一种结核杆菌特异的重组蛋白的表达纯化方法及其应用的制作方法

专利名称：一种结核杆菌特异的重组蛋白的表达纯化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因重组技术领域，涉及一种结核分枝杆菌特异的重组蛋白，
该蛋白由结核杆菌特异抗原CFP21和MPT64组成。具体是通过构建大肠杆菌重 组工程菌，经IPTG诱导后高效表达CFP21和MPT64的融合蛋白，经分离纯化 后获得该结核分枝杆菌特异的重组蛋白。最后提出以该特异蛋白刺激受检者外 周血释放IFN个并用ELISA检测分析IFN-Y量的方法(rCM-WBIA),证实该重 组蛋白在结核病和结核杆菌感染者诊断上的应用价值。
背景技术：
结核病是主要经呼吸道传播的、严重危害我国和全世界的重要传染病之一。 据世界卫生组织估计，全世界有超过1/3的结核杆菌感染者，其中的10%会发展 成为结核病病人。因此，筛检感染者在结核病的防治甚至最终的消灭中扮演中 重要的作用[CDC.MMWR 44(1995) 1-17.]。为此，世界各国都在重点研究，发现 结核感染者的诊断试剂并研究新型的疫苗用于感染者体内病菌的清除。
现有的诊断技术对结核杆菌感染者的诊断却非常难。近几十年来，临床上 采用结核菌素试验(TST)来诊断结核杆菌感染者。但TST活性成份是纯蛋白 衍生物(PPD)，该成份是一种混合物，且非结核分枝杆菌特异的。其检测结果 可被现在临床上广泛使用的疫苗一卡介苗免疫所干扰[P. Andersen， et al. Lancet 356 (2000) 1099"1104.]。从1921年发明卡介苗到现在为止，全世界已有 35亿人接种卡介苗。因此TST对感染者的诊断价值受到很大的影响。
对结核病病人的诊断技术包括痰涂片抗酸染色或痰菌培养，阳性率仅 40。/o"60o/n左右；肺部X射线检查肺部病理改变也仅在具有典型的临床症状后才 能诊断；其他血淸学诊断方法和分子诊断方法缺乏特异性，假阳性率高。因此，必须尽快研究结核病和结核杆菌感染者的早期、快速、特异和敏感的诊断方法。

发明内容
本发明是针对上述诊断方法的困难和不足之处，提出一种结核病抗原特异
的全血IFN-y诊断方法，可实现对结核病病人和感染者早期、快速、特异的诊断， 在阻断结核病的传播和流行，对结核病的控制具有重大意义。
本发明是基于以下原理来实现的。结核分枝杆菌感染人体后，首先会被人 体的免疫系统识别，激活机体的T细胞免疫应答，分泌产生IFN-p后者发挥抗 结核感染作用。部分T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次与结核杆菌相遇后， 会再次分泌产生IFN-Y，发挥抗结核感染作用。抗原特异的IFN-Y产生量与机体 是否感染或发病密切相关。因此如果采用结核杆菌特异的抗原在体外刺激感染 者和患者的T细胞，可诱导这些T细胞产生高水平的结核杆菌抗原特异的IFN-Y， 而非结核杆菌感染者或非结核病患者产生的IFN-y的量与未用抗原刺激产生的 量相近，从而实现诊断的目的。
用于TST诊断的纯蛋白衍生物(PPD)不具有结核杆菌种的特异性，结核 杆菌特异性抗原的鉴定对发展新一代的诊断试剂具有重要价值和意义。结核杆 菌和卡介苗比较基因组学的研究揭示了卡介苗缺失了几个区(regions of difference, RD)，其中之一命名为RD2区[M. A. Behr， et al. Science 284 (1999) 1520-1523.]。进一步研究证实RD2区集中在结核杆菌复合体(人型结核杆菌、 牛型结核杆菌和非洲型结核杆菌)，而在1931年以后的世界各地的卡介苗菌株 中全部缺失[P. Andersen, et al. Lancet 356 (2000) 10994104. M.A. Behr， et al. Viccine 17 (1999) 91S922.]。大量的研究证实RD2区编码的抗原MPT64 (Rvl980c)，是结核杆菌培养过程中产生的主要分泌性蛋白质，相对分子质量 24kDa，能够刺激强的迟发性变态反应和诱导结核病人和他们的接触者的外周血产生高水平的IFN-y[P. W. Roche, et al. Clin. Exp. Immunol. 103(1996) 226232. P. W. Roche, et al. Scand. J Immunol. .43 (1996) 662670. M. J. Elhay ，et al. Infect Immun. 66 (1998) 3454-3456. R. M. Nakamura， et al. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2 (1998) 541-46.]。进一步发现，RD2区编码的另外一个抗原CFP21 (Rvl984c)， 也是结核杆菌培养过程的产生的分泌蛋白之一，相对分子质量21kDa，也是一种 强免疫原性蛋白[A. Grover， et al. Proteiri Expr. Purif. 48 (2006) 274280.]，并也能 诱导结核病人的外周血产生高水平的IFN-"y[K. Weldingh， etal. Infect Immun. 66 (1998) 3492-3500.]。因此，本发明所选用的抗原CFP21 (Rvl984c)和MPT64 (Rvl980c俱有结核病特异诊断的潜在价值，并构成本发明抗原选择的依据。
本发明提出的重组蛋白，就是将CFP21和MPT64的基因连接在一起，克隆 入大肠杆菌表达载体进行工程化表达，然后进一步大规模纯化重组蛋白。可集 中两种抗原的免疫原性的优势，达到优势互补。同时也克服了国外报道的抗原 大量获取的困难[B. V. Geisbrecht， etal. Proteii Expr. Purif. 46 (2006) 6472]，为临 床大规模生产应用奠定了基础。
在获得本发明提出的重组蛋白CFP21-MPT64基础之上，本发明进一步提出 用该重组蛋白刺激受检者的全血并释放IFN-7，利用ELISA分析方法检测产生 的IFN-y的水平，即rCM-WBIA。该技术可用于临床诊断结核病患者和感染者。
该方法是通过分析结核杆菌抗原特异的细胞免疫应答而诊断疾病和感染， 并建立了结核病抗原特异的全血IFN-"y诊断试剂盒。该试剂盒两部分组成，一是 结核杆菌特异抗原CFP21-MPT64融合蛋白； 一是市场上广泛销售的双抗原夹心 法人IFN-Y ELISA检测试剂盒(如国内深圳达科为生物技术公司，晶美生物技术 公司等)。
在建立结核病抗原特异的全血IFN-Y诊断试剂盒的基础上，本发明进一 步提出两步的检测方法。 一是抗原特异的IFN-Y释放阶段具体包括采集受试者的外 周静脉血3ml，加入24孔板中的两个孔(lml/孔)；在采血后6h之内，分别加 入用稀释盐水溶液稀释到特定浓度的结核杆菌特异重组蛋白CFP21-MPT64 (终 浓度5-20微克/ml)，等体积的生理盐水(阴性对照)和PHA (终浓度5微克/ml， 阳性对照)；混匀后，37度静止放置20-24h;收集培养上清中的血浆。二是抗原 特异的IFN-y检测阶段具体的方法是按照市售的双抗原夾心法人IFN-yELISA 检测试剂kit中的说明，检测上述血浆中IFN-y的含量。
本发明提出的结核病抗原特异的全血IFN-y诊断具有以下优势 诊断需要的时间短，较为快速，共需要时间l-2天。而结核杆菌培养诊断 需时间l-2月，TST检测需要3天。
早期诊断。由于结核杆菌一旦感染人体，首先就会被机体的免疫系统所识 别，激活体液和细胞免疫应答，发生时间在感染后l-2个月，因此利用我们的细 胞免疫学检测方法即可作出诊断。X光片诊断只有在感染者肺部出现明显的病 理改变后才可作出诊断，这通常需要很长的时间。抗原抗体检测法也只有在疾 病症状处于活动期的情况下检测，但环境中分枝杆菌广泛存在，其与结核杆菌 的共同抗原，可干扰实验的诊断结果。
特异诊断。由于采用的是结核杆菌特异性的抗原，只与结核杆菌感染人体 后产生的免疫记忆T细胞起反应，因而产生的干扰素是结核杆菌抗原特异性的 IFN-"Y。
敏感性高。与TST检测相比，结核病抗原特异的全血IFN-Y诊断的敏感性 为100%，特异性高达86.7%，具有良好的诊断符合率(it=0.73)。
因此，本发明提出结核病抗原特异的全血IFN-Y诊断试剂盒及其制备方法和 应用方法，对结核病的控制和消灭具有重要意义。


图1本发明的CFP21，MPT64，CFP21-MPT64基因的扩增和表达载体pPro2164的 酶切鉴定。其中，M代表Marker， 1为pPro2164酶切产物，2为CFP21-MPT64PCR 产物，3为MPT64PCR产物，4为CFP21PCR产物。 图2本发明的CFP21-MPT64的表达载体pPro2164的结构示意图。 图3 CFP21-MPT64在大肠杆菌中的高效表达的SDS-PAGE分析(图3 A)和融 合蛋白生物学活性的免疫印迹分析(图3 B)。图A中M代表蛋白质分子量标准， 1代表IPTG诱导前的工程菌裂解产物，2和3分别代表IPTG诱导后4 h和6 h 的工程菌裂解产物。图B代表相应蛋白的免疫印迹结果。 图4CFP21-MPT64的纯化。其中，M代表蛋白质分子量标准，1 一 3代表杂蛋 白的去除过程，4代表重组蛋白CFP21-MPT64的纯化。
