甲胎蛋白和免疫调谐剂的共同施用以治疗多发性硬化的制作方法

专利名称：甲胎蛋白和免疫调谐剂的共同施用以治疗多发性硬化的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用甲胎蛋白包括其功能片段、类似物和衍生物与一种或多种免疫调
谐剂的施用结合用于治疗多发性硬化的治疗方法。
背景技术：
多发性硬化(MS)是特征在于中枢神经系统(CNS)的神经不可逆变性的神经疾病。 尽管潜在原因不明，但MS中的神经变性是神经脱髓鞘的直接结果(即，髓鞘质与神经剥离， 所述髓鞘质是通常在外层排列且使神经隔离的蛋白质)。随着状况进展，炎症斑和瘢痕形成 发展，这干扰神经功能。从而，MS患者逐渐丧失机体的感觉和运动功能。
随着脑和机体其他部分之间的交流变得被破坏，MS可以为从相对良性，到有点残 废，到破坏性。尽管脱髓鞘的确切机制未确定，但许多研究者相信MS是自身免疫疾病—— 其中机体通过其免疫系统发动针对其自己组织的防御性攻击的疾病。在MS的情况下，恰 恰是神经隔离髓鞘质变得被攻击。随着髓鞘质逐步变性且最终消失，沿着神经传播的电 脉冲减速。在疾病后期，神经自身变得受损。随着越来越多的神经受影响，患者经历由神 经系统控制的功能的进行性干扰，所述功能例如视力、言语、走路、书写和记忆。在美国约 250， 000-350， 000人患有MS。大多数人在20-40岁时经历其第一次MS症状，但MS已早在 15岁和晚至60岁得到诊断。MS是进行性破坏，除非患者接受有效停止或减缓恶化的医学 治疗。尽管一些个体短期处理良好，但随着时间过去MS患者总是变得被疾病更显著损害。
MS已知用各种治疗方式进行治疗，包括I型干扰素(IFN)，例如IFN-P-la和 IFN- P -lb (参见例如，Goodin， Int. M. S. J. ， 12 (3) :96-108， 2005)。尽管一般良好耐受且有 效，但干扰素治疗可以导致患者中产生中和抗体，这显著减少治疗的功效。因此，仍需要用 于治疗MS的新的有效治疗方法。本发明解决了这个和其他相关需要。

发明内容
本发明提供了通过给患者使用治疗有效量的甲胎蛋白(AFP)或其生物活性片段、
衍生物或类似物，和治疗有效量的免疫调谐剂来治疗具有MS的患者的方法。 在上述方法的相关实施方案中，AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物或免疫调
谐剂每日、每周、每两周或每月进行施用。在上述方法的不同实施方案中，AFP或其生物活
性片段、衍生物或类似物以约0. 5mg-400mg/剂进行施用，或免疫调谐剂以约50 y g-300mg/
剂进行施用。 在该方法的不同实施方案中，AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物和免疫调 谐剂同延地(coextensively)，例如在分开剂型中或在相同剂型中进行施用，或分开进行施用。 在该方法的相关实施方案中，AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物在免疫调谐 剂之前或之后进行施用。 在所有方法的不同实施方案中，AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物或免疫调谐剂静脉内、肌内、经口、通过吸入、肠胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌下、经鼻、在栓剂中、经 口含化、脂质体、脂肪地(adiposally)、眼内、皮下、鞘内、局部或通过局部施用进行施用。在 另外的实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和免疫调谐剂通过2种不 同施用途径进行施用，或通过相同施用途径进行施用。 在该方法的相关实施方案中，除AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和免 疫调谐剂外，一种或多种次级试剂(例如，缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、皮质类固醇、 或非类固醇抗炎药(NSAID))施用于患者。 在该方法的不同实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和免疫 调谐剂的施用导致一种或多种MS症状的严重程度中的丧失或减少(例如，麻剌感、麻木、 震颤、平衡丧失、一肢或数肢中的无力、视力模糊或复视、言语不清、吞咽问题、麻痹、缺乏协 调、认知困难、疲劳、肌痉挛、眩晕、呼吸问题和癫痫发作；例如一种或多种MS症状的严重程 度中至少20%的减少)。 本发明进一步提供了包含治疗有效量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似 物)和免疫调谐剂以治疗患者中的多发性硬化的组合物。在一个实施方案中，除AFP(或其 生物活性片段、衍生物或类似物)和免疫调谐剂外，一种或多种次级试剂(例如，DMARD、皮 质类固醇或NSAID)存在于组合物中。 本发明还提供了试剂盒，其包含治疗有效量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或 类似物)、治疗有效量的免疫调谐剂、和关于给具有多发性硬化的患者施用AFP和免疫调谐 剂的说明书。在本发明的试剂盒的几个实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类 似物)和免疫调谐剂配制用于2种不同的施用途径，或配制用于相同施用途径。在相关实 施方案中，试剂盒进一步包含一种或多种次级试剂(例如，DMARD、皮质类固醇或NSAID)用 于与AFP和免疫调谐剂组合用于施用于患者。 在上述组合物和试剂盒的不同实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类
似物)和/或免疫调谐剂配制用于静脉内、经口、吸入、肠胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌下、
经鼻、在栓剂中、经口含化、脂质体、脂肪的、眼内、皮下、鞘内、局部或局部施用。 在本发明的所有方面的不同实施方案中，AFP是人重组AFP或非糖基化AFP。在本
发明的所有方面的另外实施方案中，免疫调谐剂是肽或蛋白质(例如，干扰素-P-la、干扰
素-e -lb、干扰素-a 、干扰素-Y和干扰素-t 、以及乙酸格拉太咪尔(Copaxone ))、
抗体(例如，那他珠单抗(nataluzinab)、达利珠单抗(daclizumab)、利妥希玛、ABT-874和 阿来组单抗(alemtuz咖ab))，小分子(例如，BG 12 (延胡索酸盐)、芬戈莫德(fingolimod) (FTY-720)、米托蒽醌(mixoxantrone) ( Novantrone )、拉喹莫德(laquinimod)、特立 氟胺(teriflunomide)和阿伐他汀)、或图5中列出的试剂之一。
定义 在本申请中，当2种治疗剂"同延地施用"时，试剂的施用时间段可以完全重叠或 至少部分重叠。当2种试剂的施用不是同延地时，2种治疗剂优选在不重叠的时间段中进 行施用；施用优选在2种治疗剂之一的生物活性时间段内发生，即，在后面施用的试剂递送 时，较早施用的试剂在患者中保留其生物活性的至少相当大部分。在其中2种治疗剂不是 同延地施用的其他情况下，一种试剂可以在另一种试剂的生物活性时间段外进行施用。
如本文所使用的，术语"甲胎蛋白"或"AFP"指具有与成熟人AFP(SEQ ID NO :1)基本上相同的氨基酸序列的多肽，或编码多肽的核酸(NCBI登记号NMJ)01134 ;SEQ ID NO : 2)。成熟人AFP是591个氨基酸的蛋白质(参见SEQ ID NO :1)，起因于609个氨基酸前 体的切割(GenBank登记号NP_001125)，以去除18氨基酸信号序列。本发明的AFP具有与 SEQ ID N0:1基本上相同的氨基酸序列。AFP并不限于全长序列；它还包括AFP的生物活 性片段。本发明的AFP也包括任何重组人AFP(无论是否具有与天然存在的形式相同的翻 译后修饰)和人AFP的生物活性变体(例如，AFP的非糖基化形式，参见例如，美国专利号 7， 208， 576)。 在一些实施方案中，本发明的AFP可以包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的修饰，包 括一些氨基酸残基的置换(例如，保守置换)、缺失或添加。例如，重组人AFP在引入本文作 为参考的美国专利号7， 208， 576中得到描述，其包含在SEQ ID NO :1的位置233处的天冬 酰胺至谷氨酰胺置换。术语"甲胎蛋白"还包含本文描述的AFP的任何衍生物或类似物。
本发明的AFP具有与天然人AFP相同或基本上相同的生物活性(例如，至少 50%，优选至少60%、70%或80%，和更优选至少90%、95%或99%或更多)。例如， 本发明的AFP，如同天然人AFP，显示与人白细胞结合的能力和抑制自身免疫反应的能 力。用于测试AFP活性的白细胞结合测定在本文和例如Parker等人，Protein Express. Purification38 :177-183,2004中得到描述。关于本发明的AFP所需的自身免疫抑制活 性可以通过测定AFP抑制人自身混合淋巴细胞反应(AMLR)的能力或通过测定AFP在动物 模型中抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的能力加以证实。此种活性可以通过本文 描述的测定加以验证。本发明的功能AFP在Parker等人同上中描述的测定中展示至少 40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100X天然人AFP与人单核细胞结合的能 力，和至少40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或100%天然人八？？抑制自身免疫 反应的能力。后面一种活性通过在美国专利号5， 965， 528中描述的测定中抑制人AMLR进 行显示，或在可替代方法中，通过在小鼠模型中抑制EAE发展进行显示(参见例如，Fritz 等人，J. Immunol. 130 :1024， 1983 ;Naiki等人，Int. J. Immunopharmacol. 13 :235， 1991 ;禾口 Goverman， Lab.Anim. Sci. ，46 :482，1996)。 本发明的AFP片段可以使用本文描述的一种或多种测定(例如，AMLR测定、AFP与 单核细胞结合测定、使用EAE小鼠模型的实验、和脾细胞测定)进行测定。 一般生物活性的 AFP片段长度包含SEQ IDN0:1的至少5个邻接氨基酸，或至少8个邻接氨基酸，优选地至 少10、20或50个邻接氨基酸，更优选地至少100个邻接氨基酸，和最优选地至少200、300、 400个或更多邻接氨基酸。例如，美国专利号6， 818， 741公开了人AFP的8氨基酸片段(氨 基酸471-478 ;EMTPVNPG ;SEQ IDNO :3)以及包含这种8聚体的其他AFP片段。本发明的活 性AFP片段可以进一步包含在有限数目位置处的氨基酸置换、缺失或添加，只要AFP片段具 有与其在SEQ ID N0:1内的相应序列至少90%的同一性。对于本申请中的序列比较目的， SEQ ID N0:1的相应序列被视为具有与给定AFP片段相同数目的氨基酸。例如，对应于SEQ ID NO :1的446-479区段(LSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRHEMTPVNPGV ;SEQ IDNO :4)的34聚 体AFP肽可以包含由SEQ ID NO :1的446-479区段改变的至多3个氨基酸。生物活性AFP 片段中的序列偏离的一个此种例子在美国专利号5， 707， 963中发现，所述专利公开了在2 个氨基酸残基(SEQ ID NO :4的氨基酸9和22)处具有灵活性的人AFP的34氨基酸片段 (SEQ ID NO :4) 。 