本发明的多肽不仅可以直接地重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽来生产，该异源多肽一般是在成熟蛋白质或多肽的N-末端的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。一般选择受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的异源信号序列。对于那些不识别并加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞而言，该信号序列用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定的肠毒素II前导的原核信号序列替代。
(ii)复制起点构件 表达载体包含使得载体能够在一种或多种选出的宿主细胞中复制的核酸序列。多种微生物的此类序列是公知的。质粒pBR322的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌，诸如大肠杆菌。
(iii)选择基因构件 表达载体通常包含选择基因，也称为可选择标志物。该基因编码在选择性培养基中培养的经过转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中不会存活。这种可选择标志物与本发明所利用的和所定义的遗传标志物是不同的。典型的选择基因编码如下蛋白质(a)其赋予针对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤、或四环素，(b)其补足不是由遗传标志物的存在而引起的营养缺陷，或(c)其提供不能从复合培养基中得到的关键营养物，例如用于芽胞杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用药物来阻抑宿主细胞的生长。在这种情况中，用感兴趣核酸成功转化的细胞生成赋予耐药性的多肽并如此从该选择方案中存活下来。这样的显性选择的例子使用药物新霉素(Southern等，(1982)J.Molec.Appl.Genet.，1327)、霉酚酸(Mulligan等，(1980)Science，2091422)或潮霉素(Sugden等，(1985)Mol.Cell.Biol.，5410-413)。上文给出的这三个例子采用真核控制下的细菌基因来传送分别针对适宜药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)、或潮霉素的抗性。
(iv)启动子构件 用于生成感兴趣重组蛋白的表达载体包含受到宿主生物体识别且与编码感兴趣多肽的核酸可操作连接的合适启动子。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等，(1978)Nature，275615；Goeddel等，(1979)Nature，281544)、阿拉伯糖启动子系统(Guzman等，(1992)J.Bacteriol.，1747716-7728)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，(1980)Nucleic Acids Res.，84057及EP36,776)及杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。它们的核苷酸序列已经公布，由此使得熟练工作人员能够使用接头或衔接头提供任何需要的限制性位点以将其可操作连接至编码感兴趣多肽的DNA(Siebenlist等，(1980)Cell，20269)。还可参见例如Sambrook等，同上；及Ausubel等，同上。
在细菌系统中使用的启动子通常还包含与编码感兴趣多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。可以通过限制酶消化从细菌来源DNA中切下启动子并将其插入包含期望DNA的载体。
(v)载体的构建和分析 使用标准连接技术构建包含一个或多个上文所列构件的合适载体。将分离的质粒或DNA片段切割，剪裁，并再连接成产生所需质粒需要的形式。
为了分析以证实所构建质粒中的正确序列，使用连接混合物转化大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31,446)或其它菌株，并通过适当的氨苄青霉素或四环素抗性选择成功的转化子。从该转化子中制备质粒，并通过限制性内切核酸酶消化进行分析，和/或通过Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467或Messing等，(1981)Nucleic Acids Res.，9309的方法或者通过Maxam等，(1980)Methods in Enzymology，65499的方法测序。还可参见例如Sambrook等，同上；及Ausubel等，同上。
