专利名称：：纯化dnak的方法纯化DNAK的方法
技术领域：
：本发明涉及纯化热激蛋白(HeatShockProtein)的方法。在应激状态下，所有的细胞热激蛋白(HSP)的表达可上调。热激蛋白是分子伴侣并参与蛋白折叠。HSP分为大约6个家族并在进化中高度保守。HSP和肽之间形成的复合体在抗原呈递中扮演重要角色。HSP也参与形成一些自身免疫性疾病。可参见vanEden等人的综述(NatureReviews.Immunology5(2005)318-330)。DnaK是细菌的HSP70家族成员。纯化DnaK的方法是已知的，但是制品的纯度存在问题。通常，如果在SDS-PAGE上只检测到唯一一条带，则认为DnaK制品是纯的。但是，这样的制品不是非常纯的。Sch6nfeld等人J.Biol.Chem.270(1995)2183-2189中描述了SDS-PAGE纯的DnaK其凝胶过滤分析表明却有至少三个峰。纯化HSP的方法是已知的，参见例如-Nandanetal.J.,ImmunologicalMethods(1994)176:255-264,-Grossmannetal"Exp.cellRes.(2004)297:108-117,-Pengetal"J.ImmunologicalMethods(1997)204:13-21禾口-Jindaletal.，Biotechnology(1995)13:1105-1109。关于HSP特别是DnaK的免疫特性，过去曾经报道了不一致的数据。DnaK增强抗原呈递细胞上抗原经I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)的处理(Tobianetal.，J.Immunological172(2004),5277-5286;Tobian,Canaday,HardingJ.Immunol.173(2004)5130-5137)。根据其来源、剂量和施用途径的不同，天然的DnaK可表现出不同的甚至是相反的免疫交女应类型(vanEden,vanderZee禾口PrakkenNatRev.Immunol.5(2005):318-330)。己经在慢性炎性疾病，例如类风湿关节炎、I型糖尿病和动脉硬化症中观察到抗自体同源HSP的自身免疫反应。怀疑细菌HSP和自体同源HSP之间的抗原交叉反应是引起自身免疫性形成的原因。另一方面，在I型糖尿病和类风湿关节炎的临床试验中，HSP也表现出促进T细胞从促炎性细胞因子分泌谱向促调节性细胞因子分泌谱转变，这表明其炎性疾病的免疫调节(Bloemendaletal.,Clin.Exp.Immunol.110(1997):72-78)。更近期，Galdiero等人报道，DnaK不诱导淋巴细胞和巨噬细胞上共刺激分子(CD80/CD86)表达增加(Galdieroetal"Int.J.Imm腦pathol.Pharmacol.18(2005)637-644)。据信，这些不一致性是基于纯化方法不同，从而产生了与各种杂质和污染物相结合的DnaK。此外，由于DnaK是ATP酶，它与腺嘌呤核苷酸结合。不同形式的DnaK共同存在且可被纯化带有ATP的DnaK、带有ADP的DnaK和不含核苷酸的DnaK。这些不同形式的DnaK可具有不同的免疫效应。本发明的目标是提供一种纯化DnaK的方法，该方法至少克服了现有技术的一些缺点，特别是提供纯度增加的DnaK。在一个方面，问题的解决是通过重组纯化热激蛋白HSP，优选DnaK:-具有ATP酶活性而不加入其它的伴侣蛋白-实质上不含T-细胞刺激性杂质。纯化的重组热激蛋白的特征是其具有ATP酶活性而不加入其它的伴侣蛋白。在实施例中描述了用于测试ATP酶活性的合适的方法。而且，制品不含T-细胞刺激性杂质。这要求内毒素含量非常低。制品在TH-1(产生干扰素-Y)和TH-2(产生IL-5或IL-13)上不表现出效应。在实施例中对此进行了进一步描述。制品优选为不含免疫刺激性杂质，包括T-细胞刺激性杂质。"实质上不含免疫刺激性杂质"意思是-直至30|ig/ml未观察到T-细胞增殖；-直至10pg/ml未观察到TNF-a产生。本发明进一步目标是一种DnaK，其具有a)纯度为按重量计95%或更高；b)残余DNA污染物《lng/mg蛋白；c)残余宿主细胞蛋白污染物(HCP)<5%(按重量计)；d)内毒素污染物〈0.5E.U./吗蛋白。