专利名称：一种制备脱氧核苷酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其涉及脱氧核苷酸的制备方法。
技术背景三磷酸脱氧核苷是DNA分子的结构基础。作为各种DNA聚合酶 的反应底物，是DNA合成、DNA序列分析、基因分析、定点突变、 各种聚合酶链式反应(PCR)等体系中必不可少的组成部分。而上述 技术是现代生命科学高速发展的产物，在分子生物学、生物化学、药 学、医学等领域起着至关重要的作用。尤其是PCR技术，因其具有 操作简单、周期短、反应灵敏等特点，在分子克隆、生物工程、生物 医药研发、遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子鉴定等领域得到 越来越广泛的应用。生物技术尤其是PCR技术的迅猛发展及其应用 领域的迅速扩大，使国内外对三磷酸脱氧核苷系列产品的需求日益增 长，产品市场前景非常广阔。单磷酸脱氧核苷是制备三磷酸脱氧核苷的必须中间体。传统的单 磷酸脱氧核苷制备方法是通过生物酶促水解法或化学水解法水解脱 氧核糖核酸获得单磷酸脱氧核苷。具有底物转化率低，产物收率低， 成本高，反应条件不易控制，产物复杂等缺点。发明内本发明提供一种制备脱氧核苷酸的方法，以解决传统的通过生物 酶促水解法或化学水解法水解脱氧核糖核酸获得单磷酸脱氧核苷时， 存在的底物转化率低、产物收率低、成本高、反应条件不易控制、产 物复杂的问题。本发明采取的技术方案是将氨基葡萄寡糖和过渡态金属离子按1:1 1:10的摩尔比加入到 反应体系中，使氨基葡萄寡糖的浓度达到0.1lJM 10.0iJM，加入水 解底物脱氧核糖核酸至终浓度1 mg/mL 100 mg/mL，以缓冲液控制 反应体系pH4 11，于20'C 4(TC反应1小时 12小时；反应液用 去离子水稀释1 100倍后用离子交换层析介质进行吸附，然后经平 衡，除杂，洗脱，获得目的物dAMP、 dCMP、 dGMP和dTMP。本发明中，反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340 984Da;本发明中，反应体系中所用过渡态金属离子为Fe2+、 012+或Co2+;本发明中，所用缓冲液为醋酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，终浓 度为20 mM 200 mM。本发明克服了传统单磷酸脱氧核苷制备条件苛刻、产物复杂和纯 化步骤繁多等缺点，提供了一种可以简单、高效地制备单磷酸脱氧核 苷的方法。本发明利用氨基葡萄寡糖脱氧核糖核酸模拟酶水解脱氧核糖核 酸获得目的产物；同时充分利用目的产物与反应体系中共存杂质之间 的物理、化学及生物学性质上的差异，实现仅通过一步纯化获得高纯 度的目的产物。本发明优点在于采用氨基葡萄寡糖脱氧核糖核酸模拟酶水解脱 氧核糖核酸获得目的产物，该模拟酶与传统的生物酶相比具有分子量小，结构简单，活性高，pH和温度适应范围广，不易失活等优点。 本方法同传统方法相比，具有反应时间短，体系pH和温度范围广， 容易控制，效率高。
具体实施方式
实施例1反应体系采用醋酸缓冲体系，pH4.0。向200mM醋酸缓冲液中 加入:水解底物脱氧核糖核酸至终浓度1 mg/mL，Ci^+至终浓度1 IJM， 氨基葡萄寡糖至终浓度O.l IJM，使终反应体积为5mL，反应体系中 氨基葡萄寡糖的分子量为340 984Da，反应温度为40 °C。反应12 小时，用去离子水将反应液经过直径为2.5 x 25 cm阴离子层析柱进 行吸附，流速为2mL/Min，用去离子水平衡以去除未吸附的杂质， 然后用1.8 mM HCI去离子水溶液洗脱dCMP,用2.8 mM HCI去 离子水溶液洗脱洗脱dAMP，用36 mM NaCI去离子水溶液洗脱 dTMP，用5mMHCI、 20 mM NaCI去离子水溶液洗脱dGMP。最 后以浓度为1M的盐酸和1M的氢氧化钠按先酸后碱的顺序对离子 交换介质进行再生，再生完成后用去离子水洗阴离子层析柱至pH中 性。实施例2反应体系采用醋酸缓冲体系，pH6.0。向100 mM醋酸缓冲液中加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度30 mg/mL， 012+至终浓度15 IJM，氨基葡萄寡糖至终浓度5 1JM，使终反应体积为5mL，反应体 系中氨基葡萄寡糖的分子量为340 984Da，反应温度为30 °C。