将编码感兴趣重组蛋白的核酸插入宿主细胞。一般地，这是通过用上文所述表达载体转化该宿主细胞并在为了诱导各种启动子而酌情改良的常规营养培养基中培养而实现的。
培养宿主细胞 用于实施本发明的合适原核细胞是本领域公知的。一般使用那些以包涵体形式或者在周质空间或胞内空间中大量表达重组蛋白的宿主细胞。合适的原核生物包括细菌，例如真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)、芽胞杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽胞杆菌(B.subtilis)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。大肠杆菌宿主的一个例子是大肠杆菌294(ATCC 31,446)。其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的而不是限制性的。菌株W3110是一种典型的宿主，因为它是用于重组DNA产品发酵的常用宿主菌株。在本发明的一个方面，宿主细胞会分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110以实现编码蛋白质的基因中的遗传突变，这样的宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2、27A7、27B4、和27C7，其记载于1995年4月25日公告的美国专利号5,410,026。例如，用于生产VEGF的一种菌株是具有基因型tonAΔ ptr3phoAΔE15Δ(argF-lac)169degP41ilvg的大肠杆菌菌株W3110，称为49B3。还可参见例如WO2004/092393跨越页码23-24的表格。
用于生产感兴趣重组蛋白的原核细胞在本领域已知的且适于培养所选择的宿主细胞的培养基中进行培养，包括Sambrook等，MolecularCloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，New York)(2001)中一般性描述的培养基。适合于细菌的培养基包括但不限于AP5培养基、营养肉汤、Luria-Bertani(LB)肉汤、Neidhardt氏极限培养基、和C.R.A.P.极限或完全培养基，加上必需的营养补充物。在某些实施方案中，培养基还包含选择剂，其根据表达载体的构造来选择，以选择性允许包含表达载体的原核细胞生长。例如，将氨苄青霉素添加至培养基以用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞。还可以以适宜浓度包含在碳、氮、和无机磷酸盐源之外的任何必需补充物，或是独自引入或是作为与另一补充物或培养基的混合物诸如复合氮源。任选地，培养基可以包含一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基醋酸盐/酯、二硫赤藓糖醇、和二硫苏糖醇。
美国专利号5,304,472和5,342,763给出了合适培养基的例子。C.R.A.P.磷酸盐限制培养基含3.57g(NH4)2(SO4)，0.71g二水合柠檬酸钠，1.07g KCl，5.36g酵母提取物(经过鉴定的)，5.36g HycaseSFTM-Sheffield，用KOH调节pH至7.3，用去离子水调整体积至872毫升，并高压灭菌；冷却至55℃，并补充110ml 1M MOPS pH7.3，11ml 50％葡萄糖，7ml 1M MgSO4。然后可以向诱导培养基添加羧苄青霉素至50μg/ml的浓度。
在合适的温度培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌的培养，例如温度范围为例如大约20℃到大约39℃，或者大约25℃到大约37℃，或者大约30℃。
若使用碱性磷酸酶启动子，则在合适培养基中培养用于生产本发明感兴趣多肽的大肠杆菌细胞，其中可以如例如Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor，New York)(2001)一般性描述的部分地或完全地诱导碱性磷酸酶启动子。培养不能在缺乏无机磷酸盐或者在磷酸盐饥饿水平进行。首先，培养基包含无机磷酸盐，其量高于诱导蛋白质合成且足以使细菌生长的水平。随着细胞生长并利用磷酸盐，它们降低了培养基中的磷酸盐水平，由此引起多肽合成的诱导。
如果启动子是可诱导型启动子，那么为了让诱导发生，一般培养细胞直到达到某光密度，例如使用高细胞密度工序时大约200的A550，在这个点启动诱导(例如通过添加诱导物，通过耗尽培养基的一种成分等)，以诱导编码感兴趣多肽的基因的表达。
还可以包含本领域技术人员知道的适宜浓度的任何必需补充物，或是独自引入或者作为与另一补充物或培养基的混合物诸如复合氮源。培养基的pH可以是大约5到9中的任何pH，这主要取决于宿主生物体。对于大肠杆菌，pH是例如大约6.8到大约7.4，或者大约7.0。
