专利名称：含有高浓度鸟嘌呤单体的寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸合成方法，特别是含有高含量鸟嘌呤单体的寡核苷酸的合成。更具体地，本发明涉及一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷或延伸的寡核苷酸上的方法。本发明进一步涉及可由本发明的方法获得的寡核苷酸。
背景技术：
化学合成的DNAs和RNAs(“寡核苷酸”)及其类似物在分子生物学应用中广泛使用。寡核苷酸合成方法的使用已经有30多年的历史了(参见Agarwal等，Nature，22727-34(1970))，当今最常用的寡核苷酸合成方法是通过亚磷酰胺化学法合成(参见McBride等，Tetrahedron Lett.，24245-248(1 983))。
亚磷酰胺合成典型地起始于3’-最远端核苷酸，然后通过由四个重复步骤组成的一系列循环进行，直到5’-最远端连接上去。然而，通过在适当的构象里选择第一核苷和核苷亚磷酰胺，普通技术人员可以从5’-3’方向上建立亚磷酰胺合成方法。此处公开的方法适合于两个方向的合成，其中3’-5’方向的合成通常是优选的。
这四个步骤是脱保护、偶联、加帽和稳定化(一般地是氧化或硫化)。在一个变化形式中，在脱保护步骤中，连接在受体核苷酸的戊糖5’-碳上的三苯甲基基团在适当的溶剂如二氯甲烷或甲苯中用三氯乙酸(TCA)或二氯乙酸(DCA)移除，剩下反应性羟基。下一个亚磷酰胺单位在偶联步骤中添加。使用诸如四唑(一种弱酸)的活化剂与偶联的核苷亚磷酰胺进行反应，形成四唑基亚磷酰胺中间物。该中间物然后与受体的羟基发生反应从而形成5’至3’的连接。四唑再生并且该过程继续进行。偶联失败会产生在5’端仍然具有反应性羟基的寡核苷酸。为防止这些寡核苷酸对下一循环具有反应性(将会产生缺失了一个核苷酸的寡核苷酸)，通过用乙酰化试剂如乙酸酐与N-甲基咪唑的混合物进行反向加帽，将这些寡核苷酸从进一步的合成中移除。该试剂仅与游离羟基基团反应以给寡核苷酸加帽。在氧化步骤中，正在延长的寡核苷酸和最新加入的核苷酸之间的亚磷酸酯连接得到稳定，典型地是在四氢呋喃(THF)和水中含有碘作为温和氧化剂的情况下。水作为氧的供体且碘形成具有磷连接的加合物。加合物被水分解，留下稳定的磷三酯键。
为缩短合成时间且产生高产率的产物，亚磷酰胺合成已有许多重大改进。开发出的修饰的亚磷酰胺单体仍需额外的修饰来用于合成。然而，在合成某些寡核苷酸时仍然有很多问题。一个问题就是富含鸟嘌呤(G)的寡聚体的合成。具有富含G区域的寡核苷酸在许多应用中具有很好的前景。富含G的寡核苷酸通常折叠成复杂的结构，这些结构在分子生物学和医学中十分有用。已经筛选出多种折叠成紧密包装的4链结构的适体配子(例如凝血酶适配子)。核酸中的富含G的重复部分在某些具有多种生物作用的单价或二价金属离子存在下形成这些四链体(参见Deng等，PNAS(2001)，98，13665-13670；Jin等，PNAS(1992)，89，8832-8836；和Lee，Nucleic Acids Research(1990)，18，6057-6060)。
在DNA的情况下，这些富含G的序列的纯化最好通过阴离子交换纯化在pH12下进行，此时胸腺嘧啶和鸟嘌呤酰胺官能团被离子化而不能参与结构形成。然而，根据连续鸟嘌呤残基的数目，高质量的合成是困难的，这可能是由于偶联步骤中活化的亚磷酰胺对5’羟基基团的难接近性。
在达到特定长度或碱基组成后，支持物结合的保护的富含G的寡聚体发生一些凝集或在乙腈中具有溶解性问题，这可能是5’羟基基团的难接近性的原因。此外，这也与合成中使用的固相支持物的性质有关。因此，亟需防止凝集或解决溶解性问题的溶剂或溶剂混合物。
本发明提出的方法在偶联步骤中提供了替代的溶剂，尤其是极性非质子溶剂，以缓解富含鸟嘌呤单体的寡聚体的凝集或溶解性问题。
发明内容
本发明提出的方法在偶联步骤中提供了替代的溶剂，尤其是极性非质子溶剂，来缓解富含鸟嘌呤单体的寡聚体的凝集或溶解性问题。可向乙腈中加入溶剂来为寡聚体，尤其是含有高含量鸟嘌呤残基的寡聚体，提供更好的溶解性。
发明详述 本发明提出的方法在偶联步骤中提供了替代的溶剂，尤其是极性非质子溶剂，来缓解富含鸟嘌呤单体的寡聚体的凝集或溶解性问题。此处公开的极性非质子溶剂可单独使用，可互相组合使用，优选地，与乙腈组合使用。极性非质子溶剂可加入到乙腈中来为寡聚体，尤其是具有高含量鸟嘌呤残基的寡聚体，提供更好的溶解性。此外，此处公开的溶剂和溶剂混合物能够提供核苷亚磷酰胺在偶联溶液中的高溶解度，其中优选地所述溶解度至少为0.03M。在一个实施方式中，在偶联步骤中将溶剂加至乙腈、单体和活化剂的混合物中。溶剂与乙腈的比率可变。亚磷酰胺单体可为常规单体或修饰的单体。在一个实施方式中，鸟嘌呤单体可为具有酸不稳定封闭基团或亲脂性5’-O-封闭基团用于最终dG偶联的修饰的鸟嘌呤单体。在一个实施方式中，使用的dG单体是具有三异丙基甲硅烷基封闭基团的N2-异丁酰-2′-脱氧鸟苷3′-O-亚磷酰胺。
本发明提出的方法可用含有已知核苷单体以及修饰的核苷单体的寡核苷酸来进行。该方法可用于DNA合成或RNA合成。与常规的基于阴离子交换HPLC的纯化方法相比，本发明提出的方法也能够进行较大规模的生产。
术语“富含G”或“富含鸟嘌呤”是指具有高浓度鸟嘌呤单体的寡核苷酸。在一个实施方式中，鸟嘌呤残基浓度大到足以阻碍或降低寡核苷酸的溶解性的程度，由此使合成变得困难并且降低目标产物的产率或纯度。
术语“寡核苷酸”是指合成的RNA或DNA聚合物和它们的类似物，并且与“寡聚体”和“核酸”可交换使用。
确定寡核苷酸合成产率的方法和确定寡核苷酸纯度的方法在本领域众所周知。当提及本发明的方法的产率时，该产率典型地且优选地基本如实施例7中所述来确定。类似地，当提及一种寡核苷酸的纯度时，该纯度典型地且优选地基本如实施例7中所述来确定。
在一个方面，本发明提供一种在合成寡核苷酸过程中偶联核苷亚磷酰胺的方法，该方法包括将活化试剂与一种或多种极性非质子溶剂组合形成偶联混合物。在一个优选的实施方式中，该极性非质子溶剂是环丁砜。在一个进一步优选的实施方式中，该极性非质子溶剂是1-甲基吡咯烷-2-酮。在一个进一步优选的实施方式中，该极性非质子溶剂是N，N-二甲基乙酰胺。在一个进一步优选的实施方式中，该极性非质子溶剂是四甲基脲。在一个进一步优选的实施方式中，该活化试剂和该极性非质子溶剂与乙腈组合。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸由大于30％的鸟嘌呤单体组成。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸由大于50％的鸟嘌呤单体组成。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸由大于60％的鸟嘌呤单体组成。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸含有一个具有3个或更多连续鸟嘌呤单体的区域。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸含有一个具有4个或更多连续鸟嘌呤单体的区域。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸含有一个具有5个或更多连续鸟嘌呤单体的区域。在一个进一步优选的实施方式中，该寡核苷酸是SEQ ID NO10。
