专利名称：人参水溶性蛋白的膜分离纯化制备方法
技术领域：
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种采用缓冲液浸提、微滤和 超滤相结合的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法。
背景技术：
人参蛋白及多肽的研究始于六十年代，主要集中于人参多肽的提取方法。1963 年，德国的F.Gstimor等人首次从人参根中检测出多种氨基酸谷氨酸、半光氨酸、 酪氨酸等。1966年他们(Arch Pharm. 1966， 299(11): 934~937)又采用电泳的方 法从高丽白参的甲醇水提取液中得到5个小肽，未确定出一级结构。1980年，日 本人Ando与Okada(PlantaMedica, 1980， 38: 18~21)等发现人参水提取液中有 一种强烈抑制肾上腺素诱导的脂肪分解的物质，此物质能被链霉蛋白酶(pronase) 破坏，估计为蛋白或肽类化合物。经DEAE-Cellulose， S印hadex G-10， Avicel-Cellulose， Phosphoric-Cellulose等色谱手段分得一个14肽，氨基酸组成为 2Asp， Thr， Ser， 3Glu， 3Gly， Ala， Val， Leu， lle，未测出一级结构，之后也未 査到继续研究此肽的报道。1990年Takaku和Okada(PlantaMedica. 1990， 56: 27~30)等又报道从高丽红参中得到一种酸性物质，可以抑制肾上腺素诱导的脂肪分 解并能刺激胰岛素参与的脂肪合成，并确定该酸性物质为焦谷氨酸。同时他们还指 出红参中可能有一种非肽物质也有此活性。在此期间，韩国的Kim(CA. 108: 68730s， 107: 242499p)等报道从人参中分离纯化到有抗脂肪分解活性的寡肽，但 未给出一级结构。Yagi等人1994年从人参中提取到 一 种四肽成分 Val-D-Glu-D-ArG-Gly。并证明一些非蛋白氨基酸对其调节神经系统活性至关重要。 魏俊杰等人(白求恩医科大学学报.1990， 16(5): 436~438)从生晒参中分离出两种 人参多肽，分别是分子量为1kDa的11肽和分子量为1.3kDa的12肽，它们具有 降低2BS细胞内多糖含量和增强2BS细胞内琥珀酸脱氢酶活力的作用。Chen等 (P印tide Research. 1998， 52: 137 142)人利用水醇提取法，结合离子交换、凝 胶过滤和RP-HPLC从人参中分离出六种含a氨基酸的小肽，并通过氨基酸序列分 析已测定其结构为氧化性的谷胱甘肽及其类似物，实验证明，它具有调节动物睡眠 的作用。另外， 一种14肽也从人参中提取出来，结构为 Glu-Thr-Val-Glu-lle-lle-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala，它具有强烈的抗脂解活 性(Jounal of Chromatography B. 1996， 687: 443~448)。吉林大学的张今等(高 等学校化学学报.1985， 61(4): 376~380)， 1985年报道用717型和732型离子
3交换树酯柱从人参花蕾中分得两个酸性肽，氨基酸组成分别为I :
ASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-Mat-Leu-Phe-Arg ，分子量大于1.5kDa 。 II : ASP-Thr-Ser-Glu-Gly-Ala-Val-lle-Leu-Lys，分子量大于1.2kDa。 1988年，他们(吉 林大学自然科学学报.1988， 4: 75~78)又按照日本人Ando的分离程序及改进的 分离程序(用S印hadex G-25凝胶过滤)从人参中分离出一个具有胰岛素作用的 14肽，认为是Ando得到的14肽，但存在一个氨基酸的差异，并用DABITC/PICTC 双偶合法测定了序列为 Glu-Thr-Val-Glu-lle-lle-ASP-Ser-Glu-Gly-Gly-Gly-ASP-Ala。其后，又用CD谱研究了该肽的二级结构(生物化学与生物 物理学报.1989， 21(2):175~176);生理活性研究表明有抗脂肪分解及降低血糖和 肝糖作用(药学学报.1990， 25(6〉: 401~402;药学学报.1990， 25(10):727~728); 对该肽的基因进行了化学合成和克隆(生物化学杂志.1990， 6(3):193~195)。 1991 年又报道从红参中经DEAE-Cellulose， S印hadex G-10和RP-HPLC纯化得到两 个肽(药学学报.1991， 26(7):499~502)，其一为13肽3Gly， 2Ser， 2Glu， Ala， 2Asp， Thr， Leu， Val;另一为15月太4Gly， 3Ser， 2Glu， 2Ala， Asp， Thr， Leu， lle。测出了 15肽的N末端为Asp，各肽均未给出一级结构。