计算纯化DnaK的纯度是基于"每…重量蛋白中"，即所有蛋白中至少95%为DnaK。优选的，含量为至少97%，更优选的为至少98%(按蛋白重量计)。优选地，这个数值是通过SDS-PAGE凝胶，然后进行考马斯染色和密度计量学的分析来确定。DNA的含量优选非常低，即《lng/mg蛋白，优选为《0.5ng/mg蛋白。DNA污染物通过RT-PCR使用特异性引物来测定。测试条件取决于表达系统的类型。例如，对于在大肠杆菌(Eco/O中的表达，23SDNA的特异性引物是合适的。对于在巴斯德毕赤酵母(P/xwtewr/s)中的表达，在18SDNA中选择合适的引物。这些方法对本领域技术人员来说是已知的。此外，残余宿主细胞蛋白污染物按重量计<5%，优选为按重量计<1%,更优选为按重量计《0.0001%。优选地，这通过ELISA测试来确定，可由美国CygnusTechnologiesInc.商售的用于测定￡.co//细胞蛋白的产品"Kit￡.co//hostcellproteins"获得。必须选择表达系统相应的测试系统，即CygnusTechnologiesInc.也已经开发出其它表达系统相应的ELISA。例如SDS-PAGE(带银染)、HPLC或WesternBlotting作为其它的替代方法是合适的。根据LAL动力学测试(可由美国CambrexCorporation商售的产品"Kinetic-QCL⑧获得)所示，内毒素污染物为<0.5E.U./昭蛋白。优选的含量为<0.1E.U./吗蛋白，和优选的<0.01E.U,/昭蛋白。现在已经理解，DnaK可以含有免疫刺激性杂质污染物，特别是.--蛋白；-肽；-核酸；-脂多糖(LPS)。DnaK是伴侣蛋白，且因此与其它蛋白和肽结合。现有技术的纯化方法显然不能除去DnaK制品中结合的和未结合的杂质。令人惊奇的是，本发明的纯化步骤可能获得高纯度的重组DimK，特别是不含免疫刺激性杂质。对于DnaK在药物制品上的应用，特别是作为佐剂，DnaK不含免疫刺激性杂质是绝对必要的。本发明的另一个方面是从细胞裂解液中纯化重组热激蛋白(优选DnaK)的方法，所述方法包含下列步骤a)离子交换色谱；b)羟磷灰石色谱；a)明胶色谱。在本发明的一个优选方面，DnaK来自腐生细菌，如大肠杆菌或致病菌，如结核分支杆菌(A^co6acfer/ww加6ercw/cw/s)。在优选具体实施方式中，离子交换色谱是阴离子交换色谱。对于羟磷灰石色谱，优选为n型羟磷灰石色谱。在一个具体实施方式中，明胶色谱在明胶琼脂糖上进行。优选地，使用核苷酸例如ADP、ATP将DnaK从明胶上解离。本发明的另一个方面是在重组DnaK和至少一种肽或至少一种蛋白之间形成复合体的方法，所述方法包含下列步骤a)以摩尔比1:1至l:10将本发明所述的重组DnaK与ATP结合；b)加入至少一种肽或至少一种蛋白；c)在l(TC至6(TC优选为2(TC至45。C的温度下温育。本发明的另一个方面是本发明所述的重组纯化DnaK与至少一种肽或至少一种蛋白之间形成的混合物或复合体。优选地，使用变性形式的蛋白。本发明也涵盖DnaK与两种或两种以上不同肽的结合或DnaK与几种蛋白(可选变性蛋白)的结合，以及DnaK与肽和蛋白(可选变性蛋白)的复合体。合适的肽为，例如胰岛素、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、II型胶原、麸朊(gliadin)、GAD65、蛋白脂质蛋白、S-抗原、乙酰胆碱受体、半抗原化结肠蛋白、感光细胞间受体视黄醇类结合蛋白(interphotoreceptorretinoidbindingprotein)、骨遺革肖磷月旨石咸性蛋白、骨遣革肖少突胶质细胞糖蛋白、外周神经P2、胞质TSH受体、内因子(intrinsicfactor)、晶状体蛋白、血小板、核蛋白例如组蛋白、热激蛋白、MHCI、MHCII、MHC-肽复合体、奶变应原、毒物变应原(venomallergen)、蛋变应原、野草变应原、草变应原、树变应原、灌木变应原、花变应原、谷物变应原、真菌变应原、水果变应原、浆果变应原、坚果变应原、种子变应原、豆类变应原、鱼类变应原、贝类变应原、肉类变应原、香料变应原、昆虫变应原、螨虫变应原、动物变应原、动物毛发皮屑变应原、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)变应原、凝血因子和血型抗原、蔬菜变应原、土壤变应原、细胞因子、参与祌经退行性疾病(例如Alzheimer)的蛋白或肽、带有成瘾物质及其片段的肽。