AFP片段的一些其他例子包括结构域I (成熟人AFP的氨基酸2-198 ;SEQID NO :5)，结构域II(成熟人AFP的氨基酸199-390 ;SEQ ID NO :6)，结构域III (成熟人AFP的氨基酸391-591 ;SEQ ID NO :7)，结构域I+II (成熟人AFP的氨基酸2-390 ;SEQ IDNO :8)，结构域II+III (成熟人AFP的氨基酸199-591 ;SEQ IDNO :9)，和人AFP片段I (成熟人AFP的氨基酸267-591 ;SEQ ID NO :10)。 在本申请中，术语"氨基酸"指天然存在的和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的a碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此种类似物具有经修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链(例如，肽模拟物，例如AFP拟肽)，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指这样的化合物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但能够以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。 关于氨基酸序列，技术人员将认识到，当改变导致用其他化学上相似的氨基酸置换一个或多个氨基酸时，改变、添加或缺失序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的、对于多肽序列的个别置换、缺失或添加构成"保守修饰的变体"。提供功能上相似氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。此种保守修饰的变体加上并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。 下述8个组各自包含彼此为保守置换的氨基酸(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ;(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ;(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ;(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);(5)异亮氨酸(1)、亮氨酸(U、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V) ;(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W) ;(7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和(8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton， Proteins(1984))。 术语"生物活性"意指具有已知与天然存在的或合成肽、多肽、蛋白质、抗体、化合物、小分子或其片段、衍生物或类似物(例如，AFP或免疫调谐剂)相关的一种或多种活性。
术语"缓解疾病的抗风湿性药物"或"DMARD"指用于治疗炎性疾病的治疗剂。当以治疗有效量施用时，DMARD可以用于治疗、预防或减少患者中的炎性疾病的一种或多种症状或进展。本领域已知的DMARD的例子包括金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、环孢菌素、D-青霉胺、硫代苹果酸金钠(注射金)、羟氯喹、来氟洛米、氨甲蝶呤、米诺环素、麦考酚酸吗啉乙酯或柳氮磺吡啶。"皮质类固醇"意指特征在于氢化环戊烷多氢菲环系统的任何天然存在的或合成化合物。天然存在的皮质类固醇一般由肾上腺皮质产生。合成皮质类固醇可以是卤化的。示例性皮质类固醇在本文中得到描述。 如本文所使用的，"免疫调谐剂"指(1)干扰素，或肽或蛋白质，其具有与干扰素(例如，人干扰素)序列的全部或部分基本上相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100%相同的)的氨基酸序歹lj，例如IFN-a (例如，IFN- a -la ;参见整体引入本文作为参考的美国专利申请号20070274950) 、 IFN- a -lb (SEQID NO:ll)、 IFN-a-2a(参见整体引入本文作为参考的PCT申请号W0 07/044083)和IFN-a-2b(SEQ ID NO : 12)) 、 IFN-P (例如，在整体引入本文作为参考的美国专利号7， 238， 344中描述的；IFN_P-la(如在整体引入本文作为参考的美国专利号6， 962， 978中描述的)和IFN-P-lb(如整体引入本文作为参考的美国专利号4， 588， 585 ;4， 959， 314 ;4,737,462 ;和4， 450， 103中描述的)、IFN-y (例如SEQ ID NO :13)和IFN_ t (如整体引入本文作为参考的美国专利号5， 738， 845以及美国专利申请号20040247565和20070243163
中描述的)，或肽，例如乙酸格拉太咪尔(Copaxone ) ; (2)小分子(例如，bg12(延
胡索酸盐)、芬戈莫德(FTY-720)、拉喹莫德、特立氟胺或阿伐他汀，或展示与干扰素相同或基本上相同的生物活性的分子(例如，在小鼠模型中抑制EAE的能力中人IFN-a 、人IFN-P、人IFN-y或人IFN-t的至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的活性)；(3)抗体(例如，单克隆抗体(例如，a4整联蛋白结合抗体，例如那他珠单抗(nataluzimab) ;IL_2受体结合抗体，例如达利珠单抗；CD20结合抗体，例如利妥希玛；IL-12结合抗体，例如ABT-874 ;和CD52结合抗体，例如阿来组单抗)、多克隆抗体或抗体融合蛋白的全部或部分)；(4)肽(例如MBP-8289、NBI-5788和T细胞受体肽(NeurOVaX ));或(5)DNA疫苗(例如，BNT-3009-01)。非限制性示例性免疫调谐剂具有减少(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100% )一种或多种MS症状的严重程度的能力，或预防、抑制或减少(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或甚至100% )患者中的MS进展(例如，神经脱髓鞘和一种或多种MS症状的频率或严重程度)的能力。 所需免疫调谐剂是这样的蛋白质，其与人IFN-a 、 -13 、 - y或-t具有至少50%(更优选至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至100% )氨基酸序列同一性，且在小鼠模型中抑制EAE能力方面具有人IFN-P -la的至少50% (更优选至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% )活性。本发明含义内的免疫调谐剂包含天然存在的干扰素以及重组产生的干扰素。重组产生的干扰素可以包含对于一个或多个氨基酸残基的修饰，包括缺失、添加和置换，或它可以包含不同模式的翻译后修饰(例如，糖基化、聚乙二醇化(PEGylation)等)。适合于与本发明一起使用的非限
制性示例性免疫调谐剂包括Rebi产(iFN-e -la) 、Avonex ' (ifn-p -la) 、Betaseron
(IFN- p -lb) 、 TauferonTM(IFN- t ) 、Rofer。n-A (IFN— a _2a) 、Intron-A (IFN— a _2b)、
Rebetron (ifn-q -2b) 、Alferon-N (ifn-q -n3) 、Peg-Intron (与单甲氧聚乙二醇
共价缀合的ifn- a -2b) 、Infergen (与ifn- a -2b具有88%同源性的非天然存在的i型干扰素)、Actimmune (IFN_ Y _lb) 、Pegasys (聚乙二醇化ifn- a -ia) 、Copaxone (乙酸格拉太咪尔)和Movantron⑧(米托蒽醌)。免疫调谐剂的另外例子在图5中列出；
一种或多种这些免疫调谐剂可以与AFP组合，以产生本发明的组合物用于在治疗MS的方法
中使用，如本文所述。 术语"多发性硬化"或"MS"指其中由于脱髓鞘，中枢神经系统(脑和脊髓)的神
经变性的疾病。蛋白质髓鞘质通常提供关于神经的覆盖或隔离。"非类固醇抗炎药"或"NSAID"意指预防或减少炎症的非类固醇试剂。NSAIDs的例子包括甲氧萘丙酸钠、双氯芬酸钠、双氯芬酸钾、阿司匹林、舒林酸、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、布洛芬、萘丁美酮、三水杨酸胆碱镁、水杨酸钠、双水杨酸、非诺洛芬钙、氟比洛芬、
9酮洛芬、甲氯灭酸钠、美洛昔康、奥沙普嗪、舒林酸、托美汀和C0X-2抑制剂，例如罗非克西、塞来昔布、伐地昔布(valdecoxib)或罗美昔布(lumiracoxib)。 术语"基本同一性"或"基本上相同的"在使多核苷酸或多肽序列与参考序列比较的背景中使用时，指多核苷酸或多肽序列与参考序列相同，或具有指定百分比的核苷酸或氨基酸残基的事实，当2个序列进行最佳比对时，所述指定百分比的核苷酸或氨基酸残基在参考序列内的相应位置处是相同的。例如，如使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法用缺省参数，或通过人工比对和目视检查(参见例如NCBI网站)测量的，当在参考序列的全长上就最大对应进行比较且比对时，与参考序列"基本上相同的"氨基酸序列与参考序列(例如，如SEQ ID N0:1中所示的成熟人AFP氨基酸序列，或其片段，或干扰素)具有至少约60%同一'性，优选65% 、70% 、75% 、80% 、85% 、90% 、91% 、92% 、93% 、94% 、95% 、96%、97%、98%、99%或更高百分比同一性(最高达100% )。"协同作用"意指甲胎蛋白(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂以治疗有效量施用用于治疗MS显示加性疗效(例如，在MS消退中至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%或70%或更多改善，或一种或多种MS症状的严重程度或频率中至少1% 、5% 、10% 、15% 、20% 、25% 、30% 、35%、40%、45%、50%、60%或70%减少；参见，"治疗")，这超过当AFP或一种或多种免疫调谐剂单独施用时观察到的那种。协同作用也可以意指AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂以组合施用，允许AFP、一种或多种免疫调谐齐U、或两者以与单独施用时所需的AFP或一种或多种免疫调谐剂的量相比较，达到治疗中相同或基本上相似结果正常所需的更低剂量施用(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45X、50X、60X或90X较低剂量的AFP、一种或多种免疫调谐齐[J、或两者)。AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂之间的协同作用可以在下述情况中观察到相对于在不存在AFP的情况下以相同浓度施用时一种或多种免疫调谐剂的毒性，当与AFP结合施用时，其中一种或多种免疫调谐剂毒性减少(例如，至少5 % 、 10 % 、 15 % 、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%或更多)。协同作用也可以在AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂的共同施用后发生，其中共同施用允许一种或多种免疫调谐剂的剂量中超过用于治疗MS而正常施用的增加(例如，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、85 % 、90 % 、95 % 、 100 %或更多)，而无在一种或多种免疫调谐剂增加剂量时正常预期或观察到的毒性。"治疗"意指一种或多种MS症状(例如，麻剌感、麻木、震颤、平衡丧失、一肢或数肢中的无力、视力模糊或复视、言语不清、吞咽问题、麻痹、缺乏协调、认知困难(例如，记忆力和注意力下降)、疲劳、肌痉挛、眩晕、呼吸问题和癫痫发作)的进展、严重程度或频率中的减少(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至100% )，或预防或减少(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至100% )人患者中的MS进展(例如，神经的脱髓鞘和一种或多种MS症状的频率或严重程度)。 治疗剂(例如，本发明的AFP、免疫调谐剂、DMARD、皮质类固醇、NSAID或其他试剂)的"治疗有效量"是足以实现对于给定状况或疾病的所需疗效的试剂的量。量可以依赖于达到的效果而变。例如，单独的用于治疗MS的免疫调谐剂的"治疗有效量"可以不同于与AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物；例如，当与AFP组合施用时，免疫调谐剂的治疗有效量可以减少)组合治疗MS使用的免疫调谐剂的"治疗有效量"。