进入90年代中期，由于现代生物技术在中药领域的广泛应用，对于人参蛋白 的研究才日益增多。应用二维电泳技术现已表明人参中共有人参蛋白300多种，其 中已被报道的仅有40多种(Joumal of Chromatography B. 2005， 815: 147~155; Journal of Plant Physiology. 2004， 161: 837~845)，主要包括(1)类RNA酶蛋 白类RNA酶蛋白是人参的主要蛋白(ginseng major protein, GMP)，分子量为 28kDa，其氨基酸序列与植物的RNA酶具有高度同源性(Comparative Biochemistry and Physiology B. 2002， 132: 551~557)。 二维电泳分析显示GMP的含量随季 节的变化而变化，因此这一蛋白也被认为是人参的储存蛋白。(2)核糖核酸酶Lam 和Ng从人参根中分离得到一种由27kDa和29kDa两个亚基组成的非耐热核糖核 酸酶，其具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性(Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001， 285: 419~423)。随后他们又从人参花蕾中分 离得到一分子量23kDa的核糖核酸酶，但却没有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性 (Protein Expression and Purification. 2004， 33: 195~199)。 Gennady也从人参 愈伤组织中分离得到两种分子量都为18kDa的核糖核酸酶(FEBS Letters. 1997， 407:207~210)。(3)几丁质样蛋白分子量15kDa，具有抗真菌功能(The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2001， 33， 287~297)。 (4)木聚糖酶 从人参根部提取的木聚糖酶，分子量只有15kDa，明显低于从其他药用植物分离得 到木聚糖酶，最适酶活温度为50。C，具有人I型免疫缺陷病毒转录抑制的活性(LifeSciences. 2002， 70: 3049~3058)。 (5)皂苷p 葡萄糖苷酶从人参中分离的皂苷 (3~葡萄糖苷酶能水解人参皂苷Rg3，得到抗癌物质人参皂苷Rh2，分子量59kDa， 最适酶活温度为60。C(Chemical and Pharmaceutical Bulletin.2001，49:795~798)。
膜分离是在20世纪初出现，20世纪60年代后期迅速崛起的一门新的分离技 术。由于其兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，又有高效、节能、环保、分子级 过滤及过滤过程简单、易于控制等特征，因此，目前已广泛应用于食品、医药、生 物、环保、化工、冶金、能源、石油、水处理、电子、仿生等领域，产生了巨大的 经济效益和社会效益，已成为当今分离科学中最重要的手段之一。
膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组份透过而保留混和物中其 他组份，从而达到分离目的的技术。它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学 变化、处理效率高和省能等优点，已作为一种单元操作日益受到人们极大重视。在 其发展过程中，1960年Loeb和Sourirajan制备出第一张具有高透水性和高脱盐率 的不对称反渗透膜是膜分离技术发展的一个里程碑，使反渗透技术大规模用于水脱 盐成为现实。自此以后，不仅在膜材料范围上有了极大扩展，而且在制膜技术、组 件结构及设备研制方面也取得了重大进展。这些进展又大大促进了微滤和超滤技术 的发展，使整个膜分离技术迅速向工业化应用迈进。目前，膜分离技术已在电子工 业、食品工业、医药工业、环境保护和生物工程等领域中得到广泛应用。
膜分离技术由于具有如下优点而使其能在生物产品分离、提取与纯化过程中发 挥作用
(1) 处理效率高，设备易于放大；
(2) 可在室温或低温下操作，适宜于热敏感物质分离浓縮；
(3) 化学与机械强度最小，减少失活；
(4) 无相转变，省能；