这些蛋白可直接使用，优选为变性形式或水解为小片段之后使用。本发明的另一个方面是本发明所述的DnaK在药物组合物中作为作为载体蛋白的用途，或作为佐剂诱导体液反应、调节性T细胞反应(在没有任何其它T细胞反应的情况下)的用途。本发明的另一个方面是本发明所述DnaK或本发明所述混合物或本发明所述复合体在体外和/或体内诊断中的用途，以及本发明所述重组纯化的DnaK或本发明所述复合体在制备用于诱导耐受的药物组合物中的用途，其中所述耐受适合用在治疗和/或预防过敏症、自身免疫性疾病或移植排斥或神经退行性疾病中。在所有类型的应用中，本发明所述DnaK可与ATP复合、与ADP复合或不含核苷酸使用。对于一些用途来说，将本发明所述DnaK进行水解也是有用的。"不含核苷酸"理解为按摩尔计含有5%以下的核苷酸。典型的自身免疫性疾病尤其(interalias)包括系统性红斑狼疮病、Sj6gren疾病、风湿性多发性关节炎，以及例如肉样瘤病和骨量减少、椎关节炎、硬皮病、多发性硬化、肌萎縮性脊髓侧索硬化、甲状腺机能亢进、Addison疾病、自身免疫性溶血性贫血、Crohn病、Goodpasture综合征、Graves病、Hashimoto甲状腺炎、先天性紫癜性出血、胰岛素依赖性糖尿病、肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、感染后肾小球肾炎(poststreptococcalglomerulonephritis)、银屑病禾口特发性不育不孕症的病状。药物可通过例如静脉内、肌肉内、口服、鼻内或肺内施用。优选为途径为舌下、口腔或肠道递送。"舌下施用"和"口腔施用"是这样的方法，其中使物质结合在药物剂型中，所述结合允许至少一种物质在口腔粘膜吸收。舌下施用包括患者(在舌下)将药物组合物或药量含在其舌下，而物质经过口腔粘膜扩散入口。在口腔施用时，患者将药物组合物或药量含在其面颊和牙龈(齿龈)之间而不是含在舌下。口腔施用时可以咀嚼以允许更快的口腔吸收或释放；因此本发明在优选的具体实施方式中提供了基于齿龈的制剂或咀嚼型齿龈制剂。"经肠道递送"是这样的方法，其中物质处于药物制剂中，所述药物制剂保护活性成分，使其在进入小肠之前不被吸收和/或降解。优选吸收在回肠、十二指肠或空肠中起效。在一个优选具体实施方式中，所述药物制剂可以是栓剂。特别合适的制剂包括以聚合物包被，例如以商标Eudrag卢商售的聚合物(可从德国Degussa购得)包被，或以纤维素乙酰酞酸酯(可从Fagron获得)包被，或以羟丙基甲基纤维素酞酸酯(可从Shin-EtsuChemicalsCo.，Ltd获得)包被。这些聚合物适合于在肠内释放的固体口服制剂。在优选的具体实施方式中，合适的药物制剂包含任何所需的粘合剂或赋形剂以中和盐酸(胃酸分泌)和/或抑制胃蛋白酶和/或刺激患者的碳酸氢盐和粘液的分泌。中和盐酸和/或抑制胃中的胃蛋白酶可通过例如硫糖铝或质子结合聚合物，例如但不限于聚氮丙啶，或任何中和性抗酸的(抗酸性的)或任何酸性阻滞剂(选自铝盐、铋盐、镁盐、碳酸钠、碳酸钾、柠檬酸钾、酒石酸钾钠、磷酸钙)及其混合物来实现。可用于适合的制剂中的一些其它类型的酸阻滞剂是称为胃质子泵的抑制剂(或胃11+^+ATP酶抑制剂)、前列腺素类似物和组胺H2-受体拮抗剂。这些包括但不限于，米索前列醇(misoprostol)、雷尼替丁(ranitidine)(在ZANTAC中使用)、西咪替丁(cimetidine)(在TAGAMET⑧中使用)、尼扎替丁(nizatidine)(在AXID⑧中使用)、法莫替丁(famotindine)(在PEPCID⑧中使用)、舒福替丁(sufotidine)、罗沙替丁(roxatidine)、比芬替丁(bisfentidine)、硫替丁(tiotidine)、兰替丁(lamtidine)、尼培替丁(niperotidine)、咪芬替丁(mifentidine)、唑替丁(zaltindine)、拉伏替丁(loxtidine)、奥美拉唑(omeprazole)(在PRISOLEC⑧中使用)、和雷贝拉唑(rabeprazole)。优选地，DnaK与填充剂一起使用，所述填充剂选自非还原性糖。