图5 rCM-WBIA与TST诊断结果的比较。rCM-WBIA的诊断敏感性为100%， 特异性为86.7%。与TST的诊断符合率为89.5°/0。
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解这些实施例仅用于说明
本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体的实施方法，
通常是按照实验室技术常规或市场公开铕售的试剂盒的说明书进行。
具体实施例方式
实施例l本发明的目的基因的扩增和表达载体的构建
(l)首先设计引物扩增CFP21和MPT64 CFP21上游AAGGATCCGATCCGTGTTCGGACATCGCGGTCG (SEQ.ID.N0.2)
说明单下划线代表5fl/nif/酶切位点 CFP21下CGTGATCGAGCCTGTTCGCC (SEQ.ID.N0.3)
说明双下划线代表linker基因序列 MPT64上游
GCGCCCAAGACCTACTGCGAGGAG ( SEQ.ID.NO.4)
说明双下划线代表linke遂因序列 MPT64下游GAAAGCTTCTAGGCCAGCATCGAGTCGATCGC (SEQ.ID.NO.5)
说明单下划线代表i/fm////酶切位点
以结核杆菌标准毒株(H37Rv)基因组DNA为模板，用以上引物分别进 行扩增CFP21和MPT64, PCR反应条件如下94。C预变性5分钟；94'C变性1 分钟，60。C复性1分钟，72'C延伸45秒，30个循环；72'C延伸5分钟。PCR 产物用纯化试剂盒纯化。PCR产物见图1。
(2)扩增融合基因CFP21-MPT64和克隆入pProEXHTb质粒 利用基因拼接(GeneSOEing)方法，以CFP21和MPT64 PCR^物混合物为模 板，用CFP21的上游引物和MPT64的下游引物进行扩增CFP21-MPT64融合基因 (SEQ.ID.NO.l)， PCR反应条件如下94'C预变性5分钟；94°0变性1分钟，60'C 复性1分钟，72'C延伸90秒，30个循环；72'C延伸10分钟。PCR产物经纯化后， 用5a/wif/和i/zy^/ZZ双酶切，克隆构建在质粒pProEXHTb中，建立表达载体 pPro2164。酶切鉴定pPro2164，证实构建成功，结果见图l。表达载体pPro2164 的结构示意图见图2。
具体实施例2重组蛋白CFP21-MPT64 (SEQ.ID.N0.6)在大肠杆菌中的高效表 达和融合蛋白生物学活性的免疫印迹分析将构建好的表达载体pPro2164转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株并进行高效表 达。其步骤为活化菌体，移入l升LB培养基中摇2-3小时后，经IPTG(lmM)37X: 诱导4h。表达产物经SDS-PAGE电泳检测证实。结果见图3。 CFP21-MPT64蛋白 的western blotting^定程序如下将电泳后的SDS-PAGE凝胶剥离，电转移到NC 薄膜上，200mA恒流转移2h，将NC膜放入l。/。BSA-PBS (pH7.4)液中，37°。震 荡lh,用TBS(0.05。/。 Tween 2W>BS, pH 7.4)室温震荡漂洗3次；用兔抗6xHis Tag 抗体(GenScript Corp., USA，市售)作为一抗，室温孵育lh，用TBS展荡洗三次；用 辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体作为二抗，室温孵育lh，用TBS震荡洗三次， 用化学发光法显色，即用鲁米诺(luminol辨过氧化物(Pierce公司，市售)各0.2 mL 混匀，加到硝酸纤维素膜上反应5 min，压片显影。 具体实施例3重组蛋白CFP21-MPT64的纯化