重组蛋白的用途 如此回收的多肽可以在药学可接受的载体中配制，并用于此类分子已知的各种诊断、治疗、或其它用途。例如，本文中所描述的蛋白质可用于免疫测定法，诸如酶免疫测定法。
还涵盖使用本文中所描述的方法获得的重组蛋白的治疗用途。例如，生长因子或激素，例如VEGF，可用于根据需要增强生长。例如，VEGF可用于促进伤口愈合，例如急性伤口(例如烧伤、手术伤口、正常的伤口等)或慢性伤口(例如糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、褥疮(decubitus ulcer)、静脉曲张性溃疡等)；促进毛发生长；促进组织生长和修复等。
供贮存的重组蛋白治疗用配制剂是如下制备的，混合具有期望纯度的分子(例如多肽)与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington′sPharmaceutical Sciences第18版，Osol，A.编(1995))，以冻干剂型或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基双甲基苄基铵；氯己双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方案中，用于体内施用的配制剂是无菌的。这易于通过无菌滤膜的过滤来实现。重组蛋白可以冻干形式或者作为水溶液或凝胶形式来贮存。重组蛋白制剂的pH可以是例如大约4到8(在一个实施方案中，pH5.0)，虽然在某些情况中更高或更低的pH值可能也是合适的。可以理解，使用某种赋形剂、载体、或稳定剂可以导致重组蛋白的盐的形成。
多肽施用的路径与已知方法一致，例如表面施用，通过静脉内的、腹膜内的、脑内的、肌内的、眼内的、动脉内的或损伤内的路径进行的注射或输注，或通过下文所述持续释放系统。多肽可以通过输注或通过推注而连续施用。
一般地用于伤口愈合时，重组蛋白配制成用于位点特异性的递送。当表面地使用时，重组蛋白适合同其它成分相组合，诸如载体和/或助剂。对于此类其它成分的性质没有限制，只是它们必须是药学可接受的且对于它们的预定施用是有效的，而且不能显著降低组合物的活性成分的活性。合适的媒介的例子包括软膏剂、乳膏剂、凝胶剂、喷雾剂、或悬浮液，有或者没有纯化的胶原。组合物也可以注入无菌敷料、透皮贴片、膏药、和绷带中，任选以液体或半液体的形式。
为了获得凝胶配制剂，在液态组合物中配制的重组蛋白可以与有效量的水溶性多糖或合成聚合物诸如聚乙二醇混合以形成具有适于表面应用的适当粘性的凝胶。可以使用的多糖包括例如纤维素衍生物诸如醚化纤维素衍生物，包括烃基纤维素、羟烃基纤维素、和烷烃基羟烃基纤维素，例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羟丙基纤维素；淀粉和分级淀粉；琼脂；海藻酸和海藻酸盐/酯；阿拉伯树胶；pullullan；琼脂糖；角叉菜胶；右旋糖苷；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖；和合成生物聚合物；以及胶，诸如黄胞胶；瓜尔胶；豆角胶(locust bean gum)；阿拉伯树胶；黄蓍胶；和卡拉雅胶(karayagum)；及其衍生物和混合物。在本发明的某些实施方案中，本文中的胶凝剂是例如对生物学系统惰性的、无毒的、易于制备的、和/或不太松软的或粘性的、以及不会使其中的重组蛋白不稳定的一种胶凝剂。
在本发明的某些实施方案中，多糖是醚化的纤维素衍生物，在另一个实施方案中，是明确定义的、纯化的、和美国药典中所列的，例如甲基纤维素和羟烃基纤维素衍生物，诸如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、和羟丙基甲基纤维素。在一个实施方案中，甲基纤维素就是多糖。
可用于胶凝的聚乙二醇一般是低和高分子量聚乙二醇的混合物以获得适当的粘性。例如，分子量400-600的一种聚乙二醇与分子量1500的一种聚乙二醇的混合物在以适当的比率混合以获得糊状物时对于此目的将是有效的。
术语“水溶性的”在应用于多糖和聚乙二醇时是指包括胶状溶液和分散体。通常，纤维素衍生物的可溶性由醚基团的取代程度决定，而且本文中有用的稳定衍生物应当在纤维素链的每一脱水葡萄糖单元上有足够数量的此类醚基团，以使得衍生物可溶于水。每个脱水葡萄糖单元中至少0.35个醚基团的醚取代程度通常是足够的。另外，纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例如Li、Na、K、或Cs盐。
如果在凝胶中采用例如甲基纤维素，那么它构成该凝胶的大约2-5％、或大约3％、或大约4％或大约5％，而且重组蛋白以大约300-1000mg/ml凝胶的量存在。