在另外一个优选的具体实施方式中，合适的制剂包含所述至少一种物质的微球体，所述至少一种物质以任何形状或形式结合至或包含于钝性(inert)颗粒中，该微球体具有大约30-35目的目尺寸(大约600pm至500pm)或大约40目以上，并最优选为大约45至大约200目的范围，并可以是例如nonpareil、硅石粉末、盐晶体或糖晶体。图1:对应于实施例1的经过Q-琼脂糖HP色谱之后的SDS-PAGE分析。图2:对应于实施例1的经过II型羟磷灰石色谱之后的SDS-PAGE分析。图3:经过渗滤/尺寸排除色谱之后的SDS-PAGE分析。图4:经过明胶琼脂糖色谱之后的SDS-PAGE分析。将样品(每种制品5吗)变性并上样于12%的Bis/TrisNU-PAGE凝胶上。电泳之后，将蛋白进行银染。QSHP:Q琼脂糖HP;HA-羟磷灰石；GS^月胶琼脂糖。图5:对纯化的DnaK的SDS-PAGE分析。将药物物质变性并上样于4-12%的Bis/TrisNU-PAGE凝胶上。龟泳之后，将蛋白用考马斯蓝R250染色。图6:DnaK的ATP酶活性。图7:DnaK的促炎性效应。在不同浓度的DnaK或细菌脂多糖(LPS)存在的情况下，将全血进行温育。细胞因子白介素-lb(IL-lb)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)通过ELISA定量。图8:DnaK对T细胞反应的效应。在DnaK(10jag/ml)或植物血细胞凝集素(5吗/ml)存在的情况下，将人PBMC温育6天。培养液中的不同的细胞因子通过ELISA定量。结果表示为平均值±2次测定的偏差(6位不同捐血者)。CTRI^对照。图9:DnaK对制假丝菌素(candidin)诱导IFN，产生的效应。在制假丝菌素(3.5pg/ml)存在和DnaK浓度递增的情况下,将人PBMC温育3天。培养液中的IFN-Y通过ELISA定量。结果表示为平均值土4次测定的标准偏差。图10:Treg产生的IL-IO。将精确数量的纯化的CD4VCD25+细胞和/或CD4+CD25—细胞加入到纯化的树突状细胞中，树突状细胞以DnaK(10pg/ml)或BSA(10吗/ml)预处理。然后将细胞在DnaK或BSA存在的情况下继续培养，并用PHA剌激或者不刺激。培养液中的IFN-Y和IL-10通过ELISA定量。25-/25+代表2种细胞群以1/1的比率混合。图11:人血清中抗DnaK抗体的存在。在96孔板中包被DnaK或BSA以作为ELISA测试中的捕获蛋白。来自健康志愿者和过敏性患者的血清以1/100稀释使用。以抗人类IgG-HRP抗体来检测IgG。本发明通过以下实施例进行更详细的解释。实施例l:DnaK的产生和纯化游产主细菌菌株大肠杆菌菌株JS219/pOFXtac-l/KJl通过弓|入编码大肠杆菌DnaK的质粒进行遗传修饰。CastanieMP等人已经描述了克隆步骤和载体pOFXtac-l/KJl的构建(CastanieMP,BergesH,OregliaJ,PrereMF,FayetOAsetofpBR322-compatibleplasmidsallowingthetestingofchaperone-assistedfoldingofproteinsoverexpressedinEscherichiacoli;AnalBiochem(1997)254(1):150-152)。预培养将1管主代菌种(MasterSeed)(1.5ml)在室温下融化。在含有500ml的YES+卡那霉素的培养液(30g/1酵母提取物，5g/1NaCl和50mg/1硫酸卡那霉素)的3个2升摇瓶中，每个接种400^的主代菌种并在振荡条件下(270rpm)37。C下温育6±0.5小时，直至OD,腿为0.7单位以上。发酵将预培养体积加入到预灭菌的的发酵器中，该发酵器中含有50升的NRJ18+卡那霉素培养液(KH2P045.2g/1,K2HP0410.7g/1,甘油0.4g/l，酵母提取物50g/l，大豆蛋白胨30g/l，MgS04*7H202.5g/1,SAG4710.6ml/1,硫酸卡那霉素100mg/l)。温度保持在37°C±5°C，压力为360mbar。当光密度为25±1时，加入IPTG(终浓度为1mM)诱导培养物。然后将诱导条件保持4小时。将培养物迅速冷却至2(TC以下。将培养液通过50pmSartopurePP2过滤装置进行过滤。在4°C下4500rpm(5000xg)离心30分钟得到细胞沉淀物并将其于-20。C冷冻直至使用。