(5) 有相当好选择性，可在分离、浓縮的同时达到部分纯化目的；
(6) 选择合适膜与操作参数，可得到较高回收率；
(7) 系统可密闭循环，防止外来污染；
(8) 不外加化学物，透过液(酸、碱或盐溶液)可循环使用，降低了成本，并 减少对环境的污染。
我国膜产业从诞生至今已近二十年的历史，经过行业内广大科技人员的努力， 膜技术的研究和开发有了质的飞跃。
超滤膜已研制出截留分子量3千、6千、1万、3万、5万、10万、15万及24 万的平板膜，纺制出截留分子量6千、1万、3万与5万和10万的双皮层与内皮层 中空纤维超滤膜，并组装成不同处理量的组件与设备。该过程常用的四种组件形式
5巻式、极框式、管式、中空纤维式都有厂家生产，膜盒式超滤器也已开发成功，这 对推动我国基因生物工程的研究发展具有重要意义。 一大批重要的研究成果己向工 业生产推广，国产反渗透和超滤组件及装置己在超纯水制备、医药、环保、电厂锅 炉用水等方面替代引进的国外设备。
中空纤维切向流过滤柱是近年来最新发展起来的膜过滤设备。其中以
QuixStand系统为典型代表，其主要组成部分包括 一个储液器， 一个蠕动泵，两 个进出口压力表以及各种型号的中空纤维过滤柱。涵盖微滤和超滤两种最为常用的 领域，微滤有0.1pm、 0.2|jm、 0.45pm、 0.65ijm四种规格;超滤有1k、 3k、 5k、 10k、 30k、 50k、 100k、 300k、 500k、 750k十种规格，基本上可以解决大部分蛋白
质纯化的问题。中空纤维柱具有以下优点1、开放式通道设计；2、无液体接触死 角；3安装不需要笨重的夹具；4、大多数可以高压或者在线蒸汽灭菌；5、可承受
高达4bar以上的压力；5、成本比较低；6、有多种纤维管径可以选择。
近年来，中空纤维切向流过滤柱被广泛应用在发酵液分离(细胞、细菌分离)、 裂解液澄清(细胞、细菌分离)、包涵体澄清、病毒及质粒纯化、血液制品纯化、 蛋白质纯化中，并在高浓度、高粘度、高颗粒度的生物样品纯化方面具有独特的优 势。在大多数的中试规模以上的下游纯化中，可以替代传统的离心机，大大降低了 繁琐的实验操做所带来的诸多不便，同时也节省了大量的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度、高收率的人参水溶性蛋白的制备方法，其是 将人参匀浆液反复浸提、运用膜分离技术得到高纯度、高收率的人参水溶性蛋白，
经BCA试剂盒检测，蛋白含量可达50%以上。为工业化生产人参水溶性蛋白产品 提供强大的基础保证。
本发明所述的制备方法包括如下步骤
1) 将生晒参粉成80目~100目细粉，每克细粉加入5 10ml、含0.1 0.3mol/L NaCI、 pH=7~8的0.01~0.03mol/L Tris-HCI缓冲液，进行浸提操作，合并2~3次 浸提所得上清液，即为人参水溶性蛋白粗提液；
2) 取上述步骤获得的人参水溶性蛋白粗提液，经膜孔径为0.22pm~0.65|jm的 过滤装置进行微滤，使样品澄清，流速20~40ml/min，过膜压力5~10psi，得人参 水溶性蛋白过滤液；
3) 取上述步骤获得的人参水溶性蛋白过滤液，经膜孔径为10~100kDa的过滤 装置进行超滤，流速20 50ml/min，过膜压力10~20psi，所得内滤液经真空冷冻干 燥即为人参水溶性蛋白。
6上述步骤中所述的浸提操作是于1 10'C条件下浸提12~24小时，浸提后于 1~10°C、 5000 10000r/min离心10 60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人参 渣中加入5 10ml/g上述缓冲液，于1 1(TC条件下再浸提12 24小时，浸提后于 1~10°C、 5000~10000r/min离心10~60min，取上清液；再合并上述2次浸提的上 清液。
进一步地，上述步骤中是将人参水溶性蛋白粗提液经膜孔径为 0.22ym~0.65ym的中空纤维膜过滤装置进行微滤；是将人参水溶性蛋白过滤液经 膜孔径为10~100kDa的中空纤维膜过滤装置进行超滤并浓縮。
通过SDS PAGE凝胶电泳可判定本步骤所得产物为人参蛋白，因为只有蛋白 才会在SDS PAGE凝胶电泳上显示条带。分子量不同的蛋白其在SDS PAGE凝 胶电泳上的位置不同，得到的各蛋白分子量可以通过已知标准蛋白分子量的标准曲 线方程来获得。由电泳结果可知，蛋白浸提液经过微滤和超滤两个步骤，蛋白质几 乎没有损失，证明该方法可行。
经BCA试剂盒测定，蛋白含量可达50%以上，收率可达3%以上。
本发明具有的优点在于获得人参水溶性蛋白的纯化工艺简单、周期短、见效快， 较盐析法节省了大量的人力和物力，同时除去了绝大多数的大分子和小分子杂质而 不损失蛋白，具有纯化效果好、上样量大、收率高且可用于放大生产的特点。