此处描述的偶联反应可用于在合成寡核苷酸过程中核苷亚磷酰胺与通用支持物的起始偶联。本领域中通常使用的此类通用支持物典型地以及优选地包含琥珀酸酯连接体。此外，此处描述的偶联反应可用于在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷上，其中该第一核苷可为游离的，或优选地，其中该第一核苷被固定在支持物上。此外，此处描述的偶联反应可用于在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至延伸的寡核苷酸上。
因此，在另一方面，本发明涉及一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷或延伸的寡核苷酸上的方法，该方法包括以下步骤(i)产生一种偶联溶液，其中该偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，并且所述至少一种第一溶剂不是乙腈；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；其中优选地所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度至少是0.05M；和(ii)将所述偶联溶液与所述通用支持物、与所述第一核苷或与所述延伸的寡核苷酸接触。在另一个方面，本发明涉及一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷或延伸的寡核苷酸上的方法，该方法包括以下步骤(i)产生一种偶联溶液，其中该偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，并且其中所述至少一种第一溶剂不是乙腈；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；其中优选地所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度至少是0.05M；和(ii)将所述偶联溶液与所述第一核苷、或与所述延伸的寡核苷酸接触。
在一个优选的实施方式中，所述第一溶剂不是选自下组的溶剂(a)琥珀腈，(b)戊二腈，(c)己二腈，(d)庚二腈，(e)戊腈，(f)苄腈，(g)己腈。在一个进一步优选的实施方式中，所述第一溶剂不是选自下组的溶剂(a)二腈，(b)单腈，(c)甘醇二甲醚，(d)二甘醇二甲醚，(e)三甘醇二甲醚，(f)磷酸三甲酯，(g)二氯甲烷，(h)四氢呋喃，(i)二甲氧基乙烷，和(j)硝基甲烷。在进一步优选的实施方式中，所述极性非质子溶剂是偶极非质子溶剂。
在另一个方面，本发明涉及一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷或延伸的寡核苷酸上的方法，该方法包括以下步骤(i)产生一种偶联溶液，其中该偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；和(d)第二溶剂，其中所述第二溶剂与所述至少一种第一溶剂中的任何一种在化学上不同，并且其中优选地所述第二溶剂是乙腈；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；和(ii)将所述偶联溶液与所述通用支持物、与所述第一核苷、或与所述延伸的寡核苷酸接触。
在一个进一步优选的实施方式中，所述至少一种第一溶剂选自(a)环丁砜；(b)1-甲基吡咯烷-2-酮；(c)N，N-二甲基乙酰胺；(d)四甲基脲；和(e)二甲基亚砜(DMSO)；其中优选地所述至少一种第一溶剂选自(a)环丁砜；(b)1-甲基吡咯烷-2-酮；(c)N，N-二甲基乙酰胺；和(d)四甲基脲。在一个非常优选的实施方式中，所述至少一种第一溶剂是环丁砜。
前述任一项的方法，其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度是0.03至0.3M，优选0.03至0.20M，最优选0.05至0.15M。
在一个进一步优选的实施方式中，所述偶联溶液中所述活化试剂的浓度是0.05至0.90M，优选0.25至0.50M，最优选0.30至0.5M。在一个进一步优选的实施方式中，所述偶联溶液包含所述至少一种第一溶剂中的单一一种。
在一个进一步优选的实施方式中，所述偶联溶液由以下组分组成(a)所述至少一种第一溶剂中的单一一种；(b)所述活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺。
在一个进一步优选的实施方式中，所述偶联溶液进一步包含第二溶剂，其中优选地所述第二溶剂是一种弱碱性溶剂。在一个非常优选的实施方式中，所述第二溶剂是乙腈。
对于技术人员来说显而易见的，所述第一溶剂和/或所述第二溶剂优选地以无水的形式提供，以利于本发明的化学反应，尤其是所述核苷亚磷酰胺与所述通用支持物、所述第一核苷、或所述延伸的寡核苷酸的所述偶联。
在一个进一步优选的实施方式中，所述偶联溶液包含或优选地由下述组分组成(a)所述至少一种第一溶剂中的单一一种；(b)所述活化试剂；(c)所述核苷亚磷酰胺；和(d)第二溶剂，其中优选地所述第二溶剂是乙腈。
在一个进一步优选的实施方式中，所述至少一种第一溶剂与所述第二溶剂的比率(v/v)处于5∶1和1∶2之间，优选地在4∶1和1∶2之间，更优选地在3∶1和2∶5之间，又更优选地在2∶1和2∶5之间，又更优选地在2∶1和1∶1之间。
在一个进一步优选的实施方式中，所述至少一种第一溶剂与所述第二溶剂的比率(v/v)是5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1或1∶2；其中优选地所述比率大约是1∶1，其中更优选地该比率是1∶1。
在一个进一步优选的实施方式中，所述第一核苷和/或所述延伸的寡核苷酸被固定于支持物上，其中优选地所述支持物选自(a)聚苯乙烯支持物；和(b)二氧化硅支持物，优选可控孔度玻璃(CPG)支持物。
在一个进一步优选的实施方式中，所述支持物是聚苯乙烯支持物，其中优选地所述聚苯乙烯支持物由二乙烯基苯交联，其中进一步优选地所述聚苯乙烯支持物的特征是具有功能性羟基基团；以及其中更进一步优选地所述聚苯乙烯支持物具有大约90μm的平均颗粒大小。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含至少30％，优选地至少40％，更优选地至少50％，又更优选地至少60％，又更优选地至少70％，最优选地至少75％的鸟嘌呤单体。
在一个进一步优选的实施方式中，所述活化试剂选自(a)4，5-二氰基咪唑(DCI)；(b)5-乙硫基-1H-四唑(ETT)；(c)5-苄硫基-1H-四唑(BTT)；和(d)5-(3，5-二-三氟甲基)苯基-1H-四唑(活化剂42)。在一个非常优选的实施方式中，所述活化试剂是4，5-二氰基咪唑(DCI)。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含一个具有3个或更多，优选地4个或更多，最优选地5个或更多连续鸟嘌呤单体的区域。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含一个具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟嘌呤单体的第一区域。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含一个具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟嘌呤单体的第二区域。