细胞破碎和上清液过滤使细胞沉淀物在室温下，在pH为8的20mMTris-HCl中融化，然后通过加入缓冲液将细胞糊的浓度调节到166.6g新鲜细胞重量/升。将细胞悬浮液加入到置于冰上的槽中。用NiroSoaviPanda高压破碎器使匀质化的细胞破碎，平均压力为800&50巴，持续2个循环。在4。C下16000g(8000rpm)将细胞裂解液离心30分钟。收集上清液并通过10英寸(0.2(im)的SartobranPMaxicap过滤。过滤后的上清液在进行下一个步骤之前在4"C保持过夜。D厢I游錄众O琼脂糖HP色谱(OHP)以Q琼脂糖HP(AmershamBiosciences)进行阴离子交换色谱。以高度纯化的水以线性流速68cm/h(33.41/h)装柱。装载的柱床的尺寸为直径二250mm，横截面积132cm2，床25.0cm，装载体积=大约12.27升。用pH为8.0的20mMTris-HC1将过滤的上清液稀释两次，并且如果需要，用lM的Tris溶液(未调节pH的溶液)将pH调至8士.0.1。最终的传导性必须<10mS/cm。然后将稀释的上清液以22.11/h(45cm/h)的流速装载至柱中。装载完毕后，用2.0至3.0CV的pH为8.0的20mMTris-HCl以19.61/h(41.5cm/h)的流速洗涤，直至基线达到0。以22.11/h(45cm/h)的流速分2步进行洗脱第一步是以2-3CV的pH为8.0的20mMTris-HCl+0.25MNaCl缓冲液洗涤。第二步是以2-3CV的pH为8.0的20mMTris-HCl+0.45MNaCl缓冲液洗涤。将这一步骤中收集的组分保留以用作接下来的纯化步骤。测定其在280nm处的吸光度。将洗脱液于2-8'C贮存过夜直至下一个纯化步骤。将样品(每个组分20)il)变性并上样于4-12°/。的Bis/TrisNU-PAGE凝胶。电泳之后，蛋白以考马斯蓝染色(见图l)。II型羟磷灰石色谱(HA)以II型羟磷灰石-40(am(Bio-Rad)进行第二次色谱。将树脂(2000g)—边轻轻混合一边倒入200mM，pH6.8的3.2升Na2HP04*12H20+NaH2P04*2H20中。将200mM，pH6.8的Na2HP04*12H20+NaH2P04*2H20以线性流速175cm/h(26.91/h)装载至柱中。装载的柱床的尺寸为直径44cm，横截面积154cm2，床=21.5cm，装载体积=3.31升。将QHP洗脱液分成6等份装载于HA柱。所有羟磷灰石的过程在150cm/h(23.11/h)的流速下进行。首先用2.5至3.5CV的200mM，pH为6.8的NaH2P04/Na2HP04平衡柱子，然后用2.5至3.5CV的5mM，pH为6.8的NaH2P04/Na2HP04平衡柱子，直至其pH和传导性稳定。用50%的HC1将pH调节至6.8±0.1，将QHP洗脱液(总体积的六分之一)装载于柱子(重要的注意事项前一色谱步骤中的NaCl浓度对于HA吸附不重要)。装载完毕后，用pH为6.8的1.5至2.5CV的5mMNaH2P04+Na2HP04缓冲液洗涤柱子，直至U.V.恢复至基线。测定其在280nm处的吸光度。然后，以10CV，0%至100%梯度的pH为6.8的200mMNaH2P04/Na2HP04缓冲液进行洗脱。通常，大约6CV后洗脱完成。收集洗脱峰，将组分的集合(pool)通过0.22nm的过滤器过滤，并保持在2-8°C。洗脱后，在装载下一个样品前，用2.5至3.5CV的pH为6.8的5mMNaH2P04+Na2HP04缓冲液进行再生步骤。将样品变性并上样于4-12。/。的Bis/TrisNU-PAGE凝胶上。电泳之后，蛋白以考马斯蓝染色(见图2)。渗滤/尺寸排除色谱曾经尝试通过30kDa膜进行渗滤，和在SephacrylS100HR树脂上进行色谱来分离杂质。杂质不能通过这两个方法除掉。确实，杂质在渗滤的滞留物中和DnaK—样被回收。杂质在SephacrylS100色谱中和DnaK—起被洗脱。在图3中显示了对这些不同样品的SDS-PAGE分析。将样品变性并上样于4-12。/。的Bis/TrisNU-PAGE凝胶上。电泳之后，蛋白以考马斯。明胶琼脂糖快速流动色谱(GSFF)测试的第三个用来将杂质从DnaK中分离的方法包括在明胶琼脂糖快速流动树脂(GEHealthcare)上进行的色谱。将高度纯化的水以线性流速150cm/h(19.91/h)装柱。