图1显示成熟人AFP的氨基酸(SEQ ID NO :1)和人AFP的mRNA核酸序列(SEQ ID
NO :2) 。 N指示在成熟人AFP氨基酸序列中的天冬酰胺233糖基化位点。 图2显示包括成熟人AFP的氨基酸2-198(结构域I;SEQ ID N0:5)、氨基酸
199-390 (结构域II ;SEQ ID NO :6)、氨基酸391-591 (结构域III ;SEQ ID NO :7)、氨基酸
2-390 (结构域I+II ;SEQ ID NO :8)、氨基酸199-591 (结构域II+III ;SEQ ID NO :9)、和氨
基酸261-591 (人AFP片段1 :SEQ ID NO :10)的AFP生物活性片段的氨基酸序列。 图3显示人IFN- a -lb (SEQ ID NO : 11)和IFN- a -2b (SEQ ID NO : 12)的氨基酸序列。 图4显示人IFN- Y (SEQ ID NO :13)的氨基酸序列。
图5是免疫调谐剂表。
具体实施例方式
本发明提供了用于MS的组合治疗。这种组合治疗涉及给有此需要的患者共同施用一种或多种免疫调谐剂与AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)，各自以治疗有效量。在另一个方面，本发明提供了包括一种或多种免疫调谐剂与AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)的药物组合物，各自以治疗有效量用于治疗MS。此种组合物任选包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，并且配制用于静脉内、肌内、经口、通过吸入、肠胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌下、经鼻、通过使用栓剂、经口含化、脂质体、脂肪地、眼内、皮下、鞘内、局部或通过局部施用进行施用。在进一步的方面，本发明提供了用于治疗MS的试剂盒，其包括治疗有效量的免疫调谐剂和AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)，连同用于给患者施用免疫调谐剂和AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)的正确说明书。
多发性硬化的诊断和监控 MS可以通过观察患者中的一种或多种症状进行诊断。MS的症状可以是单个或多个，并且在强度方面可以从轻微到严重，并且在持续时间方面从短到长。从症状的完全或部分缓解在约70% MS患者中早期发生。视觉障碍通常是MS的第一个症状，但它们通常消退。患者可能注意到视力模糊或复视、红-绿失真或突盲(sudden blindness)。通常早期注意到导致协调和平衡困难的肌无力。肌痉挛、疲劳、麻木和剌痛是常见症状。可能存在感觉丧失、言语障碍、震颤、眩晕或偶然地听力丧失。50%的患者经历精神改变例如注意力下降、注意力缺陷、一定程度的记忆丧失、或判断损害。其他症状可以包括抑郁、躁狂抑郁、偏执狂、或称为大笑_流泪综合征的无法控制的大笑和流泪冲动。随着疾病恶化，患者可能经历性功能障碍或肠和膀胱控制下降。对于约60%患者，热看起来使MS症状加剧，并且用冷水浴或游泳发现缓解。妊娠看起来减少发作次数。 不存在用于MS的单个测试。医生特别是神经病学家可以考虑详细的医疗史，并且可以执行全面的体格和神经学检查，以诊断MS。用于MS的测试可以包括例如用静脉内钆的磁共振成像(MRI)或磁共振扫描(MRS)，这2者帮助鉴定、描述且注明在MS患者中出现的脑 中的损伤(即斑)的日期。另一种电生理测试——诱发电位检查通过神经传播的冲动，以 测定冲动是正常还是太慢地移动；比冲动通过神经的正常移动慢是MS的指示。最后，围绕 脊髓的脑脊液的检查可以用于鉴定脑或脊髓中漂浮的异常化学物质或细胞，这暗示MS的 存在。总的来说，这3种测试加强了MS的诊断。MS也可以通过鉴定患者中的一种或多种下 述症状进行诊断麻剌感、麻木、震颤、平衡丧失、一肢或数肢中的无力、视力模糊或复视、言 语不清、吞咽问题、麻痹、缺乏协调、认知困难(例如，记忆力和注意力下降)、疲劳、肌痉挛、 眩晕、呼吸问题和癫痫发作。 上文描述的所有方法也用于监控患者中的MS进展，以及用于监控在使用本发明 的组合物和方法治疗后MS的消退(例如，一种或多种MS症状的严重程度或频率中的消退 或减少，从而使得可以评估由患者接受的治疗的效力。此外，患者可以就治疗后MS中的改 善进行评估(例如， 一种或多种MS症状或功能中的改善)，其中使用本领域已知的一种或 几禾中方法(参见例如，Expanded Disability Status Scale (EDSS) ， Kurtzke， Neurology 33:1444-1452,1983;和Multiple Sclerosis SeverityScore (MSSS) ， Roxburgh等人， Neurology 64:1144-1151,2005。 一种或多种这些症状中的改善(例如， 一种或多种MS症 状的出现、持续时间或严重程度中的减少)指示通过本发明的组合物和方法的疗效。
通过施用本发明的组合物治疗MS的方法 本发明提供了通过共同施用治疗有效量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或类 似物)和一种或多种免疫调谐剂治疗患者中的MS的方法；本发明的组合物可以但不需要还 包括另外的治疗剂，例如下文描述的那些。本发明的组合物可以施用于患者以治疗、预防、 改善、抑制人患者中的一种或多种MS症状的进展，或减少人患者中的一种或多种MS症状的 严重程度。AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂可以以单 剂或多剂同延地或分别地进行施用。AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或 多种免疫调谐剂可以配制用于相同施用途径，或配制用于不同施用途径。
可以使用本发明的组合物进行治疗的MS症状的例子包括麻剌感、麻木、震颤、平 衡丧失、一肢或数肢中的无力、视力模糊或复视、言语不清、吞咽问题、麻痹、缺乏协调、认知 困难(例如，记忆力和注意力下降)、疲劳、肌痉挛、眩晕、呼吸问题和癫痫发作。这些MS症 状及其在治疗过程中的消退可以由医生在体格检查过程中进行测量。用于诊断MS或测定 MS严重程度的另外测试在下文描述。 医生可以基于患者中MS的严重程度、发生或进展(例如，基于一种或多种MS症状 的严重程度)，调整施用于患者的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)和/或一种或 多种免疫调谐剂的剂量(例如，增加或减少剂量) 当施用于MS患者时，本发明的组合治疗优选显示出协同作用。
本发明的组合物 本发明提供了包括AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫 调谐剂的用于治疗MS的组合物。本发明的组合物可以配制用于任何施用途径(例如，本文 描述的制剂)，并且可以以单剂或多剂施用于有此需要的受试者。本发明的组合物还可以进 一步包括次级试剂，例如一种或多种DMARD、 NSAID或皮质类固醇，如下文讨论的。
用于在本发明的组合物和方法中使用的AFPs
12
甲胎蛋白(或其生物活性片段、衍生物或类似物)可以用于本发明的组合治疗方 法中。为了本发明的目的，可以施用天然存在的人AFP和重组产生的AFP多肽(包括活性 AFP片段)。天然存在的人AFP可以通过从例如脐带或脐带血清中纯化来获得；而重组AFP 多肽或片段可以通过原核或真核表达系统来获得，例如美国专利号5， 384， 250和美国专利 号7， 208， 576中描述的那些。使用不同的表达系统可以导致重组蛋白质的翻译后修饰中的 差异。例如，天然存在的人AFP是可变糖基化的蛋白质。相比之下，当通过原核宿主细胞产 生时，重组AFP可以是未糖基化的，或当通过真核宿主细胞产生时，可以是略微不同糖基化 的。可替代地，重组AFP可以进行基因修饰以消除糖基化(例如，通过消除糖基化位点)， 与它在其中产生的表达系统无关。人AFP可通过各种商业供应商获得，包括Fitzgerald Industries International(Concord, MA) 、 CellSciences(Canton, MA) 禾口 Biodesign International(Saco， ME)。 此外，可能采用众所周知的化学合成方法以合成AFP多肽或片段，特别是如果AFP 片段是长度相对短的肽的话，例如具有少于100或50个氨基酸的肽。 与其起源或翻译后修饰的存在或不存在无关，任何AFP多肽都可以用于本发明 中，只要多肽具有相对于天然存在的AFP相同或基本上相同的生物活性(例如，至少40%， 优选至少50%、55%、65%、70%和75%，和更优选至少80 % 、85 % 、90 % 、95 % 、99 %或 100X或更多天然存在的AFP的生物活性)。本发明的AFP的生物活性可以通过使用下文更 详细描述的一种或多种测定进行评估。 类似地，人AFP的片段可以用于本发明的组合物和治疗方法中，只要片段保留天 然存在的人AFP的基本上相同的生物活性(例如，如使用本文描述的一种或多种测定来测 定的)。人AFP的片段可以通过本领域技术人员已知的方法来产生，例如蛋白酶剪切或重组 表达，或可以起因于正常蛋白质加工(例如，从新生多肽中去除不是生物活性所必需的氨 基酸)。化学方法也可以用于合成活性AFP片段。 适合于用于在实践本发明中使用的重组人AFP片段包括结构域I(SEQ ID N0:1的氨基酸2(Thr)-198(Ser) (SEQ ID NO :5))，结构域II(SEQ ID N0:1的 氨基酸199(Ser)-390(Ser) (SEQ ID NO :6))，结构域III(SEQ ID N0:1的氨基酸 391 (Gin)-591 (Val) (SEQID NO :7))，结构域I+II (SEQ ID NO : 1的氨基酸2 (Thr)-390 (Ser) (SEQ ID NO :8))，结构域II+III(SEQ ID NO : 1的氨基酸199 (Ser)-591 (Val) (SEQ ID NO: 9))，和rHuAFP片段I(SEQ ID NO :1的氨基酸267 (Met)-591 (Val) (SEQ ID NO:IO))。已知 AFP片段的其他例子可以在例如整体引入本文作为参考的美国专利号5， 707， 963和美国专 利号6，818， 741中发现。 还设想了全长人AFP的功能衍生物或类似物或其片段的用途。如上所述，此种衍 生物或类似物可以通过氨基酸序列差异(例如，添加、缺失、保守或非保守置换)，或通过不 影响序列的修饰(例如，翻译后修饰)或两者而不同于全长天然人AFP或其部分。本发明 的衍生物/类似物将一般显示出与全部或部分天然人AFP氨基酸序列(SEQ ID N0:1)至少 90 % ，更优选至少95 % ，或甚至99 %的氨基酸同一性。 由于翻译后修饰(这正常不改变一级序列)，AFP衍生物/类似物可以不同于天然 存在的人AFP，所述翻译后修饰包括多肽的体内或体外化学衍生，例如乙酰化或羧化；此种 修饰可以在多肽合成或加工过程中或用分离的修饰酶处理后发生。还包括了环化肽分子和类似物，其包含除L-氨基酸外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成氨基酸，例如 P或Y氨基酸，或具有非天然侧链的L-氨基酸(参见例如，Noren等人，Science 244 :182， 1989)。用于非天然氨基酸位点特异性掺入蛋白质的蛋白质主链内的方法在例如Ellman等 人，Science 255 :197， 1992中得到描述。还包括了具有经修饰的肽键的化学合成多肽或肽 (例如，如美国专利号4， 897， 445和美国专利号5， 059， 653中描述的非肽键)或经修饰的侧 链，以获得如本文所描述的所需药学性质。有用的衍生物和类似物使用领域公认的方法就 生物活性进行鉴定，例如本文描述的那些。