在一个进一步优选的实施方式中，所述第一区域定位于所述寡核苷酸的3’端和/或其中所述第二区域定位于所述寡核苷酸的5’端。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含10至50个，优选地20至40个，最优选地30个核苷酸单体。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含回文序列，其中优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO2)。
在一个进一步优选的实施方式中，所述回文序列的5’端侧翼为至少4个和至多20个，优选地至多10个鸟嘌呤实体(entity)；和/或其中所述回文序列的3’端侧翼为至少6个和至多20个，优选地至多10个鸟嘌呤实体。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含或优选地由选自下组的核苷酸序列组成(a)GGGGACGATC GTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；(b)GGGGGACGAT CGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；(d)GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(SEQ ID NO6)；(e)GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(SEQ ID NO7)；(f)GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(SEQ ID NO8)；(g)GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(SEQ ID NO9)；(h)GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(SEQ ID NO10)；和(i)GGGGGGCG ACGACGAT CGTCGTCG GGGGGG(SEQ IDNO11)。在一个非常优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含或优选地由SEQ ID NO10组成。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸是一种脱氧核苷酸，以及其中优选地所述脱氧核苷酸只由磷酸二酯结合的单体组成。
在另外一个方面，本发明涉及一种产生寡核苷酸的方法，所述方法包括此处所述的任何一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷、或延伸的寡核苷酸上的方法。
在另一个方面，本发明涉及一种产生寡核苷酸的方法，所述方法包括(i)将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷上；其中所述偶联包括此处描述的任何一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷上的方法；(ii)通过氧化步骤(i)的产物生成延伸的寡核苷酸；(iii)将核苷亚磷酰胺至步骤(ii)的产物上，典型地和优选地在脱保护之后；其中所述偶联包括此处描述的任何一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至延伸的寡核苷酸上的方法；(iv)通过氧化步骤(iii)的产物生成延伸的寡核苷酸；和(v)重复步骤(iii)和(iv)直至所述延伸的寡核苷酸包含所述寡核苷酸的序列。
在一个优选的实施方式中，所述方法进一步包括在变性条件下纯化所述寡核苷酸的步骤，其中优选地所述变性条件的特征在于pH10至14，优选pH10至13，更优选pH大约为12，最优选为pH12。
在一个进一步优选的实施方式中，所述方法进一步包括在pH10至14下，优选地在pH10至13下，更优选地在pH大约12下，最优选地在pH12下纯化所述寡核苷酸的步骤。
在一个进一步优选的实施方式中，所述纯化通过阴离子交换层析进行，其中优选地所述阴离子交换层析通过使用被季胺基团功能化的阴离子交换基质来进行，其中进一步优选地所述阴离子交换基质由选自聚苯乙烯和聚丙烯酸甲酯的材料组成，其中更进一步优选地所述材料是聚丙烯酸甲酯。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸以相对于所述第一核苷至少20％，优选至少25％，更优选至少30％，又更优选至少35％，最优选至少40％的摩尔产率产生。
在一个进一步优选的实施方式中，所述寡核苷酸的纯度至少是75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，又更优选地至少90％，最优选地至少95％。
在另外一个方面，本发明涉及偶联溶液在用于将核苷亚磷酰胺偶联至核苷或延伸的寡核苷酸上的方法中的应用，其中所述偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，以及其中所述至少一种第一溶剂不是乙腈；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；以及其中优选地所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度至少是0.05M。在一个优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于此处所述的在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷或延伸的寡核苷酸上的任一种方法的特征。
在另外一个方面，本发明涉及一种用于在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷、或延伸的核苷酸上的偶联溶液，其中所述偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，以及其中所述至少一种第一溶剂不是乙腈，以及其中优选地所述极性非质子溶剂不是己二腈；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；以及其中优选地所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度至少是0.05M。在一个优选的实施方式中，所述方法的特征进一步在于此处公开的任一种方法的特征。在一个优选的实施方式中，所述偶联溶液的特征在于此处公开的任何一种特征及任何可能的组合。
一个非常优选的实施方式是包含或优选地由下述组分组成的偶联溶液(a)单一一种第一溶剂，其中所述单一一种第一溶剂是一种极性非质子溶剂，以及其中所述单一一种第一溶剂选自(i)环丁砜；(ii)1-甲基吡咯烷-2-酮；(iii)N，N-二甲基乙酰胺；(iv)四甲基脲；和(v)二甲基亚砜(DMSO)；以及其中优选地所述单一一种第一溶剂是环丁砜；(b)活化试剂；(c)所述核苷亚磷酰胺；和(d)第二溶剂，其中所述第二溶剂是乙腈；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；其中所述单一一种第一溶剂与所述第二溶剂的比率(v/v)在5∶1和1∶2之间，优选地所述比率是1∶1。
在另外一个方面，本发明涉及可由此处公开方法中的任一方法获得的寡核苷酸，尤其是可由此处公开的任一产生寡核苷酸的方法获得的寡核苷酸。