装载的柱床的尺寸为直径43cm，横截面积二133cm2，床-15cm，装载体积=1.99升。将HA洗脱液的集合分成9等份装载于GSFF柱子上。在GSFF循环间隔中，以6M氯化胍进行清洁。所有的明胶琼脂糖过程在120cm/h(15.91/h)的流速下进行。以1.5至2.5CV的70%乙醇+0.1M乙酸消毒柱子，接触时间为1小时。然后以2.5至3.5CV的pH7.5的0.5MNaCl+5mMHEPES使其平衡。将HA洗脱液的集合(总体积的九分之一)装载于柱子。装载完成后，以1.5至2.5CV的pH7.5的0.5MNaCl+5mMHEPES缓冲液洗涤柱子，直至U.V.恢复至基线。测定其在280nm处的吸光度。然后，以3至4CV的pH7.5的0.5MNaCl+5mMHEPES+3mMATP+1mMMgCl2进行洗脱。吸光度上升时，在2CV收集组分。第9个GSFF循环之后，以1.5至2.5CV的6M氯化胍清洁柱子，然后以3CV的pH7.5的0.5MNaCl+5mMHEPES缓冲液洗涤,并贮存于20%的乙醇中。如图4所示，与羟磷灰石色谱后获得的样品相比，明胶琼脂糖树脂色谱明显改善了DnaK的纯度(比较泳道2和泳道3)。在这种情况下，DnaK的纯度为98.25。/。以上(参见实施例2和图5)。当细胞裂解液的上清液直接装载于明胶琼脂糖柱子时，这个步骤之后DnaK的纯度为大约95%。当明胶琼脂糖步骤在Q琼脂糖HP之后进行时，DnaK制品的纯度与Q琼脂糖HP和羟磷灰石色谱之后获得的样品相比，没有增加(图4，比较泳道2和泳道4)。这些结果证明联合使用这三种类型的色谱(IEX、HA和GSFF)以获得纯度>98%的DnaK制品是绝对必要的。通过切向流过滤的浓縮和渗滤以两个PLCTKpellicon2膜(截留分子量为30kDa，0.1m2,Millipore)，用ProfluxM12(Millipore)进行浓縮。以3升注射用水将膜洗涤两次，并在操作之前测定膜的完整性。以持续循环的0.5MNaOH消毒60分钟。然后以pH7.3的Na2HP04*12H2030mM+NaH2P04*2H2020mM缓冲液漂洗膜，直至渗透物的pH值达至lj7.3±0.1。将集合的明胶琼脂糖洗脱液(GSFF-E集合)浓縮至2000ml然后以10倍体积的pH7.3的Na2HP04*12H2030mM+NaH2P04*2H2020mM缓冲液渗滤以交换缓冲液。使用以下的过程参数Pin=1.5±0.1巴(bar),Pout=0.5±0.1巴，TMP=1巴。渗滤后，以200ml的pH7.3的Na2HP04*12H2030mM+NaH2P04*2H2020mM缓冲液将系统和膜漂洗两次。将使用的漂洗溶液加入渗滤滞留物中。渗滤后，将系统和膜以注射用水漂洗。以持续循环的0.5M氢氧化钠消毒60分钟。将系统贮存于0.1M的氢氧化钠中。无菌过滤根据对渗滤滞留物进行的UV测试，以pH7.3的Na2HPO,12H2030mM+NaH2P04*2H2020mM缓冲液将其浓度调节至2.5mg/ml。在Millipak60(0.22过滤器)上将步骤4的经渗滤的DnaK-ATP组分进行过滤。在过滤前，以pH7.3的Na2HP04*12H2030mM+NaH2P04*2H2020mM缓冲液洗涤漂洗过滤器。将所有的DnaK-ATP等分试样贮存于-2(TC。实施例2:DnaK的特性根据实施例1获得的DnaK是非常纯的蛋白纯度-对于蛋白来说，纯度为98.25%以上(按照SDS-PAGE凝胶考马斯染色所测，图5)。将该物质变性，并将数量递减的该物质上样于4-12%Bis/TrisNU-PAGE凝胶上。通过电泳分离蛋白，然后以考马斯蓝R250染色(0.1%)。通过比较泳道2中可检测到的每个可能的污染带的强度与不同稀释度的DnaK带的强度来测定产品纯度。残余DNA含量以23S染色体组DNA的引物为细菌DNA特异性引物，通过RT-PCR测定残余DNA含量为0.22ng/mg蛋白。定量实时PCR是基于聚合酶链反应(PCR)方法的基因组DNA的扩增，其中使用SYBR绿色染料(其结合至新形成的双链DNA)，通过荧光检测实时测定扩增的DNA量。按照Smith等人的建议，细菌DNA的引物在23S染色体组DNA中选择(SmMietal.,BioTechnique(1999)26:518-526)。残余宿主细胞蛋白含量由ELISA所测的残余宿主细胞蛋白含量为0.00004%。由CygnusTechnologiesInc.