10000rpm离心10min收集诱导表达工程菌,分别将菌裂解上清和沉淀进行 SDS-PAGE电泳检测，结果上清中没有发现所需的重组蛋白，CFP21-MPT64是以 包涵体形式存在于沉淀中。蛋白纯化的操作按照Ni-NTA纯化体系(Invitrogen,美 国)说明书进行。简要概括步骤如下，50ml的菌液离心收集后重悬于8ml的盐酸 胍裂解液(6M盐酸胍，20mM磷酸钠pH7.8，500mM氯化钠)，冰浴超声破碎 细菌后，于4 'C进行3000rpm离心10min，上清加到用变性结合缓冲液(8 M尿素， 200 mM PBS pH 7.8， 500 mM氯化钠)预处理的Ni-NTA树脂中。室温下孵育 30min，结合柱用4ml的变性结合缓冲液(8 M Urea, 200 mM PBS pH 7.8， 500 mM NaCl)洗两次，变性洗涤缓冲液(8 M Urea， 20 mM PBS pH 6.0， 500 mM NaCl) 洗两次，非变性洗錄缓冲液(20 mM PBS， 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0) 洗四次，最后用8ml非变性洗脱缓冲液(20 mM PBS， 500 mM NaCl， 250 mM imidazole, pH8.0殊脱。纯化过程中每步骤取上清10Ml进行SDS-PAGE (12%)分
10析。将上清装入透析带中，分别用6M， 4M， 2M， 1M， 0.5M尿素洗液(每种尿 素洗液中均含5mMTriS"Cl)各洗一次，最后用0M尿素(含Tris-C10.6057g)洗两 次，将透析液用真空冰冻干燥获得重组蛋白CFP21-MPT64冻干粉。-20"€储存备 用。纯化过程及最终纯化的重组蛋白CFP21-MPT64的SDS-PAGE鉴定见图4。重 组蛋白CFP21-MPT64的定量采用BCA法，回收效率为200mg/L。
具体实施例4结核杆菌重组蛋白CFP21-MPT64刺激外周血产生的IFN-"y检测
采集TST阴性和TST阳性的健康人群的新鲜肝素抗凝静脉血3ml。各取1 ml 全血置于24孔板中，1孔加重组蛋白CFP21-MPT64(20 pg/ml谏lj激。另外两孔为 对照，分别加植物血凝素(PHA， 5pg/ml)或PBS,混匀10min后，37。C孵育20-24h。 毎孔收集200mL血清，根据ifn，的elisa检测试剂盒(市售)的说明书进行血清中 IFN-Y含量的检测。依据40例TST阴性且未与结核病痰涂片阳性接触史的对照组， 用重组蛋白CFP21-MPT64刺激产生的血清IFN-Y的数值是250士100pg/ml (Mean ± SD)，其均数的两倍数值确定为诊断标准(cut-off value)。可将76例受检人群分 为四类(见图5)，艮P: TST阳性rCM-WBIA阳性(TST+rCM-WBIA+)者有8例； TST强阳性rCM-WBIA阳性(TST++rCM-WBIA+)者有8例；TST阴rCM-WBIA 阳性(TST-rCM-WBIA+)者有8例；TST阴性rCM-WBIA阴性(TST-rCM-WBIA-)
者有52例。可见重组蛋白CFP21-MPT64可刺激受检人群外周血产生的IFN々分析 技术(rCM-WBIA)诊断结核病感染者的敏感性为10(m，特异性为86.7%，与TST 诊断结果比较，符合率高达89.5%，显示良好的诊断一致性(k=0.73)。因此，本 发明提出的重组蛋白CFP21-MPT64及建立的新型全血IFN-Y释放分析诊断试剂 盒和应用方法，必将在结核病和结核杆菌感染者诊断应用上具有重要意义。
此外，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本 发明作各种改动和技术修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限 定的范围。
ii<120〉 一种结核杆菌特异的重组蛋白的表达纯化方法及其应用 <130>
<140> 200810045219.8 〈141〉 2008-01-21
<160〉 6
<170〉 Patentln version 3. 5
<210〉 1 <211> 1218 <212〉 DM
〈213〉编码rCM融合蛋白的核苷酸序列
<400> 1
gatccgtgtt cggacatcgc ggtcgttttc gctcgcggca cgcatcaggc ttctggtctt 60 ggcgacgtcg gtgaggcgtt cgtcgactcg cttacctcgc aagttggcgg gcggtxgatt 120 ggggtctacg cggtgaacta cccagcaagc gacgact8cc gcgcgagcgc gtcaaacggt 180 tccgatgatg cgagcgccca catccagcgc accgtcgcca gctgcccgaa caccaggatt 240 gtgcttggtg gctattcgca gggtgcgacg gtcatcgatt tgtccacctc ggcgBtgccg 300
12<formula>formula see original document page 13</formula><400〉 2