在一个优选的实施方式中，所述寡核苷酸包含或优选地由选自下组的核苷酸序列组成(a)GGGGACGATC GTCGGGGGG(SEQ IDNO3)；(b)GGGGGACGAT CGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(c)GGGGGGACGA TCGTCGGGGG G(SEQ ID NO5)；(d)GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(SEQ ID NO6)；(e)GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(SEQ ID NO7)；(f)GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(SEQ ID NO8)；(g)GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(SEQ ID NO9)；(h)GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(SEQ ID NO10)；和(i)GGGGGGCGAC GACGATCGTC GTCGGGGGGG(SEQ IDNO11)。在一个非常优选的实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ IDNO10组成。
在另外一个方面，本发明涉及包含或优选地由选自下组的核苷酸序列组成的寡核苷酸(a)GGGGACGATC GTCGGGGGG(SEQ IDNO3)；(b)GGGGGACGAT CGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；(c)GGGGGGACGA TCGTCGGGGG G(SEQ ID NO5)；(d)GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(SEQ ID NO6)；(e)GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(SEQ ID NO7)；(f)GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(SEQ ID NO8)；(g)GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(SEQ ID NO9)；(h)GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(SEQ ID NO10)；和(i)GGGGGGCGAC GACGATCGTC GTCGGGGGGG(SEQ IDNO11)；其中所述寡核苷酸的纯度至少是75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，又更优选地至少90％，最优选地至少95％。在一个非常优选的实施方式中，所述寡核苷酸由SEQ ID NO10组成。
此处公开的方法非常适合于寡核苷酸的大规模合成，尤其是富含G的寡核苷酸，例如，侧翼为poly-G的含非甲基化CpG的寡核苷酸。此类化合物可用于制药应用中。例如，它们是免疫系统的众所周知的刺激物。因此，在另外一个方面，本发明涉及本发明的寡核苷酸在制药和/或制备疫苗中的应用。
在另外一个方面，本发明涉及一种在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷、或延伸的寡核苷酸上的方法，该方法包括以下步骤(i)产生一种偶联溶液，其中该偶联溶液包含(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，以及其中所述至少一种第一溶剂不是乙腈；(b)活化试剂；和(c)所述核苷亚磷酰胺；其中所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少是0.03M；以及其中优选地所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度至少是0.05M；和(ii)将所述偶联溶液与所述通用支持物、与所述第一核苷、或与所述延伸的寡核苷酸接触。在一个优选的实施方式中，所述第一溶剂不是己二腈。
此处引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均引入本文作为参考，如同每篇参考文献被单独地和具体地引入作为参考以及完整地进行阐述。
描述本发明的上下文(特别是在下述权利要求的上下文)中使用的术语“一个”和“一种”和类似的用语应当理解为同时涵盖单数和复数形式，除非此处另外指出或者根据上下文清楚地确定不是这样。除非另外指出，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当理解为开放式的术语(即，意思是“包括，但不限于”)。此处对数值范围的叙述只是作为个别地提到落在该范围之内的每个单独数值的简略方法，除非此处另有它指，而且每个单独的数值均被引入到说明书中，就像它被此处单独提到一样。此处描述的所有方法可以按照任何适当的次序进行，除非此处另外指出或由上下文清楚地看出不是这样。任何和所有实例的使用，或此处提出的示例性语言(例如，“例如”)，只是用来更好地阐明本发明，而非对本发明的范围进行限制，除非另有声明。说明书中的语言均不应理解为将任何不要求保护的元素指为实施本发明的必要元素。
此处描述了本发明优选的实施方式，包括发明人已知的本发明的最佳实施方式。在阅读了前面的描述后，本领域普通技术人员应当明了这些优选实施方式的变化。发明人预期熟练技术人员会适当地采用这些变化，并且发明人想到了将会以此处具体描述的方式之外的方式实施的发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括所附权利要求书中所述的主题的所有变化和等同形式。此外，上述元素在其所有可能的变化中的任何组合均涵盖在本发明中，除非此处另外指出或由上下文清楚地确定不是这样。
下述实施例进一步阐明了本发明，但是，当然不应理解为以任何形式限制其范围。
实施例1 该实施例描述了经过寡聚物合成相容性测试的溶剂。下述溶剂经过了测试。
1-甲基吡咯烷-2-酮(NMP)-MW 99.13；密度1.032g/ml；粘度1.67cP；偶极距4.09D。肽合成级来自于Fluka(目录号69116；批号和填充码1059178，21504055)。由GC测得的纯度≥99.5％，含水量≤0.02％。
N，N-二甲基乙酰胺(DMA)-MW 87.12；密度0.942g/ml；20℃时的粘度1.02cP；偶极距3.79D。puriss级来自于Fluka(目录号38840；批号和填充码454936/1，40504059)。由GC测得的纯度≥99.5％。
四甲基脲(TMU)-MW 116.16；密度0.968g/ml。BioChemika级来自于Fluka(目录号87849；批号和填充码1063403，30205010)。由GC测得的纯度≥99.5％。使用前该材料在4埃分子筛上干燥48h。
二甲基亚砜(DMSO)-MW 78.13；密度1.100g/ml；20℃时的粘度1.996cP；偶极距3.96D。经过分子筛的纯Puriss.来自于Fluka(目录号41647，批号和填充码1073729，22404456)。由GC测得的纯度≥99.5％，含水量≤0.005％。
环丁砜-MW 120.17；密度1.293g/ml；30℃时的粘度10.30cP；偶极距4.8D。Puriss.级来自于Fluka(目录号86148，批号和填充码1181025，42306336)。由GC测得的纯度≥99.5％。使用前该材料首先在35℃炉中液化，然后在4埃分子筛上干燥48h。