AFP活性测定 如上所述，适合于用于本发明的组合物和方法中的AFP多肽及其片段、衍生物和 类似物包括保留与天然存在的AFP相同或基本上相同的生物活性的那些。
AFP多肽或片段、衍生物或类似物活性的第一种测定是测量其与人外周单核细胞 上的细胞受体特异性结合的能力。适合于这个目的的结合测定在Parker等人，Protein Express. Purification 38 :177-183， 2004中得到描述。简言之，竞争测定形式用于就其与 U937细胞——人单核细胞细胞系特异性结合的能力测试候选AFP多肽、片段、衍生物或类 似物。细胞维持在具有10X胎牛血清的RPMI培养基中。在结合测定前，细胞用无血清培 养基洗涤2次，并且在磷酸缓冲盐水(PBS)中调整至2.5X106细胞/ml。天然人AFP(SEQ ID N0:1)或非糖基化的人AFP(参见例如，SEQ ID NO : 12，其中例如，残基233是谷氨酰胺) 在正确反应中用可检测标记例如荧光素进行标记，随后为例如通过凝胶过滤去除未附着的 标记材料。在用荧光素标记人AFP的情况下，使蛋白质与溶于二甲亚砜中的荧光素-5-异 硫氰酸酯溶液在黑暗中混合1小时，随后为凝胶过滤以去除未结合的染料。标记的人AFP 在-2(TC下贮存于20^甘油中直至使用。对于结合测定，一定数目的U937细胞(例如， 2. 5X106细胞/ml浓度的40iil细胞悬浮液)与和各自为一组终浓度(例如，20、 10、5、2. 5、 1. 25和0. 625 ii M)的未标记的人AFP或未标记的候选AFP多肽或片段、衍生物或类似物一 起的预定量的标记人AFP (例如，以0. 5 ii M的终浓度)混合，以测定关于人AFP和候选AFP 多肽或片段、衍生物或类似物的ICs。值。在结合过程结束时，细胞随后用PBS进行洗涤，并 且悬浮于新鲜PBS中，从而使得保留在U937细胞上的标记AFP可以例如通过流式细胞术进 行测量。 AFP多肽或片段、衍生物或类似物活性的第二种测定是其在AMLR或EAE的小鼠 模型中抑制自身免疫反应的能力的测量。用于测试AMLR及其抑制的方法是本领域已知 的。例如，美国专利号5， 965， 528和6， 288， 034描述了如下的AMLR系统人外周血单核细 胞(PBMC)的分离、其分级分离成非T细胞群体和AMLR，根据标准程序进行。简言之，通过 使1. 5X1()8PMBC经过商业抗Ig亲和柱(US Biotek Laboratories, Seattle, WA)分离应 答T细胞，并且使2X10S应答细胞随后与来自单个供体的2X105自身137&-辐射的(2500 拉德)非T剌激细胞一起培养。所采用的培养基由RPMI-1640组成，所述RPMI-1640补 充有20mMHEPES(Invitrogen)、5X10—5M 2-巯基乙醇(BDH， Montreal, QC) 、4mM L-谷氨 酰胺(Invitrogen)、100U/ml青霉素(Invitrogen)和100 y g/ml硫酸链霉素，其中添加 对于应答T细胞供体自身的10X新鲜人血清用于AMLR。在培养开始时加入各种浓度的 纯化重组人AFP、人血清清蛋白、抗人AFP单克隆抗体克隆#164(在培养中125 y g/ml终 浓度)(LeincoTechnologies， St. Louis， M0) 。 AMLR培养物在37 。C下在95 %空气和5 %C02中温育4-7天。在指示时间间隔时，通过用1 y Ci 3H-胸苷(比活性56-80Ci/mmole ; ICN Radioisotopes, Cambridge, MA)的6小时脉冲来测定DNA合成。在多种样品采集器 (Skatron， Sterling, VA)上收获培养物，并且3H_TdR的掺入在Packard 2500TR液体闪烁计 数器中进行测量。结果表示为一式三份或一式四份培养物的平均cpm士平均值的标准误。
在本发明范围内的候选AFP多肽或片段、衍生物或类似物的免疫抑制活性可以通 过其抑制人自身混合淋巴细胞反应(AMLR)的能力进行评估。一般地，候选AFP多肽、片段或 衍生物就其抑制由自身非T细胞剌激的自身反应淋巴细胞的增殖应答的能力进行测试，这 通过4-7天的时间过程自始至终测量淋巴细胞自身增殖(autoproliferation)实现。AMLR 以剂量依赖性方式的抑制通过在T细胞自身增殖峰时执行的来自剂量应答研究的结果得 到证实，其中AFP多肽或片段、衍生物或类似物在培养开始时加入。此外，平行生存力研究 可以用于确定AFP多肽或片段、衍生物或类似物对人自身反应T细胞的抑制活性并非是由 于非特异性细胞毒性效应。 AFP多肽或片段、衍生物或类似物活性的第三种测定可以使用实验性自身免疫性 脑脊髓炎(EAE)的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)小鼠模型来进行。在这种体内测定中， 遗传易感小鼠品系用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的MOG进行皮下免疫接种，这导致在动 物中发展EAE。候选AFP多肽或片段、衍生物或类似物每天施用于所选择的小鼠组，在MOG 开始施用于动物之前、同时或之后开始。监控在这些动物中的EAE症状，并且在一定时间段 例如30天内与对照组(例如，仅接受盐水注射的那些)中的那些进行比较。每只动物中的 EAE严重程度基于限定临床症状给出1-5的得分；组中动物的平均得分指示组的疾病状态。 与对照相比较，生物活性的AFP蛋白质或片段将减少接受MOG的动物中的EAE严重程度(例 如，在处理30天后，疾病严重程度中至少50%的减少)。 依赖在本发明范围内的候选AFP抑制炎症细胞因子的能力的第四种测定是可用 的，所述炎症细胞因子由来自首次用于实验的小鼠的促分裂原剌激的脾细胞的体外培养诱 导(例如，如在Hooper禾口 Evans， J. R印rod. Immunol. 16 :83—961， 1989 ;禾口 Kruisbeek， in Current Protocolsin Immunology, Vol. 1， Section 3. 1. 1-3. 1. 5， 2000中描述的)。在渐增 浓度的AFP的存在下，脾细胞用植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白(conconalavin)A(ConA) 或脂多糖(LPS)剌激24小时。人血清清蛋白用作关于测定的阴性对照。10点剂量应答研 究已显示生物活性的AFP以可再现形式抑制或基本上抑制PHA诱导的IFN-y分泌。
用于在本发明的组合物和方法中使用的免疫调谐剂 本发明的组合物还包括用于在MS治疗中使用的一种或多种免疫调谐剂。如本 文所定义的，免疫调谐剂是(1)与人IFN-a (例如，IFN-a-la、 IFN-a-lb、 IFN-a-2a 和IFN-a -2b ;分另U为SEQ ID N0S :11、 12、 13禾P 14)、人IFN—P (例如，IFN—P -la和 IFN-P-lb ;分别为SEQ ID N0S :15和16)、人IFN-y (例如，SEQ ID NO :17)或人IFN-t (例 如，SEQID NO :18)具有基本上相同(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%或甚至100%相同)的氨基酸序列的蛋白质，或肽，例如乙酸格拉太咪尔
(Copaxone ) ; (2)小分子(例如，bg 12(延胡索酸盐)、芬戈莫德(fty-720)、拉喹莫
德、特立氟胺或阿伐他汀，或展示与干扰素相同或基本上相同的生物活性的分子(例如，在
小鼠模型中抑制EAE的能力中人IFN-a 、人IFN-P 、人IFN-y或人IFN-t至少50%、60%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的活性);(3)抗体(例如，单克隆抗体(例如，
15a 4整联蛋白结合抗体，例如那他珠单抗；IL-2受体结合抗体，例如达利珠单抗；CD20结合 抗体，例如利妥希玛；IL_12结合抗体，例如ABT-874 ;和CD52结合抗体，例如阿来组单抗)、 多克隆抗体或抗体融合蛋白的全部或部分)；(4)肽(例如MBP-8289、NBI-5788和T细胞受
体肽(Neurovax ));或(5)dna疫苗(例如，bnt-3009-oi)。免疫调谐剂的另外例子在
图5中列出。 相对于未接受免疫调谐剂的那些MS患者或接受安慰剂的那些患者，优选的免疫 调谐剂具有减少(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、 70%、80%、90%或甚至100% ) —种或多种MS症状的严重程度的能力，或预防或减少(例 如，至少10% 、 15% 、20% 、25% 、30% 、35% 、40% 、45% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90%或甚至 100% )人患者中的MS进展(例如，神经的脱髓鞘和一种或多种MS症状的频率或严重程 度)的能力。 免疫调谐剂的非限制性例子包括这样的蛋白质，其与人IFN-a 、 -|3 、 - y或-t 具有至少50% (更优选至少60%、70%、75%、80%、90%、95%或100% )氨基酸序列同一 性，且在小鼠模型中抑制EAE能力方面具有人IFN-P -la的至少50% (更优选至少50%、 60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)活性，这类似于用于验证AFP活性的测定 系统。免疫调谐剂的非限制性例子包括天然纯化的干扰素和重组产生的干扰素。
干扰素的重组生产在生物医学研究领域中常规实践且用于各种临床目的。例 如，人IL-P-la，天然地166氨基酸糖蛋白，已在中国仓鼠卵巢细胞系中作为八丫01^乂@ (Biogen， Cambridge, MA)或Rebi严(Serono， Geneva,瑞士 )进行生产，其可以呈现与其天 然存在的人配对物的那种不同的糖基化模式。 类似地，IFN-P -lb已在大肠杆菌(E. coli)细胞株中作为Betaseron⑧(Berlex， Wayne，NJ)或Betaferon(Schering AG， Berlin,德国)进行重组生产。尽管天然存在的人 IFN-13 -lb也是糖基化蛋白质，但细菌生产的IFN-13 -lb则不是。此外，在一些情况下，在人 IFN-P -lb的位置17处的半胱氨酸残基由丝氨酸置换，以阻止不需要的二硫键形成。在其 他情况下，人IFN-P -lb的第一个氨基酸甲硫氨酸缺失，从而使得重组蛋白质仅具有165个 氨基酸。另一种已知修饰形式的人IFN是TauferonTM(P印gen，Alameda，CA)，其与人IFN-a 共享约55X序列同源性且适合于经口施用。这种修饰的人IFN蛋白质在例如引入本文作为 参考的W005/044297中得到描述。 其为重组干扰素的非限制性示例性免疫调谐剂包括Rofen)n-A⑧(ifn-a -2a)、 Intron-A (iFN-a-2b)、 Rebetron (iFN-a-2b)、 Alferon-N (iFN-a-n3)、 Peg-Intron (与单甲氧聚乙二醇共价缀合的iFN-a -2b) 、Infergen (与iFN-a -2b具 有88%同源性的非天然存在的i型干扰素)、Aetimmune (IFN_ y _lb)和Pegasys⑧(聚