活性成分还可以封装在制备好的微胶囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合，例如分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊；在胶体药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)中；或在粗乳状液中。此类技术披露于Remington’sPharmaceutical Sciences第18版，Osol，A.编(1995)。还可参见Johnson等，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，＂Design and Production of SingleImmunizationVaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems＂，于Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman编，(Plenum PressNew York，1995)，第439-462页；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/07399；及美国专利No.5,654,010。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质处于成形制品(例如软片或微胶囊)形式。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非可降解性乙烯-乙酸乙烯、可降解性乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射性微球体)、聚-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)聚合物、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放超过100天，但是某些水凝胶在更短的时间期限释放蛋白质。在封装的蛋白质长时间保留在体内时，它们可能因为暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和可能的免疫原性变化。根据牵涉的机制，可以为了稳定化而设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制通过thio-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可以如下实现稳定化，即修饰巯基，自酸性溶液冻干，控制含水量，使用适当的添加剂，及开发特殊的聚合物基质组合物。
持续释放多肽组合物还包括装在脂质体中的多肽。包含蛋白质的脂质体通过本身已知的方法制备DE 3,218,121；EDstein等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692；Hwang等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，7740304034；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请83-118008；美国专利No.4,485,045和4,544,545；及EP 102,324。通常，脂质体是小的(大约200-800埃)单层型的，其中脂质含量高于大约30mol.％胆固醇，调节选择的比例，用于使用多肽的最有效疗法。
治疗上待采用的重组蛋白的有效量将取决于例如治疗目标、施用路径、及患者的状态。因而，治疗学家必需测定剂量，并在需要时修改施用路径以获得最有益的治疗效果。典型的日常剂量的范围可以自大约1μg/kg直至10mg/kg或更多，取决于上文提及的因素。典型地，临床医生会施用多肽直至达到的剂量取得期望的效果。患者也可以在临床医生的指导下施用多肽。该疗法的进展容易通过常规测定法监测。
以下实施例是作为例示而非作为限制提供的。
实施例 实施例1在大肠杆菌中表达的重组人VEGF的溶解和重折叠 方法 用于VEGF165表达的质粒——质粒pVEGF171设计用于在大肠杆菌周质中表达人类VEGF165(参见例如Leung等，(1989)Science，2461306-1309)。VEGF编码序列的转录位于碱性磷酸酶(AP)启动子的紧密控制下(参见例如Kikuchi等，(1981)Nucleic Acids Research，95671-8)，而翻译起始所需的序列由trp Shine-Dalgarno区提供(参见例如Yanofsky等，(1981)Nucleic AcidsResearch，96647-68)。VEGF编码序列融合在细菌热稳定肠毒素II(STII)信号序列的下游(参见例如Lee等，(1983)Infect.Immun.42264-8；及Picken等，(1983)Infect.Immun.42269-75)以便随后分泌进入大肠杆菌周质。STII信号序列中的密码子修饰提供了受到调节的翻译水平，这在周质中产生最佳的VEGF积累水平(参见例如Simmons和Yansura，(1996)Nature Biotechnoloy，14629-34)。λto转录终止子(参见例如Scholtissek和Grosse，(1987)Nucleic AcidsResearch，153185)位于VEGF转录终止密码子的下游。复制起点、及氨苄青霉素和四环素抗性基因由质粒pBR322提供。参见例如Bolivar等，(1977)Gene，295-113。