1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)-MW 168.04；密度1.596g/ml。紫外光谱级来自于Apollo Scientific(目录号PC 0877，批号BNOHFIP-05-14)。HFIP是一种常用来溶解肽的极性羟基溶剂，因此包括其作为对照。
实施例2 下述实施例证明了单体和5-苄硫基四唑(BTT)在乙腈和实施例1的溶剂的1∶1体积比混合物中的溶解性。
BTT(MW 192.2.，含水量≤75ppm)由emp Biotech GmbH(目录号NC-0101-1K，批号050904)公司提供。dT(MW 744.83)、dGibu(MW839.92)、dAbz(MW 857.93)、dCbz(MW 833.93)单体由Proligo提供。乙腈(MeCN)在25℃时具有0.345cP的粘度和3.92D的偶极距。
将74.5mg(100μmol)的dT单体称重后分别装进7个上部为螺旋帽盖的10ml瓶子内。将84mg(100μmol)的dGibu单体称重后分别装进7个上部为螺旋帽盖的10ml瓶子内。将86mg(100μmol)的dAbz单体称重后分别装进7个上部为螺旋帽盖的10ml瓶子内。将83mg(100μmol)的dCbz单体称重后分别装进7个上部为螺旋帽盖的10ml瓶子内。将228mg(1.2mmol)的BTT称重后分别装进7个上部为螺旋帽盖的10ml瓶子内。
在氩气环境下于单独的干燥瓶子内通过混合10ml无水乙腈和10ml上述所列的六种不同溶剂中的一种溶剂，来制备六种不同溶剂混合物。
向每个单独的T单体瓶子中加入1ml六种不同溶剂混合物中的一种或仅加入乙腈。迅速盖上瓶子并柔和振荡。对于dG、dA和dC单体的瓶子重复同样的步骤。所有单体在所有这7种溶剂混合物中相当快速地溶解(在10min之内，MeCN/环丁砜溶解略慢)，浓度为0.1M，这是在标准合成仪上使用所需的浓度。得到清澈无色的溶液。
向每个单独的BTT瓶子中加入4ml六种溶剂混合物中的一种。除HFIP/MeCN的溶解外所有几乎都立刻溶解达到0.3M的浓度，这是DNA和RNA合成的典型标准浓度。将BTT加入至纯乙腈中，其溶解不象在实施例1的六种溶剂中溶解的那么快。需要温和的加热过程来达到在纯乙腈中的快速溶解。
所有4种标准的被保护的DNA单体在乙腈和NMP、DMA、TMU、DMSO及环丁砜的1∶1混合物中都能迅速溶解成0.1M浓度。BTT在所有5种混合物中溶解成0.3M。
实施例3 下述实施例证明了单体在溶剂溶液中经过48h后的稳定性。为检查单体在不同溶剂混合物中的稳定性，在室温静置48h后，对于28种单体溶液各取1μl来进行硅胶tlc分析。显然显示出的任何可见的不稳定性意味着那种特定溶剂组合不适用于合成仪上的DNA合成。针对这个目的选择了含3％三乙胺的乙酸乙酯/1，2-二氯乙烷(1∶2v/v)作为洗脱剂。除在MeCN/HFIP中的溶液(全是淡黄色，可能是由于脱三苯甲基化和降解)之外的所有单体溶液仍是无色的。用于tlc的铝卡上的具有荧光指示剂254nm的硅胶来自于Fluka(目录号60778，批号503 066)。
对于6种相关溶剂混合物中的各种单体观察到下述斑点。正如大致所预期的，溶剂混合物MeCN/HFIP导致所有4种单体完全降解，在tlc上具有多个斑点，其Rfs从0至0.21。结果列于表1中。
表1.硅胶tlc分析结果 相对于在NMP和DMA中的值，在TMU的情况中tlc斑点具有略微增加的Rfs。在DMSO中Rfs有一些降低。在大多数情况下都观测到了非对映异构体。在NMP、DMA、TMU和DMSO中也观测到了非常非常淡的杂质斑点。对于dCbz单体在环丁砜中的情况，观测到了淡的杂质斑点，Rf为0.27。
在溶液中室温48h后，所有4种标准的被保护的DNA单体呈现非常少的降解/无降解。所有5种混合物似乎都适合进行含有寡聚dG的序列的小规模合成。
实施例4 下述实施例证明了当在ABI 394 DNA/RNA合成仪(AppliedBiosystems)上合成富含G的寡核苷酸过程中用于偶联步骤时实施例1的溶剂的应用。选用了下述富含鸟嘌呤的寡核苷酸来合成。SEQ ID NO1d[GGGGGGGGGG] 表2给出了允许相对于纯乙腈的粘度变化的计算出的运送因数。
表2.替代溶剂的流速因数 调节ABI 394合成仪上的循环参数。对于1μmol规模的DNA合成使用第20号循环，其相关单体和单体+tet运送时间秒数列于下表内。5种不同1∶1溶剂混合物的修正运送时间也显示在表3中。
表3.ABI 394合成仪的循环参数的调节 在ABI 394-08上使用了下述合成参数。使用纯乙腈作为缩合步骤的溶剂，以及每个NMP、DMA、TMU、DMSO及环丁砜与乙腈的1∶1混合物，在可控孔度玻璃(CPG)和聚苯乙烯(PS)支持物上进行1μmol规模的(dG)10的去除三苯甲基的合成。使用了DNA合成循环20，包括下面五个步骤(1)用DCA在1，2-二氯乙烷(DCE)中的5％溶液脱三苯甲基反应75sec；(2)与0.5M DCI加0.1M dG单体在适当溶剂混合物中偶联5min；(3)用tac酐/MeCN加帽1min；(4)用吡啶/水(9∶1v/v)中的50mM I2氧化1min；和(5)加帽5sec。“tet至废物”、“B+tet至柱”和“tet至柱”的运送时间按照上表对不同溶剂混合物进行调节。
CPG dG(tac)500A支持物由SAFC Proligo(产品号G302001，bulkno.5452，批号223460)提供，且具有35μmol/g的载量。因此，28.6mg等价于1μmol。以79μmol/g装载的dGibu 80S聚苯乙烯支持物从GEHealthcare获得，订单号17-5252-82，批号1503095，瓶12。12.7mg等价于1μmol。4，5-二氰基咪唑(DCI)从SAFC Proligo获得(产品号M700100，批号231206)提供。分子量为118.1。0.5M溶液为2.95g干燥DCI溶于50ml乙腈或其他溶剂中。dGibu单体来自于SAFCProligo(产品号G111010-01，批号230394，瓶17)。分子量为839.92。5ml 0.1M的溶液需要420mg。由GC测定为99.8％的极干燥的二氯乙烷来自于Acros Organics(产品编码32684 0010，批号A0208016)。用于氧化的50mM碘溶液来自于Biosolve(目录号15072402，批号455001)。二氯乙酸(DCA)来自于Fluka，目录号35810，批号S36318 12306B 12。Cap B ACN来自于SAFC Proligo，目录号LB50250，批号16673。Cap 2 CAN来自于SAFC Proligo，目录号LR50250，批号16950。
将420mg的dGibu单体置入六个单独的ABI 10ml亚酰胺(amidite)瓶的每一个中并且在P2O5和KOH块上过夜真空干燥。用氩气释放真空并将每个单体溶解于一种溶剂混合物中。称重2.95g等份的DCI至六个250ml ABI瓶中并真空干燥。每份DCI溶解于6种不同溶剂(5种混合物加1个纯乙腈)之一中。
六个ABI快速(snap)柱充填以28.6mg dG(tac)-CPG且6个柱充填以12.7mg dGibu 80S聚苯乙烯支持物。在用于固相合成前，PS支持物在乙腈中膨胀10min。
在每个合成开始前使用ABI启动方案，以确保所有运送管道被新鲜试剂充满。三苯甲基颜色与成功偶联相对应。