图1:人参水溶性蛋白提取工艺流程图2:实施例1的人参水溶性蛋白的SDS PAGE电泳图； 图3:实施例2的人参水溶性蛋白的SDS PAGE电泳图； 图4:实施例3的人参水溶性蛋白的SDS PAGE电泳图。
如图1所示，将生晒参粉成细粉，加入中性缓冲液浸提，浸提后离心，取上清 液；然后向浸提后沉淀的人参渣中再加入上述中性缓冲液，再次浸提后离心，取上 清液；进行2~3次浸提操作后，合并所得上清液，即为人参水溶性蛋白粗提液；然 后进行微滤及超滤等工艺步骤后，所得内滤液经真空冷冻干燥即为人参水溶性蛋 白。
如图2、图3、图4所示，其中M表示的是低分子量标准蛋白，自上而下分子 量依次为97kDa、 66kDa、 43kDa、 3化Da、 20kDa、 14kDa; 1-3均为人参水溶性 蛋白，其中1为浸提液中的总蛋白电泳检测结果，2为浸提液经微滤后的总蛋白电 泳检测结果，3为微滤后的总蛋白溶液经超滤后的蛋白电泳检测结果。在电泳取样过程中，微滤液和超滤液的体积与浸提液的体积保持一致。
具体实施方式
实施例1:
1 、人参水溶性蛋白的提取取生晒参若干，粉碎成80目细粉。取100g加800ml 含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的0.01mol/L Tris-HCI缓冲液，搅拌均匀，于4。C条 件下浸提12小时，浸提后于4。C、 4000r/min离心30min，得上清液600ml;然后 向沉淀的人参渣中再加入800ml的本步骤所述缓冲液，于4'C条件下再浸提12小 时，浸提后于4。C、 4000r/min离心30min，得上清液700ml;合并2次浸提所得上 清液，即得人参水溶性蛋白粗提液1300ml;
2、 微滤取上述步骤获得的1300ml人参水溶性蛋白粗提液，经膜孔径为 0.22|jm的中空纤维膜过滤装置(型号QuixStand benchtop system, GE公司) 进行微滤，流速20ml/min，过膜压力10psi，获得过滤液1200ml。再向剩余的粗提 液中加入200ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI缓冲液洗漆微滤，重复3次，获 得3次过滤液共550ml。将所有过滤液合并，共1750ml。
3、 超滤取上述步骤获得的1750ml人参水溶性蛋白过滤液，经膜孔径为10kDa 的中空纤维膜过滤装置进行超滤、浓缩，流速20ml/min，过膜压力10psi，当内滤 液为50ml时，向内滤液加入500ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI缓冲液洗涤 超滤，重复3次，将内滤液放出，约120ml;由于超滤过程中会有一些蛋白分子黏 附在中空纤维膜表面，所以我们进一步用缓冲液冲洗纤维膜，以避免蛋白分子损失， 用上述缓冲液300ml冲洗超滤3次，将内滤液放出，约100ml。将两次所得内滤液 合并，约220ml，真空冷冻干燥(真空度5x1(^Mbar，冷冻温度-55。C )，共获得固 体样品3.23g。经BCA试剂盒测定，纯度为51.25%，电泳结果见图2。
实施例2:
1、 人参水溶性蛋白的提取取生晒参若干，粉碎成90目细粉。取100g加800ml 含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的O.01mol/L Tris-HCI缓冲液，搅拌均匀，于4'C条 件下浸提12小时，浸提后于4°C、 4000r/min离心30min，得上清液620ml;然后 向沉淀的人参渣中再加入800ml的本步骤所述缓冲液，于4'C条件下再浸提12小 时，浸提后于4。C、 4000r/min离心30min，得上清液630ml;合并2次浸提所得上 清液，即得人参水溶性蛋白粗提液1250ml;
2、 微滤取上述步骤获得的1250ml人参水溶性蛋白粗提液，经膜孔径为 0.45(jm的中空纤维膜过滤装置(型号QuixStand benchtop system, GE公司)
8进行微滤，流速25ml/min，过膜压力6psi，获得过滤液1100ml。再向剩余的粗提 液中加入150ml的pH=7.0的0.001 mol/LTris-HCI缓冲液洗涤微滤，重复3次，获 得过滤液400ml。将两次过滤液合并，共1500ml。
3、超滤取上述步骤获得的1500ml人参水溶性蛋白过滤液，经膜孔径为30kDa 的中空纤维膜过滤装置进行超滤、浓縮，流速25ml/min，过膜压力8psi，当内滤液 为50ml时，向进样筒中加入500ml的pH=7.4的0.001 mol/L Tris-HCI缓冲液洗涤 过滤，重复3次，将内滤液放出，约100ml;用上述缓冲液300ml冲洗超滤3次， 将内滤液放出，约100ml。将两次所得内滤液合并，约200ml，真空冷冻干燥，共 获得固体样品3.47g。经BCA试剂盒测定，纯度为54.65%，电泳结果见图3。