aaggatccga tccgtgttcg gacatcgcgg tcg 33
<210> 3 <211〉 70 <212〉 DNA
<213〉人工合成序列(Artificial) <400〉 3
gctgccgcca ccgccgcttc cgccaccgcc gcttccaccg ccacctccgg cgtgatcgag cctgttcgcc
<210〉 4 <211> 69 <212> DNA
<213> 人工合成序列(Artificial) <400〉 4
ggtggcggtg gaagcggcgg tggcggaagc ggcggtggcg gcagcgcgcc caagacct8c tgcgaggag
60 70
60 69〈210〉 5 <211> 32 <212> DNA
<213>人工合成序列(Artificial) <400> 5
gaaagcttct aggccagcat cgagtcgatc gc 32
<210〉 6 <211〉 405 <212> PRT
<213> rCM融合蛋白的贫基酸序列
<柳> 6
Asp Pro Cys Ser A邻lie Ala Val Val Phe Ala Arg Gly Thr His Gin
15 10 15
Ala Ser Gly Leu Gly Asp Val Gly Glu Ala Phe Val Asp Ser Leu Thr
20 25 30
Ser Gin Val Gly Gly Arg Ser lie Gly Val Tyr Ala Val Asn Tyr Pro
35 40 45
Ala Ser Asp Asp Tyr Arg Ala Ser Ala Ser Asn Gly Ser Asp Asp Ala 50 55 60Ser Ala His lie Gin Arg Thr Val Ala Ser Cys 65 70 75
Val Leu Gly Gly Tyr Ser Gin Gly Ala Thr Val
85 90 Ser Ala Met Pro Pro Ala Val Ala Asp His Val
100
Phe Gly Glu Pro Ser Ser Gly Phe 115 120 Ser Leu Pro Thr lie Gly Pro Leu
130 135 Cys Ala Pro Asp Asp Pro lie Cys 145 150 His Val Ser Tyr Val Gin Ser Gly 165
Ala Ala Asn Arg Leu Asp His Ala 180
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly. Ser 195 200 Leu Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gin
210 215 Pro Ala Tyr Asn lie Asn lie Ser
225 230
Lys Ser Leu Glu Asn Tyr lie Ala
Pro Asn Thr Arg lie 80
lie Asp Leu Ser Thr 95
Ala Ala Val Ala Leu 105 110 Ser Ser Met Leu Trp Gly Gly Gly 125
Tyr Ser Ser Lys Thr lie Asn Leu 140
Thr Gly Gly Gly Asn lie Met Ala 155 160 Met Thr Ser Gin Ala Ala Thr Phe
170 175 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 185 190 Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Gki Glu 205
Ala Cys Gin lie Gin Met Ser Asp 220
Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gin
235 240 Gin Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser
16245
250
255
Ala Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn lie
260
265
270
Thr Ser Ala Thr Tyr Gin Ser Ala lie Pro Pro Arg Gly Thr Gin Ala
