尖海龙中抗肿瘤活性蛋白的制作方法

文档序号:3541567阅读:219来源:国知局
专利名称:尖海龙中抗肿瘤活性蛋白的制作方法
技术领域
本发明涉及的是一种医药技术领域的蛋白产品,具体的说,是涉及一种尖海 龙中抗肿瘤活性蛋白。
技术背景尖海龙Syngnathus acus Linnaeus为一常用中药材,收载于2005版《中华人 民共和国药典》,具有软坚散结、补肾壮阳之功效,用于癥瘕积聚、瘰疬痰核、 跌扑损伤、阳萎遗精、痈肿疔疮。经对现有技术的文献检索发现,李士敏等在对海龙类药材的体外抗肿瘤活性 研究中发现,尖海龙的脂溶性部分具有抑制人癌肿瘤细胞株KB细胞的作用。(李 士敏,吴筱丹,曾苏,等.海龙体外抗肿瘤活性研究[J].中国中药杂志,2001, 26 (3): 198-201),该文献公开的为尖海龙中具有抗肿瘤活性的脂溶性成分,并 不涉及水溶性的活性蛋白。李春香等报道尖海龙水提取物对Hela、 SK-RB-3细胞 的增殖具有很强的抑制抑制作用(李春香,边洪荣,邹国林,等.尖海龙提取物 抗癌作用的研究[J].武汉大学学报(理学版),2001.47 (6): 761-765),该文 献虽报道了水溶性成分,但仅为粗提物,并未涉及提取物的组成,更未涉及其中 的抗肿瘤活性蛋白类成分。李晓波等发明了一种粗吻海龙抗肿瘤蛋白(李晓波, 张朝晖,秦孙星,等.海龙抗肿瘤蛋白,中国专利,专利号ZL 200510112235.0)。 该发明是粗吻海龙抗肿瘤蛋白,其分子量为55 kDa,与本发明明显不同。目前尖海龙仍以全体入药,用于跌打损伤和阳痿遗精的治疗,文献检索未见 关于尖海龙抗肿瘤活性蛋白的报道。发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种尖海龙中抗肿瘤活性蛋 白,使其具有抗肿瘤活性,同时有低毒的特点。本发明是通过以下技术方案实现的。本发明是一种以尖海龙为原料提取的分子量为60 kDa的抗肿瘤活性蛋白。本发明抗肿瘤活性蛋白是尖海龙先经水提、硫酸铵盐析、再经离子交换层析 及凝胶过滤层析制得,其组成是分子量为60 kDa的纯蛋白,蛋白的含量为100%。本发明所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白外观为白色粉末,SDS-PAGE显示为 单一条带,HPLC显示为单一峰,为一纯蛋白。本发明所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,经测试具有良好的抗肿瘤活性小 鼠及人癌细胞株给药剂量在0.卜100g/ml范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长;小 鼠给药剂量在l-100mg/kg范围内可抑制动物体内移植肿瘤的生长,同时可以显 著改善荷瘤小鼠体征性状。本发明单独或与其它抗肿瘤药物联合使用均有抗肿瘤 作用,用于各种癌症的治疗和辅助治疗,如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白 血病等,尤其对A-549、 CCRF-CEM、 L0V0、 P388细胞株有较强抑制作用。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。从尖吻海龙中纯化以下实施例所述的抗肿瘤活性蛋白,具体如下(1) 以尖海龙为原料,粉碎后过筛,待用。(2) 在尖海龙粗粉中加入6-12倍量的蒸馏水,匀浆、低温浸泡8-16小时, 离心后取上清液,即为海龙蛋白粗提液。(3) 将蛋白粗提液于40-5(KC减压蒸发浓縮,加入硫酸按粉末使硫酸铵浓 度达到55 %-85 %饱和度,充分搅拌后4 °C静置,离心,收集沉淀,将沉淀 用少量蒸馏水溶解后透析、浓縮、冷冻干燥,即得到尖海龙粗蛋白。(4) 将尖海龙粗蛋白用pH8.4、 20腿ol/L Tris-HCl缓冲液溶解后,进行离 子交换层析,用含0、 0.1、 0.2、 0.3和0.5 mol/L NaCl的pH8. 4、 20mmol/L Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱,紫外检测仪于280nm波长处检测,得到数个不 同浓度NaCl缓冲液的洗脱组分,其中0. 3mol/L NaCl缓冲液洗脱部分经透析、 浓縮、冻干后,即为海龙抗肿瘤粗蛋白。(5) 将海龙抗肿瘤粗蛋白用pH8.4、 20mmol/L Tris-HCl缓冲液溶解,进行凝胶过滤层析,用pH8.4、 20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱,紫外检测仪于280nm 波长处检测,收集第一个洗脱峰,经透析、浓縮、冷冻干燥后,即获得尖海龙抗 肿瘤活性蛋白。实施例1本实施例所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,外观为白色粉末。 