乙二醇化IFN- a -la)。 本发明的另外免疫调谐剂包括Copaxone 、^Jovantr(m 、拉喹莫德、特立氟
胺、阿伐他汀、那他珠单抗(natalizumab)、达利珠单抗、利妥希玛、ABT_874、阿来组单抗、 MBP-8289、 NBI-5788、NeurOVax⑧和BNT-3009_01。
用于在本发明的组合治疗中使用的补充治疗剂
除AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂外，本发 明的组合治疗还可以但不需要包括一种或多种次级试剂的共同施用，例如下文列出的那 胜。 缓解疾病的抗风湿性药物(DMARDs) 几种药物是本领域已知的，并且目前用于治疗具有炎症病症的患者。若需要，本发 明的组合物可以与一种或多种DMARDs结合进行施用。可以在本发明中使用的DMARDs的非 限制性例子包括但不限于金诺芬、金硫葡糖、硫唑嘌呤、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、环孢菌素、 D-青霉胺、硫代苹果酸金钠(注射金)、羟氯喹、来氟洛米、氨甲蝶呤、米诺环素、麦考酚酸吗 啉乙酯或柳氮磺吡啶。 氨甲蝶呤是可以在本发明的组合治疗方法的一个实施方案中使用的DMARD例子。 氨甲蝶呤也称为甲氨蝶呤、RHEUMATREX⑧(LederlePharmaceutical)或FOLEX① (Aventis)，是竞争地且可逆地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)的抗代谢物，所述酶是叶酸合 成代谢途径的部分。 关于氨甲蝶呤的化学名称是N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基] 苯甲酰基]-L-谷氨酸，尽管它通常以钠盐形式存在于药物组合物中，并且它在此种组合物 中的量通过与游离酸等价进行测定。因此，当组合物被说成包含10mg氨甲蝶呤时，更大重 量的氨甲蝶呤钠盐可能存在于组合物中。氨甲蝶呤是已使用多年的普通药物且通过各种供 应商商购可得。例如，氨甲蝶呤由Pfizer和Wyeth制造和销售。
非类固醇抗炎药(NSAIDs) 若需要，本发明的组合物可以与一种或多种NSAIDs结合进行施用。可以在本发明 中使用的NSAIDs的非限制性例子包括甲氧萘丙酸钠、双氯芬酸钠、双氯芬酸钾、阿司匹林、 舒林酸、二氟尼柳、吡罗昔康、吲哚美辛、布洛芬、萘丁美酮、三水杨酸胆碱镁、水杨酸钠、双 水杨酸、非诺洛芬钙、氟比洛芬、酮洛芬、甲氯灭酸钠、美洛昔康、奥沙普嗪、舒林酸、托美汀 和C0X-2抑制剂，例如罗非克西、塞来昔布、伐地昔布或罗美昔布。
皮质类固醇 若需要，本发明的组合物可以与一种或多种皮质类固醇结合进行施用。皮质类固 醇是特征在于氢化环戊烷多氢菲环系统的天然存在的或合成化合物。天然存在的皮质类 固醇一般由肾上腺皮质产生。合成皮质类固醇可以是卤化的。可以在本发明中使用的示 例性皮质类固醇包括阿尔孕酮、6_ a -氟泼尼松龙、6_ a -甲基泼尼松龙、6_ a -甲基泼尼松 龙21-乙酸酯、6-0-甲基泼尼松龙21-半琥珀酸钠盐、6-0-9-0-二氟泼尼松龙21-乙 酸酯17-丁酸酯、安西法尔、倍氯美松、倍氯美松双丙酸酯、倍氯美松双丙酸酯一水合物、 6-13 _羟基氢化可的松、倍他米松、倍他米松-17-戊酸酯、布地奈德、氯倍他索、丙酸氯倍 他索、氯倍他松、氯可托龙、氯可托龙特戊酸酯、可的松、醋酸可的松、可托多松、地夫可特、 21-脱氧氢化可的松、地泼罗酮、地西龙、丙縮羟强龙、去氧米松(desoximethasone)、地塞 米松、地塞米松-21-乙酸酯、二氟松、二氟松、双醋二氟松、二氟米松、朵西贝他索、氟氢可 的松、氟米松、特戊酸氟米松、氟甲氧縮松、氟尼縮松、氟轻松、醋酸氟轻松、9-氟可的松、氟 羟雄烯二酮(fluorohydroxyandrostenedione)、氟米龙、氢氟縮松醋酸酯、氟甲睾酮、氟甲 叉龙(flupredidene)、氟泼尼龙、丙酮縮氟氢羟龙、氟甲酰龙、氯氟舒松、卤米松、卤泼尼松、 hyrcanoside、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、氢
17化可的松磷酸钠、氢化可的松琥珀酸钠、丙丁酸氢化可的松(hydrocortisone probutate)、 戊酸氢化可的松、6-羟基地塞米松、异氟泼尼松、醋酸异氟泼尼松、异泼尼登、甲氯松、甲 基泼尼松龙、乙酸甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙琥珀酸钠、帕拉米松、醋酸帕拉米松、泼尼 松龙、醋酸泼尼松龙、间磺苯酸泼尼松龙、泼尼松龙磷酸钠、泼尼松龙叔丁乙酯、泼尼松 龙-21-半琥珀酸酯游离酸、泼尼松龙-21-乙酸酯、泼尼松龙-21 (13 -D-葡糖苷酸)、泼尼 松、泼尼立定、普西縮松、曲拉縮松、去炎松、曲安奈德、曲安奈德21-棕榈酸酯、双醋酸去炎 松、丙酮縮去炎松己酸酯和渥曼青霉素。特别希望的皮质类固醇是泼尼松龙、可的松、地塞 米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、氟替卡松、泼尼松、去炎松和二氟松。
药物组合物 本发明的药物组合物包含治疗有效量的AFP(或其生物功能片段、衍生物或类似 物)和/或一种或多种免疫调谐剂。活性成分AFP和一种或多种免疫调谐剂，可以在相同 药物组合物中进行施用，或者它们可以存在于2种分开的药物组合物中，将2者施用于患者 (例如同延地或非同延地)。组合物可以配制用于在多种药物递送系统中使用。 一种或多 种药学上可接受的赋形剂或载体也可以包括在组合物中用于正确的制剂。用于在本发明中 使用的合适制齐ll在Remington' s PharmaceuticalSciences， Mack Publishing Company, Philadelphia, PA，第17版(1985)中发现。关于药物递送方法的简要综述，参见，Langer， Science 249:1527-1533(1990)。 药物组合物预期用于肠胃外、鼻内、局部、经口或局部施用，例如通过经皮方法，用 于预防和/或治疗处理。通常，药物组合物肠胃外(例如，通过静脉内、肌内或皮下注射)、 或通过经口摄入或通过在受MS影响的区域处局部应用进行施用。因此，本发明提供了用 于肠胃外施用的组合物，其包含溶解或悬浮于可接受载体优选地水性载体中的AFP (或其 生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂，所述载体例如，水、缓冲水、盐 水、PBS等。组合物可以包含如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调 整和缓冲剂、张力调整剂、湿润剂、去污剂等。本发明还提供了用于经口递送的组合物，其可 以包含惰性成分例如粘合剂或填充剂用于配制片剂、胶囊等。此外，本发明提供了用于局部 施用的组合物，其可以包含惰性成分例如溶剂或乳化剂用于配制乳膏、软膏等。在本发明的 不同实施方案中，AFP和一种或多种免疫调谐剂可以在相同或分开组合物中配制，用于经由 相同或2种不同的施用途径进行施用。 这些组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌，或可以进行无菌过滤。所得到的水 溶液可以包装用于就这样使用，或冻干，冻干制剂在施用前与无菌水性载体组合。制剂的pH 一般将是3-11，更优选5-9或6-8，和最优选7-8，例如7_7. 5。所得到的固体形式的组合物 可以在多个单剂单位中进行包装，各自包含固定量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或类 似物)和一种或多种免疫调谐剂，例如片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可 以在用于灵活量的容器中进行包装，例如在设计用于局部应用乳膏或软膏的可挤压管中。
可以施用包含有效量的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种 免疫调谐剂的组合物，用于预防和/或治疗处理。在预防应用中，包含AFP(或其生物活性 片段、衍生物或类似物)和/或一种或多种免疫调谐剂的组合物施用于易感或在其他方面 处于发展MS危险中的患者。此种量定义为"预防有效剂量"。在这种用途中，精确量再次依 赖于患者的健康状态，但一般为约0. 5mg-约4Q0mg AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)/剂(例如，10mg、50mg、100mg、200mg、300mg或400mg/剂)禾口约0. 1 ii g_约300mg — 种或多种免疫调谐剂/剂(例如，lOii g、30ii g、50ii g、0. lmg、10mg、50mg、100mg或200mg/ 剂)。AFP和/或免疫调谐剂的剂量可以每小时、每天、每周、每月或每年一次或多次(例如， 每小时、每天、每周、每月或每年2、4、5、6、7、8、9、10、11或12次)预防地施用于患者。更通 常地，每周单剂的AFP和/或免疫调谐剂施用于患者。 在治疗应用中，组合物施用于已患有MS的患者(例如，人患者)，其量足以治愈或 至少部分阻止或缓解疾病及其并发症的一种或多种症状。足以实现这个目的的量定义为 "治疗有效剂量"。对于这个用途有效的量可以依赖于疾病或状况的严重程度和患者的一般 状态，但一般为约0. 5mg-约400mg AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)/剂(例如， 10mg、50mg、100mg、200mg、300mg或400mg/剂)和约0. 1 ii g-约1. 2g —种或多种免疫调谐 齐U/齐U (例如，10ii g、30ii g、50ii g、0. lmg、10mg、50mg、100mg、200mg、300mg、500mg、700mg或 1. Og/剂)。AFP和/或免疫调谐剂的剂量可以每小时、每天、每周、每月或每年一次或多次 (例如，每小时、每天、每周、每月或每年2、4、5、6、7、8、9、10、11或12次)治疗地施用于患 者。更通常地，每周单剂的AFP和/或免疫调谐剂施用于患者。 在几个实施方案中，患者可以接受每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7次 或更多次)约0. 5-约400mg/剂的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)，优选地每周 一次或多次约5mg-约300mg/剂，和甚至更加优选地每周一次或多次约5mg-约200mg/齐U。 患者还可以接受约50mg-约800mg的每两周剂量的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似 物)，或约50mg-约1， 200mg的每月剂量的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)。
在其他实施方案中，AFP可以以约O. 5mg/周-约400mg/周、约1. Omg/周-约 300mg/周、约5mg/周-约200mg/周、约10mg/周-约100mg/周、约20mg/周-约80mg/ 周、约100mg/周-约300mg/周或约100mg/周-约200mg/周的一般剂量范围施用于患者。 AFP可以以约0. 5mg每隔一天-约100mg每隔一天、优选地约5mg每隔一天-约75mg每隔 一天、更优选地约10mg每隔一天-约50mg每隔一天、和甚至更加优选地20mg每隔一天-约 40mg每隔一天的范围进行施用。AFP还可以以约0. 5mg 3次/周-约100mg 3次/周，优 选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周， 和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的范围进行施用。