细胞匀浆和折射体制备——使用Microfluidizer或Niro Soavi以高于8000psid的压力使来自生产重组蛋白的大肠杆菌细胞的全细胞培养液匀浆。将匀浆物用160mM MgSO4，0.0375硫酸右旋糖苷和1％Triton X-100稀释1:1，之后通过离心(BTUX离心机，Alfa Laval，Sweden)收获沉淀物。
溶解和重折叠——将沉淀物(例如1克)悬浮于4倍体积(例如4ml)的溶解缓冲液终浓度为1M尿素/300mM精氨酸、10mM Tris或CHES、5mMEDTA，pH11，(4L/kg沉淀物)。将悬浮液在室温(15-30℃)彻底混合1-2小时。通过每个体积的溶解缓冲液添加3倍体积(1:4v/v)的缓冲液来启动重折叠，这导致重折叠缓冲液的最终浓度是1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM Tris或CHES、5mM EDTA，pH9-10。搅拌混合物，且在室温以恒定的容量传质系数kLa(例如对于2.5L容器中的空气鼓泡，kLa＝0.004至0.01min-1，鼓泡速率是0.3-3cc/min/L且混合速度是200-400rpm)通入空气或氧气达6-24小时。参见图1，其显示了重折叠的时间过程。任选地，可以在6小时后通过通入替代空气的氮气(例如对于2.5L罐体为0.3-3cc/min/L)来使VEGF在重折叠缓冲液中稳定。参见图7。通过SDS-PAGE、阳离子交换HPLC和rpHPLC层析、和/或肝素HPLC监测折叠。
通过在含有中度水平的变性剂和还原剂的高pH缓冲液中重折叠而观察到处理体积的显著下降(5倍)同时维持回收的VEGF二聚体的产量。该方法适用于其它重组蛋白(例如其它生长因子)的重折叠。
实施例2大肠杆菌中表达的重组人VEGF的单步骤溶解和重折叠 溶解和重折叠——对于每kg的细胞沉淀物，使该沉淀物在10-39升体积的重折叠缓冲液(在这种情况中称为“组合缓冲溶液”)中悬浮，其中所述组合缓冲溶液含有终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5或2mM DTT、100mM精氨酸、10mM Tris或CHES、5mM EDTA，pH9.5-10.5。参见图6，其显示了在重折叠缓冲溶液中添加尿素和精氨酸的效果。图6显示了如本实施例中所述的1步沉淀物重折叠(组合缓冲溶液)在pH9.5在室温进行15小时的结果。变性剂浓度是不同的，如下(1)1M尿素和100mM精氨酸；(2)1M尿素(和0mM精氨酸)；(3)2M尿素(和0mM精氨酸)，而所有的其它缓冲液成分(例如Tris或CHES、DTT等)保持在相同的浓度。从中提取的VEGF效价是相当的，如阳离子交换HPLC测定法所测定的。图6显示了存在精氨酸时或没有精氨酸时rpHPLC序型(profile)是相当的。
溶解和重折叠温育在室温进行3-24小时，并以传质系数kLa＝0.004至0.1min-1进行空气鼓泡(例如对于具有船用型叶轮的2.5L容器，空气鼓泡速率会是0.3至10cc/min/L、或0.3-1cc/min/L、或1cc/min/L、或25cc/min/L，而混合速度是200-400rpm)。参见图8，其显示了不同的空气鼓泡速率对重折叠条件的影响。例如，将包含VEGF的沉淀物以1:39的比率(沉淀物kg比缓冲液L)添加至pH10的组合缓冲溶液。准备三个2.5L的反应罐，每个罐的混合速率和空气鼓泡速率是不同的以达到(a)0.004、(b)0.01、(c)0.1min-1的kLa。各个罐中的测试混合速率是314rpm，而空气鼓泡速率范围自1cc/L/min至25cc/L/min。随着时间对反应监测产量和产品质量。图8中所示rpHPLC序型显示了12小时后所得折叠的VEGF的产品质量相当。任选地，温育可以在室温进行长达大约48小时。任选地，可以在6小时后以相同的鼓泡和混合速率通入替代空气的氮气来使VEGF在重折叠缓冲液中稳定。参见图7，其显示了存在空气(例如对于2.5L罐体，kLa＝0.004min-1或0.3cc/min/L)时2步沉淀物重折叠(如实施例1中所述的)的结果，其中6小时处的单体峰是减小的(因此，表明重折叠反应基本上完成)。用N2替代空气鼓泡(例如kLa＝0.004min-1)长达48小时。如在图7中所看到的，材料保持稳定，正如rpHPLC迹线所示的。通过SDS-PAGE、阳离子交换HPLC和rpHPLC层析柱、和/或肝素HPLC监测折叠。