所有12个支持物在密封良好的螺旋盖玻璃瓶中在3ml 40wt.％甲胺水溶液(Aldrich，目录号42,646-6，批号S23322-405)中65℃脱保护2.5h。冷却后，将上清液过滤至Falcon试管中且每个支持物用3ml20％乙醇水溶液洗涤。过滤洗涤物并且与相应的过滤物合并。样品然后在Speedvac中真空浓缩至大约2ml。每个样品用纯水稀释至5ml的总体积。
为确定每个样品在260nm的总ODs，每个样品取50μl的小份用1M Tris HCl缓冲液pH 7.6(用于分子生物学的FlukaBioChemika Ultra级，目录号93314，批号和填充码118896054605275)稀释至1ml。每个溶液用1cm光路长度的一次性比色杯(Plastibrand，1.5ml semi-micro，目录号7591 50)来测量A260nm。表4显示了每个合成的校正的粗ODs/μmol。
表4.溶剂合成的ODs/μmol. 然后对于所有12个粗合成物进行阴离子交换HPLC分析。每个粗合成物在5ml水中的0.5ml溶液与0.5ml HPLC缓冲液A(50mMNaCl，10mM NaOH和0.2mM EDTA溶于水中)混合。将14×1ml样品置于1.5ml短螺纹自动上样瓶(VWR International，目录号548-0177，批号19310/20060763)中，上样瓶装载在A-900自动上样器(GE Healthcare)的托盘中，该自动上样器与Akta Explorer 10HPLC系统(GE Healthcare)连接。从瓶中注射50μl样品并且在DNAPac-100柱(Dionex)上于50℃(Thermasphere柱加热器，Phenomenex)下进行分离，在25min期间使用从0至40％B的梯度，流速为1ml/min，以及在260、280和295nm处进行UV检测。B缓冲液为溶于水中的2.5M NaCl，10mM NaOH和0.2mM EDTA。表5给出了每个溶剂混合物和每个支持物的％全长产物。
表5.溶剂合成的％全长产物 对于CPG上的MeCN，HPLC痕迹显示在产物峰前有12％的杂质和3.5％的n+材料。峰高为863mAU。产生文件AutosamplerDNAPac028。对于PS，痕迹显示在产物峰前有12％的杂质和3.3％的n+材料。峰高为817mAU。产生文件Autosampler DNAPac008。
对于CPG上的DMSO/MeCN，HPLC痕迹显示大部分不完全的偶联，具有347 mAU的产物峰。PS产物峰高为215 mAU。产生文件Autosampler DNAPac009。
对于CPG上的DMA/MeCN，HPLC痕迹显示仅有少量的不完全偶联。主峰前有8.1％的杂质，均具有相当均一的强度，以及5.1％的n+材料。产物峰高为725mAU。产生文件Autosampler DNAPac003。对于PS，产物峰前仅有10.4％的杂质，以及仅0.4％的n+材料。产物峰高为805mAU。产生文件Autosampler DNAPac010。
对于CPG上的环丁砜/MeCN，HPLC痕迹仅显示非常小的失败峰(不完全偶联)和产物峰前的7.2％的杂质以及4.6％的n+材料。产物峰高为867mAU。产生文件Autosampler DNAPac004。对于PS，仅有0.8％n+材料。产物峰高为683mAU。产生文件AutosamplerDNAPac011。
对于CPG上的NMP/MeCN，HPLC痕迹显示大约同等大小的全面失败，主峰前具有6.3％失败，和大约4.8％n+材料。产物峰高为639mAU。产生文件Autosampler DNAPac005。对于PS，有几处明显的失败，但仅有0.7％n+材料。产物峰高为748mAU。产生文件Autosampler DNAPac012。
对于CPG上的TMU/MeCN，HPLC痕迹显示产物峰前有7％的失败和大约7.5％的总n+材料。产物峰高为551mAU。产生文件Autosampler DNAPac007。对于PS，在产物峰前大约有11.8％的失败，与使用纯MeCN获得的结果非常类似。总n+材料仅为2.7％。产物峰高为735mAU。产生文件Autosampler DNAPac014。
实施例5 下述实施例说明了在CPG、GE聚苯乙烯和NittoPhase支持物上进行的1μmol规模的SEQ ID NO10d[GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG]合成，其中使用纯乙腈作为缩合步骤的溶剂，以及DMA、环丁砜、NMP和TMU与乙腈的1∶1混合物中的每一种。
除以下所述外使用实施例4的循环和参数。合成中包括来自于SAFC Proligo的dAbz单体(产品号A111010-01，批号228992；分子量为854.93；2.5ml的0.1M溶液需要215mg)、来自于SAFC Proligo的dCtac单体(产品号C111020-01，批号229934；分子量为920.04；3.25ml的0.1M溶液需要299mg)；和来自于SAFC Proligo的dT单体(产品号T111010-01，批号231062；分子量为744.81；2.5ml的0.1M溶液需要186mg)。将840mg的dGibu单体置入5个单独的ABI10ml amidite瓶的每一个中且在P2O5和KOH块上真空干燥过夜。用氩气释放真空且将每个单体溶解于适当体积的一种溶剂混合物中。称重5.9g等份的DCI加于5个180ml ABI瓶的每一个中且真空干燥。每份DCI溶解于5种不同溶剂(4种混合物加一个纯乙腈)的一个中。
将5个ABI快速柱充填以大约28.6mg dG(tac)-CPG，5个柱充填以大约12.7mg dGibu 80S聚苯乙烯支持物，5个柱充填以大约11.9mg的NittoPhase dGibu支持物。表6列出了确切的用量。在用于固相合成前，PS支持物在乙腈中膨胀10min。
表6.ABI 394-08合成的柱体规格
每次合成开始前都使用ABI起始方案，以确保所有运送管道被新鲜试剂充满。合成结束后用氩气气流吹干柱体。
小心打开柱体并将支持物转移至4ml带螺旋盖的玻璃瓶中并用3ml的40wt.％甲胺水溶液(Aldrich，目录号42，646-6，批号S23322-405)于65℃脱保护2.5h。冷却后，将上清液过滤至Falcon试管中且每个支持物用2×3ml 20％乙醇水溶液洗涤。过滤洗涤物并且与相应的过滤物合并。将样品体积调整至10ml并且各取35μl的小份用于阴离子交换HPLC分析(样品G4、P4、N4、G5、P5和N5取525μl的小份，并且各自与475μl水混合，将溶液置于自动上样瓶中，上样瓶然后在连接于Akta Explorer 10HPLC系统的自动上样器上运行)。在4×250mm的分析型DNAPac PA-100柱(Dionex，产品号043010，批号005-21-017，序列号005402)上进行HPLC分析。在40min期间使用0-50％B的线性梯度，1ml/min的流速，并且柱流出液在260、280和295nm处用UV监测。缓冲液A为溶于水的50mM NaCl和10mM NaOH，缓冲液B为溶于水的2.5M NaCl和10mMNaOH。表7显示了通过整合每次运行中的所有峰获得的％全长产物。
溶液然后在Speedvac中真空浓缩至干。每个样品用纯水稀释至总体积为10ml。为确定每个样品在260nm处的总ODs，各取30μl的小份用1M Tris HCl缓冲液pH 7.6(用于分子生物学的FlukaBioChemika Ultra级，目录号93314，批号及填充码118896054605275)稀释至1ml。每个溶液用1cm光路长度的一次性比色杯(Plastibrand，1.5ml semi-micro，目录号7591 50)来测量A260nm。表7显示了每个合成的校正的粗ODs/μmol。
表7.实施例5的1μmol合成的结果.