在几个实施方案中，患者可以接受每周一次或多次(例如，每周2、3、4、5、6或7 次或更多次)约30 ii g-约300mg/剂的免疫调谐剂，优选地每周一次或多次约30 y g-约 200mg/齐U，和更加优选地每周一次或多次约30iig-约100mg/剂。患者还可以接受约 30 ii g-约1. 2g的每两周、每三周或每月剂量的免疫调谐剂，优选地约50 ii g-约1， OOOmg的 剂量，更优选地约100 ii g-约500mg的剂量。
在其中施用的免疫调谐剂是Avonex 的一些实施方案中，患者接受约isy g/
周-约75ii g/周，优选地约20ii g/周-约50ii g/周，更优选地约25ii g/周-约40ii g/周， 和甚至更加优选地约30 ii g/周-40 ii g/周的一般剂量。患者还可以接受约0. 5mg/周-约 100mg/周，优选地约5mg/周-约75mg/周，更优选地约10mg/周-约50mg/周，和甚至更加 优选地约20mg/周-约40mg/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在其中施用的免疫调谐剂是Betaseroi^的另一个示例性实施方案中，施用的一
般剂量可以是约6 ii g每隔一天-约2. Omg每隔一天，优选地约50 ii g每隔一天-约1. Omg每隔一天，更优选地约100 ii g每隔一天_约500 ii g每隔一天，和甚至更加优选地约250 ii g 每隔一天_约500 g每隔一天的范围。患者还可以接受约0. 5mg每隔一天-约lOOmg每 隔一天，优选地约5mg每隔一天-约75mg每隔一天，更优选地约10每隔一天-约50mg每 隔一天，和甚至更加优选地约20mg每隔一天-约40mg每隔一天的AFP多肽(或其生物活 性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Rebi产，施用的一般剂量可以是约
4. 4 ii g 3次/周-约100 ii g 3次/周，优选地约10 ii g 3次/周-约75 ii g3次/周，更优 选地约15 ii g 3次/周-约50 ii g 3次/周，和甚至更加优选地约22 ii g3次/周-约44 ii g 3次/周的范围。患者还可以接受约0. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3 次/周_约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚至更加优 选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是TauferonTM，施用的一般剂量可以是约 0. lmg/天-约40mg/天，优选地约0. lmg/天-约10mg/天，更优选地约lmg/天-约10mg/ 天，和甚至更加优选地约2mg/天-约5mg/天的范围。患者还可以接受约0. 5mg 3次/ 周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次 /周-约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多 肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是11()^1"011-/|^，施用的一般剂量可以是
约2. 0 X 106IU/天-约36. 0 X 106IU/天，优选地约3. 0 X 106IU/天-约36. 0 X 106IU/天，更 优选地约5. 0 X 106IU/天-约30. 0 X 106IU/天，和甚至更加优选地约5. 0 X 106IU/天-约 25.0Xl(flU/天的范围。患者还可以接受约O. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地 约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚 至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是111"011-八@，施用的一般剂量可以是约
5. 0X106IU/周-约35. 0X 106IU/周，优选地约6. 0X106IU/周-约35. 0X 106IU/周，更 优选地约6. 0 X 106IU/周-约30. 0 X 106IU/周，和甚至更加优选地约25. 0 X 106IU/周-约 35.0Xl(flU/周的范围。患者还可以接受约O. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地 约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚 至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Rebetroi^，施用的一般剂量可以是约
0. 5X106IU/周-约10. 0X106IU/周，优选地约1. 0X106IU/周-约10. 0X106IU/周，更 优选地约2. OX 106IU/周-约10. OX 106IU/周，和甚至更加优选地约5. OX 106IU/周-约 10.0Xl(flU/周的范围。患者还可以接受约O. 5mg 3次/周-约100mg 3次/周，优选地 约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚 至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。
在其中施用的免疫调谐剂是Peg-Introi^的一些实施方案中，患者接受约15 y g/
周-约150 ii g/周，优选地约20 ii g/周-约150 ii g/周，更优选地约50 ii g/周-约150 ii g/ 周，和甚至更加优选地约50ii g/周-100ii g/周的一般剂量。患者还可以接受约O. 5mg 3次
20/周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3 次/周_约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP 多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Alferon-N⑧,施用的一般剂量可以是约
0. 05 X 106IU/天-约15. 0 X 106IU/天，优选地约0. 1 X 106IU/天-约15. 0 X 106IU/天，更 优选地约1. 0 X 106IU/天-约15. 0 X 106IU/天，和甚至更加优选地约2. 0 X 106IU/天-约 15.0Xl(flU/天的范围。患者还可以接受约O. 5mg 3次/周-约100mg 3次/周，优选地 约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚 至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在其中施用的免疫调谐剂是Infergen⑧的一些实施方案中，患者接受约2i!g/
天-约30 ii g/天，优选地约5 ii g/天-约30 ii g/天，更优选地约5 ii g/天-约25 ii g/天， 和甚至更加优选地约5 ii g/天-20 ii g/天的一般剂量。患者还可以接受约0. 5mg 3次/ 周-约100mg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次 /周-约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次/周的AFP多 肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Actimmune ，施用的一般剂量可以是
约0. 5 X 106IU/周-约30. 0 X 106IU/周，优选地约1. 0 X 106IU/周-约30. 0 X 106IU/周，更 优选地约5. OX 106IU/周-约30. OX 106IU/周，和甚至更加优选地约5. OX 106IU/周-约
io. oxio6iu/周的范围。ActimmuiW^也可以以约40y g/周-约eooy g/周，优选地约
100 y g/周-约600 ii g/周，更优选地约150 y g/周-约600 ii g/周，和甚至更加优选地约 200 y g/周-约600 ii g/周的范围进行施用。患者还可以接受约0. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg3次/周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活 性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Pegasys⑧，施用的一般剂量可以是约
10 y g/周-约300 ii g/周，优选地约50 ii g/周-约300 ii g/周，更优选地约50 ii g/周-约 200 g/周，和甚至更加优选地约100 y g/周-约200 y g/周的范围。患者还可以接受约 0. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地 约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg 3次 /周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是^IovanU c)ne ，施用的一般剂量可以
是约0. 2mg/m7周-约80mg/m7周，优选地约1. 0mg/m2/周-约80mg/m7周，更优选地约 5. 0mg/m7周-约80mg/m7周，和甚至更加优选地约20. 0mg/m2/周-约80mg/m7周的范围。 患者还可以接受约0. 5mg 3次/周-约lOOmg 3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周-约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/ 周-约40mg 3次/周的AFP多肽(或其生物活性片段)。 在另一个实施方案中，其中免疫调谐剂是Copaxone⑧，施用的一般剂量可以是
约0. lmg/天-约40mg/天，优选地约1. Omg/天-约40mg/天，更优选地约5. Omg/天-约
2140mg/天，和甚至更加优选地约10. 0mg/天-约40mg/天的范围。患者还可以接受约0. 5mg 3次/周-约100mg3次/周，优选地约5mg 3次/周-约75mg 3次/周，更优选地约10mg 3次/周_约50mg 3次/周，和甚至更加优选地约20mg 3次/周-约40mg3次/周的AFP 多肽(或其生物活性片段)。 在本发明的方法的非限制性实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似
物)和一种或多种免疫调谐剂施用于患者连续1、2、3或4小时；l、2、3或4次/天；每隔一