275
280
285
Val Val Leu Lys Val Tyr Gin Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr
290
295
300
Thr Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gin Ala Tyr Arg Lys Pro lie Thr
305
310
315
320
Tyr Asp Thr Leu Trp Gin Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe
325
330
335
Pro lie Val Gin Gly Glu Leu Ser Lys Gin Thr Gly Gin Gin Val Ser
340
345
350
lie Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gin Asn Phe Ala
355
360
365
Val Thr Asn A印Gly Val lie Phe Phe Phe Asn Pro Gly GIu'Leu Leu
370
375
380
Pro Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gin Val Leu Val Pro Arg Ser Ala lie
385
390
395
400
Asp Ser Met Leu Ala
40权利要求
1、本发明涉及一种结核杆菌特异重组蛋白，其特征在于组成该特异重组蛋白的成份包括结核分枝杆菌抗原CFP21(Rv1984c)和MPT64(Rv1980c)。以及用CFP21-MPT64重组蛋白建立全血IFN-γ释放分析检测试剂盒，并建立相应的应用方法。
2、 根据权利要求l所述的结核杆菌特异重组蛋白，建立全血IFN-Y释放分析诊 断试剂盒，其原理是利用结核杆菌特异的抗原，剌激受检者的外周血细胞并产 生IFN-y，按照市售的双抗原夹心法人IFN-YELISA检测说明，检测IFN-y的浓 度。因为结核病病人和结核分枝杆菌感染者可产生高水平的抗原特异的IFN-y， 实现对结核病和结核杆菌感染者的早期、快速和特异性诊断的目的。
3、 如权利要求1所述的抗原CFP21和MPT64来源的细菌菌种，包括结核分枝 杆菌的不同型别(人型和牛型)及由这些型别衍生的细菌菌株，实现结核杆菌 特异抗原的特征。
4、 如权利要求1所述一种结核杆菌特异重组蛋白，其核苷酸的序列特征为 SEQ.ID.NO. 1 ，氨基酸序列特征为SEQ.ID.NO.6 。
5、 如权利要求l所述的结核杆菌特异重组蛋白的构建表达和纯化方法，其特征 在于具体步骤如下首先重组蛋白编码基因通过PCR技术从权利要求3所述的 细菌DNA中扩增获得；其次将重组蛋白的编码基因，克隆构建在原核表达质粒 中，并将上述质粒转化的工程宿主菌种是大肠杆菌；最后进一步从表达该蛋白 的大肠杆菌工程菌中分离纯化该蛋白。
6、 如权利要求6所述的PCR扩增引物序列包括SEQ.ID.N0.2， SEQ.ID.N0.3， SEQ.ID.N0.4和SEQ.ID.N0.5。
7、 根据权利要求1所述的结核病抗原特异的全血IFN-y诊断试剂盒的应用方法， 其特征在于该应用方法包括以下两大阶段 一是抗原特异的IFN-Y释放阶段包括采集的样本为受检者的外周静脉血；用权利要求所述1的特异重组蛋白刺激受检者的外周血细胞，37度培养箱静止培养20-24h;最后收集培养上清中的血 浆。二是抗原特异的IFN-y检测阶段按照市售的双抗原夾心法人IFN-yELISA 检测试剂kit中的说明，检测上述血衆中IFN-Y的含量。
全文摘要
本发明属于基因重组技术领域，具体为一种结核分枝杆菌特异的重组蛋白，它由结核杆菌特异抗原CFP21和MPT64的基因串联起来，两者之间的linker为编码15个氨基酸(G4S1)3的核苷酸序列(SEQ.ID.NO.1)，将重组融合基因的DNA片段插入大肠杆菌载体，并在大肠杆菌中实现了CFP21和MPT64融合蛋白的高效表达和纯化。以该蛋白为基础结合人IFN-γ的酶联免疫分析技术，建立了受检者的全血IFN-γ释放分析方法，可以用于结核病和结核杆菌感染者的早期、特异性诊断和筛检。
文档编号C07K14/195GK101492497SQ200810045219
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月21日 优先权日2008年1月21日
发明者范雄林 申请人:范雄林