实施例6 下述实施例说明了富含鸟嘌呤的寡核苷酸G10(SEQ ID NO10)的大规模合成。G10在OligoPilot 100上进行合成，其中使用充填以NittoPhase支持物的OPII柱，该支持物以120μmol/g负载dGibu，并且使用DCI作为缩合剂，DCI溶于1∶1v/v乙腈/环丁砜混合物中作为缩合步骤的溶剂。
合成。2.4mmol规模的去除三苯甲基的合成在Akta OligoPilot100合成仪上进行，使用20g的NittoPhaseTM dGibu支持物(批号195136)，其装载量为120μmol/g，并且充填在OPII柱(6cm内径，GEHealthcare编号18-1107-60)中，调整柱体积为133mL(参见下述)。使用的单体浓度(4倍过量)为在乙腈/环丁砜(1∶1v/v)中0.27M，DCI在乙腈/环丁砜(1∶1v/v)中的0.5M溶液用作偶联剂，偶联时间为10min。单体浓度计算如下循环回路的体积是5mL，使用的柱体积为120mL(当在甲苯中膨胀时这是支持物的体积，基于6.0mL/g)，充填柱中可以获得的开放体积为0.7×120＝84mL，因此产生89mL的总开放体积。这代表了活化剂加上可以加入用于偶联的亚酰胺溶液的最大体积。因为对于偶联混合物，活化剂溶液与单体溶液的比率设定在60∶40v/v，所以要加入的单体溶液的体积是35.6mL并且其中含有9.6mmol(4倍过量)的单体；因此单体的浓度是0.27M。加入用于偶联的活化剂溶液的体积是53.4mL，其相当于26.7mmol，产生的DCI∶单体的比率为2.78∶1。在开始合成前支持物要膨胀并充填在甲苯中，然后用乙腈洗涤。
脱保护。在合成结束后，支持物结合的寡核苷酸用二乙胺(DEA)在无水乙腈中的20％溶液处理，以去除氰乙基保护基团。
粗产率和粗纯度粗产率为187.8A260单位/μmol并且由HPLC确定粗纯度为70.25％。
纯化。下一步骤是粗G10的制备型阴离子交换HPLC纯化，在Waters AP-5，50×200mm柱(件号WAT023322)上运行4次，柱子用TSK-GEL SuperQ-5PW 20μm充填至床高18.9cm，并且使用上述制备型HPLC缓冲液组合物，在82.5min中用10-55％B的线性梯度以50mL/min洗脱。
在上样之前调整粗G10溶液的pH至12并且样品再过滤一次。收集40mL级分并且通过分析型阴离子交换HPLC按照上述方法分析。仅合并经过阴离子交换HPLC测得分析纯度超过85％的级分。分析前所有峰级分立即用乙酸中和至pH 6-8。
脱盐。来自上述的纯G10的合并级分(总体积2700mL)在PallCentramate 500S台式切向流过滤(TFF)系统(件号CM500SE，commission no.C500S-2017))上浓缩至300mL，该系统配备有一个1kDa Centramate Omega介质筛选盒(Pall，件号OS001C12，序列号36324055R)，具有0.093m2的表面积。然后进行十三次对纯水的连续渗滤循环以去除盐和缓冲液。滞留物进一步浓缩至200mL的体积。
实施例7 通过计算起始材料的摩尔量，使得使用的支持物的重量乘以装载量(例如20g×120μmol/g＝2.4mmol)，来确定实施例6中所述的合成的总工艺产率。100％的产率将是相同摩尔量的产物，考虑到产物的摩尔质量(即，对于SEQ ID NO10为9612mg/mmol)。产率是使用产物特异性消光系数(对于SEQ ID NO10，1AU260-340＝27.8μg，路径长度为1cm时)通过UV光谱法定量实际得到的相对量。实施例6中所述的合成的总工艺产率为31.4％。
产生的寡核苷酸的纯度通过HPLC分析来确定，在该分析中，在25℃的炉温下，将40μl的5至100μM产物溶液注射到DNAPac PA-100柱中。柱子用75％的缓冲液A(20mM NaOH)和25％的缓冲液B(20mM NaOH，1.5M NaCl，40％甲醇)平衡。使用0.75ml/min的流速。检测波长为260nm。注射一分钟后，开始梯度，在4分钟内缓冲液B的百分比增至40％，然后，在接下来的35分钟内缓冲液B的百分比增加至55％。然后，在一分钟内缓冲液B的百分比增加至100％并保持3分钟，然后在3.9分钟内缓冲液B的百分比降低至25％。纯度为相对于整个层析图上的总峰面积的主峰下的相对峰面积。设置了整合限度以进行谷对谷的整合。实施例6描述的合成的产物纯度为87.75％。
实施例8 寡核苷酸G10(SEQ ID NO10)的合成基本上按照实施例5所述来进行。对下述极性非质子溶剂与MeCN的混合物进行了测试并且与单独的MeCN进行了比较1.)DMA/MeCN，2.)环丁砜/MeCN，3.)NMP/MeCN，和4.)TMU/MeCN。实验一式两份重复6次，其中每次重复时所述溶剂与MeCN的比率(v/v)从5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1至1∶2变化。产物的产率和纯度如上所述进行测定并且进行比较。
序列表
<110>综合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，Inc.)