天或每两天，每隔两天，每隔三天，或每隔四天；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次/周；每两周； 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或30次/月;每两月;1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次/6个月;1、2、3、4、5、6、7、8、9、10U1、 12、13、14、15、16、17、18、19或20次/年；或每半年。AFP (及其生物活性片段、衍生物或类 似物)和一种或多种免疫调谐剂可以在治疗方案过程中以不同频率进行施用(即，在MS的 晚期中以较高频率施用(例如，在MS起始阶段中每周施用1次和在MS的晚期每周施用3 次)或在MS的早期以较高频率施用(例如，在MS起始阶段过程中每周施用3次和在MS的 晚期每周施用1次))。在另外的实施方案中，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物) 和一种或多种免疫调谐剂可以以相同频率或不同频率施用于患者。 达到所需疗效需要的一种或多种免疫调谐剂和AFP(或其生物活性片段、衍生物 或类似物)的量依赖于众多因素，例如所选择的具体免疫调谐剂、施用方式和接受者的临 床状况。技术人员将能够确定一种或多种免疫调谐剂和AFP(或其生物活性片段、衍生物或 类似物)的合适剂量以达到所需结果。 根据本发明的方法，AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免 疫调谐剂的共同施用指在相同一般时间段中使用2种活性成分，或使用相同的一般施用方 法。然而，不总是必需在确切相同的时间施用2者。例如，如果AFP和一种或多种免疫调谐 剂在2种分开的药物组合物中施用于患有MS的患者，那么2种组合物无需在相同时间段过 程中或甚至在2个部分重叠的时间段过程中施用于患者。在一些情况下，第二种试剂(例 如，AFP)的施用可以在关于第一种试剂(例如，IFN-e-la)的施用时间段完成后不久开始， 或反之亦然。2个施用时间段的时间间隙可以是1天到1周或1个月。在一些情况下，一 种治疗剂(例如，AFP)可以首先在分开的时间段中与第二种试剂(例如，IFN) —起施用， 并且随后在后续时间段中不含第二种进行施用。这个类型的一般时间表可能需要在第一个 共同施用时间段中的较高剂量的第一种治疗剂和在第二个时间段中的较低剂量，且反之亦 然。这同样适用于第二种试剂。 包含有效量的AFP (或其生物活性片段、衍生物或类似物)和/或一种或多种免疫
调谐剂的组合物的单次或多次施用可以用由治疗医生选择的剂量水平和模式来进行。剂量
和施用时间表可以基于患者中的多发性硬化严重程度进行确定且调整，根据由临床医生通
常实践的方法或本文描述的那些，这可以在治疗过程自始至终进行监控。 关于次级试剂的剂量 除AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂外，本发 明的组合治疗还可以但不需要包括一种或多种次级试剂(例如，DMARD、 NSAID或皮质类固 醇)的共同施用。关于这些次级试剂的剂量在下文描述。 作为次级试剂，DMARD可以以下述范围施用于患者约0. lmg-3， 000mg/剂一次或多次/周(例如，2、3、4、5、6、或7次或更多次/周)、0. lmg-2， 500mg/剂一次或多次/周、 0. lmg-2， 000mg/剂一次或多次/周、0. lmg-l， 500mg/剂一次或多次/周、0. lmg-l， 000mg/ 剂一次或多次/周、0. lmg-800mg/剂一次或多次/周、0. lmg-600mg/剂一次或多次/周、 0. lmg-500mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-400mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-300mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-250mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-200mg/剂 一次或多次/周、 0. lmg-150mg/剂一次或多次/周、0. lmg-100mg/剂一次或多次/周或0. lmg-50mg/剂一次 或多次/周。 作为次级试剂，NSAID可以以下述范围施用于患者0. lmg-l， 500mg/剂一次或多 次/周(例如，2、3、4、5、6、或7次或更多次/周)、0. lmg-l， 200mg/剂一次或多次/周、 0. lmg-l， 000mg/剂一次或多次/周、0. lmg-800mg/剂一次或多次/周、0. lmg-600mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-500mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-400mg/剂 一次或多次/周、 0. lmg-300mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-200mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-150mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-100mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-80mg/剂 一 次或多次/周、 0. lmg-60mg/剂一次或多次/周、0. lmg-40mg/剂一次或多次/周、0. lmg-20mg/剂一次或多 次/周或0. lmg-10mg/剂一次或多次/周。 作为次级试剂，皮质类固醇可以以下述范围施用于患者0. lmg-l， 500mg/剂一次 或多次/周(例如，2、3、4、5、6、或7次或更多次/周)、0. lmg-l， 200mg/剂一次或多次/ 周、0. lmg-l， 000mg/剂一次或多次/周、0. lmg-800mg/剂一次或多次/周、0. lmg-600mg/ 剂一次或多次/周、0. lmg-500mg/剂一次或多次/周、0. lmg-400mg/剂一次或多次/周、 0. lmg-300mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-200mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-150mg/剂 一次或多次/周、0. lmg-100mg/剂 一 次或多次/周、0. lmg-80mg/剂 一 次或多次/周、 0. lmg-60mg/剂一次或多次/周、0. lmg-40mg/剂一次或多次/周、0. lmg-20mg/剂一次或多 次/周或0. lmg-10mg/剂一次或多次/周。
试剂盒 本发明还提供了用于治疗MS的试剂盒。试剂盒一般包括包含AFP多肽(或其生 物活性片段、衍生物或类似物)的药物组合物，以及包含一种或多种免疫调谐剂的药物组 合物，各自以治疗有效量用于治疗MS。在可替代实施方案中，有效量的AFP(或其生物活性 片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂可以存在于单一药物组合物中。任选地， 一种或多种药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，或可以包含一种或多 种次级试剂(例如，DMARD、皮质类固醇或NSAID)。 优选地，试剂盒包括单剂的一种或多种药物组合物的多个包装，所述药物组合物 包含有效量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和/或一种或多种免疫调谐剂。 任选地，关于施用一种或多种药物组合物所需的仪器或设备可以包括在试剂盒中。例如，本 发明的试剂盒可以提供包含有效量的AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)的一个 或多个预装注射器，和包含有效量的一种或多种免疫调谐剂的一个或多个预装注射器或片 齐U。此外，试剂盒还可以包括另外组分，例如说明书或施用时间表用于患有MS的患者，以使 用包含AFP(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和/或一种或多种免疫调谐剂的一种 或多种药物组合物。本发明的试剂盒的不同实施方案还可以包含一种或多种次级试剂(例 如，NSAID、 DMARD或皮质类固醇)。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神或范围的情况下，可 在本发明的组合物、方法和试剂盒中进行各种修饰和改变。因此，预期本发明包含本发明的 修饰和变化，前提是它们在附加权利要求及其等同方案的范围内。
实施例 提供下述实施例仅用于举例说明而不是限制。本领域技术人员将容易认识到可以 改变或修饰各种非关键参数，以产生基本上相同或相似的结果。
实施例1 :使用M0G-EAE小鼠模型的重组AFP的功能测试 重组形式的人AFP(根据美国专利申请公开号20040098755产生的rhAFP)的功效 实验在小鼠模型中来进行，其中通过用髓鞘质抗原或肽(髓鞘少突胶质细胞蛋白质[M0G] 或蛋白脂质蛋白质[PLP])免疫接种遗传易感小鼠品系来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE)。这个测定系统用于测定本发明的AFP多肽或生物活性AFP片段的功能性。
研究目的这些研究的目的是用预期作为用于MS的治疗剂的测试化合物执行，所 述MS是与主要组织相容性复合物(MHC)II类分子HLA-DR2直接相关的自身免疫疾病。就 其与人MS的关联性选择小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。
EAE模型描述和特征实验性变应性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统的脱髓鞘疾 病。它充当关于多发性硬化(MS)的动物模型(Goverman， Lab. Anim. Sci. 46 :482， 1996 ; Paterson，Clin. Immunol. Rev. 1 :581,1981)。 EAE可以呈现急性、慢性或复发-缓解疾病过 程，其依赖于诱导方法和使用的动物类型。疾病诱导导致逐步升高程度的上行性动物麻痹。 所产生的麻痹是使虚弱的，但并非疼痛的，并且大多数动物将显示一定程度的恢复，即使在 EAE晚期。麻痹通常从虚弱的尾部开始，逐渐随后为后肢无力进展至麻痹，并且较不频繁地 前肢麻痹。EAE疾病进展可以用评分系统进行监控，所述评分系统由正常状况开始且当小鼠 变得濒死时结束。因为疾病严重程度从动物到动物不等，所以不存在可靠预测动物是否恢 复的方法。因此，在这种动物模型中需要紧密监控。EAE可以用中枢神经系统的组分(Levine和Sowinski， J. Immunol. 110 :139， 1973 ;Fritz等人，J. Immunol. 130 :1024， 1983)、或月太(Tuohy等人，J. Immunol. 140 :1868， 1988 ;McFarlin等人，Science179 :478， 1973 ;和Linington等人，Eur. J. Immunol. 23 : 1364， 1993)、并且还经由从EAE诱导动物到正常接受者的T细胞转移(Yamamura等人， J.Neurol. Sci. 76 :269,1986)进行诱导。完全弗氏佐剂(CFA)必须与蛋白质或肽一起 使用，以有效触发自身免疫应答。CFA通常与百日咳毒素组合使用(Lee， Proc.Soc.E邓. Biol. Med. 89 :263， 1955 ;Kamradt等人，J. Immunol. 147 :3296， 1991)，以增加免疫接种的功 效。不可能施用止痛剂以减轻可能与CFA注射相关的任何疼痛，因为大多数止痛剂影响其 为模型的基本组分的免疫应答(Billiau， J. Leukoc. Biol. 70 :849,2001 ;Naiki等人，Int. J. Imm皿opharmacol. 13 :235， 1991)。
实验设计和方法 实验MS样疾病综合征的诱导6-8周龄的50只雌性小鼠(C57BL6)在第0天(左 腰椎旁区)和第7天(右腰椎旁区)时进行皮下免疫接种，其中使用在包含热杀死的结 核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37RA的CFA中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (mM0G-35-55肽)乳剂(125yg/小鼠)。此外，小鼠在免疫接种后第0天和第2天时腹膜 内给予百日咳毒素(Ptx)。
疾病监控在第一次免疫接种后 IO天开始观察到起始病征(无力的尾部或麻 痹)。主动免疫接种的小鼠根据确定的等级就EAE临床病征每天进行评估，直到第30天
