专利名称：一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白opn的方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域。具体地说，本发明涉及一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白 OPN的方法。
背景技术：
骨桥蛋白(Oste叩ontin, OPN)是一种重要的多功能细胞外基质蛋白，也是一个与炎症 过程有关的潜在的促炎症细胞因子，主要来源于人、小鼠、大鼠、牛、猪和兔，在骨组织细 胞、巨噬细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等多种细胞上表达，在介导细胞的趋化、聚集、黏附、 增殖和迁移，以及骨组织的矿化与重建、免疫调节、信号转导等方面起着重要的作用。由于 这种蛋白是细胞在骨基质中的产物，并能在细胞与基质中的矿质形成一种桥连，人们将其命 名为骨桥蛋白。OPN是一种含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)带负电荷的非 胶原性骨基质分泌型糖基化磷蛋白，由于它是一种高度酸化的多功能域的蛋白，理论分子量 约为33kDa，但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75kDa。其中含有特异的序 歹ij:信号肽序列、7 10个连续Asp序歹"RGD序列和酪氨酸激酶II磷酸化识别序列。在RGD 下游还存在N-连结糖基化部位序列和O-连结糖基化部位。磷酸化后的OPN主要是以RGD结 构与细胞表面的整合素受体(oM3p 04卩3)结合，而未磷酸化OPN则不依赖于RGD结构与某些 CD44的变异体结合，OPN和细胞表面受体相互作用能诱导信号传导从而促进细胞的黏附和 迁移，与多种生物学功能密切相关。
蛋白质的分离、纯化主要有二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-Gel)、亲和层析(Affinity Chromatography, AC)以及高效液相色谱分离(HPLC)的方法，它们各自有独特的优势。但 2D-Gel分离蛋白的方法所用试剂消耗大、程序繁琐""fl/. CTzm. /卯6， 6& S50-WS) ; AC 方法 (/Vofd" Expre咖'ow朋c/ Pwny ca"肌 2003, 23S-245;fixpressfo" cmc/ 尸w诉c^/o". 7卯7, 9: M9-JW)，虽然在OPN分离、纯化上有一定优势，但程序复杂、消耗 时间长、所用试剂种类多、成本又高，而且，AC是在一种特制的具有专一性吸附能力的亲 和层析试剂上进行的层析，不是所有的蛋白质都可以找到合适的亲和层析试剂，在蛋白质纯 化工作中存在一定的局限性
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单、快速的分离、纯化人乳中骨 桥蛋白OPN的方法。
本发明所用的傅立叶变换离子回旋共振质谱(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR-MS)，是最近三十年快速发展起来的一项 质谱检测手段。它以高分辨率、高质量检测上限、高扫描速度、宽的动态范围、最佳的质量 准确度等技术优势，越来越广泛地应用到蛋白质的研究中，成为将各种蛋白质与序列数据库 联系起来的桥梁。本专利采用"Bottom Up"方法，在多肽水平上鉴定和研究蛋白质，采用 HPLC (SCX和C4色谱柱)和配有Nano-spray技术的高分辨FT-ICR-MS等化学方法，摸索 出分离与纯化了人乳中骨桥蛋白OPN的最佳色谱条件，所用试剂简单、操作方便。将纯化 后样品OPN利用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，利用FT-ICR-MS串联质谱(MS/MS或 MSn)，母离子的活化采取碰撞激发解离(CAD)和电子捕获诱导解离(ECD)的方式，根 据多肽碎片命名规则以及CAD的C-N肽键断裂和ECD的N-Ca断裂在裂解机理上的互补性 规律，借助先进的Mascot软件数据库，分析了 OPN中有代表性的多肽片段GDSVVYGLR 和QNLLAPQTLPSK的质谱裂解机理，充分证明了高分辨质谱的准确性，可以达到100%的 覆盖率，不仅增强了OPN鉴定的可信度，也能更好的鉴定OPN翻译后的修饰位点。 本发明从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)的方法，按以下步骤进行
(A) 将人乳样品经高速离心分离，高速离心机的转速需大于12000转/分钟，温度控制在 不超过0。C，离心时间为30 45min;分离出乳脂、乳清和乳粒，其中乳脂在上层、乳粒在下 层，OPN在中层的乳清部分中；