开发的细菌蛋白含量检测方法主要基于夹心ELISA原理。简单来说，用抗大肠杆菌捕获抗体来包被96孔板。样品中含有的大肠杆菌蛋白被这些抗体截获并使用其它的特异性的偶联至碱性磷酸酶的大肠杆菌抗体检测。洗涤以除去未结合的试剂后，加入酶的底物(对硝基苯磷酸酯-pNPP)，吸光度测定与反应产物的浓度成比例，从而与样品中的宿主细胞蛋白成比例。内毒素含量内毒素含量(由LAL方法确定)为0.002E.U./吗蛋白。用于定量内毒素的方法是由Cambrex开发的Kinetic-QCI^测试。它是基于以下的原理革兰氏阴性菌内毒素催化美洲鲎试剂(LimulusAmebocyte，LAL)裂解液中酶原的激活。这个酶激活之后，对硝基苯胺(pNA-黄色)从Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNa(无色)中释放出来。在温育过程中持续测定在405nm处的吸光度，该吸光度值与培养液中pNA的浓度成比例。将样品中的内毒素的反应时间与已知数量的大肠杆菌内毒素标准的反应时间相比较，从而计算样品中的内毒素浓度。核苷酸含量通过这个方法获得的纯化DnaK的40%对应于不含核苷酸的DnaK，而另外60%为DnaK-ADP。实施例3:DnaK的ATP酶活性为了检测DnaK的功能性，测定了其ATP酶活性。加入外源ATP酶，ADP随时间产生。通过C18柱离子配对反相色谱来分析核苷酸。ATP的水解速率为0.05/分，这与文献中报道的数值相符合(JordanetMcMacken,J.Biol.Chem.(1995)270:4563-4569)。具体地说，在Tris50mM,pH7.4，MgCl23mM和KC110mM.存在的情况下，在DnaK中加入外源ATP(6摩尔当量)。在5、15、30、45和60分钟之后收获反应介质的等分试样(500jil)，通过加入100pi的1MHCL终止反应。通过lOkDa的过滤器将核苷酸从DnaK中分离出来，中和滤液后，通过C18柱离子配对反相色谱来分析核苷酸(图6)。洗脱溶液由100mM磷酸盐缓冲液和20%甲醇组成，四丁基铵用作配对试剂。实施例4:DnaK的生物特性DnaK不具有促炎性效应当在全血中加入DnaK时，与加入细菌脂多糖(LPS)相比较，DnaK诱导产生非常低的白介素1P(IL-ip)、白介素6(IL-6)或肿瘤坏死因子a(TNFoO。这些细胞因子的产生只是在高浓度DnaK(30pg/ml)时可以检测到(图7)。将全血在DnaK或LPS存在的情况下温育24小时，将产生的细胞因子定量，通过ELISA测定。DnaK本身不诱导TVJ或TV(2反应当只有DnaK存在的情况下，温育人PBMC(外周血淋巴细胞)6天时，没有产生干扰素i(IFN-Y)(干犹素-y反映Th1型淋巴细胞的激活)(图8)。TH1型淋巴细胞的激活和IFN-y的产生引起炎性反应的激活。没有产生白介素5或13(IL-5、IL-13)(图8)，它们是在TH2淋巴细胞激活后产生的。TH2反应参与IgE抗体产生和肥大细胞的脱粒化。阳性对照是PHA(植物血细胞凝集素)，其以非特异性方式激活淋巴细胞。5位不同志愿者的培养液中产生的细胞因子通过ELISA测定(每次测定重复进行两次)。在6个样品其中的2个样品中，可以检测到DnaK诱导产生的微量白介素IO(IL-IO)。IL-10参与耐受现象的形成。DnaK不刺激PBMC的增殖在DnaK(1-9|ig/ml)或水痘带状疱疹病毒抗原(Varicellazostervirusantigen)(lCPAU/ml，作为阳性对照)存在的情况下，在96孔板中温育从人血液中纯化的PBMC5天。100pi培养液用含有1pCi的氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷的新鲜培养液取代，然后将细胞继续培养16个小时。在第6天，以P计数器使用液体闪烁法测定引入的氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>结果以平均值士5次测定的标准偏差表示。DnaK抑制另一种抗原诱导产生IFN々将人PBMC单独与制假丝菌素温育，或者在浓度递增的DnaK(l-20(ig/ml)存在的情况下，与制假丝菌素温育，共孵育3天。培养液中的IFN-Y通过ELISA定量。结果以平均值土4次测定的SD表示。