反 应4小时，用去离子水将反应液经过直径为2.5 x 25 cm阴离子层析 柱进行吸附，流速为2mL/Min，用去离子水平衡以去除未吸附的杂 质，然后用1.8 mM HCI去离子水溶液洗脱dCMP,用2.8 mM HCI 去离子水溶液洗脱洗脱dAMP，用36 mM NaCI去离子水溶液洗脱 dTMP，用5mMHCI、 20 mM NaCI去离子水溶液洗脱dGMP。最 后以浓度为1M的盐酸和1M的氢氧化钠按先酸后碱的顺序对离子 交换介质进行再生，再生完成后用去离子水洗阴离子层析柱至pH中 性。实施例3反应体系采用Tris-HCl缓冲体系，pH7.5。向200 mM Tris-HCl 缓冲液中加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度100mg/mL， F^+至 终浓度1 [JM，氨基葡萄寡糖至终浓度1卩M，使终反应体积为5 mL， 反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340 984Da，反应温度为20 。C。反应6小时，用去离子水将反应液稀释100倍后经过直径为2.5 x 25 cm阴离子层析柱进行吸附，流速为2 mL/Min，用去离子水平衡以 去除未吸附的杂质，然后用1.8 mM HCI去离子水溶液洗脱dCMP， 用2.8 mM HCI去离子水溶液洗脱洗脱dAMP，用36 mM NaCI去 离子水溶液洗脱dTMP，用5 mM HCI、 20 mM NaCI去离子水溶液 洗脱dGMP。最后以浓度为1 M的盐酸和1 M的氢氧化钠按先酸后碱的顺序对离子交换介质进行再生，再生完成后用去离子水洗阴离子层析柱至pH中性。 实施例4反应体系采用Tris-HCl缓冲体系，pHl 1 。向20 mM Tris-HCl缓 冲液中加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度50mg/mL， 0)2+至终 浓度50 pM，氨基葡萄寡糖至终浓度10 pM，使终反应体积为5 mL， 反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340 984Da，反应温度为30 °C。反应1小时，用去离子水将反应液稀释50倍后经过直径为2.5 x 25cm阴离子层析柱进行吸附，流速为2mL/Min，用去离子水平衡以 去除未吸附的杂质，然后用1.8 mM HCI去离子水溶液洗脱dCMP， 用2.8 mM HCI去离子水溶液洗脱洗脱dAMP,用36 mM N。CI去 离子水溶液洗脱dTMP，用5 mM HCI、 20 mM NaCI去离子水溶液 洗脱dGMP。最后以浓度为1 M的盐酸和1 M的氢氧化钠按先酸后 碱的顺序对离子交换介质进行再生，再生完成后用去离子水洗阴离子 层析柱至pH中性。
权利要求
1、一种制备脱氧核苷酸的方法，其特征在于包括下列步骤将氨基葡萄寡糖和过渡态金属离子按1∶1～1∶10的摩尔比加入到反应体系中，使氨基葡萄寡糖的浓度达到0.1μM～10.0μM，加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度1mg/mL～100mg/mL，以缓冲液控制反应体系pH 4～11，于20℃～40℃反应1小时～12小时；反应液用去离子水稀释1～100倍后用离子交换层析介质进行吸附，然后经平衡，除杂，洗脱，获得目的物dAMP、dCMP、dGMP和dTMP。
2、 如权利要求1所述的制备脱氧核苷酸的方法，其特征在于， 反应体系中氨基葡萄寡糖的分子量为340 984 Da。
3、 如权利要求1所述的制备脱氧核苷酸的方法，其特征在于， 反应体系中所用过渡态金属离子为F^+、 012+或0)2+。
4、 如权利要求1所述的制备脱氧核苷酸的方法，其特征在于， 所用缓冲液为醋酸缓冲液或Tris- HC1缓冲液，终浓度为20 mM ~ 200 mM0
全文摘要
本发明涉及一种制备脱氧核苷酸的方法，属于生物技术领域。将氨基葡萄寡糖和过渡态金属离子按1∶1～1∶10的摩尔比加入到反应体系中，使氨基葡萄寡糖的浓度达到0.1μM～10.0μM，加入水解底物脱氧核糖核酸至终浓度1mg/mL～100mg/mL，以缓冲液控制反应体系pH 4～11，于20℃～40℃反应1小时～12小时；反应液用去离子水稀释1～100倍后用离子交换层析介质进行吸附，然后经平衡，除杂，洗脱，获得目的物dAMP、dCMP、dGMP和dTMP。本方法同传统方法相比，具有反应时间短，体系pH和温度范围广，容易控制，效率高。
文档编号C07H19/00GK101225096SQ20081005029
公开日2008年7月23日 申请日期2008年1月23日 优先权日2008年1月23日
发明者陈大伟 申请人:吉林省奇健生物技术有限公司