实施例3重组蛋白的非沉淀物重折叠 将生产重组蛋白的大肠杆菌全细胞培养液在15M型实验室均浆仪Gaulin15M(小规模)或M3(大规模)(Gaulin Corporation，Everett，MA)中匀浆，并使每个体积匀浆物在重折叠缓冲液中稀释1:4(v/v)，并以传质系数kLa＝0.004至0.01min-1进行空气鼓泡(例如对于具有船用型叶轮的2.5L容器，空气鼓泡速率将是0.3至3cc/min/L、或0.3-1cc/min/L、或1cc/min/L、或3cc/min/L，而混合速率是200-400rpm)。重折叠缓冲液含有终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM Tris或CHES、5mM EDTA，pH9-10。重折叠温育在室温进行3-24小时。任选地，可以在3小时重折叠温育后通入替代空气的氮气来使VEGF在重折叠缓冲液中稳定。通过阳离子交换HPLC、rpHPLC层析、和/或肝素HPLC监测折叠。
实施例4重组人VEGF(rhVEGF)在重折叠后的纯化 纯化——如下使重折叠集合澄清，即添加Triton X-100至1％的终浓度，调节至pH9，然后离心(10,000x g，20分钟，在4℃)。然后将上清液过滤(Cuno深度滤器(depth filter)+0.22或0.45μ膜滤器)，之后在pH9和电导率小于10mS/cm的混合模式树脂(CaptoMMCTM，GE Healthcare，Piscataway，NJ)上捕捉。任选地，将重折叠集合在平衡加样缓冲液中稀释至少1:5，然后过滤(Cuno深度滤器+0.22或0.45μ膜滤器)，之后在pH9和电导率小于10mS/cm的混合模式树脂(CaptoMMCTM，GE Healthcare，Piscataway，NJ)上捕捉。用25mMHEPES pH9平衡填充的柱，之后将样品加载于该柱上。用1M精氨酸/25mMHEPES pH6-9(例如pH7.5)自MMC柱等度洗脱VEGF。参见图2。
将CaptoMMCTM集合用0.1N氢氧化钠调节至pH7.5，并用WFI稀释至20mS/cm电导率，之后加载至SP-SepharoseHP柱(用50mM HEPES pH7.5平衡的)上。使用10-20个柱体积(例如15个柱体积)的、由50mM HEPES/0-1.2M乙酸钠pH7.5构成的线性盐梯度洗脱VEGF，并收集级分(1个柱体积)。在280nm处具有最高吸光度(OD最大值在大约42mS/cm)的级分典型地含有大于90％的VEGF，并进行合并，用于进一步加工。参见图3。
第三层析步骤包括疏水树脂(例如Hi Propyl，J.T.Baker，Phenyl SepharoseFast Flow(low sub)，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。使用或是醋酸钠或是硫酸钠使SP-Sepharose HP洗脱集合条件化至50mS/cm电导率，之后加载至平衡后的柱(50mM HEPES，1.2M醋酸钠，pH7.5)上。参见图4。VEGF等度洗脱入50mM HEPES pH7.5，并对该集合分析剩余宿主细胞杂质和可溶性聚集体。收集各级分，并合并那些含有正确折叠的VEGF的，如本文中所述的测定法所测定的。任选地，实施额外的层析步骤，例如使用第二疏水树脂(例如苯基TSK)或离子交换树脂。
超滤/渗滤——可以在实验室规模的TFF系统上的5kD再生纤维素膜上将合并的VEGF超滤至6g/L的浓度(UF1)。将样品经由TFF系统用7-14个DV(渗滤体积(Diavolume))在5mM琥珀酸钠中渗滤至10g/L，然后配制成5g/L，在-80℃贮存。使用的配制缓冲液是5mM琥珀酸钠/275mM脱水海藻糖/0.01％聚山梨醇酯20/pH5.0。
实施例5重组人VEGF(rhVEGF)在重折叠后的纯化 纯化——如下使重折叠集合澄清，即添加Triton X-100至1％的终浓度，调节至pH8.5-9.5(例如pH8.7)，并在25-30℃保持1-10小时，之后离心。在离心机(10,000xg，20分钟，在4℃)上加工以除去大密度颗粒后，将回收的液体(离心液)通过一系列深度滤器和无菌防护(0.22或0.45μ膜)滤器(sterileguard filter)以除去细微颗粒。然后在pH8.7和电导率小于10mS/cm的混合模式树脂(CaptoMMCTM，GE Healthcare，Piscataway，NJ)上捕捉rhVEGF。用25mM CHES pH8.7平衡填充的柱，之后将样品加载于该柱上。用0.9M盐酸L-精氨酸/25mM HEPES pH6-9(例如pH7.5)自MMC柱等度洗脱VEGF。
