专利名称：：一种新型八碳侧链氢化异吲哚酮类化合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用绮丽穗霉KLA03(S;,'ca〃'fle/ega"sKLA03)(保藏编号是CCTCCM205049)制备一种新型八碳侧链氢化异吲哚酮类化合物开链10-苯基氢化异吲哚酮类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。
背景技术：
：io-苯基取代的氢化异n引哚酮类化合物属于细胞松弛剂类化合物，己有一些文献报道，该类化合物显示了多种生物活性，如对哺乳动物细胞的生长有显著的抑制作用，显示HIV-1蛋白激酶抑制活性，抗菌抗肿瘤活性等。该类化合物最重要的生物活性是能够与肌动蛋白结合从而改变其聚合反应，并且已经成为研究肌动结合蛋白的工具药。到目前为止已发现该类化合物80余种，该类化合物的结构特征是均具有氢化异吲哚酮母核，而IO位为苯基取代的占绝大多数，少数为苯并吲哚基，另外该类化合物结构中C9处与Q侧链形成不同的含氧大环，所包含的大环多为11、13和14元环。如Espada，A.Rivera-Sagredo,J.M.delaFuente,etal.NewCytochalasinsfromtheFungus々/an'a/^/cwy/亂r"ra,1997，53(18):6485-6492;YunjiangF.,JohnW.B.,AnthonyL丄，etal.ThreenovelcytochalsinsX,YandZfromi^eMdewrari蹈zo爐,./Ato./Voc/.2002,65,1274-1277.YuzoF.,HirokoT"MasakatuI.andHiromitsuN.,ZygosporinDandtwonewcytochalsinsproducedbythefUngusA/etorr/z/z/wOTawiop//ae.J!iVa,./Vod2000,63,132-135;另夕卜也有12、15禾tU6元环的报道，如MalcolmS.B.，ToshihiroH.,andYoshinoriA.,CytochalasinsfromaZ)a/c//w/asp.offungus.尸/^tocAe附/W^y,1996，41(3):821-828.Evidente,A.etal"Tetrahedron,1992,48，6317-6324;该类化合物C9与C8侧链为开环结构在C-18位有羰基的未见任何报道。本发明人研究发现绮丽穗霉KLA03(5Wcar&We卵/7SKLA03)(保藏编号是CCTCCM205049)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的细胞坏死活性，遂对其活性成分进行了研究，结果发现了1个新的开链10-苯基氢化异吲哚酮类化合物具有抗肿瘤活性，目前尚未见对该化合物的化学结构及细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。
发明内容本发明旨在提供一种结构独特的具有细胞增殖抑制以及直接杀伤癌细胞等抗肿瘤活性的新化合物。本发明的目的还在于提供一类新化合物的制备方法及其新化合物在制备肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂中的用途。本发明首次从绮丽穗霉KLA03(S/^can'ae/egfl"sKLA03)发酵物中发现了结构新颖的开链10-苯基氢化异吲哚酮类化合物，如式I所示其中式IR!、R3和R4为氢、氨基、羟基、垸氧基、酰氧基或酰氨基；R2为氢、烃基、羟基或酰基。所述的式I化合物为化合物1，其中I^R2均为氢，R3为羟基，R4为甲基。上述发明中最优选的式I化合物是由海洋来源的绮丽穗霉KLA030S]w'cw7'ae/ega附KLA03)的液体发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，石油醚-丙酮5:5的洗脱物，再经正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇9:2洗脱产物再经HPLC，以60%甲醇-水洗脱得化合物l(10mg)。本发明采用MTT法测试了化合物1对P388、A-549、HL60及BEL-7402细胞株的抗肿瘤活性。实验证实，这个化合物对这四种肿瘤细胞均有增殖抑制作用。因此本发明的式I化合物可用作细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂。式I化合物与各种药物可接受的载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤药物，用于肿瘤的治疗。式I化合物还可作为抑制细胞增殖的低分子生物探针用于生命科学研究，作为探针应用时，式I化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亚砜的含水溶液中加以应用。本发明的式I化合物可通过微生物发酵培养，然后从发酵物中分离纯化而得到；也可由上述优选化合物经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式I化合物的方法可采用其它任何能生产该类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可作为生产菌用于制备式I化合物。本发明的实施例中列举了利用绮丽穗霉KLA03株制备优选的本发明式I化合物的实例。该真菌KLA03株由从青岛近海海泥样品中分离，并经分类学研究鉴定为绮丽穗霉S//cw/fle/egara。该菌株已于2005年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏编号CCTCCM205049)。该绮丽穗霉KLA03(5^'can'ae/egaraKLA03)CCTCCM205049株具有如下微生物菌学特征(见表l):表1kla03菌株的微生物菌学特征检测项目结果检测项目结果菌落直径Om)810淀粉+表面颜色白色一灰褐色，粉状d-木糖+/-基质色素浅褐色麦芽糖+气生菌丝分枝，丰茂a-d-葡萄糖+分生孢子长穗状l-鼠李糖+/-孢子形态长圆形麦牙三糖一形成隔膜+蜜二糖—有核多核d-果糖+吐温80-d-乳糖一阿东糖醇-d-棉子糖—d-甘露醇-d-阿酪醇糖一d-甘露糖-d-松三糖一d-阿拉伯糖-海藻糖+d-阿拉伯醇-溴化琥珀酸—d-纤维二糖-癸二酸半乳糖-/+琥珀酸+d-半乳糖醛酸-琥珀酸甲酯+m-肌醇-甘油-对苯二酚葡萄苷+l-脯氨酸+龙胆二糖-p-羟基苯乙酸+需要特别说明的是，经发酵微生物制取本发明式i化合物的方法可釆用其它任何能生产开链10-苯基取代的氢化异吲哚酮类化合物的微生物，只要能生产该类化合物的微生物均可用作产素菌用于制备式i化合物。具体实施例方式在如下的实施例中所指的化合物l的化学结构是(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)r4r2HOR3式i5化合物l的R,R2均为氢，R3为羟基，R4为甲基。实施例1化合物1的发酵生产及分离精制1发酵生产生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取绮丽穗霉KLA03(5^cfln》e/eg"mKLA03)(保藏编号为CCTCCM205049)适量，接种到PDA斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。