对该蛋白进行SDS-PAGE,分离胶浓度为12%、浓縮胶浓度为5%,以分子 量在14.4-116 kDa的混合标准蛋白作为对照,本实施例所提供的尖海龙抗肿瘤 活性蛋白在SDS-PAGE中显示单一条带,分子量为60 kDa。采用HPLC进行纯度 检测,色谱柱为依利特C4柱(5um, 250mmX4.6mm, 300A),柱温为30°C,乙 腈-水(10: 90)为流动相,流速0. 75ml/min,检测波长280nm,结果显示为单 一峰,蛋白纯度为100%。对该蛋白进行抗肿瘤活性测试,经MTT法检测,当药物浓度为200口g/ml 时,对对L0V0 (人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌细胞株)、L1210 (小鼠白血病 细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率分别为53.6%、 56.8%、 51.2 %和57.5%。采用MTT法测试本发明所得活性蛋白与甲胺蝶呤、5-氟尿嘧啶联合使用, 对Lovo (人结肠癌细胞株)进行抗肿瘤活性体外测试,当活性蛋白浓度为 0.2mg/ml,甲氨蝶呤浓度为2.5yg/ml时,邻胞生长抑制率增加39.3% ,当活 性蛋白浓度为0.2mg/ml, 5-氟尿嘧啶浓度为25ug/ml时,细胞生长抑制率增 加68.4%。采用荧光显微镜观察和流式细胞术分析发现所得活性蛋白可诱导L0V0、 A549等肿瘤细胞的凋亡。采用动物移植性肿瘤实验法考察尖海龙抗肿瘤活性蛋白对昆明种小鼠S180 肉瘤的抑制率,当给药剂量为50mg/kg时,小鼠肿瘤抑制率为31.3%。实施例2本实施例所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,外观为白色粉末,SDS-PAGE显示为分子量60kDa的单一条带。采用HPLC进行纯度检测,显示为单一峰,蛋白 纯度为100%。采用MTT法测试本实施例所得活性蛋白的抗肿瘤活性,当药物浓度为 0.2mg/ml时,尖海龙抗肿瘤活性蛋白对LOVO人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌 细胞株)、L1210 (小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率 分别为53.2%、 57.2%、 51.3%、 58.4%。
实施例3
本实施例所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,外观为白色粉末,SDS-PAGE显 示为分子量60kDa的单一条带。采用HPLC进行纯度检测,显示为单一峰。蛋白 纯度为100%。采用MTT法测试本实施例所得活性蛋白的抗肿瘤活性,当药物浓度为 0.2mg/ml时,尖海龙抗肿瘤活性蛋白对L0V0人结肠癌细胞株)、A549 (人肺癌 细胞株)、L1210 (小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM (人白血病细胞株)的抑制率 分别为71.2%、 56.2%、 54.3%、 63.4%。
权利要求
1、一种尖海龙抗肿瘤活性蛋白,其特征在于,以尖海龙为原料提取的分子量为60kDa的活性蛋白,蛋白的含量为100%。
2、 根据权利要求1所述的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,其特征是,所述蛋白, 其外观为白色粉末,SDS-PAGE显示是单一条带,HPLC显示为单一峰。
全文摘要
本发明公开一种医药技术领域的尖海龙中抗肿瘤活性蛋白,是以尖海龙为原料提取的分子量为60kDa的活性蛋白,其外观为白色粉末,SDS-PAGE显示为单一条带,HPLC显示为单一峰。本发明所提供的尖海龙抗肿瘤活性蛋白,具有抗吸瘤活性,同时有低毒的特点。本发明单独或其它药物理学联合使用均有抗肿瘤作用,主要用于各种癌症的治疗和辅助治疗如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白血病等,尤其是对LOVO人结肠癌细胞株)、A549(人肺癌细胞株)、L1210(小鼠白血病细胞株)、CCRF-CEM(人白血病细胞株)有较强抑制作用。
文档编号C07K14/435GK101215328SQ20081003274
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月17日 优先权日2008年1月17日
发明者李晓波, 王梦月, 聂玉晓, 鞠培俊 申请人:上海交通大学
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