将CaptoMMCTM集合用0.1N氢氧化钠调节至pH7.5，并用WFI稀释至20mS/cm电导率，之后加载到SP-Sepharose High Performance柱(用25mMHEPES pH7.5平衡的)上。使用10-20个柱体积(例如15个柱体积)的、由50mMHEPES/0-1.2M乙酸钠pH7.5构成的线性盐梯度洗脱VEGF，并收集级分(1个柱体积)。在280nm处具有最高吸光度(OD最大值在大约42mS/cm)的级分典型地含有大于90％的VEGF，并进行合并，用于进一步加工。第三层析步骤包括疏水树脂(例如Hi Propyl，J.T.Baker，Phenyl Sepharose FastFlow(low sub)，GE Healthcare，Piscataw ay，NJ)。将SP-Sepharose HP洗脱集合直接加载到平衡后的HIC柱(25mM HEPES，0.75M醋酸钠，pH7.5)上。参见图5。将VEGF等度洗脱入50mMHEPES pH7.5，并对该集合分析剩余宿主细胞杂质和可溶性聚集体。收集各级分，并合并那些含有正确折叠的VEGF的，如本文中所述的测定法所测定的。任选地，实施额外的层析步骤以进一步除去宿主杂质，例如使用第二疏水树脂(例如苯基TSK)或离子交换树脂。
超滤/渗滤——可以将合并的VEGF在商品化的TFF系统(Pellicon2盒，Millipore，Billerica，MA)中的5kD再生纤维素膜上超滤至10g/L的浓度，然后用7-14个渗滤体积(例如10个DV)渗滤至配制缓冲液中。最终的条件化产生在5mM琥珀酸钠/275mM脱水海藻糖/0.01％聚山梨酯20/pH5.0中含有5g/LVEGF的溶液，可以贮存在-80℃。
实施例6用于测定折叠的和/或纯化的重组蛋白的测定法 本文所述方法和工艺中，最终的纯度和/或活性可以通过以下方法来评估肽作图、二硫化物作图、SDS-PAGE(还原性的和非还原性的)、圆二色性、鲎变形细胞溶解物(LAL)、阳离子交换HPLC、肝素HPLC(例如，肝素HPLC可用于测定VEGF二聚体浓度和错误折叠种类的水平)、反相(rp)HPLC层析(例如，还原样品的rpHPLC可用于测定总VEGF浓度，而天然样品的rpHPLC可评估重折叠的VEGF的质量)、受体结合(例如对于VEGF，例如KDR受体结合-Bioanalytic R & D，和/或Flt1受体结合)、SEC分析、细胞测定法、HUVEC效能测定法、利用VEGF抗体的ELISA、质谱分析等。
用于测定总VEGF表达的测定法 (1)还原样品的rpHPLC——使用反相HPLC测定法在C18柱(Jupiter C18柱(4.6x250mm，5微米，Phenomenex，Torrance，CA)上测量所表达的VEGF的数量。将该柱在0.22％三氟乙酸中平衡，并使用含有0.2％三氟乙酸的25％至45％乙腈的线性梯度在30分钟内以1mL/min的流速洗脱。在280nm处监测洗脱液。处理样品，并在胍和DTT中完全还原，之后注射。还原性VEGF蛋白在26分钟左右洗脱，且峰面积用于从已知标准曲线计算样品中的总VEGF量。
用于重折叠VEGF的测定法 (1)阳离子交换HPLC测定法——使用分析性阳离子交换柱例如SP-5PW柱(TSK凝胶SP-5PW，7.5 x 75mm，10微米，Tosoh Biosciences LLC，Japan)测定正确重折叠的VEGF二聚体的数量。将该柱在50mM硫酸钠pH7.5中平衡。以1mL/min的流速，使用平衡缓冲液中的0至2M氯化钠的线性梯度在60分钟里洗脱该柱。在280nm或214nm处监测洗脱液。典型地，大部分蛋白质在前30分钟内洗脱，而VEGF在40分钟左右洗脱。参见图9。
(2)rp-HPLC测定法——使用Zorbax 300SB-C8柱(4.6x150mm，3.5微米，Agilent Technologies，Santa Clara，CA)测定正确重折叠的VEGF的质量。将该柱在0.1％三氟乙酸中平衡，并使用含有0.08％三氟乙酸的0至50％乙腈的线性梯度在50分钟里以1mL/min的流速洗脱。在214nm处监测洗脱液。典型地，VEGF在35分钟左右洗脱，并对峰序型评估相对于主峰的前缘疏水种类百分比含量。解折叠的VEGF单体在2-3分钟后洗脱。
(3)肝素结合HPLC测定法——使用含固定化的肝素的柱测定正确重折叠的VEGF的质量和数量。在含有0.15M氯化钠的10mM磷酸钠pH7.4中平衡肝素-5PW柱(7.5x75mm，10微米，TSK凝胶，Tosoh Biosciences LLC，Japan)。使用平衡缓冲液中的0.15M至1.6M氯化钠的线性梯度在20分钟里以1mL/min的流速洗脱该柱。在有些测定法中，洗脱在16分钟里进行。在280nm处监测洗脱液。典型地，大部分蛋白质在外水体积中洗脱，并可以鉴定出3类VEGF。最高亲和力、最迟洗脱的种类鉴定为正确折叠的VEGF，有时鉴定为“峰3VEGF”。
应当理解，本文所述保藏、实施例和实施方案仅仅是用于例示目的，根据本文得到的各种修饰或改变对于本领域技术人员是暗含在内的，它们也包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文中所引用的所有出版物、引文、专利、和专利申请都完整收录在此作为参考，用于所有目的。
序列表
<110>健泰科生物技术公司(GENENTECH，INC.)