(B) 初步分离乳清部分用lmol/L硫酸调节至PH为4.6，沉淀，除去酪蛋白后，采用 高效液相色谱配有SCX色谱柱进行分离，流动相A(20mmol/L柠檬酸、20mmol/L拧檬酸铵、 pH 3.0)和流动相B (20 mmol/L拧檬酸、20 mmol/L拧檬酸铵、0.5 mol/LNaCl、 pH3.0)进行 梯度洗脱，先100。/。A洗脱20min,然后流动相B含量从0%到10%洗脱10min,后再大幅 度使用流动相B含量从60%到100。/。洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为lmL/min， 柱温为35。C，得到八个组份(见图l),其中，SCX5、 SCX6组份含有OPN;
(C) 进一步纯化将SCX5、 SCX6组份合并，用高效液相色谱配有C4色谱柱对SCX5、 SCX6组份进行纯化，流动相组成为A(0.1%TFA 、 99.9%水(v/v))和B (0.1% TFA 、9.9% 水与90%乙氰(v/v))，进行梯度洗脱，先100。/。A洗脱10min,然后流动相B含量从20。/o提 高到40%，洗脱10min，后流动相B含量从40%到60%,洗脱25min，最后使流动相B含量 从60%到100%，洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为lmL/min，柱温为40 。C，可 以得到纯度较高的骨桥蛋白OPN (图2)，图3、图4给出了分离、纯化OPN的色谱图。
将纯化后样品OPN用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，采用"Bottom Up"并结合HPLC等化学方法，利用FT-ICR-MS串联质谱(MS/MS或MS")，母离子的活化采取碰撞激发解 离(CAD)和电子捕获诱导解离(ECD)的方式，根据多肽碎片命名规则(图5)以及CAD 的C-N肽键断裂和ECD的N-Ca断裂在裂解机理上的互补性(图6)，鉴定了OPN蛋白中 有代表性的双电荷分子离子峰为483.2570的多肽GDSVVYGLR片段(图7)和双电荷分子 离子峰为655.3816的多肽QNLLAPQTLPSK片段(图8)。而且，多肽GDSVVYGLR片段 和多肽QNLLAPQTLPSK片段与标准谱库匹配率(Score)分别为69禾B 101。借助先进的 Mascot软件数据库进行质谱分析，MS/MS串联质谱显示，平均分子量为964.4977的单电荷 中性多肽片段GDSVVYGLR，与平均分子量为964.4998 (483.2572, 2+)多肽片段 GDSVVYGLR的匹配分子离子相对照，相对偏差为0ppm，平均分子量为1308.7401的单电 荷中性多肽片段QNLLAPQTLPSK,与平均分子量为1310.7632 (655.3816， 2+)多肽片段 QNLLAPQTLPSK的匹配分子离子相对照，相对偏差为4ppm (图9)，充分证明了高分辨质 谱的准确性充分验证了高分辨质谱的准确性，从而验证了 OPN蛋白鉴定的可信度。
本发明的有益效果利用FT-ICR-MS并结合HPLC等化学方法，摸索出最佳的色谱分离 条件，步骤简单，不需借助亲和层析特有的层析试剂复杂的吸附、解析过程，可以成倍縮短 时间，快速地分离、纯化人乳样品中的OPN， 1L人乳样品中可得到10mg纯度在95。/。以上的 OPN。借助Mascot软件数据库进行质谱分析，可以简洁、准确地获得相关多肽片段的结构信 息，从而进一歩鉴定OPN。随着各种酶解方法的不断改进，高分辨质谱配合HPLC分离、纯 化OPN方法的进一歩成熟，必将为OPN多肽片段不同修饰位点与相关疾病的发病机理及研发 新的药物提供理论依据。
图l:分离与纯化人乳的流程图； 图2:人乳乳清部分的纯化流程图3:人乳乳清部分SCX色谱柱的HPLC分离与纯化色谱图； 图4: SCX5和SCX6组分C4色谱柱的HPLC分离与纯化色谱图； 图5:多肽碎片命名规则示意图； 图6:多肽碎片互补裂解机理示意图7: OPN中双电荷分子离子峰为483.2570多肽GDSVVYGLR片段的FT-ICR-MS C AD谱图8: OPN中双电荷分子离子峰为483.2570多肽GDSVVYGLR片段的FT-ICR-MS ECD
谱图9: OPN中双电荷分子离子峰为655.3816多肽QNLLAPQTLPSK片段的FT-ICR-MSCAD谱图10: OPN中双电荷分子离子峰为655.3816多肽QNLLAPQTLPSK片段的FT-ICR-MS ECD谱图ll:多肽片段GDSVVYGLR分子量准确度分析示意图； 图12: QNLLAPQTLPSK分子量准确度分析示意图。
具体实施方式
实施例1:
从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)按以下步骤进行
(A) 将人乳样品1L经高速离心分离，转速需大于12000转/分钟，温度控制在不超过 0°C，离心时间为30 45min;分离出乳脂(60mL)、乳清(920mL)和乳粒(20mL)，其中乳脂 在上层、乳粒在下层，OPN在中层的乳清部分中；