O无疾病
l尾部无力 21个或2个无力后肢，足以损害复原(righting)或1肢麻痹
3截瘫 4四肢麻痹(quadr即l egic)
5濒死或死亡 将50只小鼠随机分成各10只小鼠的5个组。10只小鼠的一个组接受盐水注射，
以充当未经处理的EAE疾病对照。4种化合物在剩余4个组中进行评估。 小鼠用100 iil测试rhAFP或对照材料每天进行IP注射。这些化合物是1-500 y g
rhAFP; 1-500 iig人血清清蛋白(对照)。此外，针对特定白细胞子集(例如，CD4+细胞)
的耗尽抗体在一些研究中用作一种或多种另外的对照。 小鼠在这个研究中用于评估在MS的实验模型EAE中rhAFP对疾病进展的作用。如
果没有治疗，那么预期许多动物将发展EAE病征和症状，即进行性脑病和麻痹。 除在30天时间过程中就疾病进展每天监控动物外，在研究结束时处死动物，并且
收获中枢神经系统组织(脑和脊髓)用于浸润性、引起疾病的细胞(即，CD4+T细胞)的免
疫组织化学分析。 此外，6-10天短期研究用于评估rhAFP施用对疾病诱导期的一种或多种作用。在 这些较短期研究中，收获引流淋巴结细胞用于免疫学细胞子集的FACs分析，包括但不限 于T细胞、CD4+细胞、调节T细胞及其活化标记。来自每个处理组的收获细胞的级分就对 剌激实验对象组的体外增殖应答进行评估，以评估针对免疫抗原(Ag)M0G35-55的Ag特异 性回忆应答、和针对促分裂原实验对象组(伴刀豆球蛋白A、PHA、LPS)的Ag非特异性应答。 来自相同方式的培养物结构的上清液就细胞因子(IL-2、IL-4、IFN-y等)进行分析。
实施例2 :AFP和干扰素13 la在MOG-EAE小鼠模型中的协同作用
重组人AFP和干扰素13 la用于治疗EAE的协同作用在利用用于MS的MOG-EAE或 PLP-EAE小鼠模型的研究中进行测试。 —般实验设计等同于实施例1。简言之，6-8周龄的70只雌性小鼠(C57BL6)在 第0天(左腰椎旁区)和第7天(右腰椎旁区)时进行皮下免疫接种，其中使用在包含热 杀死的结核分枝杆菌H37RA的CFA中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mM0G-35-55肽)乳剂 (125iig/小鼠)。 将70只小鼠随机分成各10只小鼠的7个组。10只小鼠的一个组接受盐水注射，以 充当未经处理的EAE疾病对照。6种不同制剂在剩余6个组中进行评估。组1小鼠接受安 慰剂；组2接受10 ii g/天的rhAFP ;组3接受100 y g/天的rhAFP ;组4接受0. 1 y g/天的 IFN- P -la ;组5接受1 ii g/天的IFN- P -la ;组6接受分别为10 y g和0. 1 y g/天的rhAFP 和IFN-P -la ;和组7接受分别为100 ii g禾口 1 ii g/天的rhAFP和IFN-Ha。施用为通过 每天注射(ip或皮下)从第0天直到在第60天实验结束时。在研究的持续时间，根据如实 施例1中所述的等级，所有组每天就疾病症状进行评分。 在第60天时，所有小鼠实施安乐死，并且收获各种器官和血液(例如，脾、膝、后和前爪)用于免疫组织化学和免疫学分析。
其他实施方案 尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但应当理解它能够进一步修饰，并 且本申请预期包含本发明的任何变化、用途或适应，所述任何变化、用途或适应遵循一般而
言的本发明原理的，并且包括来自在本发明所属领域的已知或常规实践内且可以用于上文 阐述的基本特征的本公开内容的此种背离。 本说明书中提及的所有出版物和专利申请都引入本文作为参考，其程度与每个独 立出版物或专利申请特别且个别指出整体引入作为参考相同。
权利要求
一种用于治疗具有多发性硬化(MS)的患者的方法，其包括给所述患者施用治疗有效量的甲胎蛋白(AFP)或其生物活性片段、衍生物或类似物，和治疗有效量的免疫调谐剂。
2. 权利要求1的方法，其中所述AFP或其生物活性片段是人重组AFP。
3. 权利要求1的方法，其中所述AFP或其生物活性片段是非糖基化的。
4. 权利要求1的方法，其中所述免疫调谐剂是蛋白质。
5. 权利要求4的方法，其中所述蛋白质是干扰素或乙酸格拉太咪尔。
6. 权利要求5的方法，其中所述干扰素选自干扰素-!3-la、干扰素-l3-lb、干扰 素-a、干扰素-Y、干扰素-T。
7. 权利要求l的方法，其中所述免疫调谐剂是抗体。
8. 权利要求7的方法，其中所述抗体选自那他珠单抗、达利珠单抗、利妥希玛、ABT-874 和阿来组单抗。
9. 权利要求l的方法，其中所述免疫调谐剂是小分子。
10. 权利要求9的方法，其中所述小分子是BG12、芬戈莫德、米托蒽醌、拉喹莫德、特立 氟胺或阿伐他汀。
11. 权利要求1的方法，其中所述AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物每天、每周、 每两周或每月进行施用。
12. 权利要求11的方法，其中所述AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物每天进行施用。
13. 权利要求1的方法，其中所述AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物以约0. 5mg 或400mg/剂进行施用。
14. 权利要求l的方法，其中所述免疫调谐剂每天、每周、每两周或每月进行施用。
15. 权利要求1的方法，其中所述免疫调谐剂以约50ii g-300mg/剂进行施用。
16. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂同延地进行施用。
17. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂在分开剂型中进行施用。
18. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂在相同剂型中进行施用。
19. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂分开进行施用。
20. 权利要求l的方法，其中所述AFP在所述免疫调谐剂前进行施用。
21. 权利要求l的方法，其中所述AFP在所述免疫调谐剂后进行施用。
22. 权利要求1的方法，其中所述AFP或所述免疫调谐剂静脉内、肌内、经口、通过吸 入、肠胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌下、经鼻、在栓剂中、经口含化、脂质体、脂肪地、眼内、 皮下、鞘内、局部或通过局部施用进行施用。
23. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂通过2种不同的施用途径进行 施用。
24. 权利要求l的方法，其中所述AFP和所述免疫调谐剂通过相同施用途径进行施用。
25. 权利要求1的方法，其进一步包括给所述患者施用缓解疾病的抗风湿性药物 (DMARD)、皮质类固醇、或非类固醇抗炎药(NSAID)中的一种或多种。
26. 权利要求l的方法，其中所述施用导致一种或多种MS症状的严重程度中的丧失或 减少。
27. 权利要求26的方法，其中所述一种或多种MS症状选自麻剌感、麻木、震颤、平衡丧失、一肢或数肢中的无力、视力模糊或复视、言语不清、吞咽问题、麻痹、缺乏协调、认知困 难、疲劳、肌痉挛、眩晕、呼吸问题和癫痫发作。
28. —种组合物，其包含治疗有效量的甲胎蛋白(AFP)或其生物活性片段、衍生物或类 似物和免疫调谐剂，以治疗患者中的多发性硬化。
29. 权利要求28的组合物，其中所述AFP或其生物活性片段是人重组AFP。
30. 权利要求28的组合物，其中所述AFP或其生物活性片段是非糖基化的。
31. 权利要求28的组合物，其中所述免疫调谐剂是蛋白质。
32. 权利要求31的组合物，其中所述蛋白质是干扰素或乙酸格拉太咪尔。
33. 权利要求32的组合物，其中所述干扰素选自干扰素-13 -1&、干扰素-13 -llK干扰 素-a、干扰素-Y、干扰素-T。
34. 权利要求28的组合物，其中所述免疫调谐剂是抗体。
35. 权利要求34的组合物，其中所述抗体选自那他珠单抗、达利珠单抗、利妥希玛、 ABT-874和阿来组单抗。
36. 权利要求28的组合物，其中所述免疫调谐剂是小分子。
37. 权利要求36的组合物，其中所述小分子是BG12、芬戈莫德、米托蒽醌、拉喹莫德、特 立氟胺或阿伐他汀。
38. 权利要求28的组合物，其配制用于静脉内、肌内、经口、通过吸入、肠胃外、腹膜内、 动脉内、经皮、舌下、经鼻、在栓剂中、经口含化、脂质体、脂肪、眼内、皮下、鞘内、局部或局部施用。
39. 权利要求28的组合物，其进一步包含缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、皮质类固 醇、或非类固醇抗炎药(NSAID)中的一种或多种。
40. —种试剂盒，其包含(i) 治疗有效量的甲胎蛋白(AFP)或其生物活性片段、衍生物或类似物；(ii) 治疗有效量的免疫调谐剂；禾口(iii) 用于给具有多发性硬化的患者施用所述AFP或其生物活性片段、衍生物或类似 物和所述免疫调谐剂的说明书。
41. 权利要求40的试剂盒，其中所述AFP或其生物活性片段是人重组AFP。
42. 权利要求40的试剂盒，其中所述AFP或其生物活性片段是非糖基化的。
43. 权利要求40的试剂盒，其中所述免疫调谐剂是蛋白质。
44. 权利要求43的试剂盒，其中所述蛋白质是干扰素或乙酸格拉太咪尔。
45. 权利要求44的试剂盒，其中所述干扰素选自干扰素_ 13 -1&、干扰素-13 -llK干扰 素-a、干扰素-Y、干扰素-T。
46. 权利要求40的试剂盒，其中所述免疫调谐剂是抗体。
47. 权利要求46的试剂盒，其中所述抗体选自那他珠单抗、达利珠单抗、利妥希玛、 ABT-874和阿来组单抗。
48. 权利要求40的试剂盒，其中所述免疫调谐剂是小分子。
49. 权利要求48的试剂盒，其中所述小分子是BG12、芬戈莫德、米托蒽醌、拉喹莫德、特 立氟胺或阿伐他汀。
50. 权利要求40的试剂盒，其中所述AFP或其生物活性片段、衍生物或类似物，和/或所述免疫调谐剂配制用于静脉内、肌内、经口、通过吸入、肠胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌 下、经鼻、在栓剂中、经口含化、脂质体、脂肪、眼内、皮下、鞘内、局部或局部施用。
51. 权利要求50的试剂盒，其中所述AFP和所述免疫调谐剂配制用于2种不同的施用 途径。
52. 权利要求50的试剂盒，其中所述AFP和所述免疫调谐剂配制用于相同施用途径。
53. 权利要求40的试剂盒，其进一步包含缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、皮质类固 醇、或非类固醇抗炎药(NSAID)中的一种或多种。
54. —种试剂盒，其包含(i) 权利要求28的组合物；禾口(ii) 用于给具有多发性硬化(MS)的患者施用所述组合物的说明书。
55. 权利要求54的试剂盒，其中所述组合物配制用于静脉内、肌内、经口、通过吸入、肠 胃外、腹膜内、动脉内、经皮、舌下、经鼻、在栓剂中、经口含化、脂质体、脂肪、眼内、皮下、鞘 内、局部或局部施用。
56. 权利要求54的试剂盒，其进一步包含缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、皮质类固 醇、或非类固醇抗炎药(NSAID)中的一种或多种。
全文摘要
本发明的特征在于通过给有此需要的患者施用甲胎蛋白多肽(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂用于治疗多发性硬化的方法。还公开了包含甲胎蛋白多肽(或其生物活性片段、衍生物或类似物)和一种或多种免疫调谐剂的组合物和试剂盒。
文档编号C07K19/00GK101743018SQ200780051406
公开日2010年6月16日 申请日期2007年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者E·J·斯图尔特, M·布里斯金 申请人:梅里麦克药品公司