<120>含有高浓度鸟嘌呤单体的寡核苷酸
<130>PA2007-17
<150>US 60/869,588
<151>2006-12-12
<160>11
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成G寡核苷酸
<400>1
gggggggggg10
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>回文序列
<400>2
gacgatcgtc10
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>3
ggggacgatc gtcgggggg 19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>4
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>5
ggggggacga tcgtcggggg g 21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>6
gggggggacg atcgtcgggg gg22
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>7
ggggggggac gatcgtcggg gggg 24
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>8
ggggggggga cgatcgtcgg gggggg26
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>9
gggggggggg acgatcgtcg gggggggg 28
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>10
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg30
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>富含G的寡核苷酸
<400>11
ggggggcgac gacgatcgtc gtcggggggg30
权利要求
1.在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷或延伸的寡核苷酸上的方法，所述方法包括以下步骤
(i)产生一种偶联溶液，其中所述偶联溶液包含
(a)至少一种第一溶剂，其中所述至少一种第一溶剂是极性非质子溶剂，且所述至少一种第一溶剂不是乙腈；
(b)活化试剂；和
(c)所述核苷亚磷酰胺；
其中在所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度至少为0.03M；和
(ii)将所述偶联溶液与所述通用支持物、所述第一核苷或所述延伸的寡核苷酸进行接触。
2.前述权利要求的方法，其中所述至少一种第一溶剂选自
(a)环丁砜；
(b)1-甲基吡咯烷-2-酮；
(c)N，N-二甲基乙酰胺；
(d)四甲基脲；和
(e)二甲基亚砜(DMSO)。
3.前述任一项权利要求的方法，其中所述至少一种第一溶剂是环丁砜。
4.前述任一项权利要求的方法，其中在所述偶联溶液中的所述核苷亚磷酰胺的浓度为0.03至0.30M。
5.前述任一项权利要求的方法，其中在所述偶联溶液中的所述活化试剂的浓度为0.05至0.90M。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述偶联溶液进一步包含第二溶剂，其中所述第二溶剂是乙腈。
7.权利要求6的方法，其中所述偶联溶液由下述成分组成
(a)所述至少一种第一溶剂中的单一一种；
(b)所述活化试剂；
(c)所述核苷亚磷酰胺；和
(d)第二溶剂，其中所述第二溶剂是乙腈。
8.权利要求6或7任一项的方法，其中所述至少一种第一溶剂与所述第二溶剂的比率(v/v)在5∶1和1∶2之间。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述至少一种第一溶剂与所述第二溶剂的比率(v/v)是1∶1。
10.前述任一项权利要求的方法，其中所述第一核苷和/或所述延伸的核苷酸被固定在支持物上。
11.前述任一项权利要求的方法，其中所述支持物是聚苯乙烯支持物，其中所述聚苯乙烯支持物由二乙烯基苯交联。
12.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含至少30％的鸟嘌呤单体。
13.前述任一项权利要求的方法，其中所述活化试剂选自
(a)4，5-二氰基咪唑(DCI)；
(b)5-乙硫基-1H-四唑(ETT)；
(c)5-苄硫基-1H-四唑(BTT)；和
(d)5-(3，5-二-三氟甲基)苯基-1H-四唑(活化剂42)。
14.前述任一项权利要求的方法，其中所述活化试剂是4，5-二氰基咪唑(DCI)。
15.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含具有3个或更多连续鸟嘌呤单体的区域。
16.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟嘌呤单体的第一区域。
17.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟嘌呤单体的第二区域。
18.权利要求16或17任一项的方法，其中所述第一区域定位于所述寡核苷酸的3’端和/或其中所述第二区域定位于所述寡核苷酸的5’端。
19.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含10至50个核苷酸单体。
20.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含回文序列，其中所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO2)。
21.前述任一项权利要求的方法，其中所述回文序列在其5’端侧翼为至少4个且至多20个鸟嘌呤实体；和/或其中所述回文序列在其3’端侧翼为至少6个且至多20个鸟嘌呤实体。
22.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸包含选自下组的核苷酸序列
(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；
(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；
(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；
(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO6)；
(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO7)；
(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；
(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ IDNO9)；
(h)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO10)；和
(i)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO11)。
23.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸由SEQ IDNO10组成。
24.一种产生寡核苷酸的方法，所述方法包括权利要求1至23中任一项的方法。
25.一种产生寡核苷酸的方法，所述方法包括
(i)将核苷亚磷酰胺偶联至第一核苷上；其中所述偶联包括权利要求1至23中任一项的方法；
(ii)通过氧化步骤(i)的产物产生延伸的寡核苷酸；
(iii)在脱保护后将核苷亚磷酰胺偶联至步骤(ii)的产物上；其中所述偶联包括权利要求1至23中任一项的方法；
(iv)通过氧化步骤(iii)的产物产生延伸的核苷酸；和
(v)重复步骤(iii)和(iv)直至所述延伸的寡核苷酸包含所述寡核苷酸的序列。
26.权利要求24或25任一项的方法，其中所述方法进一步包括在变性条件下纯化所述寡核苷酸的步骤，其中所述变性条件的特征在于pH 10至14。
27.权利要求26的方法，其中所述纯化通过阴离子交换层析进行。
28.权利要求25至27中任一项的方法，其中所述寡核苷酸以相对于所述第一核苷至少20％的摩尔产率产生。
29.前述任一项权利要求的方法，其中所述寡核苷酸的纯度至少为75％。
30.通过权利要求24至28中任一项的方法获得的寡核苷酸。
31.权利要求30的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含选自下组的核苷酸序列
(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；
(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；
(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；
(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO6)；
(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO7)；
(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；
(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ IDNO9)；
(h)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO10)；和
(i)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO11)。
32.权利要求31的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQ IDNO10组成。
33.一种寡核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列
(a)GGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO3)；
(b)GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO4)；
(c)GGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO5)；
(d)GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO6)；
(e)GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG(SEQ ID NO7)；
(f)GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG(SEQ ID NO8)；
(g)GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG(SEQ IDNO9)；
(h)GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ IDNO10)；和
(i)GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG(SEQ IDNO11)；
其中所述寡核苷酸的纯度至少为75％。
34.权利要求33的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由SEQ IDNO10组成。
序列表
SEQ ID NO1
GGGGGGGGGG
SEQ ID NO2
GACGATCGTC
SEQ ID NO3
GGGGACGATCGTCGGGGGG
SEQ ID NO4
GGGGGACGATCGTCGGGGGG
SEQ ID NO5
GGGGGGACGATCGTCGGGGGG
SEQ ID NO6
GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG
SEQ ID NO7
GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG
SEQ ID NO8
GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG
SEQ ID NO9
GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG
SEQ ID NO10
GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG
SEQ ID NO11
GGGGGGCGACGACGATCGTCGTCGGGGGGG
全文摘要
本发明涉及寡核苷酸合成方法，特别是含有高含量鸟嘌呤单体的寡核苷酸的合成。更具体地，本发明涉及在合成寡核苷酸过程中将核苷亚磷酰胺偶联至通用支持物、第一核苷或延伸的核苷酸上的方法。本发明进一步涉及可由本发明方法获得的寡核苷酸。
文档编号C07H21/02GK101611048SQ200780049850
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月12日 优先权日2006年12月12日
发明者B·S·斯普罗特 申请人:综合Dna技术公司