实施例3:
1、 人参水溶性蛋白的提取取生晒参若干，粉碎成100目细粉。取100g加 800ml含0.15mol/L NaCI的pH=7.4的O.01mol/L Tris-HCI缓冲液，搅拌均匀，于 4。C条件下浸提12小时，浸提后于4。C、 4000r/min离心30min，得上清液630ml; 然后向沉淀的人参渣中再加入800ml的本步骤所述缓冲液，于4'C条件下再浸提12 小时，浸提后于4。C、 4000r/min离心30min，得上清液670ml;合并2次浸提所得 上清液，即得人参水溶性蛋白粗提液1300ml;
2、 微滤取上述步骤获得的1300ml人参水溶性蛋白粗提液，经膜孔径为 0.65ym的中空纤维膜过滤装置(型号:QuixStand benchtop system, GE公司) 进行微滤，流速32ml/min，过膜压力5psi，获得过滤液1150ml。再向剩余的粗提 液中加入150ml的pH=8.0的0.001 mol/L Tris-HCI缓冲液洗涤微滤，重复3次，获 得过滤液420ml。将两次过滤液合并，共1570ml。
3、 超滤取上述步骤获得的1570ml人参水溶性蛋白过滤液，经膜孔径为50kDa 的中空纤维膜过滤装置进行超滤、浓縮，流速30ml/min，过膜压力6psi，当内滤液 为50ml时，向进样筒中加入500ml的pH=7.4的O.001mol/L Tris-HCI缓冲液洗涤 过滤，重复3次，将内滤液放出，约100ml;用上述缓冲液300ml冲洗超滤3次， 将内滤液放出，约100ml。将两次所得内滤液合并，约200ml，真空冷冻干燥，共 获得固体样品3.58g。经BCA试剂盒测定，纯度为53.77%,电泳结果见图4。
9
权利要求
1、人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其包括如下步骤(1). 将生晒参粉成80目～100目细粉，每克细粉加入5～10ml、含0.1～0.3mol/L NaCl、pH＝7～8的0.01～0.03mol/L Tris-HCl缓冲液，进行浸提操作，合并2～3次浸提所得上清液，即为人参总蛋白粗提液；(2). 取上述步骤获得的人参总蛋白粗提液，经膜孔径为0.22μm～0.65μm的过滤装置进行微滤，流速20～40ml/min，过膜压力5～10psi，即得人参总蛋白过滤液；(3). 取上述步骤获得的人参总蛋白过滤液，经膜孔径为10～100kDa的过滤装置进行超滤并浓缩，流速20～50ml/min，过膜压力10～20psi，所得内滤液经真空冷冻干燥即为人参水溶性总蛋白。
2、 如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于浸 提操作是于1 1(TC条件下浸提12~24小时，浸提后于1~10'C、5000~10000 r/min离心10 60min，取上清液；然后向浸提后沉淀的人参渣中加入5~10ml /g上述缓冲液，于1-1(TC条件下再浸提12 24小时，浸提后于1 1(TC、 5000~10000r/min离心10~60min，取上清液；再合并上述2次浸提的上清 液。
3、 如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于是将人参总蛋白粗提液经膜孔径为0.22nm~0.65|jm的中空纤维膜过滤装置进 行微滤。
4、 如权利要求1所述的人参水溶性蛋白的分离纯化制备方法，其特征在于是 将人参总蛋白过滤液经膜孔径为10~100kDa的中空纤维膜过滤装置进行超 滤并浓縮。
全文摘要
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种采用缓冲液抽提、膜分离技术纯化制备人参水溶性总蛋白的方法。其是将人参粉成细粉后，加入中性缓冲液中，进行2～3次浸提，将合并的浸提液经膜孔径为0.22μm～0.65μm的中空纤维膜过滤后，再经截留分子量为10～100kDa的中空纤维膜超滤，从而获得高纯度、高收率的人参总蛋白。本发明具有纯化效果好、处理量大、样品收率高且可用于放大生产等特点。经BCA试剂盒测定，蛋白含量可达50％以上，且收率可达3％以上。
文档编号C07K1/34GK101423545SQ200810051560
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者幺宝金, 巍 张, 歌 惠, 李红艳, 雨 赵, 赵大庆 申请人:长春中医药大学