取斜面培养4天的绮丽穗霉KLA03(Sp'ca〃'fle/egaraKLA03)适量，接种到装有120mL培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0,pH7.0]的500mL锥型瓶中，在28°C、120转/分钟条件下摇床培养48小时，获得绮丽穗霉KLA03OS//o^'ae/egaraKLA03)的种子培养液。将该种子培养液按10%接种量分别接种于装有300毫升生产培养液[培养基组成(克/升)麦芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0,pH7.0]的1000mL三角烧瓶中，进行为期25天24°C的静置生产发酵，获得菌丝体和发酵液。2浸膏的获得用棉布将菌丝体和发酵液分离。将菌丝体用丙酮浸提三次，减压浓縮至不含丙酮，所得水层用等体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液减压浓縮，得粗浸膏。发酵液减压浓縮为四分之一体积后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌丝体和发酵液的浸膏，共15.0克。3化合物的分离精制浸膏(15.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶剂溶解后，加70克200-300目硅胶H(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，分为30个流份。Fr-15(l克，石油醚-丙酮5:5洗脱物)，再经正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇9:2洗脱产物再经HPLC，以60%甲醇-水洗脱得化合物1(10mg)。化合物1黄色油状物，分子式C28H34N06,HRESIMSm/z410.2337[M-H20+H]+，计算值410.2331。tH及"CNMR数据见表1表1化合物1的，H(600MHz)和"CNMR(150MHz)数据postion<5H(■/inHz)HMBC'H-'HCOSY1175.0s—2(NH)—5.49(brs)C-3,C-4，C-9356.9d3.48(m)lOb452.9d2.65(brd,5.2)C-3，C-5，C-9，C-103'10a，11124.9s—-6129.9s—673.0d3.83(brs)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2抗肿瘤活性的测试1实验样品及实验方法被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的纯品化合物1。准确称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供活性测试。细胞系及细胞的继代培养活性测试采用P388、HL60、BEL-7402和A549细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基，在37QC通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)本发明采用MTT法，测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的formazan,formazan的多少可通过酶标仪测定其吸收度求得。由于formazan的量与活细胞数成正比，所以可根据吸收度求出活细胞的数目，从而了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。活性测试时，取对数生长期的P388、HL60、BEL-7402和A549细胞，用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升5><104个细胞的细胞悬液，按每孔200微升接种于96孔板中，在37。C下培养24小时后，每孔加入2微升不同浓度的样品溶液，继续培养72小时。然后加入20uL含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L)，再培养4小时，移出150uL培养液后加入150uLDMSO溶解formazan，在540nm处测定其吸收度。按照IR%=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照xi00Q/。式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%)。2实验结果化合物l的细胞增殖抑制活性-表2.化合物l对四种细胞株的抑制率细胞株化合物/浓度(//M)io-410-510-610-7P38868.49.96.75.9"A-54956.17.74.85.08.1HL6062.020.625.326.115.1BEL-740258.114.708.78.93结论化合物1对包括人在内的哺乳动物来源的癌细胞具有抗肿瘤作用。因此，本发明的式i、式n化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗，也可作为细胞增殖抑制的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。权利要求1.式I化合物式I其中式IR1、R3和R4为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2为氢、烃基、羟基或酰基。2.权利要求1所述的式I化合物为化合物1，其中R,R2均为氢，R3为羟基，R4为甲基。3.权利要求2所述式I化合物的制备方法，其特征是发酵培养绮丽穗霉KLA03GSp/cw/ae/egamKLA03)(菌种保藏号CCTCCM205049)，获取含有上述式I化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出式I化合物。4.权利要求3所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚-丙酮为溶剂进行梯度洗脱，石油醚-丙酮5:5的洗脱物，再经正相硅胶柱层析，氯仿-甲醇9:2洗脱产物再经HPLC，以60%甲醇-水洗脱得化合物1(9mg)。5.权利要求1所述的式I化合物在制备细胞增殖抑制剂或肿瘤细胞杀伤剂中的用途。6.权利要求1所述的式I化合物在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的用途。7.权利要求1所述的式I化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。全文摘要本发明涉及一种新型八碳侧链氢化异吲哚酮类化合物开链10-苯基氢化异吲哚酮类化合物及其制备方法和用途。本发明用从海洋样品中分离得到的绮丽穗霉KLA03(SpicariaelegansKLA03)生产出结构新颖的上述类型的化合物。经实验证实，该类化合物可作为细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。文档编号C07D209/46GK101508668SQ20081000815公开日2009年8月19日申请日期2008年2月14日优先权日2008年2月14日发明者蒋习斐,瑾郑申请人:蒋习斐