(B) 初步分离乳清部分用lmol/L硫酸调节至PH为4.6，沉淀，除去酪蛋白后，采用 高效液相色谱配有SCX色谱柱进行分离，流动相A( 20mmol/L柠檬酸、20mmol/L柠檬酸铵、 pH 3.0)和流动相B (20 mmol/L柠檬酸、20 mmol/L柠檬酸铵、0.5 mol/L NaCl、 pH3.0)进行 梯度洗脱，先100。/。A洗脱20min，然后流动相B含量从0%到10%洗脱10min,后再大幅 度使用流动相B含量从60%到100%洗脱10 min，在洗脱的过程中保持总流速为lmL/min， 柱温为35 。C，得到八个组份(见图1)，其中，SCX5 (50mL)、 SCX6 (40mL)组份含有
OPN;
(C) 进一步纯化将SCX5、 SCX6组份合并，用高效液相色谱配有C4色谱柱对SCX5、 SCX6组份进行纯化，流动相组成为A(0.1%TFA 、 99.9%水(v/v))禾卩B (0.1% TFA 、 9.9% 水与90%乙氰(v/v))，进行梯度洗脱，先100% A洗脱10 min,然后流动相B含量从20%提 高到40%，洗脱10min,后流动相B含量从40%到60%，洗脱25min，最后使流动相B含量 从60%到100%,洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为lmL/min，柱温为40 。C，得 到纯度较高的骨桥蛋白OPN(10mg)(图2)，图3、图4给出了分离、纯化OPN的色谱图。
本专利采用"Bottom Up"和配有Nano-spray技术的高分辨FT-ICR-MS等化学方法，将纯化 后样品OPN利用胰蛋白酶在温和条件下进行酶解，利用FT-ICR-MS并借助先进的Mascot软件 数据库将所获得的质谱图进行分析，得到了其相关多肽片段的质谱结构信息。根据多肽碎片 命名规则(图5)以及CAD的C-N肽键断裂和ECD的N-Ca断裂在裂解机理上的互补性(图6)， 鉴定了OPN蛋白中有代表性的双电荷分子离子峰为483.2570的多肽GDSVVYGLR片段(图7) 和双电荷分子离子峰为655.3816的多肽QNLLAPQTLPSK片段(图8)。而且，多肽 GDSVVYGLR片段和多肽QNLLAPQTLPSK片段与标准谱库匹配率(Score)分别为69和101。借助先进的Mascot软件数据库进行质谱分析，MS/MS串联质谱显示，平均分子量为964.4977 的单电荷中性多肽片段GDSVVYGLR，与平均分子量为964.4998 (483.2572， 2+)多肽片段 GDSVVYGLR的匹配分子离子相对照，相对偏差为0ppm。平均分子量为1308.7401的单电荷 中性多肽片段QNLLAPQTLPSK，与平均分子量为1310.7632 (655.3816， 2+)多肽片段 QNLLAPQTLPSK的匹配分子离子相对照，相对偏差为4ppm (图9)，充分说明了高分辨质谱 的准确性，也验证了OPN蛋白鉴定的可信度。
权利要求
1.一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)的方法，其特征是按以下步骤进行(A)将人乳样品经高速离心分离，转速需大于12000转/分钟，温度控制在不超过0℃，离心时间为30～45min，分离出乳脂、乳清和乳粒，其中乳脂在上层、乳粒在下层，OPN在中层的乳清部分中；(B)初步分离乳清部分用1mol/L硫酸调节至PH为4.6，沉淀，除去酪蛋白后，采用高效液相色谱配有SCX色谱柱进行分离，流动相A为20mmol/L柠檬酸、20mmol/L柠檬酸铵、pH 3.0和流动相B为20mmol/L柠檬酸、20mmol/L柠檬酸铵、0.5mol/LNaCl、pH3.0，进行梯度洗脱，先100％A洗脱20min，然后流动相B含量从0％到10％洗脱10min后，再大幅度使用流动相B含量从60％到100％洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为1mL/min，柱温为35℃，分离得到八个组份见图1，其中，SCX5、SCX6组份含有OPN；(C)进一步纯化将SCX5、SCX6组份合并，用高效液相色谱配有C4色谱柱对SCX5、SCX6组份进行纯化，流动相组成为A为0.1％TFA、99.9％水(v/v)和B为0.1％TFA、9.9％水与90％乙氰(v/v)，进行梯度洗脱，先100％A洗脱10min，然后流动相B含量从20％提高到40％，洗脱10min后，流动相B含量从40％到60％，洗脱25min，最后使流动相B含量从60％到100％，洗脱10min，在洗脱的过程中保持总流速为1mL/min，柱温为40℃，可以得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。
全文摘要
本发明提供了一种从人乳中分离、纯化骨桥蛋白(OPN)的方法。该方法先从人乳样品经高速离心分离出含OPN的乳清，然后采用高效液相色谱配有SCX色谱柱进行初步梯度分离，得到含有OPN的SCX5、SCX6组份，该二组份在C4色谱柱上进一步纯化，最后可以得到纯度较高的骨桥蛋白OPN。使用该方法，步骤简单、快速省时、所用试剂种类少、成本较低。
文档编号C07K1/00GK101638428SQ200810051738
公开日2010年2月3日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者雷 于, 刘晓梅, 韶 王, 磊 石, 舸 程, 蒋鑫萍 申请人:吉林大学