由于IFN-Y参与抗原引起的炎性反应，在DnaK存在的情况下其产生被抑制这一事实表明DnaK可以具有一些抗炎性效应(图9)。DnaK刺激Treg细胞的产生IL-IO.-IL-10是耐受调节因子。IL-10由一些Treg细胞产生，这些细胞在其细胞表面强烈表达CD25(CD25+细胞)。从人血液中分离树突状细胞、CD25+和CD25—细胞并将它们以精确比率混合。首先在BSA或DnaK(10吗/ml)存在的情况下温育树突状细胞，然后加入淋巴细胞单独加入CD25'、单独加入CD25+或加入CD257CD25+(比率1:1)的混合物。培养3天，并将细胞以PHA刺激或者不刺激。如所预料的，培养物中CD25+细胞的存在抑制了CD25—细胞的IFN-y的产生(图10)。CD25+细胞的IL-10的产生相对于那些用BSA温育的细胞来说，对于用DnaK温育的细胞更重要，对于细胞群体的混合物来说产量甚至更高。这表明DanK在PHA激活T细胞后，刺激Treg细胞产生IL-lO。人血液中存在抗DanK抗体使用ELISA测试，我们指出在人血清中存在抗DanK的IgG。对于40%的测试样品(来自健康志愿者和过敏性患者)来说，DnaK的情况下比BSA情况下的OD4Q5應更高(图ll)，这反映出抗DnaK的IgG比抗BSA的IgG有更高的滴度。权利要求1、重组纯化的DnaK制品，其-具有ATP酶活性而不加入任何其它的伴侣蛋白；-实质上不含T-细胞刺激性杂质。2、根据权利要求l所述的重组纯化的DnaK制品，其具有a)按重量计纯度为95%或更高；b)残余DNA污染物《1ng/mg蛋白；c)残余宿主细胞蛋白污染物(HCP)按重量计<5%;d)内毒素污染物〈0.5E.U./吗蛋白。3、根据权利要求1或2所述的重组DnaK制品，其具有98%或更高的纯度，优选肽含量以摩尔计为1%以下。4、根据权利要求1至3任一项所述的重组DnaK制品，其中残余DNA污染物《0.5ng/mg蛋白，禾口/或HCP按重量计<0.1%，更优选为按重量计<0.0001%。5、根据权利要求1至4任一项所述的重组DnaK制品，其中DnaK是经过水解的。6、根据权利要求1至5任一项所述的重组DnaK制品，其中内毒素污染物《0.01E.U,/Vg蛋白。7、根据权利要求1至6任一项所述的重组DnaK制品，其中，DnaK实质上不含核苷酸，是与ADP复合的形式、与ATP复合的形式或其混合物。8、根据权利要求1至7任一项所述的重组DnaK制品，其中，DnaK按重量计纯度为至少98%。9、一种从细胞裂解液中纯化如权利要求1-8任一项所述的重组DnaK制品的方法，其包含以下步骤a)离子交换色谱；b)羟磷灰石色谱；a)明胶色谱。10、根据权利要求9所述的方法，其中DnaK来自腐生细菌，优选为大肠杆菌。11、根据权利要求9至10任一项所述的方法，其中离子交换色谱为阴离子交换色谱。12、根据权利要求9至11任一项所述的方法，其中羟磷灰石色谱是II型羟磷灰石色谱。13、根据权利要求9至12任一项所述的方法，其中明胶色谱在明胶琼脂糖上进行。14、一种在重组DnaK和至少一种肽或至少一种蛋白之间形成复合体的方法，所述方法包含下列步骤a)以HSP:ATP的摩尔比为1:1至1:10将如权利要求1至8任一项所述的重组DnaK与ATP结合；b)加入至少一种肽或至少一种蛋白；c)在10。C至6(TC，优选2(TC至45。C的温度下温育。15、一种如权利要求1至8所述的重组DnaK和至少一种肽或至少一种蛋白的混合物，其优选为复合体的形式。16、如权利要求1至8所述的DnaK或如权利要求15所述的混合物或复合体在体内和/或体外诊断中的用途。17、如权利要求1至8所述的重组纯化的DnaK或如权利要求15所述的混合物或复合体在制备用于诱导耐受，治疗或预防过敏症、自身免疫性疾病、移植排斥或神经退行性疾病的药物组合物中的用途，或在制备作为诱导体液反应或调节性T细胞反应的佐剂中的用途。18、一种包含如权利要求1至8所述的重组纯化的DnaK制品或如权利要求15所述的混合物或复合体的药物产品。全文摘要重组的纯化DnaK，其具有ATP酶活性而不加入其它的伴侣蛋白，并且其实质上不含T-细胞刺激性杂质。文档编号C07K14/47GK101528771SQ200780037947公开日2009年9月9日申请日期2007年10月12日优先权日2006年10月13日发明者F·黑诺特,G·普拉西尔,S·皮若通,T·莱岗申请人:生物技术工具公司