<120>重组蛋白的重折叠
<130>P2385R1 WO
<150>US 60/830,831
<151>2006-07-14
<160>1
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>权利要求
1.一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤
(a)从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；
(b)使所述蛋白质在第一缓冲溶液中溶解，所述第一缓冲溶液其pH大于9且包含第一离液剂；
(c)使所述溶解的蛋白质在第二缓冲溶液中重折叠，所述第二缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且包含第二离液剂、两种或更多种还原剂且通入空气或氧气，其时间和条件使得所述重组蛋白发生重折叠；并
(d)回收所述重折叠的重组蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是生长因子。
3.权利要求2的方法，其中所述生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。
4.权利要求3的方法，其中所述VEGF是VEGF165。
5.权利要求1的方法，其中所述第一和第二离液剂是尿素。
6.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液还包含精氨酸。
7.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液还包含精氨酸。
8.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 11。
9.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 11。
10.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 10。
11.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 10。
12.权利要求1的方法，其中将所述重组蛋白在所述第一缓冲溶液中温育至少1小时。
13.权利要求12的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。
14.权利要求1的方法，其中将所述溶解的蛋白质在所述第二缓冲溶液中温育约3-24小时。
15.权利要求14的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。
16.权利要求1的方法，其中所述两种或更多种还原剂包含半胱氨酸和DTT。
17.权利要求1的方法，其中所述通入空气或氧气是以akLa＝0.001-0.1min-1提供的。
18.权利要求1的方法，还包括通过通入氮气来使所述重折叠的重组蛋白稳定。
19.权利要求1的方法，其中所述回收步骤(d)包括使含有所述重组蛋白的所述第二缓冲溶液澄清，并使所述重折叠的重组蛋白相继接触混合式层析支持物、阳离子层析支持物、和第一疏水层析支持物，并从每个支持物中选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。
20.权利要求19的方法，其中所述澄清步骤包括添加去污剂至1％的终浓度，调节pH至约8.5-9.5，在25-30℃将溶液温育1-10小时，将所述溶液离心；并将从所述离心步骤中回收的液体过滤。
21.权利要求19的方法，还包括使所述重折叠的重组蛋白接触第二疏水层析支持物或离子交换支持物，并从所述支持物中选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。
22.权利要求19或21的方法，其中所述第一和第二疏水相互作用层析支持物选自丁基-、丙基、辛基-、苯基-和芳基-琼脂糖树脂。
23.一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤
(a)从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；
(b)使所述蛋白质在组合缓冲溶液中溶解并重折叠，所述组合缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且通入空气或氧气；并
(c)回收所述重折叠的重组蛋白。
24.权利要求23的方法，其中所述回收步骤包括使含有所述重组蛋白的所述组合溶液澄清，并使所述重折叠的重组蛋白相继接触混合模式层析支持物、阳离子层析支持物、和第一疏水层析支持物，并从每个支持物中选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。
25.权利要求24的方法，其中所述澄清步骤包括添加去污剂至1％的终浓度 ，调节pH至约8.5-9.5，在25-30℃将溶液温育1-10小时，将所述溶液离心，并将从所述离心步骤中回收的液体过滤。
26.权利要求23的方法，其中所述组合缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 10。
27.权利要求23的方法，其中所述组合缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 10。
28.权利要求23的方法，其中将所述重组蛋白在所述组合缓冲溶液中温育大约3-24小时。
29.权利要求28的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。
30.权利要求24的方法，还包括使所述重折叠的重组蛋白接触第二疏水层析支持物或离子交换支持物，并从所述支持物中选择性洗脱所述重折叠的重组蛋白。
31.一种用于纯化重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤使重组蛋白相继接触混合模式层析支持物、阳离子层析支持物和第一疏水相互作用层析支持物，并从每个支持物中选择性洗脱所述重组蛋白。
32.权利要求30的方法，还包括使所述重组蛋白接触第二疏水层析支持物或离子交换支持物，并从所述支持物中选择性洗脱所述重组蛋白。
全文摘要
提供了用于回收和纯化异源宿主细胞中所生成的重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括在高pH缓冲液中重折叠所述蛋白质的步骤。
文档编号C07K1/14GK101506222SQ200780031808
公开日2009年8月12日 申请日期2007年7月13日 优先权日2006年7月14日
发明者谢利·皮扎罗, 艾伦·桑切斯, 查尔斯·H·施梅尔泽 申请人:健泰科生物技术公司